JPWO2016079912A1 - 毛乳頭細胞活性化剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、酸性糖アルカリ土類金属塩を含む、毛乳頭細胞の増殖活性化剤を提供し、前記酸性糖はリン酸化糖およびラクトビオン酸からなる群より選択される。好ましくは、酸性糖はリン酸化糖である。好ましくは、アルカリ土類金属塩は、カルシウム塩またはマグネシウム塩である。本発明により、毛乳頭細胞の増殖が促進される。したがって、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進および発毛促進等の育毛および発毛効果が期待される。

Description

本発明は、毛髪分野に関する。

毛髪の成長においては毛根の毛母細胞が分裂し、そこから生じた細胞が毛髪を構成していく。一方、毛髪の成長には毛周期と呼ばれる周期があり、成長期→退行期→休止期を繰り返す。毛乳頭細胞は増殖因子の産生と放出を通じて、毛包上皮幹細胞の増殖・分化に影響を及ぼし、毛周期を制御している。毛乳頭細胞や毛母細胞の活性化が毛成長のメカニズムに寄与すると言われている。

また、毛周期に応じて毛包では活発に血管のリモデリングが行われるが、このときの血管新生に問題があると、毛髪形成のための栄養や酸素の供給が不十分となる。毛包血管網からの血流の不足は男性型脱毛症(AGA) の病態に関与すると言われている。

毛乳頭細胞の遺伝子と発毛・毛成長については、以下のようなことが知られている。すなわち、乳頭細胞が毛母細胞に対して分泌する増殖因子にはFGF-7やIGF-1などが知られている。これら遺伝子には毛包成長を維持する作用がある。血管内皮成長因子(VEGF)は毛乳頭細胞より分泌されて毛包血管の増生に関わり、またオートクラインに毛乳頭細胞を増殖させる効果があるが、成長期から退行期へ移行するにしたがい、発現量は減少する。VEGF遺伝子はAGA（男性型脱毛症）の毛組織で発現が低下している。VEGFBはVEGFが作用する受容体であるVEGFR-1に競合して結合する。VEGFBは血管内皮細胞の増殖や透過性亢進活性を持つが、毛包での効果は不明である。

Wntファミリーは毛包発生に関与することが知られている。そのうち、Wnt5aは毛乳頭細胞のほか、外毛根鞘細胞、内毛根鞘細胞でも発現し、毛包の発生に関与し、毛乳頭細胞の細胞死を防ぐ効果がある。毛乳頭細胞においては成長期に発現量が最大となることが知られている(非特許文献１＝PLoS One 4, e5354 (2009), 非特許文献２＝Acta Histochemica 113,608-612 (2011))。

アルカリホスファターゼ (ALP、ALPL) は発毛誘導能を含む毛乳頭細胞の活性の指標となる。

Versican(バーシカン)はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンで、成長期の毛包で増加し、休止期に向けて減少する(非特許文献３＝J. Dermatol. Sci.39,147-154(2005))ことが知られており、発現量は発毛誘導活性と相関がある。

育毛効果のある薬剤としては種々知られており、日本皮膚科学会による「脱毛症治療のガイドライン」で5段階に有効性をランク付けした中で、ミノキシジル、フィナステリド（男性のみ）は「強く勧められる」に該当し、アデノシンは「考慮してもよいが、十分な根拠が無い」に分類される。その他に塩化カルプロニウム、t-フラバノン、6-ベンジルアミノプリン(サイトプリン)、ペンタデカン、ケトコナゾール、セファランチンが前記ガイドラインで取り上げられている。

ミノキシジルはSUR（sulfonylurea receptor）の活性化と、それに基づくミトコンドリアATP感受性Kチャネル開放による毛母細胞アポトーシスの抑制と、血管平滑筋ATP感受性Kチャネル開放による毛組織血流改善、毛乳頭細胞からのVEGFなどの細胞成長因子産生促進効果が報告されている。

フィナステリドはテストステロンをジヒドロテストステロンに変換する酵素である5α-還元酵素を阻害することで、ジヒドロテストステロンによって引き起こされる男性の脱毛症であるAGAに対し効果がある。一方で、AGA以外の脱毛症である円形脱毛症などには効果がない。

ｔ−フラバノンは毛母細胞の増殖を抑制するＴＧＦ−βの発現を抑制することで、毛成長を促進すると考えられている。

6-ベンジルアミノプリンは毛母細胞のアポトーシスに関与するNT-4遺伝子の毛乳頭細胞での発現を抑制し、発毛とともに抜け毛を減らす。

アデノシンは、毛乳頭に直接作用し、発毛促進因子であるFGF-7の産生量を高めて発毛を促進することで毛周期の成長期を長くさせ、細く弱い毛から太くて強い毛に育てる作用がある。

加えて、特公平５−３８７２６号公報（特許文献１）にはヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸である低分子酸性ムコ多糖類が、特開平９−１８８６０７号公報（特許文献２）には硫酸化多糖及び／又はその塩が、特開平１０−２０３９３０号公報（特許文献３）にはアルギン酸オリゴ糖またはその塩が、特許第２５５５３８９号（特許文献４）にはシアル酸及びシアル酸誘導体が、特開２００４−２３８２８６号公報（特許文献５）にはβ-1,3-グルカン誘導体の一つとしてβ-1,3-グルカンの硫酸エステル及びリン酸エステルが、特許３８３１２５２号公報（特許文献６）にはフコイダンが、特許３７１９２０７号公報（特許文献７）には酸性キシロオリゴ糖が育毛効果をもつことが示されているが、毛乳頭細胞に作用することは明示も示唆もされていない。さらにそれらのナトリウム塩で効果が得られている。

また、特許２５８３８１２号公報（特許文献８）にはアルギン酸、カラギーナン、ペクチン及びデキストラン硫酸からなる群から選ばれた少なくとも1種の酸性多糖体のカチオンを水素イオンに交換することで養毛効果が増進することが示されている。

特許第３２４０１０２号公報（特許文献９）にはリン酸化糖カルシウム塩がカルシウムを可溶化させて、口腔内組成物や肥料などの用途が開示されている。特開２００６−２４９０７７号公報（特許文献１０）にはリン酸化糖カルシウム塩の皮膚外用剤用途が示されており、ミネラル供給、表皮のコラーゲン産生促進及び皮膚の保水効果の改善についての効果が開示されている。ＷＯ２００７／０４００２７号公報（特許文献１１）にはリン酸化糖カルシウム塩とアスコルビン酸等を組み合わせることにより、皮膚の保湿効果や老化予防、細胞賦活効果もしくは美白効果を著しく向上することが開示されている。特開２０１２−７７０４４号公報（特許文献１２）にはリン酸化糖カルシウム塩が表皮のターンオーバー促進、ケラチノサイト分化促進、タイトジャンクション形成促進作用を有することが開示されている。

特公平５−３８７２６号公報 特開平９−１８８６０７号公報 特開平１０−２０３９３０号公報 特許第２５５５３８９号 特開２００４−２３８２８６号公報 特許３８３１２５２号公報 特許３７１９２０７号公報 特許２５８３８１２号公報 特許第３２４０１０２号公報 特開２００６−２４９０７７号公報 特ＷＯ２００７／０４００２７号公報 特開２０１２−７７０４４号公報

PLoS One 4, e5354 (2009), Acta Histochemica 113, 608-612 (2011) J. Dermatol. Sci. 39, 147-154 (2005)

本発明者らは鋭意開発した結果、歯の再石灰化促進効果や皮膚のバリア機能向上効果などが知られていたリン酸化糖カルシウム等の酸性糖アルカリ土類金属塩について研究を進め、毛髪に対する効果を見出した。本発明では、毛周期と毛成長を制御する毛乳頭細胞に対して、リン酸化オリゴ糖カルシウム及び、その類似体が毛髪の成長に重要な働きを有する遺伝子を活性化する機能を有することを新たに見出した。また、本発明者らは毛乳頭細胞の増殖を促進する効果も見出した。これにより、リン酸化オリゴ糖カルシウムを含む酸性糖アルカリ土類金属塩の毛乳頭細胞の増殖・活性化による育毛用途への応用が可能と考えられる。他方、酸性糖ナトリウム塩では効果を有しないことも判明しており、アルカリ土類金属を用いることが有利であることが判明した。上記背景技術で説明したいずれの文献にもリン酸化糖カルシウム塩が毛乳頭細胞に与える効果は明示も示唆もされていない。

したがって、本発明は、以下を提供する。
（項目１）アルカリ土類金属を含む酸性糖を含む、毛乳頭細胞の増殖活性化剤。
（項目２）前記酸性糖はリン酸化糖およびラクトビオン酸からなる群より選択される、項目１に記載の増殖活性化剤。
（項目３）前記酸性糖はリン酸化糖である、項目１または項目２に記載の増殖活性化剤。
（項目４）前記アルカリ土類金属は、カルシウムまたはマグネシウムである、項目１〜３のいずれか１項に記載の増殖活性化剤。
（項目５）前記アルカリ土類金属は、カルシウムである、項目１〜４のいずれか１項に記載の増殖活性化剤。
（項目６）前記アルカリ土類金属を含む酸性糖は、ラクトビオン酸カルシウム塩、グルコース−１−リン酸カルシウム塩（Ｇ１Ｐ−Ｃａ）、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）ともいう）、リン酸化オリゴ糖マグネシウム塩（ＰＯｓ−Ｍｇ）である、項目１〜５のいずれか１項に記載の増殖活性化剤。
（項目７）前記アルカリ土類金属を含む酸性糖は、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））である、項目１〜６のいずれか１項に記載の増殖活性化剤。
（項目８）アルカリ土類金属を含む酸性糖は、酸性糖アルカリ土類金属塩、または酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩もしくは酸性糖と酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩との組み合わせによって提供される、項目１〜７のいずれか１項に記載の増殖活性化剤。
（項目９）前記酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩は酸性糖アルカリ金属塩である、項目８に記載の増殖活性化剤。
（項目１０）前記酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩は、水溶性アルカリ土類金属塩である、項目８または９に記載の増殖活性化剤。
（項目１１）さらに毛母細胞も増殖促進させるためのものである、項目１〜１０のいずれか１項に記載の増殖活性化剤。
（項目１２）さらに毛包も増殖促進させるためのものである、項目１〜１１のいずれか１項に記載の増殖活性化剤。
（項目１３）さらに毛母細胞および毛包も増殖促進させるためのものである、項目１〜１２のいずれか１項に記載の増殖活性化剤。
（項目１４）アルカリ土類金属を含む酸性糖を含む、育毛剤。
（項目１５）前記育毛剤は、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進および発毛促進からなる群より選択される少なくとも１つのためのものである、項目１４に記載の育毛剤。
（項目１５Ａ）項目２〜１４のいずれか1項に記載の特徴をさらに有する、項目１４または１５に記載の育毛剤。
（項目１６）アルカリ土類金属を含む酸性糖を含む、発毛剤。
（項目１６Ａ）項目２〜１４のいずれか1項に記載の特徴をさらに有する、項目１４または１６に記載の発毛剤。
（項目１７）さらに、他の有効成分を含む、項目１〜１３のいずれか１項に記載の毛乳頭細胞増殖剤、項目１４、１５または１５Ａに記載の育毛剤、または項目１６もしくは１６Ａに記載の発毛剤。
（項目１８）前記有効成分はミノキシジルを含む、項目１７に記載の剤。
（項目１９）毛乳頭細胞の増殖活性化のためのアルカリ土類金属を含む酸性糖。
（項目２０）毛乳頭細胞の増殖活性化のための方法であって、該方法は、該増殖活性化を必要とする被験体に対して有効量のアルカリ土類金属を含む酸性糖および薬学的に許容し得るキャリアを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。

本発明は以下をも提供する。
（Ａ１）アルカリ土類金属および酸性糖の組合せを含む、毛乳頭細胞の増殖活性化剤。
（Ａ２）前記酸性糖はリン酸化糖およびラクトビオン酸からなる群より選択される、項目Ａ１に記載の増殖活性化剤。
（Ａ３）前記酸性糖はリン酸化糖である、項目Ａ１またはＡ２に記載の増殖活性化剤。
（Ａ４）前記アルカリ土類金属は、カルシウムまたはマグネシウムである、項目Ａ１〜Ａ３のいずれか１項記載の増殖活性化剤。
（Ａ５）前記アルカリ土類金属は、カルシウムである、項目Ａ１〜Ａ４のいずれか１項記載の増殖活性化剤。
（Ａ６）前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、ラクトビオン酸カルシウム塩、グルコース−１−リン酸カルシウム塩（Ｇ１Ｐ−Ｃａ）、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））、リン酸化オリゴ糖マグネシウム塩（ＰＯｓ−Ｍｇ）である、項目Ａ１〜Ａ５のいずれか１項記載の増殖活性化剤。
（Ａ７）前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））であるかまたは混合するとリン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））となる成分である、項目Ａ１〜Ａ６のいずれか１項記載の増殖活性化剤。
（Ａ８）前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））である、項目Ａ１〜Ａ７のいずれか１項記載の増殖活性化剤。
（Ａ９）前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、混合するとリン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））となる成分であり、塩化カルシウムとリン酸ナトリウムとを含む、項目Ａ１〜Ａ８のいずれか１項記載の増殖活性化剤。
（Ａ１０）アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、酸性糖アルカリ土類金属塩、または酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩もしくは酸性糖と酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩との組み合わせによって提供される、項目Ａ１〜Ａ９のいずれか１項記載の増殖活性化剤。
（Ａ１１）前記酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩は酸性糖アルカリ金属塩である、項目Ａ１０に記載の増殖活性化剤。
（Ａ１２）前記酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩は、水溶性アルカリ土類金属塩である、項目Ａ１０または１１に記載の増殖活性化剤。
（Ａ１３）さらに毛母細胞も増殖促進させるためのものである、項目Ａ１〜Ａ１２のいずれか１項記載の増殖活性化剤。
（Ａ１４）さらに毛包も増殖促進させるためのものである、項目Ａ１〜Ａ１３のいずれか１項記載の増殖活性化剤。
（Ａ１５）さらに毛母細胞および毛包も増殖促進させるためのものである、項目Ａ１〜Ａ１４のいずれか１項記載の増殖活性化剤。
（Ａ１６）アルカリ土類金属および酸性糖の組合せを含む、育毛剤。
（Ａ１７）前記育毛剤は、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進および発毛促進からなる群より選択される少なくとも１つのためのものである、項目Ａ１６に記載の育毛剤。
（Ａ１８）アルカリ土類金属および酸性糖の組合せを含む、発毛剤。
（Ａ１９）さらに、他の有効成分を含む、項目Ａ１〜Ａ１５のいずれか１項に記載の毛乳頭細胞増殖剤、項目Ａ１６またはＡ１７に記載の育毛剤、または項目Ａ１８に記載の発毛剤。
（Ａ２０）前記有効成分はミノキシジルまたはアデノシンを含む、項目Ａ１９に記載の剤。
（Ａ２１）前記有効成分はミノキシジル、センブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウムおよびアデノシンからなる群より選択される少なくとも一つを含む、項目Ａ１９に記載の剤。
（Ａ２２）前記有効成分はアデノシンを含む、項目Ａ１９に記載の剤。
（Ａ２３）毛乳頭細胞の増殖活性化のためのアルカリ土類金属を含む酸性糖。
（Ａ２４）毛乳頭細胞の増殖活性化のための方法であって、該方法は、該増殖活性化を必要とする被験体に対して有効量のアルカリ土類金属および酸性糖の組合せならびに薬学的に許容し得るキャリアを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。

本発明において、上述した１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解することにより、当業者に認識される。

通常のカルシウム剤に比べて毛乳頭細胞の増殖を促進させる。通常のカルシウム剤では活性化されないＣＳＰＧ４、Ｗｎｔ５ａ、ＡＬＰＬ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＶＥＧＦを活性化する。また、ＦＧＦ−７の発現も促進する。Ｗｎｔ５ａの促進により毛乳頭細胞アポトーシス抑制が示される。ＶＥＧＦの発現により毛包血管新生が示される。ＦＧＦ−７の発現により毛母細胞増殖促進が示される。ＡＬＰＬおよびＶｅｒｓｉｃａｎの促進により毛乳頭細胞の活性が促進されていることが示される。Ｖｅｒｓｉｃａｎは毛乳頭細胞特異的細胞外基質である。Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃの発現により成長期毛包の促進が示される。ＣＳＰＧ４の増加により成長期毛包の促進が示される。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎは広く存在する細胞外基質であり毛乳頭細胞等の促進が期待される。これらの遺伝子の発現上昇により、毛乳頭細胞が毛成長期の機能を発揮して、毛成長を促進する。通常のカルシウム剤を与えた時に発現が上昇するＶＥＧＦＢについて、発現抑制する効果がある。ミノキシジルとの併用では相加的（補完的）に効果をもたらす。つまり、ミノキシジルとの併用により、別のメカニズムの組み合わせでさらに毛成長促進を達成することができると考えられる。本発明は、比較的安価に調製することができるものであり、また、医薬品としての使用のほか、化粧品や医薬部外品としても使用が可能である点、従来の医薬用途に開発されている育毛剤とは異なるといえる。

これまで、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）等の酸性糖アルカリ土類金属塩については、保湿、バリア機能強化などの皮膚外用剤としての効果は明らかにされていたが、毛髪に対する効果は不明であり、特に毛乳頭細胞に与える効果は示唆もされていなかった。育毛効果のある素材はこれまでに医薬品主剤としてミノキシジル、フィナステリド、塩化カルプロニウムなどが、医薬部外品の有効成分としてt-フラバノン、サイトプリン、ペンタデカン、アデノシン、ニンジンエキス、センブリエキスなどの植物エキスが報告されている。しかし、それぞれ作用機序は一様ではなく、また作用機序不明のものも多い。そのため、育毛・発毛において重要な遺伝子群を総じて活性化するには、遺伝子発現への影響の異なる多くの素材の組み合わせが効果的であり、本発明は、新規な発毛素材を提供するという点で有用である。

また、医薬品として登録された薬剤はかえって化粧品や食品としての用途が制限されるという問題もあるが、本発明の酸性糖アルカリ土類金属塩は、食品や化粧品として広く利用されており、安全性も確認されていることから、従来の医薬品として開発された育毛剤または発毛剤に比較して患者に対する副作用が低いであろうことが期待される。

よって、本発明は、カルシウムやマグネシウムのようなアルカリ土類金属イオンを適度にキレートする酸性糖カルシウム塩又はマグネシウム塩を毛乳頭細胞に作用させることで、毛成長関連遺伝子の発現にこれまでに報告されている薬剤とは異なる効果を与え、毛髪成長を促すという作用効果を示す。

図１Ａは、カルシウム種の異なる物質の細胞増殖率の比較を示す。コントロールを１とした、増殖率を示す。左はＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）であり、右は塩化カルシウムの相当量を示す。 図１Ｂは、別のロットで行ったＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）での毛乳頭細胞増殖試験の結果を示す。ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）の作用濃度として、０．２％を超える濃度で毛乳頭細胞増殖効果があることを示した。平均±標準偏差を示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定でｐ＜０．０５は黒丸同士を結んだ線で示す。 図１Ｃは、別のロットで行ったグルコース−１−リン酸カルシウムでの毛乳頭細胞増殖試験の結果を示す。グルコース−１−リン酸カルシウムの作用濃度として、０．３％を超える濃度で毛乳頭細胞増殖効果があることを示した。平均±標準偏差を示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定でｐ＜０．０５は黒丸同士を結んだ線で示す。 図１Ｄは、ＰＯｓ−Ｎａと塩化カルシウムとを混合して最終的にＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）となるようにした場合の毛乳頭細胞増殖試験の結果を示す。ＰＯｓ−Ｎａと塩化カルシウムとを混合して最終的にＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）とした場合の作用濃度として、試した濃度全てで毛乳頭細胞増殖効果があることを示し、０．１％未満でも効果があることが示唆された。平均±標準偏差を示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定でｐ＜０．０５は黒丸同士を結んだ線で示す。 図１Ｅは、図１Ｄで示した各々の単独成分（ＰＯｓ−Ｎａおよび塩化カルシウム）の場合の毛乳頭細胞増殖試験の結果を示す。平均±標準偏差を示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定でｐ＜０．０５で検定したところ有意差を示すペアはなかった。いずれも、毛乳頭細胞の増殖は見られなかったことから、両者が必要であることが示された。 図２は、育毛効果および発毛効果に関連する種々の遺伝子の発現を示す。各グラフは左からコントロール、ＣａＣｌ_２、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）を示す。コントロールを１とした。グラフは、上欄左からＣＳＰＧ４、Ｗｎｔ５ａ、ＡＬＰＬを示し、中欄左からＴｅｎａｓｃｉｎ Ｃ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎを示し、下欄左からＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＦＧＦ７を示す。平均±標準偏差を示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定でｐ＜０．０５は＊で示す。 図３は、種々の遺伝子の発現についてミノキシジルとの比較実験を示す。各グラフは左からコントロール、ミノキシジル、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）を示す。コントロールを１とした。上欄左からＦＧＦ−７、ＶＥＧＦ、Ｗｎｔ５ａを示し、中欄左からＡＬＰＬ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、ＶＥＧＦＢを示し、下欄左からＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃ、ＣＳＰＧ４を示す。平均±標準偏差を示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定でｐ＜０．０５は＊で示す。 図４Ａは、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）とアデノシンと組み合わせた場合の遺伝子発現の変動の観察結果である。上パネルにはＦＧＦ７、下パネルでは左からＶＥＧＦ、ＶＣＡＮおよびＷＮＴ５Ａを示す。実験は、ＤＭＥＭ（無血清）中でＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）０．２５％およびアデノシン５０μＭの組合せで行い、３７℃で５時間インキュベートして行った。Ｄｕｎｎｅｔｔ検定でｐ＜０．０５で検定したところアデノシン、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）およびＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）＋アデノシンのすべてにおいて有意差があった（ｎ＝８）。さらにＦＧＦ７の場合、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）とアデノシンとを混合すると相乗的に作用することも示された。ＶＥＧＦ、ＶＣＡＮおよびＷＮＴ５Ａの場合は、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）とアデノシンとの組み合わせは相加的に寄与していた。 図４Ｂは図４Ａの続きで、同様の実験を別の遺伝子（ＣＳＰＧ４，ＦＮ１およびＴＮＣ）で行った結果を示す。Ｄｕｎｎｅｔｔ検定でｐ＜０．０５で検定したところ、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）およびＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）とアデノシンとの組み合わせで有意差があることが分かった（ｎ＝８）。他方、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）とアデノシンとは相加的に寄与していた。 図５は、マグネシウムとの組み合わせの場合の遺伝子発現変動の観察結果である。実験は、ＤＭＥＭ（無血清）中でＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）０．２５％および塩化マグネシウム０．０５２％（最終）の組合せで行い、３７℃で５時間インキュベートして行った。Ｄｕｎｎｅｔｔ検定でｐ＜０．０５で検定したところ（ｐ＜０．０５は黒丸同士を結んだ線で示す。）、ＦＧＦ７、ＶＥＧＦ、ＷＮＴ５Ａ（グラフ左から）のうち、ＦＧＦおよびＷＮＴ５Ａでは、ＰＯｓ−Ｍｇが有意に発現を亢進していた。リン酸化糖が金属イオンのキャリアとなって効果を奏したことが考えられる。 図６は、ＰＯｓ−Ｃａと一般的育毛成分とを組み合わせた場合の遺伝子発現変動を観察した結果である。実験は、ＤＭＥＭ（血清マイナス）中でＰＯｓ−Ｃａ０．２５％、および追加の成分としては、グリチルリチン酸二カリウム（０．２５％）、トコフェロール酢酸エステル（１％）、パントテニルエチルエーテル（０．１２５％）およびセンブリ（１％）との組み合わせによる効果を観察した。グラフでは、上パネルでＦＧＦ７に対する効果を、下パネルでＶＥＧＦに対する効果を示す。左から組合せ無し、グリチルリチン酸二カリウム（０．２５％）、トコフェロール酢酸エステル（１％）、パントテニルエチルエーテル（０．１２５％）およびセンブリ（１％）との組み合わせを示す。各々の棒の左側はＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）なし、右側がＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）を組み合わせた場合を示す。

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

（酸性糖アルカリ土類金属塩を含む、毛乳頭細胞の増殖活性化剤、育毛剤・発毛剤）
１つの局面において、本発明は、酸性糖アルカリ土類金属塩を含む、毛乳頭細胞の増殖活性化剤、育毛剤または発毛剤を提供する。本発明は、酸性糖アルカリ土類金属塩を用いることで、従来予想されていなかった毛乳頭細胞の増殖活性化効果を実証した。また、本発明では、種々の毛髪関連遺伝子において、正の効果があることが示された。例えば、Ｗｎｔ５ａが促進されており毛乳頭細胞アポトーシス抑制が示される。ＶＥＧＦの発現が亢進しており毛包血管新生が示される。ＦＧＦ−７の発現が亢進しており毛母細胞増殖促進が示される。ＡＬＰＬおよびＶｅｒｓｉｃａｎの発現が促進しており毛乳頭細胞の活性が促進されていることが示される。Ｖｅｒｓｉｃａｎは毛乳頭細胞特異的細胞外基質であり、発現上昇により毛乳頭細胞が活性化していることが示される。Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃの発現が促進されており、成長期毛包の促進が示される。ＣＳＰＧ４の発現が促進されており、成長期毛包の促進が示される。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎは広く存在する細胞外基質でありこの細胞外基質も促進していることから、毛乳頭細胞等の促進が示される。これらの遺伝子の発現上昇により、毛乳頭細胞が毛成長期の機能を発揮して、毛成長を促進する。通常のカルシウム剤を与えた時に発現が上昇するＶＥＧＦＢについて、発現抑制する効果がある。本発明では、このような効果を実証することにより、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進および発毛促進等の育毛効果および発毛効果が達成され得ることが示された。本発明の毛乳頭細胞増殖剤、育毛剤、または発毛剤は、さらに、他の有効成分を含む、そのような有効成分としては、ミノキシジル等が挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において、「酸性糖アルカリ土類金属塩」とは、当該分野で通常使用されるのと同じ意味で使用され、酸性糖とアルカリ土類金属との塩をいい、水溶液で存在する場合は、そのイオン形態等も含むことが理解される。

本明細書において「酸性糖」とは、酸性基を含む任意の糖をいう。使用され得る酸性基としては、リン酸基、硫酸基等の無機酸基、カルボキシ基等の有機酸基等を挙げることができるがこれらに限定されない。

本明細書において「アルカリ土類金属」としては、周期律表ＩＩa族に属する任意の金属をいい、例えば、本明細書において、通常、カルシウム、ストロンチウム、マグネシウム、バリウムなどが含まれる。本発明において使用されるアルカリ土類金属としては、カルシウムまたはマグネシウムが好ましいがこれらに限定されない。本発明においてアルカリ土類金属が酸性糖との組合せ（アルカリ土類金属を含む酸性糖）で提供される場合、酸性糖アルカリ土類金属塩、または酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩もしくは酸性糖と水溶性アルカリ土類金属塩との組み合わせとして提供され得る。１つの好ましい実施形態では、酸性糖アルカリ土類金属塩は、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））であり得る。

本発明の一実施形態において「塩」は、例えば、任意の酸性基（例えばリン酸基）で形成されるアニオン塩、または任意の塩基性基または塩基性実体（例えばアルカリ土類金属）で形成されるカチオン塩を含む。本発明において「塩」は、目的とする酸性基を有する酸性糖と、目的とする塩基性基または塩基性実体（アルカリ土類金属）を有する塩とを提供して適時に合わせることによって提供されることができる。

本明細書において「毛乳頭細胞」とは、毛球の先端部に毛乳頭を構成する細胞をいう。毛は表皮から上の部分を「毛幹」、表皮より下の部分を「毛根」と呼び、毛根部の一番下のふくらんだ部分は「毛球」を構成する。毛乳頭が毛細血管から栄養を取り込んで、毛を成長させるとされている。

本明細書において「毛包」とは、毛嚢ともいい、毛根を包む組織である。毛根を保護し，毛の伸長の通路を構成する。

本明細書において「増殖活性化」とは、毛乳頭細胞についていうとき、何も処置しない状態に比べて増殖速度が増加することをいう。毛乳頭細胞の増殖活性化が起こると、毛髪の再生のサイクルが促進され、既に存在している毛髪の増毛硬化につながるとされることから、育毛効果が実証されたといえることになる。毛乳頭細胞と育毛効果の関係については、例えば、日本薬理学雑誌１３３，７３−７７（２００９）のｐ．７５において、抗男性型脱毛症(ＡＧＡ)薬の創出を目指した評価系として、毛乳頭細胞増殖試験の評価系と、毛乳頭細胞の増殖促進が太くしっかりとした毛を形成させるのに重要である旨記載されており、また、日本薬理学雑誌１１９，１６７−１７４（２００２）のｐ．１７０ ６．ミノキシジルの発毛メカニズムにおいて、ミノキシジルの発毛効果の考察として、具体的作用に毛乳頭細胞の増殖作用が示されており、さらに「化粧品の有用性評価技術の進歩と将来展望」（編集企画：日本化粧品技術者会）では、育毛剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価系として毛乳頭細胞培養と増殖率や増殖因子の定量などが一次スクリーニングとして紹介されていることから、毛乳頭細胞培養と増殖率や増殖因子の定量により、育毛効果が一定程度実証されたといえることが当該分野でも認知されているといえる。

本明細書において「発毛」とは、新たに毛を生やすことをいい、脱毛した毛穴から発毛させる作用効果が含まれる。

本明細書において「育毛」とは、すでにある毛の脱落防止および成長促進を包含する概念をいい、産毛を含め，今生えている髪の毛を太く丈夫に育てる作用効果も含まれる。

１つの実施形態では、育毛作用は、毛伸長速度を指標として評価することができる。育毛作用とは、毛の伸長の促進、太さの増大、毛周期の休止期から成長期への移行促進、および／または成長期から退行期への移行阻害を行なうことにより結果として毛の量が増加していることを意味する。従って、育毛には、発毛、養毛及び脱毛予防の概念が包含されるものとする。育毛作用を測定する方法としては、特に限定されないが、例えば単離毛包を器官培養し、培養期間中の毛の伸長量を測定する方法が挙げられる。

本明細書では、「毛乳頭細胞増殖促進剤」とは、毛乳頭細胞の増殖を促進する薬剤をいい、毛乳頭細胞増殖促進剤を加えた場合に、それを加えないときと比較して毛乳頭細胞の増殖が増大すること、好ましくは統計学的に有意に増大することをいう。

本明細書において「発毛剤」とは、発毛作用効果のある任意の薬剤をいう。

本明細書において「育毛剤」とは、育毛作用効果のある任意の薬剤をいう。

本明細書において使用される用語「医薬品」とは、人又は動物の疾病の診断、治療又は予防に使用することが目的とされている物であって、機械器具、歯科材料、医療用品及び衛生用品でないもの；または人又は動物の身体の構造又は機能に影響を及ぼすことが目的とされている物であって機械器具、歯科材料、医療用品及び衛生用品でないものをいう。医薬品の定義には、医薬部外品および化粧品は含まれない。

毛髪関係の医薬品の効能範囲としては、円形脱毛症、脂漏性脱毛症、びまん性脱毛症、老人性脱毛症、ＡＧＡなど薄毛の改善や、発毛促進などに関する項目で、厚生労働省が認めたものを挙げることができる。

本明細書において使用される用語「医薬部外品」とは、（１）吐き気その他の不快感又は口臭若しくは体臭の防止；あせも、ただれ等の防止；脱毛の防止、育毛又は除毛；或いは人又は動物の保健のためにするねずみ、はえ、蚊、のみ等の駆除又は防止が目的とされており、かつ、人体に対する作用が緩和な物であって機械器具、歯科材料、医療用品及び衛生用品でないもの、もしくは（２）人又は動物の疾病の診断、治療又は予防に使用することが目的とされている物、または人又は動物の身体の構造又は機能に影響を及ぼすことが目的とされている物、のうち、厚生労働大臣が指定するものをいう。なお、日本国以外の国では「医薬品」および「医薬部外品」の定義は、その国の法律が優先する。

毛髪関係での、医薬部外品の効能範囲としては、育毛、薄毛、かゆみ、脱毛の予防、毛生促進、発毛促進、病後・産後の脱毛、養毛を挙げることができる。

本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。

本明細書において「被験体（者）」とは、本発明の薬剤を用いた予防または治療等の対象をいい、好ましくはヒトをいう。

本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。

（本発明で使用される材料）
本発明で用いられるアルカリ土類金属を含む酸性糖としては任意の酸性糖と任意のアルカリ土類金属との組み合わせが用いられる。そのようなアルカリ土類金属を含む酸性糖は、酸性糖アルカリ土類金属塩の形態で、または酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩もしくは酸性糖と水溶性アルカリ土類金属塩との組み合わせによって提供されることができる。

本発明で用いられる酸性糖は、任意の酸性糖を使用することができ、例えば、リン酸化糖、硫酸化糖、ウロン酸、ラクトビオン酸、マルトビオン酸、アルギン酸、フコイダン等を含む酸性多糖類、もしくはその還元糖、又はアルダル酸もしくはアルドン酸等を挙げることができるがそれらに限定されない。好ましくは、リン酸化糖またはラクトビオン酸が挙げられ、より好ましくは、リン酸化糖が挙げられる。

１つの好ましい実施形態では、本発明で用いられる酸性糖は、リン酸化オリゴ糖またはその糖アルコールを含み、このリン酸化オリゴ糖は、ジャガイモデンプンから調製されることができ、通常α−１，４結合した３〜５個のグルコースからなり、そして１個のリン酸基が結合しているグルカン、および／または、α−１，４結合した２〜８個のグルコースからなり、そして２個のリン酸基が結合しているグルカンである。

１つの実施形態では、本発明で用いられるアルカリ土類金属としては、カルシウム、ストロンチウム、マグネシウム、バリウム等を挙げることができ、好ましくはカルシウムまたはマグネシウムであり、さらに好ましくはカルシウムである。

１つのさらに好ましい実施形態では、本発明は、リン酸オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））を用いることができる。

（リン酸化オリゴ糖）
上記リン酸化オリゴ糖は、ジャガイモの粗製デンプンのような、リン酸基が多く結合したデンプンから調製され得る。ジャガイモデンプン中では、これを構成するグルコースの３位および６位にリン酸基が比較的多くエステル結合している。リン酸基は主にアミロペクチンに存在する。

デンプンなどの酵素的分解には、デンプン分解酵素であるα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、およびネオプルラナーゼ（Ｋｕｒｉｋｉら、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７０巻、１５５４頁−１５５９頁、１９８８年）、ならびに糖転移酵素であるシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１９；以下ＣＧＴａｓｅと略する）をそれらのうち１種以上作用させ、または、それら１種以上とα−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０）を併用する。

イソアミラーゼあるいはプルラナーゼで分解することにより、デンプン中のα−１，６分枝構造を切ることによって、分枝構造を有しないリン酸化糖を得ることができるし、これらの酵素を用いなければ、α−１，６分枝構造を有するリン酸化糖を得ることもできる。また、グルコアミラーゼで分解することにより、非還元末端に結合したリン酸化されていないグルコースを順次遊離させることができる。このような酵素処理を行うことで、精製後のリン酸化糖の分子量あたりのリン酸基数を増減させることが可能となる。

酵素による分解は複数種の酵素を同時に反応させることにより、同時に進行させ得る。簡単に言えば、原料となるデンプンを、水、または酵素が作用できるｐＨに調整した緩衝液に溶解する。この反応液に、液化型α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼなどを同時に加えて、加熱を行うことにより反応させる。この方法を用いると、デンプンを糊化させながら、中性糖を遊離すること、リン酸化糖の非還元末端に結合したリン酸化されていないグルコースを遊離させること、あるいはリン酸化糖構造中の原料に由来するα−１，６分枝構造を切断することができる。この方法により、２段階の反応ではなく、１段階の反応でリン酸含量を高めたリン酸化糖が得られる。

複数種の酵素を個別の工程で作用させることにより２段階以上の酵素反応をさせる場合においては、作用させる酵素の順序は特定されない。しかし、デンプンの濃度が高い場合、最初に液化型アミラーゼを含めた酵素を作用させるのが好ましい。最初にイソアミラーゼあるいはプルラナーゼを作用させるとアミロース含量が増える。アミロースはアミロペクチンに比べて老化および沈澱しやすいため、原料が老化、沈澱してしまう。そして他の酵素による作用を受けなくなる。

使用するデンプン分解酵素、糖転移酵素、およびα−グルコシダーゼの由来は特に問わない。例えば、α−アミラーゼの由来としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌やアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のデンプン分解酵素製剤が好適に使用され得る。また、酵素の反応条件は、酵素が作用し得る温度およびｐＨであればよい。例えば、温度２５℃〜７０℃、ｐＨ４〜８が好適に用いられる。

まず原料となるデンプンを、水、または酵素の作用できるｐＨに調整した緩衝液に溶解する。この溶液に、液化型α−アミラーゼを加え、加熱して反応させることにより、デンプンを糊化させつつ液化する。その後、温度２０〜８０℃にて適当な時間保持する。作用させる液化型α−アミラーゼ量は、デンプンを液化できる量であれば、少量でも過剰でも良い。好適な量としては、２０〜５０，０００Ｕである。また、この時の保持時間は、デンプンがその後の工程中において老化を起こさない程度まで液化されるならば、その長さは問わない。好ましくは、２０〜８０℃で３０分間保持される。

液化終了後、特に酵素を失活させる必要はないが、１００℃で１０分保持するなど常法により酵素を失活させてもよい。さらに、遠心分離あるいは膜濾過などの常法により不溶物を分離除去してもよい。その後、リン酸化糖を分画してもよいが、リン酸含量を高めたリン酸化糖を得るには、さらに以下の操作を行う。

簡単に言えば、原料を液化させた後、これに、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、およびα−グルコシダーゼをそれぞれ同時にあるいは適当な順序で添加して糖化させ、例えば温度４０〜６０℃で３０分〜４０時間作用させて、原料から、中性糖およびリン酸化糖の非還元末端に結合したリン酸化されていないグルコースを遊離させ得、そしてリン酸化糖構造中の原料に由来するα−１，６分枝構造を切断し得る。このグルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼを組み合わせて使用する場合、その組み合わせおよび添加順序は問わない。また、酵素の添加量および保持時間は、リン酸化オリゴ糖に求められるリン酸含量などに応じて決定され得る。好ましくは、グルコアミラーゼは５０〜７００Ｕ、イソアミラーゼおよびプルラナーゼはそれぞれ２〜１００Ｕ、α−グルコシダーゼは５０〜７００Ｕ添加され得る。酵素は固定化しても好適に用いられ得る。

各酵素の反応終了後においては、特に酵素を失活させる必要はないが、１００℃で１０分保持するなど常法により酵素を失活させてもよい。さらに、遠心分離あるいは膜濾過などの常法により不溶物を分離除去してもよい。

リン酸化オリゴ糖を含有する糖混合物からリン酸化オリゴ糖を精製するために、リン酸化オリゴ糖が中性糖とは異なりイオン性の物質であることから、陰イオン交換樹脂が用いられ得る。樹脂の種類は、特に限定するものではないが、キトパールＢＣＷ２５００タイプ（富士紡績製）、アンバーライトＩＲＡタイプ（オルガノ製）、ＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン製）、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＱＡＥ−セファデックス（ファルマシア製）、ＱＡＥ−セルロース（バイオラッド製）などが好適に用いられ得る。適当なｐＨに調整した緩衝液を用いて、樹脂を平衡化する。例えば１０〜５０ｍＭ程度の酢酸緩衝液（ｐＨ４〜５）などの条件が好適に用いられ得る。平衡化した樹脂をカラムに詰め、リン酸化オリゴ糖を含有する糖混合物をチャージする。中性糖を洗浄除去した後、吸着したリン酸化オリゴ糖をアルカリ性の溶液または塩溶液を用いて溶出する。

リン酸化オリゴ糖の溶出を溶出液のイオン強度を上昇させることによって行う場合、用いる塩の種類は特に問わない。例えば、塩化ナトリウム、重炭酸アンモニウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムのような塩が好適に用いられ得る。

リン酸化オリゴ糖の溶出を溶出液のｐＨをアルカリに変化させることによって行う場合、用いるアルカリ試薬の種類は特に問わない。例えば、アンモニア、炭酸ナトリウム、または水酸化ナトリウムが用いられ得る。しかし、強アルカリ条件下では、リン酸基が糖から離脱し、あるいは糖の還元末端が酸化される。従って、好ましくは、リン酸化オリゴ糖の溶出は、弱酸性から弱アルカリ性の範囲のｐＨで行い、さらに好ましくはｐＨ３〜ｐＨ８の範囲で行う。

この場合、徐々に溶出液の塩濃度またはｐＨを高くしたり、あるいは段階的に塩濃度またはｐＨを上昇させてリン酸化オリゴ糖を溶出することにより、リン酸化糖１分子当たりに結合しているリン酸基の個数に応じてリン酸化オリゴ糖の成分を分画することが可能となる。

リン酸化オリゴ糖を含有する糖混合物からリン酸化オリゴ糖を精製するには、陰イオン交換樹脂の代わりに活性炭もまた用いられ得る。用いる活性炭の種類は特に問わないが、好ましくは、カラムに充填可能な粒状活性炭が用いられる。グルコースを除く中性糖の吸着能が生じる条件となるように、緩衝液、酸、アルカリ、塩溶液、および蒸留水を用いて、活性炭を調製する。例えば粒径が均一で、脱気を施した活性炭を、カラムに充填し、蒸留水で洗浄したものなどが好適に用いられ得る。カラムに試料を供して中性糖を吸着させることにより、リン酸化オリゴ糖を素通り画分に得ることができる。

リン酸化オリゴ糖を含有する糖混合物からリン酸化オリゴ糖を精製するには、炭素数１〜３のアルコールを添加してリン酸化オリゴ糖を沈澱させる方法もまた、用いられ得る。簡単に言えば、試料溶液にアルコールを添加することにより、リン酸化オリゴ糖のみが沈澱として得られ得る。１０％以上の糖濃度であれば容積比で３倍量以上のアルコールを添加することが望ましい。

アルコールに加えて、アルカリ土類金属塩、好ましくはカルシウム塩の存在下で、このリン酸化オリゴ糖はリン酸化オリゴ糖アルカリ土類金属塩を形成し、沈澱が生じやすくなる。このため、アルカリ土類金属塩の存在下では、先に示したアルコールのみによる沈澱化に比べ、少量のアルコールでもリン酸化オリゴ糖の回収が容易となり、本発明の成分が直接製造し得る。好ましくはアルカリ条件下で実施する。用いるアルカリ土類金属塩の種類は特に限定するものではないが、例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウムが、溶解性もよく、好適に用いられ得る。アルコールを添加することで生じた沈澱の採取は、一般に使用される方法、例えば、デカンテーション、濾過、遠心分離などにより行われる。

アルカリ土類金属塩を添加し、沈殿物として分離されるリン酸化オリゴ糖アルカリ土類金属塩を含む画分から、アルカリ土類金属塩を除去してリン酸化オリゴ糖アルカリ土類金属塩を製造してもよいし、本発明の成分として直接使用してもよい。金属体の除去（脱塩）は定法により行われ得る。脱塩は、例えば卓上脱塩装置マイクロアシライザーＧ３（旭化成（株）製）を用いると容易に行われ得る。

このようなアルカリ土類金属塩はリン酸化オリゴ糖とアルカリ土類金属塩との化合物であるリン酸化オリゴ糖アルカリ土類金属塩の沈澱として、上述のようなアルコール沈澱を回収することで製造することができる。必要ならば、回収した沈澱を水あるいは適当な溶液に再溶解し、アルコールを再度添加する操作を繰返し行ってもよい。この操作により、中性糖および過剰の塩などの不純物が除去され得る。塩など不純物の除去には限外濾過膜もまた用いられ得る。

（酸性糖アルカリ土類金属塩の提供）
１つの実施形態では、本発明においては、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム）含有する酸性糖成分を提供する目的で、（ｉ）酸性糖カルシウム塩等の酸性糖アルカリ土類金属塩；または（ｉｉ）酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、酸性糖カルシウム塩）以外の酸性糖の塩（例えば、酸性糖アルカリ金属塩等）もしくは酸性糖と、酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、酸性糖カルシウム塩）以外のアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩）との組み合わせ；あるいは（ｉｉｉ）上記（ｉ）および（ｉｉ）の混合物が使用される。必要に応じて他の材料（例えば、他の育毛剤、発毛剤、栄養成分、清涼剤など）もまた使用され得る。好ましくは（ｉｉ）で使用される酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩は、水溶性のアルカリ土類金属塩である。（ｉｉ）の酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、酸性糖カルシウム塩）以外の酸性糖の塩（例えば、酸性糖アルカリ金属塩）もしくは酸性糖と、酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、酸性糖カルシウム塩）以外の塩（例えば、アルカリ金属塩）とは、水溶液中で酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、酸性糖カルシウム塩）を形成することができ、酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、酸性糖カルシウム塩）と同様に作用し得る。そのため、本明細書中での言及する酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、酸性糖カルシウム塩）についての効果は、（ｉｉ）の組み合わせについても同様に得られると考えられる。本発明で使用され得る酸性糖アルカリ金属塩のアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウム等が使用され得、好ましくはカリウムまたはナトリウムが用いられる。

１つの特定の実施形態では、本発明においては、リン酸化糖のカルシウム含有成分を提供する目的で、（ｉ）リン酸化糖カルシウム塩；または（ｉｉ）リン酸化糖カルシウム塩以外のリン酸化糖の塩もしくはリン酸化糖と、リン酸化糖カルシウム塩以外のカルシウム塩との組み合わせ；あるいは（ｉｉｉ）上記（ｉ）および（ｉｉ）の混合物が使用される。必要に応じて他の材料（例えば、他の育毛剤、発毛剤など）もまた使用され得る。（ｉｉ）のリン酸化糖カルシウム塩以外のリン酸化糖の塩もしくはリン酸化糖と、リン酸化糖カルシウム塩以外のカルシウム塩とは、水溶液中でリン酸化糖カルシウム塩を形成することができ、リン酸化糖カルシウム塩と同様に作用し得る。そのため、本明細書中での言及するリン酸化糖カルシウム塩についての効果は、（ｉｉ）の組み合わせについても同様に得られると考えられる。

本発明において使用されるリン酸化糖は、糖部分とリン酸基とからなっている。本明細書で用いる場合、用語「リン酸化糖」とは、分子内に少なくとも１個のリン酸基を有する糖をいう。本明細書で用いる場合、用語「リン酸化糖の塩」とは、リン酸化糖の塩をいう。本明細書で用いる場合、用語「リン酸化糖無機塩」とは、リン酸化糖の無機塩をいう。本明細書で用いる場合、用語「リン酸化糖のカルシウム塩」とは、リン酸化糖のカルシウム塩をいう。

リン酸化糖等の酸性糖中の酸性基（リン酸化等の場合リン酸基）の数は特に限定されないが、リン酸化糖等の酸性糖１分子あたり１０個以下が好ましく、５個以下がより好ましい。さらに好ましくは、リン酸化糖等の酸性糖中の酸性基（例えば、リン酸基）の数は、リン酸化糖等の酸性糖１分子あたり１個、２個または３個であり、特に好ましくは１個または２個である。

リン酸化糖等の酸性糖中の糖部分の重合度は、好ましくは、２以上であり、より好ましくは３以上である。リン酸化糖中の糖の重合度は、好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約９０以下であり、より好ましくは約８０以下であり、より好ましくは約７０以下であり、より好ましくは約６０以下であり、より好ましくは約５０以下であり、より好ましくは約４０以下であり、より好ましくは約３０以下であり、より好ましくは約２０以下であり、より好ましくは約１０以下であり、より好ましくは約９以下であり、より好ましくは約８以下であり、さらに好ましくは約７以下であり、より好ましくは約６以下であり、特に好ましくは約５以下である。なお、本明細書中では、リン酸化糖等の酸性糖中の糖部分の重合度が１０以下のものを、酸性オリゴ糖（リン酸化糖の場合、リン酸化オリゴ糖）ともいう。本明細書中では、「重合度」とは、構造単位の数、すなわち、単糖残基の数をいう。例えば、３つのグルコース単位からなる糖の重合度は３である。場合によっては平均的な重合体分子の構造単位の数を指す。

リン酸化糖等の酸性糖の分子量は、好ましくは約４００以上であり、より好ましくは約５００以上であり、さらに好ましくは約６００以上であり、特に好ましくは約７００以上である。リン酸化糖の分子量は、好ましくは約１００万以下であり、より好ましくは約１０万以下であり、さらに好ましくは約１万以下であり、例えば、約９０００以下、約８０００以下、約７０００以下、約６０００以下、約５０００以下、約４０００以下、約３０００以下であり、特に好ましくは２０００以下であり、１つの実施形態では１０００以下である。

リン酸化糖等の酸性糖は、酸の形態（すなわち、リン酸化糖の場合リン酸基に水素が結合している）である。本発明においては、リン酸化糖等の酸性糖の電離形態（すなわち、リン酸化糖の場合リン酸基の水素が解離して離れてリン酸イオンになっている）を用いてもよく、塩の形態（すなわち、リン酸化糖の場合リン酸イオンと塩基の陽イオンが結合している）を用いてもよい。特定の実施形態では、好ましくは、リン酸化糖等の酸性糖の無機塩が使用される。リン酸化糖等の酸性糖の無機塩は、アルカリ土類金属塩であり、好ましくはカルシウム塩またはマグネシウム塩である。カルシウム塩の形態のリン酸化糖をリン酸化糖カルシウムともいう。リン酸化糖のマグネシウム塩をリン酸化糖マグネシウムともいう。他の無機塩についても同様である。好ましくは、本発明で用いられるリン酸化糖およびその塩は、特開平８−１０４６９６号公報に記載されるリン酸化糖およびその塩である。

リン酸化糖等の酸性糖の糖部分は、任意の糖残基であり得る。糖部分は、好ましくは、グルカン、還元グルカン、マンナン、デキストラン、寒天、シクロデキストリン、フコイダン、ジェランガム、ローカストビーンガム、グアーガム、タマリンドガム、およびキサンタンガムからなる群より選択される糖の残基である。グルカン残基または還元グルカン残基が好ましい。ここで、還元グルカンとは、グルカンの還元末端のアルデヒドがアルコールに還元されたものをいう。還元グルカンは、例えば、グルカンに水素添加してアルデヒドをアルコールに還元することによって得られる。

グルカン残基または還元グルカン残基中の重合度、すなわち、グルコース残基の数は、好ましくは、２以上であり、より好ましくは３以上である。グルコース残基の数は、好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約９０以下であり、より好ましくは約８０以下であり、より好ましくは約７０以下であり、より好ましくは約６０以下であり、より好ましくは約５０以下であり、より好ましくは約４０以下であり、より好ましくは約３０以下であり、より好ましくは約２０以下であり、より好ましくは約１０以下であり、より好ましくは約９以下であり、より好ましくは約８以下であり、さらに好ましくは約７以下であり、より好ましくは約６以下であり、特に好ましくは約５以下である。

酸性糖カルシウム（例えば、リン酸化糖カルシウム）中のカルシウムイオンの数は特に限定されず、酸性糖（例えば、リン酸化糖）中に存在する酸性基（例えば、リン酸基）のすべてにカルシウムイオンが結合してもよいし、一部のみにカルシウムイオンが結合してもよい。リン酸化糖１分子に対して１個のみのカルシウムイオンが結合してもよいし、２個結合してもよく、または３個以上結合してもよい。リン酸化糖１分子当たりのカルシウムイオン結合数は、好ましくは約２０個以下であり、より好ましくは約１０個以下であり、さらに好ましくは約５個以下である。

リン酸化糖カルシウムには歯の再石灰化効果、カルシウム吸収促進効果、さらに味質改善効果があることが知られているが、毛髪に対する効果は知られていない。

好ましい実施態様では、糖部分がグルカン残基または還元グルカン残基であり、ここで、このグルカン残基または還元グルカン残基に少なくとも１個のリン酸基が結合しているリン酸化糖またはその無機塩が使用される。さらに別の好ましい実施態様では、糖部分がグルカン残基または還元グルカン残基であり、ここで、このグルカン残基または還元グルカン残基に１個〜２個のリン酸基等の酸性基が結合しており、これらのリン酸基等の酸性基のそれぞれに無機イオンが結合している酸性糖無機塩（例えば、リン酸化糖無機塩）が使用される。

さらに好ましい実施態様では、糖部分がグルカン残基または還元グルカン残基であり、ここで、このグルカン残基または還元グルカン残基に少なくとも１個のリン酸基が結合しており、これらのリン酸基の少なくとも１個にカルシウムが結合しているリン酸化糖カルシウムが使用される。さらに別の好ましい実施態様では、糖部分がグルカン残基または還元グルカン残基であり、ここで、このグルカン残基または還元グルカン残基に１個〜２個のリン酸基等の酸性基が結合しており、これらのリン酸等の酸性基のそれぞれにカルシウムが結合している酸性糖カルシウム（例えば、リン酸化糖カルシウム）が使用される。

さらに別の好ましい実施態様では、糖部分がグルカン残基または還元グルカン残基であり、ここで、このグルカン残基または還元グルカン残基が、α−１，４結合した３〜５個のグルコース残基からなり、そしてこのグルカン残基または還元グルカン残基に１個のリン酸基等の酸性基が結合しており、このリン酸基等の酸性基に無機イオンが結合している酸性糖無機塩（例えば、リン酸化糖無機塩）が使用される。

さらに別の好ましい実施態様では、糖部分がグルカン残基または還元グルカン残基であり、ここで、このグルカン残基または還元グルカン残基が、α−１，４結合した３〜５個のグルコース残基からなり、そしてこのグルカン残基または還元グルカン残基に１個のリン酸基等の酸性基が結合しており、このリン酸基等の酸性基にカルシウムが結合している酸性糖カルシウム（例えば、リン酸化糖カルシウム）が使用される。

さらに別の好ましい実施態様では、糖部分がグルカン残基または還元グルカン残基であり、ここで、このグルカン残基または還元グルカン残基は、α−１，４結合した２〜８個のグルコース残基からなり、そしてこのグルカン残基または還元グルカン残基に１個〜２個のリン酸基等の酸性基が結合しており、これらのリン酸基等の酸性基のうちの少なくとも１個、好ましくは全てに無機イオンが結合している酸性糖の無機塩（例えば、リン酸化糖の無機塩）が使用される。

さらに別の好ましい実施態様では、糖部分がグルカン残基または還元グルカン残基であり、ここで、このグルカン残基または還元グルカン残基は、α−１，４結合した２〜８個のグルコースからなり、そしてこのグルカン残基または還元グルカン残基に１個〜２個のリン酸基等の酸性基が結合しており、これらのリン酸基等の酸性基のうちの少なくとも１個、好ましくは全てにカルシウムが結合している酸性糖カルシウム（例えば、リン酸化糖カルシウム）が使用される。

さらに別の好ましい実施態様では、糖部分がグルカン残基または還元グルカン残基であり、ここで、このグルカン残基または還元グルカン残基は、α−１，４結合したグルコースを主鎖とし、α−１，６結合またはα−１，４結合したグルコースを側鎖とする酸性糖（例えば、リン酸化糖）が使用される。

本発明で用いられ得るリン酸化糖等の酸性糖およびその塩は、純粋な１種類の化合物として用いられてもよく、複数種の混合物として用いられてもよい。本発明で用いられるリン酸化糖等の酸性糖およびその塩は、好ましくは、特開平８−１０４６９６号公報に記載されるリン酸化糖およびその塩である。特開平８−１０４６９６号公報に記載される方法に従って製造すると複数種類のリン酸化糖等の酸性糖またはその塩の混合物が得られる。その混合物をそのまま用いてもよく、純粋な化合物に分離した後に、１種類の化合物のみを選択して用いてもよい。リン酸化糖等の酸性糖およびその塩は、１種類で用いた場合も、混合物として用いた場合も、優れた性能を発揮する。

リン酸化糖等の酸性糖は、例えば、公知の糖類をリン酸化することにより製造され得る。リン酸化糖無機塩等の酸性糖無機塩は、例えば、公知の糖類をリン酸化等の酸性糖付与の処理をして酸の形態のリン酸化糖等の酸性糖を得て、その後、酸の形態のリン酸化糖等の酸性糖を無機塩とすることにより製造され得る。リン酸化糖カルシウム等の酸性糖カルシウム塩は、例えば、公知の糖類をリン酸化等の酸性か処理をして酸の形態のリン酸化糖等の酸性糖を得て、その後、酸の形態のリン酸化糖等の酸性糖をカルシウム塩とすることにより製造され得る。代表的な例として、リン酸化糖およびその塩の製造方法は、特開平８−１０４６９６号公報に記載される。リン酸化糖カルシウムはまた、江崎グリコ株式会社からリン酸化オリゴ糖カルシウムとして販売されている。

リン酸化糖等の酸性糖およびその塩の製造原料である糖としては、グルカン、マンナン、デキストラン、寒天、シクロデキストリン、フコイダン、ジェランガム、ローカストビーンガム、グアーガム、タマリンドガム、およびキサンタンガムが挙げられる。以下、グルカンの場合について説明する。一般の粗製植物澱粉、好ましくは馬鈴薯の粗製澱粉などのリン酸基が多く結合した澱粉が適しているが、精製品でもよい。化工澱粉もまた、好適に用いられ得る。さらに、リン酸基等の酸性基を化学的に結合させた各種糖質を用いることもまた可能である。馬鈴薯澱粉中では、これを構成するグルコースの３位および６位にリン酸基が比較的多くエステル結合している。リン酸基等の酸性基は主にアミロペクチンに存在する。

好ましい実施態様では、糖がグルカンの場合には、リン酸基等の酸性基を有する澱粉または化工澱粉を分解して得られ得る。

好適な実施態様では、リン酸基等の酸性基を有する澱粉または化工澱粉に、澱粉分解酵素、糖転移酵素、またはα−グルコシダーゼ、あるいはそれらの１種以上の組み合わせ（但し、α−グルコシダーゼ１種のみを除く）を作用させる。

好ましい実施態様では、上記澱粉分解酵素は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、またはネオプルラナーゼの１種以上の組み合わせからなるものである。好ましい実施態様では、上記糖転移酵素は、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼである。

好ましい実施態様では、上記製造方法は、リン酸基等の酸性基を有する糖に糖転移酵素を作用させる。上記糖転移酵素がシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼである。

リン酸化糖アルカリ土類金属塩等の酸性糖アルカリ土類金属塩は、例えば、酸の形態のリン酸化糖にアルカリ土類金属の塩を作用させて製造される。リン酸化糖カルシウム等の酸性糖カルシウムは、例えば、酸の形態のリン酸化糖等の酸性糖にカルシウム塩を作用させて製造される。

リン酸化糖等の酸性糖およびその塩としては、高純度のものを用いてもよく、低純度のものを用いてもよい。例えば、リン酸化糖等の酸性糖およびその塩は、他の糖との混合物として用いられてもよい。なお、本明細書中でリン酸化糖等の酸性糖およびその塩の濃度および含有量について言及する場合、この濃度および含有量は、純粋なリン酸化糖等の酸性糖およびその塩の量に基づいて計算される。それゆえ、リン酸化糖等の酸性糖およびその塩以外の物を含む混合物を用いた場合、濃度および含有量は、混合物全体の量ではなく、混合物中のリン酸化糖等の酸性糖およびその塩の量に基づいて計算される。

（アルカリ土類金属）
本発明で用いられるアルカリ土類金属はどのような形態のアルカリ土類金属を用いてもよい。例えば、塩の形で提供されてもよく、酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩もしくは酸性糖と水溶性アルカリ土類金属塩との組み合わせとして、提供されてもよい。例示として、アルカリ土類金属塩に使用されるアルカリ土類金属の例示としては、カルシウム、ストロンチウム、マグネシウム、バリウムなどを挙げることができる。好ましくは、生理的に受容可能なアルカリ土類金属が使用される。別の好ましい実施形態において、アルカリ土類金属としてカルシウムまたはマグネシウムが使用される。

本発明の特定の実施形態では、アルカリ土類金属としてはカルシウムが用いられる。カルシウムは塩形態で用いられる場合、水溶性、水不溶性、水難溶性のいずれであってもよい。水溶性カルシウム塩が好ましい。本明細書中では、「水不溶性カルシウム塩」とは、２０℃の水中での溶解度が０．１ｇ／１００ｍｌ Ｈ_２Ｏ未満であるカルシウム塩をいう。水不溶性カルシウム塩の例としては、フッ化カルシウム、炭酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、リン酸一水素カルシウム、酸化カルシウム、クエン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ステアリン酸カルシウムおよびリン酸カルシウムが挙げられる。本明細書中では、「水難溶性カルシウム塩」とは、２０℃の水中での溶解度が１ｇ／１００ｍｌ Ｈ_２Ｏ以上５ｇ／１００ｍｌ Ｈ_２Ｏ以下であるカルシウム塩をいう。水難溶性カルシウム塩の例としては、水酸化カルシウム、リンゴ酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、リン酸二水素カルシウムおよび安息香酸カルシウムが挙げられる。本明細書中では、「水溶性カルシウム塩」とは、２０℃の水中での溶解度が５ｇ／１００ｍｌ Ｈ_２Ｏより高いカルシウム塩をいう。本発明で用いられる水溶性カルシウム塩の２０℃の水中での溶解度は、好ましくは約２重量％以上であり、より好ましくは約３重量％以上であり、さらに好ましくは約４重量％以上であり、特に好ましくは約５重量％以上である。水溶性カルシウム塩の定義には、リン酸化糖カルシウム塩も含む。このような水溶性カルシウム塩の他の例としては、塩化カルシウム、水溶性有機酸カルシウム塩（例えば、乳酸カルシウム、酢酸カルシウム、グルタミン酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、ギ酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウムなど）、ポリオールリン酸カルシウム、硝酸カルシウム、カゼインホスホペプチドカルシウムなどが挙げられる。水溶性カルシウム塩は、乳酸カルシウム、酢酸カルシウム、ギ酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、ポリオールリン酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、カゼインホスホペプチドカルシウム、塩化カルシウムおよび硝酸カルシウムからなる群より選択されることが好ましい。

本発明の特定の実施形態では、アルカリ土類金属としてはマグネシウムが用いられる。マグネシウムは塩形態で用いられる場合、水溶性、水不溶性、水難溶性のいずれであってもよい。水溶性マグネシウム塩が好ましい。本明細書中では、「水不溶性マグネシウム塩」とは、２０℃の水中での溶解度が０．１ｇ／１００ｍｌ Ｈ_２Ｏ未満であるマグネシウム塩をいう。水不溶性マグネシウム塩の例としては、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、フッ化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ミリスチン酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウムが挙げられる。本明細書中では、「水難溶性マグネシウム塩」とは、２０℃の水中での溶解度が１ｇ／１００ｍｌ Ｈ_２Ｏ以上５ｇ／１００ｍｌ Ｈ_２Ｏ以下であるマグネシウム塩をいう。水難溶性マグネシウム塩の例としては、シュウ酸マグネシウムが挙げられる。本明細書中では、「水溶性マグネシウム塩」とは、２０℃の水中での溶解度が５ｇ／１００ｍｌ Ｈ_２Ｏより高いマグネシウム塩をいう。本発明で用いられる水溶性マグネシウム塩の２０℃の水中での溶解度は、好ましくは約２重量％以上であり、より好ましくは約３重量％以上であり、さらに好ましくは約４重量％以上であり、特に好ましくは約５重量％以上である。水溶性マグネシウム塩の定義には、リン酸化糖マグネシウム塩も含む。このような水溶性マグネシウム塩の他の例としては、安息香酸マグネシウム、塩化マグネシウム、ギ酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、チオ硫酸マグネシウム、ヘキサフルオロケイ酸マグネシウム、モリブデン酸マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硫酸マグネシウム、アスパラギン酸マグネシウム、リン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウムからなる群より選択されることが好ましい。

（本発明の製造方法）
本発明の組成物または剤は、アルカリ土類金属を含む酸性糖成分として：（ｉ）リン酸化糖カルシウム塩等の酸性糖アルカリ土類金属塩；または（ｉｉ）酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、リン酸化糖カルシウム塩）以外の酸性糖（例えば、リン酸化糖）の塩（例えば、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩）もしくは酸性糖（例えば、リン酸化糖）と、酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、リン酸化糖カルシウム塩）以外のアルカリ土類金属塩（例えば、塩化カルシウム）との組み合わせ；あるいは（ｉｉｉ）上記（ｉ）および（ｉｉ）の混合物を含むように、当該分野で公知の任意の方法によって製造され得る。

上記（ｉｉ）の場合、酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、リン酸化糖カルシウム塩）以外の酸性糖（例えば、リン酸化糖）の塩（例えば、アルカリ金属塩）もしくは酸性糖（例えば、リン酸化糖）と、酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、リン酸化糖カルシウム塩）以外のアルカリ土類金属塩（例えば、塩化カルシウム等のカルシウム塩）との組み合わせを本発明の組成物または剤に実質的に均一に含むことが好ましい。これらを均一に含む組成物または剤は、製造が容易であるという利点がある。

上記（ｉｉ）の場合、酸性糖（例えば、リン酸化糖）の塩もしくは酸性糖（例えば、リン酸化糖）を含む部分と、酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、リン酸化糖カルシウム塩）以外のアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩）を含む部分とを分けてもよい。この場合には、本発明の組成物または剤においては、酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、リン酸化糖カルシウム塩）以外の酸性糖（例えば、リン酸化糖）の塩（例えば、アルカリ金属塩）もしくは酸性糖（例えば、リン酸化糖）が放出されるのと同時またはそれよりも後に酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、リン酸化糖カルシウム塩）以外のアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩）が組成物または剤から放出されるように設計されるべきである。酸性糖アルカリ土類金属塩（例えば、リン酸化糖カルシウム塩）以外のアルカリ土類金属塩（例えば、塩化カルシウム等のカルシウム塩）の方が酸性糖（例えば、リン酸化糖）またはその塩よりも早く放出されると、アルカリ土類金属イオン（例えば、カルシウムイオン）が頭皮に無秩序に沈着してしまい、好ましくないからである。

これらのことは、本発明の全ての組成物または剤について適用される。

（剤型および他の成分および有効成分）
本発明の組成物または剤は、常法に従って、均一溶液、ローション、ジェルなどの形態で、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアリキッド、シャンプー、ポマード、リンス、などに用いられる。また、育毛効果を有する外用剤として使用することができる。

本発明の組成物または剤は、エアゾール組成物の形態をとることができ、その場合には、上記の成分以外に、ｎ−プロピルアルコール又はイソプロピルアルコール等の低級アルコール；ブタン、プロパン、イソブタン、液化石油ガス、ジメチルエーテル等の可燃性ガス；窒素ガス、酸素ガス、炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等の圧縮ガスを含有することができる。また、本発明に係る外用剤及び育毛剤は、例えば皮膚用の医薬部外品として使用するものであり、使用形態に適した剤形として提供される。具体的に剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、軟膏、水剤、エキス剤、ローション剤、トニック剤、スプレー剤及び乳剤等が挙げられる。当該医薬部外品には、植物の抽出物の他に、助剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤及び界面活性剤等の薬学的に許容される担体を任意に組合せて配合することができる。

本発明は、特に、毛乳頭細胞の増殖促進を通じて、毛周期において成長期から休止期への移行を抑制し、成長期を更に延長することにより、更に強い育毛効果と共に、および／または優れた抜け毛予防効果を発揮することを含むものである。このような相乗効果を更に高めるために、必要に応じて又は使用目的に応じて、本発明の組成物または剤には、酸性糖アルカリ土類金属塩以外の任意の成分および／または他の有効成分を本発明の目的及び効果を損なわない範囲で含有することができる。

このような任意の成分および／または他の有効成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤又はその他の界面活性剤、セルロース類、植物油、エステル油、角質溶解剤、高分子樹脂、紫外線吸収剤、ビタミン類、アミノ酸類、色剤、香料、他の有効成分が挙げられる。

水としては、例えば精製水、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水、海洋深層水、などが挙げられる。

セルロース類としては、例えばヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、などが挙げられる。

非イオン性界面活性剤としては、例えばソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート等）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油モノ又はイソステアレート、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル（モノミリスチン酸デカグリセリン、モノミリスチン酸ペンタグリセリン）、などが挙げられる。

エステル類としては、例えば多価アルコール脂肪酸エステル（トリ−２エチルヘキサン酸グリセリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン酸等の多価アルコール脂肪酸エステル、などが挙げられる。

植物油としては、例えばユーカリ油、サフラワー油、月見草油、ホホバ油、などが挙げられる。

エステル油としては、例えば不飽和脂肪酸アルキルエステル（オレイン酸エチル、リノール酸イソプロピル等）、リノレイン酸エステル、ミリスチン酸メチル、ミリスチン酸イソプロピル、などが挙げられる。

高分子樹脂としては、例えば両性ポリマー、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー、ノニオン性ポリマー、などが挙げられる。

紫外線吸収剤としては、例えばメトキシケイ皮酸オクチル（ネオヘリオパンＡＶ）、オキシベンゾン、ウロカニン酸、などが挙げられる。

ビタミン類としては、例えばビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、酢酸トコフェロール等のトコフェロール、ニコチン酸、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ベンジル、ニコチン酸ブトキシエチル、ニコチン酸エステル、コハク酸トコフェロール、トコフェロールニコチン酸、トコフェロールニコチン酸エステル、イノシトールヘキサニコチン酸エステル、トコフェロールリノレイン酸エステル、などが挙げられる。アミノ酸類としては、例えばグルタミン酸、メチオニン、セリン、グリシン、シスチン、スレオニン、などが挙げられる。

また、育毛剤または発毛剤においては、本発明の有効成分の他に、他の有効成分、例えば、通常用いられる養毛薬効剤、例えば、角質溶解剤、毛包賦活剤、細胞賦活剤、血行促進剤（血管拡張剤）、抗菌剤、抗炎症剤、保湿剤、抗脂漏剤、局所刺激剤、皮膚機能亢進剤、抗男性ホルモン剤、カリウムチャンネルオープナー、抗酸化剤等を必要に応じて適宜配合し、育毛または発毛効果の向上を図ることができる。角質溶解剤としては、例えばサリチル酸、レゾルシン、などが挙げられる。毛包賦活剤としては、フラバノノール類、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン、パントテン酸及びその誘導体、アデノシン及びその誘導体、アスパラギン酸カリウム、ペンタデカン酸グリセリド、６−ベンジアルアミノプリン、モノニトログアヤコールナトリウム、感光素301、ビオチン、タマサキツヅラフジエキス、ニンジンエキス（チクセツニンジンエキス、オタネニンジンエキス等）、ブドウエキス、リンゴエキス、酵母エキス、ニンニク成分、真珠蛋白抽出液、プラセンタエキス、ローヤルゼリー、アセチルコリン、センブリエキス、ヨウ化ニンニクエキス、イチョウエキス、塩化カルプロニウム、スピロノラクトン、ビタミンＢ6塩酸塩、γ−オリザノール、サークレチン、クロマカリム、セファランチン、ニコランジル、ビタミンＥ類（ＤＬ−α−トコフェロール、Ｄ−α−トコフェロール、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール、酢酸Ｄ−α−トコフェロール等）、ニコチン酸類（ニコチン酸、ＤＬ−α−トコフェロールニコチン酸エステル、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等）、ピナシジル、ミノキシジル、フタリド類、キナエキス、ショウブ根エキス、ソフォラ抽出液、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、トウヒエキス、当薬エキス、トウガラシチンキ、ユズ抽出液、カンタリスチンキ、ショウキョウチンキ等が挙げられる。細胞賦活剤としては、例えばペンタデカン酸グリセリド、コレウスエキス、ジンセンエキス、アデノシン、などが挙げられる。血行促進剤（血管拡張剤）としては、二酸化炭素、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、センブリエキス、ニンジンエキス、塩化カルプロニウム、ミノキシジル、セファランチン、ノナン酸バニリルアミド、ビタミンＥ、及びその誘導体等が挙げられる。抗菌剤としては、イソプロピルメチルフェノール、塩化ベンザルコニウム、オクトピロックス、ジンクピリチオン、ヒノキチオール等が挙げられる。抗炎症剤としては、甘草エキス、グリチルリチン酸及びその誘導体、グリチルレチン酸及びその誘導体、アズレン、グアイアズレン、オウゴンエキス、カミツレエキス、クマザサエキス、ローズマリーエキス、シソエキス、シラカバエキス、ゼニアオイエキス、桃葉エキス、セイヨウノコギリソウエキス等が挙げられる。保湿剤としては、オトギリソウエキス、オーツ麦エキス、グリセリン、チューベロースポリサッカライド、冬虫夏草エキス、延命草エキス、オオムギエキス、ブドウエキス、プロピレングリコール、桔梗エキス、ヨクイニンエキス等が挙げられる。抗脂漏剤としては、イオウ、レシチン、カシュウエキス、チオキソロン等が挙げられる。局所刺激剤としては、カンファー、トウガラシチンキ等が挙げられる。皮膚機能亢進剤としては、例えばＤ−パンテノール、パントテニルエチルエーテル等パンテノール誘導体、などが挙げられる。抗男性ホルモン剤としては、サイプロテロンアセテート、１１α−ハイドロキシプロゲステロン、フルタマイド、３−デオキシアデノシン、酢酸クロルマジノン、エチニルエストラジオール、スピロノラクトン、エピテステロン、フィナステライド、アロエ、サンショウ、チョウジエキス、クアチャララーテエキス、オタネニンジン等が挙げられる。カリウムチャンネルオープナーとしては、ミノキシジル、クロマカリム、ジアゾキシド及びその誘導体、ピナシジル等が挙げられる。抗酸化剤としては、紅茶エキス、茶エキス、エイジツエキス、黄杞エキス、ビタミンＣ及びその誘導体、エリソルビン酸、没食子酸プロピル、ジブチルヒドロキシトルエン等が挙げられる。他の有用成分としては、オリザノール、デキストラン硫酸ナトリウム、アセチルコリン、センブリエキス、トウガラシチンキ、カンタリスチンキ、ショウキョウチンキ、オタネニンジン、チクセツニンジン、セファランチン、サークレチン、ニコランジル、ピナシジル、ニンニクエキス、トウキエキス、ゲンチアナエキス、ヨウ化ニンニクエキス、カンゾウ、ミノキシジル、センキュウ、チクセツニンジン、ショウガ、ジオウ、アロエ、スピロノラクトン、ヒノキチオール、ヒノキオール、朝鮮にんじん、桃仁、白薬子、防巳、補骨脂、黄耆、紅花、加水分解糖参エキス（加水分解ヒカゲノツルニンジンエキス）、加水分解黒豆エキス、ビャッキュウ（白及）抽出物、バウダルコ樹皮エキス（タベブイアインペチギノサ樹皮エキス）、豆乳発酵液、ハイビスカス花発酵液、アッケシソウエキス、デイリリー花発酵液（ヘメロカリス属の花の発酵液）、ムラサキシキブ抽出物、カミツレ抽出物、コンブ等の海藻の抽出物、アマモ等の海産顕花植物等の抽出物、リノール酸及びその誘導体もしくは加工物（例えばリポソーム化リノール酸など）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体、動物又は魚由来のコラーゲン及びその誘導体、エラスチン及びその誘導体、ニコチン酸及びその誘導体、グリチルリチン酸及びその誘導体（ジカリウム塩（グリチルリチン酸二カリウム）等）、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＣ及びその誘導体、アラントイン、α−ヒドロキシ酸類、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、タマサキツヅラフジから得られるビス型アルカロイド、ゲンチアナエキス、甘草エキス、ハトムギエキス、ニンジンエキス、アロエエキスなどの生薬抽出エキス、米抽出物又はその加水分解物、有色素米（黒米、赤米、紫米、緑米等）の抽出物又はその加水分解物、米糠抽出物又はその加水分解物、米発酵エキス、アナアオサ抽出物、ソウハクヒエキス、ジョアゼイロ（Zizyphus joazeiro）抽出物などを挙げることができる。

製剤の成分としては本発明の成分以外にも、本発明の効果を損なわない限り、ミノキシジル、塩酸ジフェンヒドラミン、塩酸イソペンジル等の抗ヒスタミン剤、グリチルレチン酸、グアイアズレン等の抗炎症剤、尿素、サリチル酸等の角質溶解剤、グルコン酸クロルヘキシジン、イソプロピルメチルフェノール、第４級アンモニウム塩、ヒノキチオール、ピロクトンオラミン等の殺菌剤、ヒアルロン酸ナトリム、グリセリン、コンドロイチン硫酸等の保湿剤、イチイ、ボタンピ、カンゾウ、オトリギソウ、附子、ビワ、カワラヨモギ、コンフリー、アシタバ、サフラン、サンシン、ローズマリー、セージ、モッコウ、セイモッコウ、ホップ、プラセンタ等の動植物の抽出物、酢酸レチノール、塩酸ピリドキシン、アスコルビン酸、硝酸チアミン、シアノコバラミン、ビオチン、酢酸トコフェロール等のビタミン類、スクワラン、流動パラフィン、レシチン等の油分、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤、メントール、カンフル等の精油成分、ジブチルヒドロキシトルエン、イソプロピルガレート等の抗酸化剤、エチレンジアミンテトラアセテートまたはその塩等の金属イオン封鎖剤、色素、香料等を配合することができる。

血流促進成分は、毛乳頭細胞や毛母細胞に繋がる血液の流れを改善する成分であり、毛髪の成長に必要な酸素や栄養素を効率的に供給して細胞の代謝を活性化する。したがって、本発明の成分と組み合わせて使用することができる。このような血流促進成分としては、ビタミンＥ、酢酸トコフェロール等のビタミンＥ誘導体、ニコチン酸及びニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等のニコチン酸誘導体、セファランチン、塩化カルプロニウム、アセチルコリン、γ−オリザノール、サークレチン、クロマカリム、ニコランジル、ピナシジル、フタリド類、ジアルキルモノアミン誘導体、イチョウエキス、カミツレエキス、トウキエキス、センキュウエキス、ローズマリーエキス、オランダカラシエキス、ベニバナエキス、トウガラシチンキ、チンピエキス、ショウキョウチンキ、人参エキス、ショウブ根エキス、シナノキエキス、延命草エキス、当薬エキス、フユボダイジュ花エキス、ブドウ種子エキス、センブリエキス、ユズエキス等が挙げられる。

一方、上述した有効成分は化粧品として使用することもできる。この場合には、剤形としては、特に限定されるものではないが、例えば、油中水型又は水中油型の乳化化粧品、クリーム、ローション、ジェル、フォーム、エッセンス、ファンデーション、パック、スティック及びパウダー等が挙げられる。当該化粧品には、植物の抽出物の他に、化粧品成分として一般に使用されている油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料及び各種皮膚栄養剤等を任意に組合せて配合することができる。具体的には、皮膚化粧品に配合される薬効成分、例えば微粒子酸化亜鉛、酸化チタン、パーソールＭＣＸ、パーソール１７８９等の紫外線吸収剤、アスコルビン酸等のビタミン類、ヒアルロン酸ナトリウム、ワセリン、グリセリン、尿素等の保湿剤、ホルモン剤、及びコウジ酸、アルブチン、プラセンタエキス、ルシノール等の他の美白成分、ステロイド剤、アラキドン酸代謝物やヒスタミン等に代表される化学伝達物質産生・放出抑制剤（インドメタシン、イブプロフェン）、レセプター拮抗剤等の抗炎症剤、抗男性ホルモン剤、ビタミンＡ酸、ローヤルゼリーエキス、ローヤルゼリー酸等の皮脂分泌抑制剤、ニコチン酸トコフェロール、アルプロスタジル、塩酸イソクスプリン、塩酸トラゾリン等の抹消血管拡張剤及び末梢血管拡張作用のある炭酸ガス等、ミノキシジル、塩化カルプロニウム、トウガラシチンキ、ビタミンＥ誘導体、イチョウエキス、センブリエキス等の血行促進剤、ペンタデカン酸グリセリド、ニコチン酸アミド等の細胞賦活化剤、ヒノキチオール、Ｌ−メントール、イソプロピルメチルフェノール等の殺菌剤、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、セラミド及びセラミド類似化合物等を添加配合することができる。

本発明の酸性糖アルカリ土類金属塩を医薬、医薬部外品又は化粧品として使用する場合、酸性糖アルカリ土類金属塩の配合量は、乾燥物として計算して、通常、医薬、医薬部外品又は化粧品の全組成の０．００００１〜５重量％、特に０．０１〜２重量％、好ましくは、０．１〜１重量％、さらに好ましくは、０．２〜０．５重量％あるいは０．２〜０．４重量％であることが好ましいがこれらに限定されず、育毛効果または発毛効果がみられる限り当業者は適宜の濃度を決定することができる。特にＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）では、０．０６２５〜１．０重量％で効果がみられており、特に０．０１〜２重量％、好ましくは、０．１〜１重量％、さらに好ましくは、０．２〜０．５重量％あるいは０．２〜０．４重量％が好ましく、別の実施形態では、０．２重量％以上あるいは０．２重量％より多く、あるいは０．２重量％〜１．０重量％、０．２重量％超過〜１．０重量％、０．３重量％以上、あるいは０．３重量％〜１．０重量％が好ましいことが理解される。あるいは、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）がＰＯｓ−Ｎａと塩化カルシウムとの組み合わせで提供される場合は、より低濃度で育毛効果または発毛効果が発揮され得ることが理解される。例えば、０．１重量％以上、あるいは０．１重量％から０．８重量％であり得、或いは０．８重量％以下であってもよい。あるいは、１．０重量％未満、あるいは０．１重量％以上１．０重量％未満であってもよい。他方、グルコース−１−リン酸カルシウムの場合は、育毛効果または発毛効果が発揮され得る濃度として好ましい範囲は、０．３重量％より多く１．０重量％未満であり得、例えば、０．３重量％より多く０．８重量％以下、あるいは０．６重量％以上１．０重量％未満、あるいは０．６〜０．８重量％等を挙げることができるがそれらに限定されない。

また、上述した有効成分を化粧品、医薬又は医薬部外品として使用する場合、例えばチョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、ゴム、コロイドシリカナトリウムポリアクリレート等の粉体；例えば鉱油、植物油、シリコーン油等の油又は油状物質；例えばソルビタントリオレエート、ソルビタントリステアレート、グリセロールモノオレエート、高分子シリコーン界面活性剤等の乳化剤；パラ−ヒドロキシベンゾエートエステル等の防腐剤；ブチルヒドロキシトルエン等の酸化防止剤；グリセロール、ソルビトール、２−ピロリドン−５−カルボキシレート、ジブチルフタレート、ゼラチン、ポリエチレングリコール等の湿潤剤；トリエタノールアミン又は水酸化ナトリウムのような塩基を伴う乳酸等の緩衝剤；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の界面活性剤；密ろう、オゾケライトワックス、パラフィンワックス等のワックス類；増粘剤；活性増強剤；着色料；香料等、を必要に応じ適宜組合せて用いることができる。

追加の成分として、酸性糖アルカリ土類金属塩に加えて含まれ得る育毛、発毛、養毛、増毛効果を有する種々の成分であれば、上述した各成分に限定されるものではない。つまり、上述したものは可能性のある有効成分の一例を列挙したに過ぎない。従って、生体への安全性などを損なわない限りにおいて、殺菌剤、抗男性ホルモン剤、脂分泌抑制剤、免疫抑制剤、抗ヒスタミン剤、局所刺激剤、角質軟化剤、抗アポトーシス剤など、育毛、発毛、養毛、増毛効果を有するあらゆる種類の薬剤も有効成分として配合することができる。

また、本発明に係る育毛剤の実際の使用場面においては、毛髪や頭皮に塗布または散布するに可なる剤型（液剤、乳液剤、クリーム剤、ジェル剤、チック剤、シャンプー剤、スプレー剤、ムース剤、パック剤など）がとられる。従って、本発明の効果を損なわない限りにおいて、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールなど）、多価アルコール（エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、１、３−ブチレングリコール、イソプレングリコール）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィンなど）、エーテル類（エチルエーテル、プロピルエーテルなど）、香料、防腐剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色素、香料等を適宜配合してもよい。

本発明で使用される他の有効成分としては、すでに当該分野において育毛効果および／または発毛効果がみられている任意の成分を用いてもよい。このような他の育毛効果または発毛効果を有する成分としては、上述したものも含め、例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（Versican(バーシカン)として知られる）、ミノキシジル、フィナステリド、アデノシン、塩化カルプロニウム、t-フラバノン、6-ベンジルアミノプリン(サイトプリン)、ペンタデカン、ケトコナゾール、セファランチン等の日本皮膚科学会による「脱毛症治療のガイドライン」に掲載されているものを使用してもよい。本発明は実施例でも示されるように、ミノキシジルとは少なくとも相加効果を示すものと考えられる。したがって、本発明の効果は、他の成分に追加するような作用を一般に有し得ると考えられる。

（投与）
本発明を被験体に投与する場合、種々の送達（デリバリー）系が知られ、そしてこのような系を用いて、本発明の剤を適切な部位（例えば、頭皮）に直接投与することも可能であり、このような系には、例えば、水性または非水性媒体への溶解または懸濁、リポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用などがある。投与法には、限定されるわけではないが、経皮、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス（bolus）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。

（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M.(1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M. (1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al.(1995).PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J. et al.(1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

以下に、本発明の実施例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守して行った。

（製造例：使用したリン酸化糖カルシウム塩）
以下の実験に用いたリン酸化糖カルシウム（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））は、特開平８−１０４６９６号の実施例１の手順で、塩化ナトリウムの代わりに塩化カルシウムを用いて、馬鈴薯澱粉より調製することができる。つまり、α−１，４結合した２から８個のグルコースからなるオリゴ糖に分子内に１個から２個のリン酸基が結合し、これらのリン酸化糖にそれぞれカルシウムが結合したリン酸化糖カルシウムの混合物である。このリン酸化糖カルシウムは、３、４または５個のグルコースからなるオリゴ糖に分子内で１個のリン酸基が結合し、このリン酸基にカルシウムが結合しているものと５、６、７または８個のグルコースからなるオリゴ糖に分子内で２個のリン酸基が結合し、このリン酸基にカルシウムが結合しているものとの混合物である。ここで、１個のリン酸基が結合しているものと２個のリン酸基が結合しているものとのモル比は約８：２である。以下の実験では、このようにして調製した塩を用いた。イオン交換樹脂を用いる本方法以外にも、一般的な電気透析によって、脱塩後、各金属塩を添加することで容易に各種金属塩のリン酸化糖が調製できる。なお、リン酸化糖のカルシウム塩については、江崎グリコ株式会社からリン酸化オリゴ糖カルシウムとして販売されているものも好適に用いることができる。

（一般手法）
以下、本発明の毛髪関連の実験についての説明を行う。

（材料および方法）
まず、本発明において使用した試薬類および方法を説明する。

（１）一般試薬
水酸化ナトリウム、塩化カルシウム二水和物及び塩化マグネシウム六水和物は和光純薬工業（株）製の特級品を用いた。

（２）水
水はいずれもＭｉｌｌｉＱ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ＵＳ）を用いて製造された脱イオン水を用いた。

（３）１０％ （ｗ／ｖ） ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）水溶液
１．０ｇ ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）（王子コーンスターチ株式会社製、５．０％（ｗ／ｗ）カルシウム含有）を水８ｍｌに溶かし、ハンディタイプのｐＨメーター（ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ Ｂ−７１１，堀場製作所）を用いて１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した。それを、１０ｍｌにメスアップしてから、１０ｍｌシリンジ（テルモ（株））で０．２０μｍ フィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ， Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｆｒｅｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＵＳ）に通して滅菌状態とする。

（４）１．８４％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ水溶液
１０％ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）と同量のカルシウム含有の水溶液。カルシウムの影響を比較するために使用。０．１８４ｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏを水に溶かし、１０ｍｌとしてから、シリンジで０．２２μｍフィルターに通して滅菌状態とする。

（５）１０％ （ｗ／ｖ） ＰＯｓ−Ｎａ水溶液
１．０ｇ ＰＯｓ−Ｎａ（王子コーンスターチ株式会社製）を水８ｍｌに溶かし、ハンディタイプのｐＨメーター（ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ Ｂ−７１１，堀場製作所）を用いて１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した。それを、１０ｍｌにメスアップしてから、１０ｍｌシリンジ（テルモ（株））で０．２０μｍ フィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ， Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｆｒｅｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＵＳ）に通して滅菌状態とする。

（６）１０％ （ｗ／ｖ） ＰＯｓ−Ｍｇ水溶液
１．０ｇ ＰＯｓ−Ｍｇ（王子コーンスターチ株式会社製、５．６％（ｗ／ｗ）マグネシウム含有）を水８ｍｌに溶かし、ハンディタイプのｐＨメーター（ＬＡＱＵＡｔｗｉｎ Ｂ−７１１，堀場製作所）を用いて１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した。それを、１０ｍｌにメスアップしてから、１０ｍｌシリンジ（テルモ（株））で０．２０μｍ フィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ， Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｆｒｅｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＵＳ）に通して滅菌状態とする。

（７）４．４５％（ｗ／ｖ）ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ水溶液
１０％ＰＯｓ−Ｍｇと同量のマグネシウム含有の水溶液。マグネシウムの影響を比較するために使用。０．４４５ｇのＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを水に溶かし、１０ｍｌとしてから、シリンジで０．２２μｍフィルターに通して滅菌状態とする。

（８）１２．９％（ｗ／ｖ） Ｇ１Ｐ−Ｃａ水溶液
グルコース−１−リン酸水溶液に水酸化カルシウムを加えて中和・乾燥させ、カルシウム含量が３．８％（ｗ／ｗ）の塩を作製した。それを０．１２９ｇ定量し、９ｍｌの水に溶かした。その水溶液についてハンディタイプのｐＨメーターを用いて１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した。それを、１０ｍｌにメスアップしてから、１０ｍｌシリンジ（テルモ（株））で０．２０μｍフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ， Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｆｒｅｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＵＳ）に通して滅菌状態とする。

（９）ヒト毛乳頭細胞
ヒト毛乳頭細胞はＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社（Ｇｅｒｍａｎｙ）の販売する株（Ｌｏｔ． ３０９２５０４．１２）を使用した。特記した場合を除き、毛乳頭細胞専用培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を用いてＣＯ_２インキュベーターにおいて、３７℃で培養した。細胞の継代は５０００〜１００００ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２でコート無しのディッシュに播いて、サブコンフルエントになったらトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０３％）で処理をして剥離と再播種をおこなった。トリプシン−ＥＤＴＡ処理は３７℃で１０分弱インキュベートすると完全に剥がれ、生着率は高い。培地交換はおよそ３日に１回行った。

（実施例１：カルシウム種の異なる物質の細胞増殖率の比較）
本実施例では、カルシウム種の異なる物質の細胞増殖率の比較を行った。具体的な手順を以下に示す。

（１）９６ウェルコラーゲンＩコートプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ９６−ｗｅｌｌ ｃｌｅａｒ ｐｌａｔｅ）に１．６×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにヒト毛乳頭細胞をまき、３７℃で２４時間培養した。プレート上の２ウェルはブランク用に細胞をまかなかった。

（２）表の組成の溶液を１０％（ｗ／ｖ）ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標），１．８４％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ水溶液、又は１２．９％（ｗ／ｖ）Ｇ１Ｐ−Ｃａ水溶液から作製した。

（３）上記水溶液と専用培地を１：９に混合することにより、それぞれ、表１の１／１０の濃度を終濃度とする各カルシウム種について５通りの濃度の培地を作製した。表１の各列は同じカルシウム濃度となる。

（４）（２）のプレートから培地を除いた後で（３）の培地に置き換えた。各濃度の各培地について、５ウェル（５サンプル）試験区を設けた。また、対照として、水と専用培地を１：９で混合して作製した培地で５ウェルを置き換えた。

（５）上記プレートを３７℃で３日間培養した。

（６）各ウェルにＰｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ）を同量の専用培地で希釈して作製した溶液を２０μｌずつ加え、３０分呈色反応させた。

（７）蛍光マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈ ２．４，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳ）で、各ウェルの４４０ ｎｍの吸光度を測定した。

（８）サンプルのウェルの吸光度からブランクウェルの吸光度を差し引いた値を各ウェルのサンプルの相対細胞量の値とした。対照培地の相対細胞量の平均値で各ウェルの相対細胞量の値を割ることで、対照に対する細胞増殖度を算出した。

（×は倍数を示す）
（結果）
図１Ａに結果を示す。グラフで示すように０．２５％を添加した時に最大の増殖率を示し、塩化カルシウムおよびコントロールと比較して毛乳頭細胞が有意により多く増殖していた（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）はコントロールに対して６６．０％の増加に対して塩化カルシウムはコントロールに対して５．６％の増加）。また、実施した濃度範囲である、０．０６２５％、０．１２％、０．２５％、０．５％、１．０％のいずれにおいても、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）では塩化カルシウム（それぞれ、０．０１１５％、０．０２３％、０．０４６％、０．０９２％および０．１８４％（これらは、それぞれがカルシウム量としては同一になる計算である。））に比べていずれの濃度でも高い増殖率を示した。特に、０．０１１５％および０．０２３％では、塩化カルシウムは減少傾向を示すのに対して、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）では、対応する０．０６２５％および０．１２％でも増加傾向がみられた。塩化カルシウムでも増加傾向が見られた０．０９２％および０．１８４％についても、対応する濃度のＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）（０．５％および１．０％）では、５０％増から2倍以上の増加の程度を示した。

(実施例２：カルシウム種の異なる物質の細胞増殖率の比較実験（２）)
１．実施例１の（１）、（３）〜（５）は上記と同様に実施した。下表の組成の溶液を１０％（ｗ／ｖ）ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標），１２．９％（ｗ／ｖ）Ｇ１Ｐ−Ｃａ、１．８４％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ水溶液、１０％（ｗ／ｖ）ＰＯｓ−Ｎａ又は水溶液から作製した。

２．実施例１の条件（（６）、（７）および（８））の代わりに各ウェルにＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−Ｆ（同仁化学研究所）をマニュアルに従って用い、細胞数を計測した。

３．(結果) ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）は図１Ｂ〜１Ｄのように、０．２倍を超える濃度で有意に毛乳頭細胞数を増加させた。Ｇ１Ｐ−Ｃａも同様の傾向を示し、０．６〜０．８倍で有意に細胞数が増加した。ＰＯｓ−ＮａとＣａＣｌ_２を組み合わせた場合も同様の傾向を示し、０．１〜０．８倍まで有意に細胞数が増加した。また、いずれも、全ての濃度で何も加えなかった場合より細胞数は増加していた。よって、望ましくは０．６〜０．８倍の濃度を含むことで、毛乳頭細胞の増殖を促進させる効果が期待できる。

一方、図１Ｅに示すように、ＣａＣｌ_２単独又はＰＯｓ−Ｎａ単独では、何も加えない場合と比べて細胞数の増加は見られなかった。よって、酸性糖成分とカルシウム成分の両方が、毛乳頭細胞の増殖に必須の構成であることが示された。

（実施例３：育毛効果および発毛効果に関連する種々の遺伝子の発現）
次に、本実施例では、種々の遺伝子の発現が本発明の成分によってどのように変化するかを調べた。

使用したものは、ＣＳＰＧ４、Ｗｎｔ５ａ、ＡＬＰＬ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−７およびネガティブコントロールとしてのＶＥＧＦＢである。

なお、各遺伝子については、Ｗｎｔ５ａの促進により毛乳頭細胞アポトーシス抑制が示される。ＶＥＧＦの発現により毛包血管新生が示される。ＦＧＦ−７の発現により毛母細胞増殖促進が示される。ＡＬＰＬおよびＶｅｒｓｉｃａｎの促進により毛乳頭細胞の活性が促進されていることが示される。Ｖｅｒｓｉｃａｎは毛乳頭細胞特異的細胞外基質である。Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃの発現により成長期毛包の促進が示される。ＣＳＰＧ４の増加により成長期毛包の促進が示される。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎは広く存在する細胞外基質であり毛乳頭細胞等の促進が期待される。これらの遺伝子の発現上昇により、毛乳頭細胞が毛成長期の機能を発揮して、毛成長を促進する。通常のカルシウム剤を与えた時に発現が上昇するＶＥＧＦＢは、発現抑制される場合に育毛または発毛効果が示されることになる。

（材料および方法）
（１）４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの毛乳頭細胞を懸濁した５００μｌの専用培地をＴｙｐｅ Ｉコラーゲンコート２４ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分注し、１．０×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の細胞密度から３７℃で４２時間培養した。
（２）（ａ）水（ｃｏｎｔｒｏｌ）、および（ｂ）２．５％（ｗ／ｖ）ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）、（ｃ）０．４５７％ ＣａＣｌ_２（（ｂ）と同じカルシウム量）、の水溶液を作製した。（ａ）〜（ｃ）の溶液とＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を１：９で混合した。
（３）（１）の各ウェルから培地を吸引除去し、１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，８．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４，２．６８ｍＭ ＫＣｌ，１．４７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７．４），和光純薬）１ｍｌを加えて吸引除去することでウェルを洗浄し、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅを５００μｌ加え、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、５時間インキュベートした。コントロール、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）、ＣａＣｌ_２それぞれについて６ウェル（６サンプル）を実験サンプルとした。
（４）各ウェルから培地を除いた後、ＣｅｌｌＡｍｐ Ｄｉｒｅｃｔ ＲＮＡ ｐｒｅｐ ｋｉｔ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｋａｒａ）でｍＲＮＡ抽出を行った。方法は該キットのマニュアルに従った。
（５）抽出されたｍＲＮＡ溶液 （各ウェル２００μｌ）のうち、８μｌを用いてＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｔａｋａｒａ）で４０μｌスケールで逆転写反応し、ｃＤＮＡを得た。反応条件は該キットのマニュアルに従った。
（６）各ｃＤＮＡ溶液を水で２倍に希釈し、そのうち０．５μｌと、表２に示す各遺伝子のプライマー１およびプライマー２を各々４μＭ含む溶液を１μｌ、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔａｋａｒａ）を５μｌ、水を３．５μｌ加え、各遺伝子について定量ＰＣＲを行った。装置はＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（ＢＩＯ−ＲＡＤ， ＵＳＡ）を用い、９５℃で３０秒の変性処理の後、９５℃５秒、６２℃２０秒の２ステップサイクルを６５サイクル行なわせ、各サイクル後の蛍光強度を測定した。
（７）リファレンス遺伝子としてＰＧＫ１とＧＡＰＤＨを使用し、ＣＦＸ９６Ｔｏｕｃｈに付属の解析ソフト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ ３．０）で発現量比較解析を行った。相対的な発現量の算出はソフトウェアのデフォルトの条件で行った。
（８）得られた発現量を各条件で処理した細胞由来の６サンプルについて平均値を求め、コントロールに対する発現量とした。

（結果）
結果を図２に示す。ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）処理をした場合には、ＣＳＰＧ４、Ｗｎｔ５ａ、ＡＬＰＬ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−７遺伝子でコントロール及びＣａＣｌ_２処理よりも遺伝子発現が促進していた。特にＣＳＰＧ４、Ｗｎｔ５ａ、ＡＬＰＬ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＶＥＧＦ遺伝子については、Ｄｕｎｎｅｔｔの方法による多重比較検定（ｎ＝６）でコントロールに比べて有意に遺伝子発現が上昇していた。塩化カルシウムではこのような有意な発現の上昇は見られず、ＶｅｒｓｉｃａｎおよびＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ遺伝子についてはコントロールよりも有意に発現量が低下するというＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）とは逆の効果が見られた。

一方、ＶＥＧＦＢについては、塩化カルシウムでコントロールと比較して有意に発現が上昇するのに対し、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）では逆に有意に発現が抑えられていた。

Ｗｎｔ５ａの促進によりＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）の毛乳頭細胞アポトーシス抑制が示される。ＶＥＧＦの発現により毛包血管新生が示される。ＦＧＦ−７の発現によりＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）の毛母細胞増殖促進が示される。ＡＬＰＬおよびＶｅｒｓｉｃａｎの促進によりＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）の毛乳頭細胞の活性の促進が示される。Ｖｅｒｓｉｃａｎは毛乳頭細胞特異的細胞外基質である。Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃの発現によりＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）の成長期毛包の促進が示される。ＣＳＰＧ４の増加によりＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）の成長期毛包の促進が示される。Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎは広く存在する細胞外基質でありＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）による毛乳頭細胞等の促進が期待される。これらの遺伝子の発現上昇により、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）が毛乳頭細胞に対して毛成長期の機能を発揮させ、毛成長を促進する効果があることが理解される。ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）のは、通常のカルシウム剤を与えた時に発現が上昇するＶＥＧＦＢについて、発現抑制する効果があることから、この点でも毛成長を促進する効果があることが理解される。

（実施例４：ミノキシジルとの比較実験）
次に、本実施例では、実施例３と同様の実験を、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）と既存の発毛剤であるミノキシジルとの比較実験を行った。

（材料および方法）
実施例３の（２）を以下のように変更した以外は実施例３と同様の実験を行った。
（２）（ａ）水（ｃｏｎｔｒｏｌ）、および（ｂ）２．５％（ｗ／ｖ）ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）の水溶液、（ｄ）５００μＭ ミノキシジルの水溶液（終濃度５０μＭ）および（ｅ）２．５％（ｗ／ｖ） ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標），５００μＭ ミノキシジル（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）終濃度０．２５％、ミノキシジル終濃度５０μＭ）の水溶液を作製した。（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）の溶液とＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を１：９で混合した。ミノキシジル濃度はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ１１７，１５９４−１６００ （２００１）の結果を参考に、毛乳頭細胞に影響を与えることが確認された濃度として選択した。

（結果）
結果を図３に示す。ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）処理をした場合には、Ｗｎｔ５ａ、ＡＬＰＬ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＦＧＦ−７遺伝子について、Ｔｕｋｅｙの方法による多重比較検定（ｎ＝６）でミノキシジル処理に比べて有意に発現が向上した。ミノキシジルはその作用機序が不明な点があるが、これと比べて、以下の点で本発明のＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）の効果が異なることが理解され、ミノキシジルの効果を補完し得ることが理解される。
・Ｗｎｔ５ａについて、Ｔｕｋｅｙの方法による多重比較検定（ｎ＝６）でコントロールに比べて有意差の有無で検討すると、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）では顕著に効果があるのに対してミノキシジルではほとんど効果がないという顕著な相違があることから、本発明はミノキシジルにない毛乳頭細胞アポトーシス抑制効果を有すること、および併用により補完し得ることが理解される。
・ＶＥＧＦ、ＴｅｎａｓｃｉｎおよびＣＳＰＧ４は、Ｔｕｋｅｙの方法による多重比較検定（ｎ＝６）でコントロールに比べて有意差の有無で検討すると、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）では顕著に効果があるのに対してミノキシジルではほとんど効果がないという顕著な相違があることから、本発明はミノキシジルにない毛包促進の効果があることが期待されること、および併用により補完し得ることが理解される。
・ＦＧＦ−７については、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）の効果がミノキシジルよりも優れていることから、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）が毛母細胞増殖促進に優れていることが理解され、本発明はミノキシジルにない毛母細胞増殖促進の効果があることが期待されること、および併用により補完し得ることが理解される。
・ＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎおよびＶＥＧＦＢについても、Ｔｕｋｅｙの方法による多重比較検定（ｎ＝６）でコントロールに比べて有意差の有無で検討すると、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）では統計学的有意な効果がみられるのに対してミノキシジルでは見られないことから、ミノキシジルにない育毛または発毛効果がＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）によって提供されることが期待されること、および併用により補完し得ることが理解される。

（実施例５：アデノシンとの組み合わせ試験）
次に、本実施例では、実施例３と同様の実験を、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）と既存の育毛成分であるアデノシンとの比較実験を行った。

（材料および方法）
実施例３の（２）を以下のように変更した以外は実施例３と同様の実験を行った。
（２）（ａ）水（ｃｏｎｔｒｏｌ）、および（ｂ）２．５％（ｗ／ｖ）ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）の水溶液、（ｄ）５００μＭ アデノシンの水溶液（終濃度５０μＭ）および（ｅ）２．５％（ｗ／ｖ） ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標），５００μＭ アデノシン（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）終濃度０．２５％、アデノシン終濃度５０μＭ）の水溶液を作製した。（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）の溶液とＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を１：９で混合した。アデノシン濃度はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ１１７， １５９４−１６００ （２００１）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １２７， １３１８-１３２５（２００７）の結果を参考に、毛乳頭細胞に影響を与えることが確認された濃度として選択した。

（結果）
結果を図４Ａおよび図４Ｂに示す。ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）とアデノシンを組み合わせて処理をした場合には、ＦＧＦ−７およびＣＳＰＧ４でＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）単独やアデノシン単独で処理をした場合に比べて相乗的に発現量が増大した。Ｗｎｔ５ａ、ＡＬＰＬ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＣＳＰＧ４、Ｔｅｎｎａｓｃｉｎ遺伝子について、Ｄｕｎｎｅｔｔの方法による多重比較検定（ｎ＝８）で無処理に比べて有意に発現が向上した。いずれもＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）単独又はミノキシジル単独の処理と比較して、それぞれの効果を合わせたような発現量となっていた。アデノシンは細胞膜上のアデノシン受容体であるＡ１ＲやＡ２Ｒに結合し、細胞内のカルシウム濃度とｃＡＭＰを増加させることで、毛成長関連因子の発現に影響を与えることが示唆されている （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ１１７， １５９４−１６００ （２００１）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １２７， １３１８-１３２５（２００７））。本発明のＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）が細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇に寄与している可能性も考えられる。

（実施例６：他の酸性化糖アルカリ土類金属塩）
次に、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）に加えそれ以外の酸性化等アルカリ土類金属塩について、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ−７の発現率比較を行い、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）以外のアルカリ土類金属塩でも同様の毛乳頭細胞増殖活性化効果、育毛および発毛効果が期待されることを実証した。

（材料および方法）
（１） ２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの毛乳頭細胞を懸濁した５００μｌの専用培地をＴｙｐｅ Ｉコラーゲンコート２４ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分注し、５×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の細胞密度から３７℃で７２時間培養した。
（２）（ａ）水（ｃｏｎｔｒｏｌ）、（ｂ）２．５％（ｗ／ｖ）ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）、（ｃ）０．４５７％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ_２、（ｄ）３．２３％（ｗ／ｖ）Ｇ１Ｐ−Ｃａ、（ｅ）２．５％リン酸化オリゴ糖ナトリウム塩（ＰＯｓ−Ｎａ、王子コーンスターチ株式会社）、（ｆ）２．５％（ｗ／ｖ）リン酸化オリゴ糖マグネシウム塩（ＰＯｓ−Ｍｇ、王子コーンスターチ株式会社）、（ｇ）０．４５７％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ_２・２．５％（ｗ／ｖ）マルトトリオース（林原）、（ｈ）１．１９％（ｗ／ｖ）ラクトビオン酸ナトリウム塩・０．４５７％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ_２の水溶液を作製した。なお（ｂ）〜（ｈ）のカルシウム濃度は等しい。
（３）（ａ）〜（ｃ）の溶液とＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を１：９で混合した。
（４）実施例２の（４）〜（６）と同様にして細胞からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを調製してからＶＥＧＦ、ＦＧＦ−７、ＧＡＰＤＨ遺伝子について定量ＰＣＲで発現量を定量した。
（７）リファレンス遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用し、ＣＦＸ９６Ｔｏｕｃｈに付属の解析ソフト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ３．０）で発現量比較解析を行った。発現量の算出はソフトウェアのデフォルトの条件で行った。
（８）定量ＰＣＲ測定を４回繰り返して平均値を求め、コントロールの発現量で割った値を発現率とした。

（結果）
ＶＥＧＦおよびＦＧＦ−７の発現率比較を表に示す。（ｃ）塩化カルシウム及び（ｇ）塩化カルシウムにリン酸基を含まないオリゴ糖であるマルトトリオースを混合したもの、及びリン酸化オリゴ糖のアルカリ金属塩であるＰＯｓ−Ｎａについては、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ−７の遺伝子発現量はコントロールと同等か下回る値を示すのに対し、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）と同様に糖リン酸化物のカルシウム塩である（ｄ）Ｇ１Ｐ−Ｃａ、酸性糖誘導体のカルシウム塩である（ｈ）ラクトビオン酸カルシウムはＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）と同様にＶＥＧＦおよびＦＧＦ−７の発現量を上昇させた。また、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）と同様にリン酸化オリゴ糖のアルカリ土類金属の塩であるＰＯｓ−Ｍｇも両遺伝子に対して発現上昇効果をもっていた。

以上の結果から、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）以外の酸性糖アルカリ土類金属塩一般で、毛乳頭細胞増殖促進効果、育毛効果および発毛効果があることが理解される。特に、ＰＯｓ−ＭｇはＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）に準じる効果があることが期待され、ラクトビオン酸カルシウムもまた、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）に準じる効果があることが期待される。しかしながら、予備的実験ながら、対比実験を行ったところ、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）がＰＯｓ−Ｍｇやラクトビオン酸カルシウムよりも高い毛乳頭細胞増殖促進効果、育毛効果および発毛効果があることが分かり、好ましい実施形態では、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）が有利であることが分かった。

（実施例７：マグネシウムとの組み合わせの場合の遺伝子発現変動）
次に、本実施例では、マグネシウムとの組み合わせの場合の遺伝子発現変動を確認した。以下に詳細を示す。

（材料および方法）
実施例３の（１）（２）を以下のように変更した以外は実施例３と同様の実験を行った。

ＰＯｓ−ＭｇとＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏについて、マグネシウムイオンの量を揃えた場合の毛乳頭細胞におけるＶＥＧＦ、ＦＧＦ７およびＷｎｔ５ａの発現率比較を行い、酸性糖とマグネシウムの組み合わせによる効果を実証した。

（材料および方法）
（１） ４×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの毛乳頭細胞を懸濁した５００μｌの専用培地をＴｙｐｅ Ｉコラーゲンコート２４ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分注し、１×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の細胞密度から３７℃で４８時間培養した。
（２）（ａ）水（ｃｏｎｔｒｏｌ）、および（ｂ）２．５％（ｗ／ｖ）ＰＯｓ−Ｍｇの水溶液、（c）１．１１％（ｗ／ｖ）ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏの水溶液を作製した。（ａ）、（ｂ）、（および（c）の溶液とＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を１：９で混合した。

（結果）
リン酸化オリゴ糖マグネシウム塩（ＰＯｓ−Ｍｇ）についてはＦＧＦ７、ＷＮＴ５Ａで通常のマグネシウムでは見られなかった有意差のある発現増加がみられた。ただし、ＶＥＧＦはＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）ほどの活性化が見られなかったが（図５）、依然として増加の傾向を示した。したがって、マグネシウム塩もまた、本発明において利用可能であると理解される。

（実施例８：ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）と一般的育毛成分とを組み合わせた場合の遺伝子発現変動）
般的に化粧品や医薬部外品の育毛剤で用いられるセンブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウムをＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）とともに添加したときの効果を、それぞれの成分のみを添加した時と比較検証した。

（材料）
（１）グリチルリチン酸二カリウムは和光純薬（生化学用）を水で希釈して２０%（ｗ／ｖ）とし、１０ｍｌシリンジ（テルモ（株））で０．２０μｍ フィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ， Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｆｒｅｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＵＳ）に通して滅菌状態としたものを適宜滅菌水で希釈して用いた。
（２）トコフェロール酢酸エステルは、和光純薬の酢酸（±）α−トコフェロール（一級）を、パントテニルエチルエーテルはSanta Cruz Biotechnology社のDL-pantothenyl ethyl etherを、それぞれエタノールで５倍希釈して２０％(ｖ／ｖ)とし、それを適宜滅菌水で希釈して用いた。
（３）センブリエキスとして有限会社センケン社製の水-エタノール溶液を100%（ｖ／ｖ）のエキスとして、適宜滅菌水で希釈して用いた。

（方法）
（１） ２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの毛乳頭細胞を懸濁した５００μｌの専用培地をＴｙｐｅ Ｉコラーゲンコート２４ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分注し、５×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の細胞密度から３７℃で９６時間培養し、サブコンフルエントとした。
（２）以下の表の組成の溶液を作製し、それぞれをＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）と１：９で混合した。

（３）（ａ）〜（ｉ）を含む各DMEM溶液について培養するウェルの数は２とし、ＦＧＦ７、ＶＥＧＦについて実施例３の（３）〜（８）と同様に発現量を解析し、２ウェルの平均値を比較した。

（結果）
化粧品や医薬部外品の育毛剤で用いられることの多いセンブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウムについては、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）との相乗的な効果を発揮するものはなかった（図６）。

（実施例９：製剤）
本発明の実施例として、育毛剤の例を示す。
（１）製剤例１
ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標） １．０ ｇ
（他の成分）
ポリビニルアルコール ０．５ｇ
グリチルリチン酸二カリウム ０．１ｇ
蒸留水 加えて１００ｍｌにする
合計 １００ｍｌ
以上の材料は、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）については、王子コーンスターチ株式会社から入手可能であり、ポリビニルアルコールは大阪有機化学工業株式会社、ＢＡＳＦ社から、グリチルリチン酸二カリウムは丸善製薬株式会社から入手可能である。
（２）製剤例２
ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標） １．０ ｇ
（他の成分）
エタノール ５％
ポリビニルアルコール ０．５ｇ
グリチルリチン酸二カリウム ０．１ｇ
ｌ−メントール ０．３％
センブリエキス (センブリ抽出リキッドET) １．０％
パントテニルエチルエーテル １％
人参エキス (ニンジン抽出液) １．０％
酢酸トコフェロール １００ｍｇ
蒸留水 加えて１００ｍｌにする
合計 １００ｍｌ
以上の材料は、ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標）については、王子コーンスターチ株式会社から入手可能であり、パントテニルエチルエーテルはＤＳＭニュートリションジャパン株式会社から、酢酸トコフェロールは岩瀬コスファ株式会社から、他は丸善製薬株式会社から入手可能である。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、特願2014-235352に対して優先権主張をするものであり、その内容はあたかもすべてが本願の一部を構成するようにその全体が参考として援用される。

化粧品(育毛剤、シャンプー、整髪料)、医薬品、ペット用育毛剤、リン酸化糖カルシウムそのものの育毛用途での供給が可能である。

配列番号１：Fibronectin プライマー１（フォワード）：CCCATCAGCAGGAACACCTT
配列番号２：Fibronectin プライマー２（リバース） ：GGCTCACTGCAAAGACTTTGAA
配列番号３：CSPG4 プライマー１（フォワード） ：AGCTAGCCAGGACTGATGGA
配列番号４：CSPG4 プライマー２（リバース） ：CAGCCTAACCTGCTCCAAAG
配列番号５：Tenascin Cプライマー１（フォワード）：AGGGACCACTGGGTGAGAGA
配列番号６：Tenascin Cプライマー２（リバース）：GGGCTGGTTGTATTGATGCTTT
配列番号７：Versicanプライマー１（フォワード）：CAAGCATCCTGTCTCACGAA
配列番号８：Versicanプライマー２（リバース） ：CAACGGAAGTCATGCTCAAA
配列番号９：ALPL プライマー１（フォワード） ：GACCCTTGACCCCCACAAT
配列番号１０：ALPL プライマー２（リバース） ：GCTCGACTGCATGTCCCCT
配列番号１１：Wnt5aプライマー１（フォワード） ：AGGGCTCCTACGAGAGTGCT
配列番号１２：Wnt5aプライマー２（リバース） ：GACACCCCATGGCACTTG
配列番号１３：VEGF プライマー１（フォワード） ：CTACCTCCACCATGCCAAGT
配列番号１４：VEGF プライマー２（リバース） ：AGCTGCGCTGATAGACATCC
配列番号１５：VEGFB プライマー１（フォワード）：GCAGATCCTCATGATCCGGT
配列番号１６：VEGFB プライマー２（リバース） ：GGCTTCACAGCACTGTCCTT
配列番号１７：FGF-7プライマー１（フォワード）：TGTCGAACACAGTGGTACCTG
配列番号１８：FGF-7プライマー２（リバース） ：CCCTTTGATTGCCACAATTC
配列番号１９：PGK1プライマー１（フォワード） ：AGGGAAAAGATGCTTCTGGG
配列番号２０：PGK1プライマー２（リバース） ： AAGTGAAGCTCGGAAAGCTTCTAT
配列番号２１：GAPDHプライマー１（フォワード）：ACAGTCAGCCGCATCTTCTT
配列番号２２：GAPDHプライマー２（リバース） ：ACGACCAAATCCGTTGACTC

Claims (24)

1. アルカリ土類金属および酸性糖の組合せを含む、毛乳頭細胞の増殖活性化剤。
2. 前記酸性糖はリン酸化糖およびラクトビオン酸からなる群より選択される、請求項１に記載の増殖活性化剤。
3. 前記酸性糖はリン酸化糖である、請求項１に記載の増殖活性化剤。
4. 前記アルカリ土類金属は、カルシウムまたはマグネシウムである、請求項１に記載の増殖活性化剤。
5. 前記アルカリ土類金属は、カルシウムである、請求項１に記載の増殖活性化剤。
6. 前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、ラクトビオン酸カルシウム塩、グルコース−１−リン酸カルシウム塩（Ｇ１Ｐ−Ｃａ）、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））、リン酸化オリゴ糖マグネシウム塩（ＰＯｓ−Ｍｇ）である、請求項１に記載の増殖活性化剤。
7. 前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））であるかまたは混合するとリン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ）となる成分である、請求項１に記載の増殖活性化剤。
8. 前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、リン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））である、請求項１に記載の増殖活性化剤。
9. 前記アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、混合するとリン酸化オリゴ糖カルシウム塩（ＰＯｓ−Ｃａ（登録商標））となる成分であり、塩化カルシウムとリン酸ナトリウムとを含む、請求項１に記載の増殖活性化剤。
10. アルカリ土類金属および酸性糖の組合せは、酸性糖アルカリ土類金属塩、または酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩もしくは酸性糖と酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩との組み合わせによって提供される、請求項１に記載の増殖活性化剤。
11. 前記酸性糖のアルカリ土類金属以外の塩は酸性糖アルカリ金属塩である、請求項１０に記載の増殖活性化剤。
12. 前記酸性糖アルカリ土類金属塩以外のアルカリ土類金属塩は、水溶性アルカリ土類金属塩である、請求項１０または１１に記載の増殖活性化剤。
13. さらに毛母細胞も増殖促進させるためのものである、請求項１に記載の増殖活性化剤。
14. さらに毛包も増殖促進させるためのものである、請求項１に記載の増殖活性化剤。
15. さらに毛母細胞および毛包も増殖促進させるためのものである、請求項１に記載の増殖活性化剤。
16. アルカリ土類金属および酸性糖の組合せを含む、育毛剤。
17. 前記育毛剤は、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進および発毛促進からなる群より選択される少なくとも１つのためのものである、請求項１６に記載の育毛剤。
18. アルカリ土類金属および酸性糖の組合せを含む、発毛剤。
19. さらに、他の有効成分を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の毛乳頭細胞増殖剤、請求項１６または１７に記載の育毛剤、または請求項１８に記載の発毛剤。
20. 前記有効成分はミノキシジルまたはアデノシンを含む、請求項１９に記載の剤。
21. 前記有効成分はミノキシジル、センブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウムおよびアデノシンからなる群より選択される少なくとも一つを含む、請求項１９に記載の剤。
22. 前記有効成分はアデノシンを含む、請求項１９に記載の剤。
23. 毛乳頭細胞の増殖活性化のためのアルカリ土類金属を含む酸性糖。
24. 毛乳頭細胞の増殖活性化のための方法であって、該方法は、該増殖活性化を必要とする被験体に対して有効量のアルカリ土類金属および酸性糖の組合せならびに薬学的に許容し得るキャリアを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。