WO2007037486A1 - 毛包真皮毛根鞘細胞の培養法 - Google Patents

毛包真皮毛根鞘細胞の培養法 Download PDF

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WO2007037486A1
WO2007037486A1 PCT/JP2006/319728 JP2006319728W WO2007037486A1 WO 2007037486 A1 WO2007037486 A1 WO 2007037486A1 JP 2006319728 W JP2006319728 W JP 2006319728W WO 2007037486 A1 WO2007037486 A1 WO 2007037486A1
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WO
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hair
cell
dermal
pdgf
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PCT/JP2006/319728
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Koei Toyoshima
Mikaru Matsunaga
Katsutoshi Yoshizato
Original Assignee
Phoenixbio Co., Ltd.
Biointegrence Inc.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0627—Hair cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing hair follicular dermal sheath cells. More specifically, the present invention relates to a culture method capable of growing hair follicular dermal hair sheath cells while maintaining their functions. More specifically, the present invention relates to a culture method capable of differentiating and proliferating hair follicle dermal hair sheath precursor cells into dermal hair root sheath cells.
  • Hair follicles which are tissues that produce hair, are formed at a time during the fetal period by the interaction of a special mesenchyme called the dermis clump and the epidermis.
  • the cells that make up the dermal conglomerate become the hair papilla when hair follicle formation is complete.
  • the hair papilla is also deeply involved in the progression of the hair cycle, which is the cycle of hair elongation.
  • this epidermis-papillary (mesenchymal) interaction must be performed in vivo.
  • the present inventors transplanted the epidermis / hair papilla mixed cells into the skin as a means of causing hair to grow on the fur-free skin, whereby the human hair papilla cells separated the epidermal cells into hair follicles, and this hair Wrapping power Invented a method for hair growth and has already filed a patent application (Patent Document 1).
  • papilla cells separated and cultured from rat pupae can be subcultured for a long time by adding the primary culture supernatant of rat sole epidermal cells to the medium, and can be subcultured for a long time. It has been reported that the dermal papilla cells retain the ability to induce hair follicle formation (Non-patent Document 1 and Patent Document 2). However, the present inventors have found that rat pupa-derived hair papilla cells grown by long-term subculture (approximately 40 passages or more) by the method described in Patent Document 2 retain the ability to induce hair follicle formation!
  • the dermal root sheath is a single-layered tissue that wraps the outermost layer of the hair follicle!
  • the dermal cell layer (positive for vimentin), distributed in the lower 1/3 of the hair follicle, It is defined as consisting of smooth muscle type ⁇ -actin ( ⁇ -SMA) positive cells.
  • This dermal root sheath is histologically continuous with the dermal papilla at the lowest end of the hair bulb.
  • the rat hair follicle is cut up and down, and the hair follicle dermal follicle sheath cell is embedded in the upper part of the follicle and transplanted to reconstruct the hair bulb including the hair follicle derived from the hair follicle dermal follicle sheath cell. And elongation of the hair shaft is observed.
  • the progenitor cells of hair papilla cells are distributed in the hair follicle dermal sheath, which is considered to be a cell supply source to the hair papilla (Non-patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 it has been reported that when primary cultured rat hair follicle dermal follicular sheath cells are allograft transplanted directly under hairless skin epidermis of rat auricles, hair follicle formation is induced from auricular epidermis and leads to hair growth.
  • Non-Patent Document 5 hair follicle dermal root sheath cells contain progenitor cells of dermal papilla cells and can be used as a source thereof.
  • Non-patent Documents 6 and 7, Patent Document 3 cultured dermal follicular dermal sheath cells derived from rabbits were transplanted to the back of nude mice in combination with cells prepared from the outer follicular root sheath, and normal skin was formed.
  • the formation of the epidermis of bell-shaped artificial skin made up of human cells and collagen gel was compared between human foreskin-derived fibroblasts and hair-derived hair follicle dermal root sheath cells.
  • the sheath cells formed a thicker epidermis layer.
  • dermal root sheath cells have the ability to differentiate into fibroblasts that form good dermis as well as dermal papilla!
  • the hair follicle dermal root sheath cells can be used as a qualitative improvement in hair follicle regeneration, a supply source of dermal papilla cells, and a fibroblast of artificial skin.
  • it since it has a function of promoting hair shaft elongation, it can be said to have extremely high utility value in the development of pharmaceuticals for hair restorers and alopecia treatments targeting hair follicle dermal root sheath cells.
  • the human hair follicle dermal sheath is a minute tissue that surrounds the hair follicle with almost one layer of cells, and the number of cells obtained is extremely small.
  • the hair follicle dermis in the primary culture The root sheath cell growth rate is extremely slow.
  • the risk of contamination with mold is extremely high, and it is difficult to secure the number of cells that can be used for treatment and drug development. Therefore, a culture method is desired in which primary culture is performed at a growth rate that is as fast as possible from a very small amount of hair follicle dermal root sheath tissue, and then a sufficient number of cells that maintain a certain function can be secured.
  • Non-patent Document 5 Hair follicle-induced hair growth is recognized in rat follicular dermal root sheath cells that have been cultured for the first time to date, but this is significant for cells grown by subculture using existing culture techniques. Hair follicle-induced hair growth ability and hair follicle dermal root sheath formation ability were recognized (Non-patent Document 5).
  • PDGF-AA a subtype of platelet-derived growth factor (PDGF)
  • PDGF-BB a subtype of platelet-derived growth factor
  • PDGF-BB cannot promote the proliferation activity specific to hair papilla cells. Also, the function of these grown cultured dermal papilla cells is not clearly shown.
  • the present inventors have made it possible to grow hair papilla cells that maintain the ability to induce hair follicle formation using the method described in Patent Document 2. However, in the same method, hair follicle dermal root sheath cells are difficult to grow in culture.
  • rat follicle-derived hair follicle true The hair follicle sheath cells proliferate sufficiently in the medium supplemented with FGF2, and this cultured rat follicular dermal follicle sheath cell does not have the ability to induce hair growth by itself. Indicated. However, human hair-derived hair follicle dermal follicle sheath cells can be obtained using FGF2-added medium.
  • hair follicle dermal root sheath cells are a powerful cell material for hair regeneration and the like by cell transplantation.
  • these hair follicle dermal root sheath cells are satisfactory in a state in which their functions are maintained. There was no means to grow them.
  • the presence of progenitor cells of dermal root sheath cells has not been reported so far.
  • a new progenitor cell of the dermal root sheath is found, and this is a high culture method that can proliferate while maintaining high proliferation activity and ability to distribute to the dermal root sheath and dermal papilla cells. It is obvious that it has applicability and utility value.
  • Patent document 1 International publication pamphlet of PCT / JP2004 / 018421
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 7-274950
  • Patent Document 3 Japanese Translation of Special Publication 2002-507132
  • Patent Document 2 Weinberg WC et al. Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells. J. invest. Dermatol, 100, 229-236, 1993
  • Non-Patent Document 3 Horne KA and Jahoda CAB, Restoraction of hair growth by surgical i mplantation of follicular dermal sheath.Development 116, 563-571, 1992
  • Non-Patent Document 4 Reynolds AJ et al, Trans-gender induction of hair follicles. Nature, 40 2, 33-34, 1999
  • Non-Patent Document 5 McElwee KJ et al, Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla. J. invest. Dermatol, 121, 1267-1275, 2003
  • Non-Patent Document 6 Jahoda CAB and Reynolds AJ, Hair follicle dermal sheath cells: unsun g participants in wound healing. Lancet, 358, 1445-1448, 2001
  • Non-Special Reference 7 Gharzi A et al, Plasticity of hair follicle dermal cells in wound healing and induction. Exp Dermatol, 12, 126-136, 2003
  • Non-Special Reference 8 Goodman LV and Ledbetter SR, Secretion of stromelysin by cultured dermal papilla cells: differential regulation by growth factors and functional role in mi togen— induced cell proliferation. J. Cellular Physiol, 151, 41—49, 1992
  • Jonoda 10 Jahoda CAB et al, Smooth muscle a -actin is a marker for hair follicl e dermis in vivo and in vitro. J. Cell Science, 99, 627-636, 1991
  • Non-Special Review 12 Oliver RF, Histological studies of whisker regeneration in the hoode d rat. J. Embryol. Exp. Morph., Vol. 16, 2, 231-244, October 1966
  • Non-Special Reference 13 Oliver RF, Ectopic regeneration of wniskers in the hooded rat from i mplantea lengths of vibrissa follicle wall. J. Embryol. Exp. Morph., Vol. 17, 1, 27—34, February 19b / '
  • stem cells or progenitor cells with pluripotency can be differentiated into specific cell types and can be differentiated by culture into transiently proliferating cells (TA cells) that have high proliferative potential. If it can be controlled, target cells can be efficiently procured from a smaller amount of tissues and cells.
  • the hair follicle dermal root sheath cells are a powerful cell material for hair regeneration and the like by cell transplantation.
  • the hair follicle dermal root sheath cells maintain their functions. There was no means to grow well in the state. Furthermore, the presence of progenitor cells of dermal root sheath cells has not been reported so far. However, a new progenitor cell of the dermal sheath is found, and a culture method that can proliferate while maintaining high proliferative activity and ability to distribute to the dermal sheath and dermal papilla cells is a very high application. It has sex and utility value.
  • An object of the present invention is to provide a method for culturing cells that can not only proliferate the hair follicle dermal sheath and its progenitor cells but also maintain or sort out specific functions. That is.
  • the present invention is a culture method for proliferating hair follicular dermal root sheath cells in a state in which the function is maintained, and comprises platelet-derived growth factor AA (PDGF-AA) and fibroblast growth factor 2 (FGF2). It is a culture method characterized by culturing hair follicular dermal sheath cells in an added animal cell culture medium.
  • PDGF-AA platelet-derived growth factor AA
  • FGF2 fibroblast growth factor 2
  • One preferred embodiment of the invention is a method of using cells derived from the lower follicular dermis root sheath as the follicular dermis root sheath cells.
  • Another embodiment of the invention is a method of using Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM10) containing 1% to 30% serum as a medium for animal cells.
  • DMEM10 Dulbecco's modified Eagle medium
  • Yet another embodiment of the invention is a method of culturing hair follicular dermal hair sheath cells together with other hair follicle-forming cells.
  • the present invention is also a method for differentiating and proliferating hair follicular dermal sheath precursor cells into dermal root sheath cells, comprising platelet-derived growth factor AA (PDGF-AA) and fibroblast growth factor.
  • PDGF-AA platelet-derived growth factor AA
  • fibroblast growth factor AA
  • a culture method comprising culturing hair follicle dermal sheath precursor cells in an animal cell medium supplemented with (FGF2).
  • One aspect of the invention is a method of using cells derived from the lower follicular dermal sheath as the follicular dermal sheath precursor cells.
  • Another embodiment of the invention is a method of using Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM10) containing 1% to 30% serum as a medium for animal cells.
  • DMEM10 Dulbecco's modified Eagle medium
  • the present invention relates to dermal root sheath cells by culturing in a medium for animal cells supplemented with platelet-derived growth factor AA (PDGF-AA) and fibroblast growth factor 2 (FGF2). Hair follicle dermal root sheath progenitor cells that can be.
  • PDGF-AA platelet-derived growth factor AA
  • FGF2 fibroblast growth factor 2
  • the ⁇ function '' that is maintained when culturing hair follicle dermal sheath cells is cultured is the function as a source of hair papilla cells, the function of inducing the formation of hair follicles with hair growth ability, or when skin transplantation is performed. It means the function of forming the epidermis.
  • “Proliferation" of hair follicular dermal sheath cells means that the number of cells initially subjected to culture increases by more than 3 times, preferably more than 10 times, more preferably more than 100 times.
  • “culture” in the present invention means “primary culture” in which hair follicular dermal sheath cells isolated from the skin are cultured, and cells grown in this primary culture are separated from the medium, and a new medium is used. Includes “passaging” to continue culturing.
  • DS Dermatal root sheath
  • H-SMA anti-smooth muscle ⁇ -actin
  • the dermal root sheath cell is a progenitor of the dermal papilla cell because it has the ability to divide the dermal root sheath less than 1/3 below the follicle into the dermal papilla and induce regeneration of the hair bulb. It is considered. However, no cells fit this definition during the resting period of the hair cycle.
  • Upper dermal root sheath is a site newly defined by the present invention. Tissue consisting of a few layers of dermal cells (vimentin positive) that wraps the outermost layer of the hair follicle, distributed over the ORS bulge region and its upper part, and negative for anti- ⁇ -SMA antibody Cell power of. Histological observations appear to be continuous with the cell layer defined as the dermal root sheath. It has been reported that upper DS does not have the ability to induce dermal papilla regeneration and hair bulb regeneration (Non-patent Documents 12 and 13). In the case of rats, it is obtained by cutting above the site where the napped muscle is attached and below the sinus. For humans, cut at half the total length of the hair follicle.
  • “Lower dermal follicle sheath (lower DS)” defines a DS according to a known definition as a lower DS with respect to the newly defined “upper DS”. The definition of marker and distribution is the same as that of the dermal root sheath.
  • the "hair bulb” is the bulging portion at the lower end of the hair follicle. Contains hair papilla, dermal sheath, and hair matrix cells It is. The dermal root sheath and the dermal papilla are connected at the lowest end of the hair bulb. The lower DS distributed in the region of the hair bulb is called the Dermal Sheath Cup (DSC).
  • DSC Dermal Sheath Cup
  • “Hair follicle formation induction” refers to a phenomenon in which hair papilla cells induce epidermal cells to form a hair follicle structure.
  • the method of the present invention makes it possible to proliferate a large amount of hair follicle dermal sheath cells useful as transplanted cells for hair regeneration and the like while maintaining their functions.
  • the method of the present invention is also effective for growing other hair follicle-forming cells (for example, hair papilla cells) while maintaining their functions (for example, equivalent to the method of Patent Document 2).
  • hair follicular dermal sheath cells and dermal papilla cells that are both useful as transplanted cells for hair regeneration and the like can be proliferated well while maintaining their respective functions.
  • a novel hair follicle dermal root sheath progenitor cell having the ability to separate hair follicle dermal hair sheath cells, and differentiation and proliferation of the precursor cells into hair follicle dermal hair sheath cells A culture method is provided.
  • a culture method is provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of human hair.
  • the slightly swollen portion at the lower end of the hair follicle is called the hair bulb portion.
  • the hair bulb has a hair matrix (HM) composed of epidermal cells and a hair papilla (DP) composed of dermal cells surrounded by the hair matrix.
  • the dermal papilla is the dermal papilla (PS) at the lowest end of the hair bulb, and is connected to the dermal root sheath (DS) of the dermal cells that surround the outermost layer of the hair follicle.
  • PS dermal papilla
  • DS dermal root sheath
  • DS and DP cells express vimentin, a marker for dermal cells.
  • DS has been the lower part of hair follicle 1/2 (A 1/2) and has been defined to be positive for anti-smooth muscle type aActin (a_SMA) antibody distributed below the bulge region.
  • a_SMA anti-smooth muscle type aActin
  • the hair follicle upper half is distributed so as to surround the bulge region (BG), and anti- ⁇ -SMA antibody negative and vimentin positive cells are defined as upper DS cells, and are distributed in the lower half for convenience.
  • Anti-oc-SMA antibody positive and vimentin positive cells were defined as lower DS cells.
  • the DP and lower DS separate the hair bulb from the follicle, remove the hair matrix (HM) and outer root sheath (ORS), and then use the ophthalmic scalpel to position the dermal papilla (PS).
  • the DP and the lower hair follicle DS were prepared separately.
  • the hair follicle is cut up and down at the position of arrow A, and the ORS and hair shaft (HS) including the upper DS and bulge (BG) are separated from the top of the hair follicle using an enzyme treatment and a microscopic insulator under a microscope. Obtained.
  • FIG. 3 shows the results of primary and subculture of lower DS cells derived from human hair.
  • the lower DS was separated from the human hair follicle and subjected to primary culture under the medium conditions described in Table 1. Two independent cultures were performed independently from two different volunteer hairs. As a result, the lower human DS had a success rate of adhesion and colony formation of 50% to 90% with DMEM10 and CM5. In contrast, PDGF-AA / FGF2 was over 90%. In PDGF-AA / FGF, cell migration and proliferation after adhesion were observed earliest. (A) The number of cells that formed colonies, migrated and proliferated under each culture condition was counted by image analysis.
  • CM5 (DMEM PDGF-AA / FGF2 shows a higher value when compared with the number of proliferating cells in the medium supplemented with FGF2 (1.8 times) or PDGF-AA (1.9 times) alone. It was. From these results, PDGF-AA / FGF2 was significantly higher than the growth activity of PDGF-AA or FGF2 alone (** p ⁇ 0.01 vs. CM5: * p ⁇ 0.05 vs. FGF2, PDGF -AA).
  • FIG. 4 Microscopic images of primary and subcultured human head hair-derived lower DS cells.
  • PDGF-AA / FGF2 maintained its small, spindle-shaped cell morphology until the 1st passage, but it gradually changed to a flat shape with stress fibers indicating cell aging.
  • DMEM10 had a flat shape with stress fibers already in the first passage (DMEM10).
  • the effectiveness of PDGF-AA / FGF2 was also demonstrated in terms of cell morphology. Bar, 200 ⁇ m.
  • FIG. 5 shows the results of functional analysis of lower DS cells derived from human hair.
  • a cell transplantation experiment was conducted to confirm the function of hair follicle hair bulb DS cells cultured in a PDGF-AA / FGF2-containing medium.
  • High-passage rat ⁇ ⁇ DP cells that lost DS-forming ability by long-term subculture were combined with human head hair follicle bulb DS cells (Table 2) and transplanted to the back of nude mice.
  • a photo of the hair growth at the cell transplant site inside the dotted circle
  • biopsy were performed.
  • Biopsy tissues were fixed in formalin and embedded in paraffin, serial sections with a thickness of 5 m were prepared, and HE staining and immunostaining with anti-a-SMA antibody were performed.
  • B As a result of histological observation of the high-passage rat DP cell transplantation group, a hair shaft was formed! A dull, incomplete hair follicle (dotted line part) was observed (H & E staining).
  • C In these hair follicles, anti- ⁇ -SMA antibody positive DS was not confirmed.
  • Vascular endothelial cells can be clearly distinguished from DS because they contain anti- ⁇ -SMA antibody-positive force luminal structures and blood cells (arrows).
  • FIG. 8 shows the results of primary and subculture of human hair-derived DP cells.
  • Lower DP was isolated from normal scalp hair follicles provided by male volunteers, and primary culture was performed for 14 days under the medium conditions described in Table 1. The number of proliferating cells that adhered and formed colonies was counted by image processing, and the number of proliferating cells per DP was compared.
  • (A) PDGF-AA / FGF2 showed the same high growth activity as CM5. It was also shown to be significantly higher than DMEMIO, FGF2, PDGF-AA (*** p 0.05 vs.
  • DMEMIO, FGF2, PDGF-AA) 0 (B) Primary cultured human DP cells Were subcultured every 7 days, and the average cell doubling time (PDT) of each passage was compared for each medium condition. As a result, PDGF-AA / FGF2 all showed higher proliferative activity than DMEM10 until the fourth passage. However, in subculture with PDGF-AA / FGF2, the PDT value tended to increase gradually depending on the passage number, whereas CM5 tended to decrease gradually.
  • EGFP EGFP
  • E Hoechst nuclear staining
  • G upper DS-derived cells
  • F high-passage DP cells
  • Arrows are red blood cells that fluoresce when excited by G and B. Bars in A, 1 mm, in B, 100 ⁇ m and in E, 50 ⁇ m.
  • the FGF2 and PDGF-AA added to the medium in the method of the present invention are preferably derived from the same animal species from which the cells to be cultured are derived.
  • FGF2 and PDGF-AA are preferably derived from human.
  • recombinants obtained by known methods and those produced from blood.
  • Commercially available products can be used for human-derived FGF2 and PDGF-AA (for example, human FGF2 is manufactured by UPSTATE, human-derived PDGF-AA is manufactured by R & D Systems, etc.).
  • the medium may be a known animal cell medium such as Alpha-MEM (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), ATCC-CRCM 30 (ATCC), Coon's modified F12 (SIGMA, etc.), DM-160 and DM-201.
  • Alpha-MEM Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • ATCC-CRCM 30 ATCC
  • Coon's modified F12 SIGMA, etc.
  • DM-160 DM-201.
  • DMEM Ham's F12 mixed medium (1: 1) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), DMEM: RPMI1640 mixed medium (1: 1) ), Eagles basal medium (BME) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), Eagle's Minimum Essentia 1 Medium (EMEM) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), EMEM: RPMI1640 mixed medium (1: 1), ES medium (Nissui) Pharmaceutical Co., Ltd.), Fischer's Medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Ham's F10 (Dainippon Pharmaceutical Co.,
  • the amount of FGF2 added to these animal cell culture media is 0.5 to 20 ng / ml, preferably 2 to 20 ng / ml, and the amount of PDGF-AA added is 0.5 to 20 ng. / ml, preferably about 2 to 20 ng / ml.
  • the hair follicle dermal root sheath to be cultured preferably includes a hair bulb. It is also positive for anti-a-SMA antibodies. Head hair, eyelashes, and body hair are preferred. Force capable of simultaneously culturing hair follicular dermal sheath cells and other hair follicle-forming cells In this case, the hair follicle-forming cells are preferably hair papilla. The hair papilla cells are also preferably derived from hair, eyelashes, and body hair.
  • the hair follicle dermal sheath precursor cells can be prepared from the hair follicle upper half, for example. This preferably includes a region in contact with the bulge. It is also anti- ⁇ -SMA antibody negative. Furthermore, hair, eyelashes, and body hair are preferred.
  • the culture time in the method for culturing hair follicular dermal sheath cells of the present invention is not particular limitation.
  • the cells are cultured continuously or subcultured until they grow to an isolated hair follicle dermal hair sheath cell strength of 3 times or more, preferably 10 times or more, more preferably 100 times or more.
  • the precursor cells are cultured for, for example, 500 hours or more, preferably 600 hours or more until they differentiate into hair follicle dermal sheath cells.
  • the progenitor cells were separated into hair follicular dermal sheath cells because the combination of high-passage rat ⁇ ⁇ DP cells that lost DS-forming ability after long-term subculture and cultured progenitor cells combined with the dorsal part of the nude mouse. This can be confirmed by mixing and transplanting to form lower DS and DP.
  • the hair bulb was cut and separated from the lower 1/2 follicle.
  • the dermal sheath (DS) and dermal papilla (DP) of the hair bulb are separated into a lump and separated from epidermal components such as the collagen sheath and hair matrix. It was.
  • DS and DP were separated with a micro knife at the connecting part located at the lowest end of the hair bulb (FIG. 1, arrow B line part was cut).
  • the upper half of the hair follicle contains 1000 units / ml dispase (manufactured by Sankyo Junyaku Kogyo) (DMEM1 OHEPES) at 37 ° C for 10 minutes, treated with dispase, and washed well with DMEM10HEPES.
  • the upper hair follicle DS was separated with a micro insulator.
  • Skin was provided and collected from the posterior hairs of healthy 34 and 46 year old male volunteers.
  • the collected volunteer scalp skin was divided according to the flow of hair follicles, and further separated into blocks containing skin and subcutaneous tissue for each follicular unit using a scalpel.
  • This FU block was treated with 1000 units / ml dispase (DMEM10HEPES) at 37 ° C for 10 minutes. After treatment with despase, it was thoroughly washed with DMEM10HEPES, and FU was separated from the skin and subcutaneous, and stored in 4 ° CDMEM1 OHEPES until use. Thereafter, the lower DS and DP were separated from the lower half hair follicle and the upper DS was separated from the upper half, as in 1-1-1.
  • DMEM10HEPES 1000 units / ml dispase
  • the separated hair bulb DS, upper DS and DP from human volunteer scalp were seeded one by one in a primary 24-well cell culture plate (Pecton Dickinson).
  • Human hair bulb DS cells and DP cells were primary cultured for 2 weeks using 5 types of medium (Table 1) based on DMEM10, and the medium was changed once every 4 days.
  • Human recombinants were used for FGF2 (UPSTATE) and PDGF-AA (R & D SYSTEMS). After the primary culture, subculture was performed every 7 days.
  • Human hair follicle DS is 3 weeks each for DMEM10 and PDMEM-AA / FGF2-added DMEM10 Primary culture was performed, and the medium was changed once every 4 days. On day 21 of primary culture, the cells were detached by enzyme treatment, and the number of cells was counted. Subculture was performed every 7 days after the primary culture. Similarly, hair bulb DS, upper DS and DP derived from rat pupae were seeded one tissue at a time in a primary 24-well cell culture plate. Hair bulb DS cells and DP cells were cultured in primary culture medium for 2 weeks using 5 types of medium (Table 1) based on DMEM10, and the medium was changed once every 4 days. Subculture was performed every 7 days after the primary culture.
  • the upper DS of hair follicles was primary cultured for 2 weeks in DMEM10 supplemented with PDGF-AA / F GF2, and the medium was changed once every 4 days. On day 14 of primary culture, the cells were detached by enzyme treatment and the number of cells was counted. Subculture was performed every 7 days after the primary culture.
  • the method for calculating the total number of cells obtained up to passage 1 and 3 is as follows.
  • Epidermal cells with hair-growth differentiation ability were prepared from the skin of 2 day old Wistar rat neonates. Newborn Wistar rats were sacrificed by anesthesia with jetyl ether, and the front and rear limbs and tail were excised, leaving only the trunk. The trunk skin was peeled off, sterilized with isodine and 70% ethanol, washed with PBS, and stored at 4 ° C until use. Under a sterile environment, the subcutaneous tissue attached to the newborn skin was removed with a microscissor using a stereomicroscope. All steps below this were performed aseptically in a clean bench or in a sterile instrument.
  • the skin tissue was cut into strips having a width of about 3 mm and a length of about 10 mm, and was treated with a dispase solution dissolved in DMEM10 at 4 ° C for 4 ° C so as to be 1000 units / ml.
  • the skin tissue treated with despase was thoroughly washed with cold PBS (-) to separate the epidermis and dermis.
  • the separated epidermis was minced with a scalpel and treated with a 0.25% trypsin EDTA solution at 37 ° C for 10 minutes to obtain a suspended cell suspension.
  • the cell suspension was passed through 100 ⁇ m and 40 ⁇ m mesh size filters to remove agglomerates that adhered to multiple cells.
  • Transplantation example 1 Transplantation example 2
  • Transplantation example 3 Rat newborn origin Fresh 1 x 10 "1 X 10 6
  • DS and DP were isolated from the rat eyelash follicle bulb (Fig. 1), and were cultured primarily under the culture conditions of Method 1-2. Three to five days after the start of primary culture, the tissue adhered to the culture dish, and cell colony formation, cell proliferation and migration were observed. In the 2-week primary culture, the number of cells grown under each culture condition was counted by image analysis. As a result, the number of proliferating cells of rat lower DS cells in PDGF-AA / FGF2 was about 8.5 times that of DMEM10 (* p ⁇ 0.05, Fig. 2A).
  • PDGF-AA / FGF2 was the highest among the medium conditions compared (* p ⁇ 0.05 vs. CM5: ** p ⁇ 0.01 vs. FGF2).
  • the lower DS and DP were separated from the human hair follicle bulb (Fig. 1), and the primary culture was performed under the culture conditions of Method 1-2, and the cell growth rate and subculture in the primary culture under each medium condition were considered. The number of cells obtained was compared.
  • the lower DS cells initially cultured under the PDGF-AA / FGF2 and DMEM10 medium conditions were subcultured under the same medium conditions (7 days / passage), and the average cells in each passage were subcultured for each medium condition.
  • Double cocoon time (PDT) was compared.
  • PDGF-AA / FGF2 showed a higher growth rate than DMEM10 at all the passages measured.
  • the growth rate gradually decreased after the third passage (Fig. 3B).
  • the first passage (p l ) Showed a flat shape with stress fibers (Fig. 4, DMEM10), and the effectiveness of PDGF-AA / FGF2 was also demonstrated in terms of cell morphology.
  • Rat sputum-derived DP cells grown by long-term subculture using the method described in Patent Document 2 retain the ability to induce hair follicle formation, but the hair growth ability decreases from the hair follicles induced to form. Lost (Patent Document 1).
  • the present inventors restored the hair growth-inducing ability by reducing the hair growth-inducing ability by adding a certain amount of DS cells to DP cells whose hair growth ability was reduced by long-term subculture. It has been found that the growth of hair generated by the enveloping force is significantly promoted (Patent Document 1).
  • the lower DS cell force cultured with PDGF-AA / FGF2 of the present invention retains this function, the following experiment was conducted.
  • the DS cells contain DP cell progenitor cells, and the DP cells differentiated and proliferated from the DS cells are supplied to the hair papilla via the hair papilla pattern from the lowest end of the hair bulb. Histologically, it is connected with the dermal papilla at the lowest end of the hair bulb. When DS and DP are separated from the tissue, they are separated as a single connection.
  • the present inventors restored a reduced hair growth-inducing ability by adding a certain amount of hair follicle dermal root sheath cell cells to the hair papilla cells whose hair growth ability was reduced by long-term subculture, and generation of hair follicle force was generated.
  • Patent Document 1 DS cells and DP cells, which are close in terms of cytoanalysis and structure, can be cultured under the same conditions, the method is very high and has utility value!
  • PDGF-AA / FGF2 medium can be used for the culture of rat sputum-derived DP cells. Verified. As a result, PDGF-AA / FGF2 medium showed significantly higher growth activity than DMEM10 ( Figure 5, * p ⁇ 0.001 vs. DMEM10). O Previously filed DP cell growth medium (CM5) ( Non-patent document 1 and patent document 2) showed the same proliferation activity.
  • rat DP cells that were initially cultured under each medium condition of PDGF-AA / FGF2, CM5, and DMEM10 were subcultured under the same medium conditions (7 days / passage).
  • the mean cell doubling time (PDT) in each generation was compared (Fig. 8-B).
  • PDGF-AA / F GF2 had a faster growth rate than the other conditions until the second passage, but after the third passage, the PDT value increased and became slower than CM5 (Fig. 8-B).
  • PDGF-AA / FGF 2 was 1.4 times that of CM5 (approximately 70 times that of DMEM10).
  • CM5 approximately 70 times that of DMEM10
  • PDGF-AA / FGF2 was found to be effective for DP culture because PDGF-AA / FGF2-containing medium was as high and proliferative as CM5. . This indicates that DS cells and DP cells can be cultured simultaneously under the same conditions. Note that. In Table 4, passage cultures after passage 1 were seeded to give 6.6xl0 4 cells / 6 cm dish.
  • the entire medium was changed on the 4th day, and the passage was performed on the 7th day. From the number of cells collected at each passage, using the method of 1-2, comparing the DMEM10 to 1 through the 3rd passage, the total number of cells obtained by the 3rd passage is 1.4 times more than CM5, 70 times Met. Although these results were different from those of human DS, the highest growth activity was observed in PDGF-AA / FGF2-containing media against both human DS / DP cells.
  • DS is defined as a tissue that wraps outside the hair follicle and consists of dermal cells that are positive for anti-oc-SMA antibodies.
  • anti- ⁇ -SMA antibody-positive DS cells disappear in the rest period of the hair cycle, it is assumed that precursor cells of DS cells exist.
  • Upper DS was isolated from rat eyelash follicles by the method described in 1-1, and cultured in PDGF-AA / FGF2 medium, which was effective for culturing DS cells.
  • the primary cell culture that grew slower than DS cells in the hair bulb took 21 days.
  • the number of proliferating cells was twice that of DMEM10.
  • a rapid growth rate of around 40 hours was maintained up to the 4th passage, but thereafter the PDT value increased (Fig. 9).
  • 2-4-2 Upper DS cells derived from human hair
  • the upper DS was separated from the human hair follicle by the method described in 1-1, and primary culture and subculture were performed with PDGF-AA / FGF2.
  • PDGF-AA / FGF2 showed 2.2 times the proliferation activity compared to DMEM10, as in the rat results.
  • PDGF-AA / FGF2 was about 2.2 times that of DMEM10 (Table 5).
  • Table 5 passage cultures after passage 1 were seeded so as to be 6.6xl0 4 cells / 6 cm dish. The entire medium was changed on the 4th day, and the passage was performed on the 7th day. From the number of cells collected at each passage, the total number of cells obtained until passage 1 was determined using the method 1-2. Comparing DMEM10 as 1, the total number of cells obtained by passage 1 was 2.2 times.
  • the upper DS cells are progenitors of lower DS and DP cells
  • the upper DS cells should be able to be separated into lower DS and DP cells when cells are transplanted using Method 1-3. Therefore, we decided to verify that the upper DS contains precursor cells of lower DS cells and DP cells.
  • DP cells were found to have no anti- ⁇ -SMA antibody-positive cells in the outermost layer of the hair follicle (Fig. 5-B).
  • transplanted DS cells are derived from EGFP-Tg. Rats, serial sections of anti-ex-SMA antibody-positive hair follicles were immunostained with GFP fluorescence stem and anti-EGFP antibodies, and derived from upper transplanted DS cells. Verified. As a result, it was clarified that the lower DS of the hair follicles whose hair growth ability was restored by the addition of the upper DS cells expressed EGFP (FIG. 10-D). Furthermore, EGFP-expressing cells were observed in a part of DP in the same experimental group (Fig. 10-E, F, G).
  • the tissue derived from the upper DS cells used in the experiments described above is a tissue that is negative for anti- ⁇ -SMA antibodies in vivo!
  • the upper DS cells are the lower DS cells.
  • DP cells do not share. For this reason, it has so far been thought that the upper DS does not contain lower DS and DP cell progenitors.
  • rat upper DS cells cultured according to the present invention were divided into lower DS and DP and had a function of restoring hair growth. From this result, it was shown that the upper DS cells are progenitor cells capable of separating the lower DS and DP cells.
  • the present invention not only proliferates the lower DS cells while maintaining the function, but also cultures and proliferates cells having functions equivalent to those of the lower DS cells from the progenitor cells contained in the upper DS. It was possible.
  • the culture method according to the present invention can also be said to be a method for controlling and proliferating a poorly differentiated DS precursor cell that does not express a differentiation marker.

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Abstract

　細胞移植による毛髪再生等のための有力な細胞材料である毛包真皮毛根鞘細胞およびその前駆細胞の培養方法を提供する。すなわち、血小板由来増殖因子AA（PDGF-AA）および線維芽細胞増殖因子2（FGF2）を添加した動物細胞用培地で培養することによって、毛包真皮毛根鞘細胞をその機能を維持した状態で増殖させ、また、毛包真皮毛根鞘前駆細胞を真皮毛根鞘細胞へと分化、増殖させる。

Description

明 細 書
毛包真皮毛根鞘細胞の培養法
技術分野
[0001] 本発明は、毛包真皮毛根鞘細胞の培養方法に関するものである。さらに詳しくは、 本発明は、毛包真皮毛根鞘細胞を、その機能を維持させた状態で増殖させることの できる培養方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、毛包真皮毛根鞘前 駆細胞を、真皮毛根鞘細胞へと分化、増殖させることのできる培養方法に関するもの である。
背景技術
[0002] 毛髪を作り出す組織である毛包は、真皮集塊と呼ばれる特殊な間充織と表皮との 相互作用によって胎児期の一時期に形成される。真皮集塊を構成する細胞は毛包 形成が完了すると毛乳頭となる。毛乳頭は毛髪の伸長'休止の周期である毛周期の 進行にも深く関与している。細胞移植により毛包を形成誘導するには、この表皮-毛 乳頭 (間充織)相互作用を生体内で行わなければならない。本発明者らは、無毛皮 膚に発毛させる手段として、皮膚内に表皮 ·毛乳頭混合細胞を移植することにより、ヒ ト毛乳頭細胞が表皮細胞を毛包に分ィ匕さ、この毛包力 発毛させる方法を発明し、 既に特許出願している (特許文献 1)。
[0003] また、ラット頰髭より分離培養された毛乳頭細胞が、その培地にラット足裏表皮細胞 初代培養上清を添加することで長期継代培養することができ、かつ長期間継代培養 した毛乳頭細胞が毛包形成誘導能を保持して 、ることを報告して 、る（非特許文献 1 、特許文献 2)。ただし本発明者らは、特許文献 2に記載された方法で長期継代培養 (およそ 40継代以上）により増殖させたラット頰髭由来毛乳頭細胞は毛包形成誘導能 を保持して!/ヽるが、形成誘導した毛包から発毛能が減弱し失われることを示して!/ヽる (特許文献 1)。この問題点を解決する方法として、本発明者らは、長期継代培養によ り発毛能が減弱した毛乳頭細胞に毛包真皮毛根鞘細胞細胞を一定量添加すること で、減弱した発毛誘導能を回復させ、毛包から発生した毛の成長が顕著に促進され ることを可能とし、既に特許出願している（特許文献 1)。 [0004] 真皮毛根鞘は、毛包の最外層を包む一層な!/、し数層の真皮性細胞層（ビメンチン 陽性)よりなる組織であり、毛包の下部 1/3以下に分布し、かつ平滑筋型 αァクチン（ α -SMA)陽性細胞よりなると定義されている。この真皮毛根鞘は、組織学的に毛球 部最下端において毛乳頭と連続している。さらにラット頰髭毛包を上下に切断し、毛 包上部に毛球部の毛包真皮毛根鞘細胞を埋め込み移植すると、毛包真皮毛根鞘細 胞由来の毛乳頭を含む毛球部が再構築され、毛幹の伸長が観察される。これらの事 実より、毛包真皮毛根鞘に毛乳頭細胞の前駆細胞が分布しており、毛乳頭への細胞 供給源であると考えられて ヽる (非特許文献 3)。
[0005] これらの知見より、男性の毛包真皮毛根鞘を女性の前腕部皮膚に他家移植したと ころ、移植した真皮毛根鞘由来の毛乳頭を含む毛包が形成誘導され、発毛すること が報告された (非特許文献 4)。さらに、初代培養ラット毛包真皮毛根鞘細胞をラット 耳介の無毛皮膚表皮直下に同種移植すると、耳介表皮より毛包が形成誘導され発 毛に至ることが報告されている (非特許文献 5)。これらの事から、毛包真皮毛根鞘細 胞は、毛乳頭細胞の前駆細胞を含み、その供給源として利用可能である。
[0006] さらに毛包真皮毛根鞘細胞は毛乳頭細胞の供給源としてだけでなぐ創傷治癒材 料として有望であることが報告されている (非特許文献 6、 7、特許文献 3)。ラットを用 いた実験で、頰髭由来の培養毛包真皮毛根鞘細胞を毛包外毛根鞘より調製した細 胞と組み合わせてヌードマウス背部へ移植したところ、正常な皮膚が形成された。ま た、ヒト細胞とコラーゲンゲルカゝらなるベル型人工皮膚の表皮形成を、ヒト包皮由来線 維芽細胞と頭髪由来毛包真皮毛根鞘細胞とで比較した結果、明らかに毛包真皮毛 根鞘細胞の方が厚い表皮層を形成した。このことより、真皮毛根鞘細胞は、毛乳頭の みならず良好な真皮を形成する線維芽細胞への分化能を有して!/ヽると!ヽえる。
[0007] 以上のように毛包真皮毛根鞘細胞は、毛包再生における質的向上，毛乳頭細胞供 給源 ·人工皮膚の繊維芽細胞として利用できる。また、毛幹の伸長を促進する機能を 有することから毛包真皮毛根鞘細胞をターゲットとした育毛剤や脱毛症治療薬など への医薬品開発においても極めて高い利用価値を有するといえる。しかし、ヒトの毛 包真皮毛根鞘は、毛包をほぼ一層の細胞で取り囲む微小な組織であり、得られる細 胞数は極めて少ない。さらに、既存の培養方法では、初代培養における毛包真皮毛 根鞘細胞増殖速度は極めて遅い。一般的に初代培養時における増殖速度が遅い場 合、カビゃ細菌の混入リスクが非常に高くなり、治療や医薬品開発に利用できるほど の細胞数を確保するのが難しくなる。従って、微量な毛包真皮毛根鞘組織より、でき る力ぎり早い増殖速度の初代培養を行い、その後、一定の機能を維持した細胞を数 量的に十分確保できる培養方法が望まれる。しカゝしながら、現在までに初代培養を 行ったラット毛包真皮毛根鞘細胞には毛包誘導発毛能が認められるが、既存の培養 技術による継代培養で増殖させた細胞では有意な毛包誘導発毛能および毛包真皮 毛根鞘形成能は認められて 、な 、 (非特許文献 5)。
[0008] これまで論じた様に、特定の機能を有する細胞を一定の機能を維持しながら培養し 増殖させることで、利用価値の高い細胞を大量に得ることができる。だが分化多能性 を持つ幹細胞または前駆細胞より、特定の細胞種へ分化可能かつ高い増殖能をもつ た細胞へと培養により分ィ匕制御することができれば、同様の結果を得られるばかりか 、より少量の組織および細胞から効率的に目的とする細胞を調達することができる。 しかし、真皮毛根鞘細胞は毛周期の休止期において消失することから、その前駆細 胞の存在が考えられる力 その存在および培養法についてこれまで報告されていな い。
[0009] 一般的に、細胞培養法にお!、ては、培養液に様々な増殖因子を添加して、細胞の 増殖や分化を制御する。真皮毛根鞘細胞は毛乳頭細胞の前駆細胞であると報告さ れており、種々の増殖因子添カ卩による培養法について報告されている。その中で線 維芽細胞増殖因子 2 (FGF2)や表皮細胞培養上清の添加が細胞増殖に有効である という報告がある (非特許文献 1, 9)。また、培養毛乳頭細胞において、血小板由来 増殖因子（PDGF)のサブタイプである PDGF-AAは増殖を促進しな!、が、 PDGF-BB は濃度依存的に促進する。し力し PDGFの両サブタイプは、培養線維芽細胞の増殖 を促進することから、 PDGF-BBは毛乳頭細胞特異的に増殖活性を促進するとは 、え ない。また、これらの増殖した培養毛乳頭細胞の機能についても明確に示されてい ない。本発明者らは、特許文献 2に記載の方法を用いて毛包形成誘導能を維持した 毛乳頭細胞の増殖を可能にしている。しかしながら、同じ方法では毛包真皮毛根鞘 細胞は培養増殖が困難である。特許文献 1の方法において、ラット頰髭由来毛包真 皮毛根鞘細胞は FGF2添加培地により十分に増殖し、この培養ラット毛包真皮毛根鞘 細胞は単独では発毛誘導能を持たないが、毛乳頭細胞への添カ卩により有意な発毛 能を示した。しかしながら、ヒト頭髪由来毛包真皮毛根鞘細胞は FGF2添加培地を用 V、ても十分な細胞増殖が得られて 、な!/、。
以上のとおり、毛包真皮毛根鞘細胞は、細胞移植による毛髪再生等のための有力 な細胞材料であるが、従来は、この毛包真皮毛根鞘細胞を、その機能を維持した状 態で良好に増殖させる手段は存在しな力つた。さらに、真皮毛根鞘細胞の前駆細胞 の存在はこれまで報告されていない。しかし、真皮毛根鞘の前駆細胞を新たに見い だして、これを高 、増殖活性と真皮毛根鞘および毛乳頭細胞への分ィ匕能を保持して 増殖可能な培養法は非常に高 、応用性と利用価値を有することは自明である。 特許文献 1： PCT/JP2004/018421の国際公報パンフレツト
特許文献 2：特開平 7— 274950号公報
特許文献 3：特表 2002-507132号公報
特 §午文献 1 : Inamatsu, M et al, Estaoiishment of rat dermal papilla cell lines that s ustain the potency to induce hair follicles from afollicular s in. J. Invest. Dermatol. I l l, 767-775, 1998
特許文献 2 : Weinberg WC et al. Reconstitution of hair follicle development in vivo ： determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells. J. invest. Dermatol, 100, 229-236, 1993
非特許文献 3 : Horne KA and Jahoda CAB, Restoraction of hair growth by surgical i mplantation of follicular dermal sheath. Development 116, 563—571, 1992 非特許文献 4 : Reynolds AJ et al, Trans-gender induction of hair follicles. Nature, 40 2, 33-34, 1999
非特許文献 5： McElwee KJ et al, Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla. J. invest. Dermatol, 121, 1267-1275, 2003
非特許文献 6 : Jahoda CAB and Reynolds AJ, Hair follicle dermal sheath cells: unsun g participants in wound healing. Lancet, 358, 1445-1448, 2001 非特言午文献 7 : Gharzi A et al, Plasticity of hair follicle dermal cells in wound healing and induction. Exp Dermatol, 12, 126 - 136， 2003
非特言午文献 8 : Goodman LV and Ledbetter SR, Secretion of stromelysin by cultured dermal papilla cells: differential regulation by growth factors and functional role in mi togen— induced cell proliferation. J. Cellular Physiol, 151， 41—49， 1992
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4
特言午文献 10 : Jahoda CAB et al, Smooth muscle a -actin is a marker for hair follicl e dermis in vivo and in vitro. J. Cell Science, 99， 627 - 636， 1991
非特言午文献 11 : A quantitative study of the differential expression of alpha-smooth m uscle actin in cell populations of follicular and non— follicular origin. J. invest. Dermat ol. 101， 577-583, 1993
非特言午文献 12 : Oliver RF, Histological studies of whisker regeneration in the hoode d rat. J. Embryol. exp. Morph., vol. 16， 2, 231-244, October 1966
非特言午文献 13 : Oliver RF, Ectopic regeneration of wniskers in the hooded rat from i mplantea lengths of vibrissa follicle wall. J. Embryol. exp. Morph., vol. 17, 1， 27—34， February 19b /'
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 細胞移植により組織を再生するには、移植細胞が本来持つ機能を維持させたまま 増殖させる必要がある。これは患者力 摘出する組織の量を減少させることになり、 患者の負担が軽減されるためである。またそれと同様に、分化多能性を持つ幹細胞 または前駆細胞より、特定の細胞種へ分化可能であり、かつ高い増殖能をもった一 過性増殖細胞 (TA細胞)へと培養により分ィ匕制御することができれば、より少量の組 織および細胞から効率的に目的とする細胞を調達することができる。
[0012] 毛包真皮毛根鞘細胞は、前記のとおり、細胞移植による毛髪再生等のための有力 な細胞材料であるが、従来は、この毛包真皮毛根鞘細胞を、その機能を維持した状 態で良好に増殖させる手段は存在しな力つた。さらに、真皮毛根鞘細胞の前駆細胞 の存在はこれまで報告されていない。しかし、真皮毛根鞘の前駆細胞を新たに見い だして、これを高 、増殖活性と真皮毛根鞘および毛乳頭細胞への分ィ匕能を保持して 増殖可能な培養法は非常に高い応用性と利用価値を有する。
[0013] 本発明の課題は、毛包真皮毛根鞘およびその前駆細胞を、増殖させるのみならず 、特定の機能を維持または分ィ匕することでその機能を発揮できる細胞の培養方法を 提供することである。
[0014] 本発明は、毛包真皮毛根鞘細胞を、機能を維持した状態で増殖させる培養方法で あって、血小板由来増殖因子 AA(PDGF-AA)および線維芽細胞増殖因子 2 (FGF2) を添加した動物細胞用培地で毛包真皮毛根鞘細胞を培養することを特徴とする培養 方法である。
[0015] 前記発明の一つの好ましい態様は、毛包真皮毛根鞘細胞として毛包下部真皮毛 根鞘由来の細胞を使用する方法である。
[0016] 前記発明の別の態様は、動物細胞用培地として、 1%〜30%血清を含むダルべッ コ改変イーグル培地（DMEM10)を使用する方法である。
[0017] 前記発明のさらに別の態様は、毛包真皮毛根鞘細胞を、他の毛包形成細胞ととも に培養する方法である。
[0018] 本発明はまた、毛包真皮毛根鞘前駆細胞を、真皮毛根鞘細胞へと分化、増殖させ る方法であって、血小板由来増殖因子 AA(PDGF-AA)および線維芽細胞増殖因子
2 (FGF2)を添加した動物細胞用培地で毛包真皮毛根鞘前駆細胞を培養することを 特徴とする培養方法である。
[0019] 前記発明の一つの態様は、毛包真皮毛根鞘前駆細胞として毛包下部真皮毛根鞘 由来の細胞を使用する方法である。
[0020] 前記発明の別の態様は、動物細胞用培地として 1%〜30%血清を含むダルベッコ 改変イーグル培地 (DMEM10)を使用する方法である。
[0021] さらに本発明は、血小板由来増殖因子 AA(PDGF-AA)および線維芽細胞増殖因 子 2 (FGF2)を添加した動物細胞用培地で培養することによって真皮毛根鞘細胞へと 分ィ匕することができる毛包真皮毛根鞘前駆細胞である。 [0022] 用語の定義
毛包真皮毛根鞘細胞を培養した際に維持させるその「機能」とは、毛乳頭細胞供給 源としての機能、発毛能を有する毛包の形成を誘導する機能、あるいは皮膚移植し た際に表皮を形成する機能等を意味する。
[0023] 毛包真皮毛根鞘細胞の「増殖」とは、最初に培養に供した細胞数力 ¾倍以上、好ま しくは 10倍以上、さらに好ましくは 100倍以上に増加することを意味する。さらに、本発 明における「培養」とは、皮膚から単離した毛包真皮毛根鞘細胞を培養する「初代培 養」と、この初代培養で増殖した細胞を培地から分離し、新たな培地で培養を継続す る「継代培養」を含む。
[0024] 「真皮毛根鞘（DS)」は、毛包の最外層を包む一層な!/、し数層の真皮性細胞 (ビメン チン陽性)よりなる組織であり、毛包の下部 1/2以下に分布し、かつ抗平滑筋型 αァ クチン（ひ- SMA)抗体陽性細胞よりなると定義されている。この真皮毛根鞘は、組織 学的に毛球部最下端において毛乳頭と連続している（非特許文献 10、 11)。また、毛 包下部 1/3以下の真皮毛根鞘に毛乳頭へと分ィ匕し、毛球部を再生誘導する能力が あることから、真皮毛根鞘細胞は毛乳頭細胞の前駆細胞であると考えられている。し かし、毛周期の休止期では、この定義に当てはまる細胞は存在しない。
[0025] 「上部真皮毛根鞘（上部 DS)」は、本発明によって新たに定義された部位である。毛 包の最外層を包む一層な ヽし数層の真皮性細胞 (ビメンチン陽性)よりなる組織であ り、 ORSのバルジ領域およびその上部までを裏打ちして分布し、かつ抗 α -SMA抗体 陰性の細胞力 なる。組織学的な観察では、真皮毛根鞘として定義される細胞層と 連続性を持つように見える。上部 DSは、毛乳頭再生および毛球部再生誘導能を持た ないことが報告されている (非特許文献 12、 13)。ラットの場合立毛筋付着部位より上 側で、血洞より下側で切断することで得られる。ヒトの場合は毛包全長の 1/2のところ で切断する。
[0026] 「下部真皮毛根鞘（下部 DS)」は、新たに定義された「上部 DS」に対して、既知の定 義による DSを下部 DSと定義する。マーカーおよび分布などの定義は上記真皮毛根 鞘と同一である。
[0027] 「毛球部」は、毛包下端のふくらんだ部分。毛乳頭、真皮毛根鞘、毛母細胞が含ま れる。毛球部の最下端部で真皮毛根鞘と毛乳頭は接続している。毛球部の領域に 分布する下部 DSは Dermal Sheath Cup (DSC)と呼ばれる。
[0028] 「毛包形成誘導」とは、毛乳頭細胞が表皮性細胞を誘導して毛包構造を形成する 現象をいう。
[0029] 「発毛誘導」とは、毛包の毛母細胞が分ィ匕増殖して毛幹を形成し、体表面より毛幹 を伸長させるために、真皮毛根鞘細胞が毛母または ORSに働きかけている現象であ る。
発明の効果
[0030] 本発明の方法によって、毛髪再生等のための移植細胞として有用な毛包真皮毛根 鞘細胞を、機能を維持させた状態で大量に増殖させることが可能となる。
[0031] また、本発明方法は、他の毛包形成細胞 (例えば毛乳頭細胞)を、その機能を維持 させた状態で増殖させることにも有効であり（例えば、特許文献 2の方法と同等の効 果)、共に毛髪再生等のための移植細胞として有用な毛包真皮毛根鞘細胞と毛乳頭 細胞を、それぞれの機能を維持させた状態で良好に増殖させることが可能である。こ のことは、極めて微細な組織領域に含まれて 、る毛包真皮毛根鞘細胞と毛乳頭細胞 をそれぞれに分離することなぐ共に増殖させた両細胞の混合物を毛髪再生のため の移植に使用することを可能とする。
[0032] さらに本発明によって、毛包真皮毛根鞘細胞への分ィ匕能を有する新規は毛包真皮 毛根鞘前駆細胞と、この前駆細胞を毛包真皮毛根鞘細胞への分化、増殖させること のできる培養方法が提供される。これによつて、例えば、毛髪再生等のための移植細 胞を調製する際に、患者力 分離した毛包組織をより有効利用することが可能となる 図面の簡単な説明
[0033] [図 1]ヒト頭髪模式図である。毛包の下端の若干膨らんだ部分を毛球部という。毛球 部には表皮性細胞よりなる毛母 (HM)と、それに取り囲まれた真皮性細胞よりなる毛 乳頭 (DP)がある。この毛乳頭は毛球部の最下端部の毛乳頭柄 (PS)で、毛包最外層 を取り囲む真皮性細胞の真皮毛根鞘（DS)と連結している。 DSと DP細胞は真皮性細 胞のマーカーであるビメンチンを発現している。またこれまで、 DSは毛包下部 1/2 (A 1/2)でバルジ領域より下方に分布し、抗平滑筋型 a Actin( a _SMA)抗体陽性である と定義されてきた。本発明では毛包上部 1/2でバルジ領域 (BG)を取り囲むように分布 し、抗 α -SMA抗体陰性かつビメンチン陽性細胞を上部 DS細胞と定義し、便宜的に 下部 1/2に分布する抗 oc -SMA抗体陽性かつビメンチン陽性細胞を下部 DS細胞定義 した。本特許において DPと下部 DSは、毛包より毛球部を分離し、毛母 (HM)と外毛根 鞘 (ORS)を除去し、さらに眼科用メスを用いて毛乳頭柄 (PS)の位置で DPと毛包下部 D Sを分離して調製した。また、毛包を矢印 Aの位置で上下に切断し、毛包上部より酵 素処理および顕微鏡下マイクロ鑷子を用いて上部 DSとバルジ (BG)を含む ORSおよび 毛幹 (HS)を分離して得た。
圆 2]ラット頰髭由来下部 DS細胞の初代および継代培養の結果である。ラット頰髭毛 包毛球部より下部 DSを分離し、表 1に記載の培養液を用いて初代培養を行った。プ ラスチック培養皿状に接着し、コロニー形成し遊走増殖した細胞数を、画像解析によ り計数した。（A)PDGF-AA/FGF2で 14日間初代培養増殖したラット DS細胞は、 DME M10と比較して約 8.5倍高い値であった。同様に、 CM5、 FGF2、 PDGF-AA単独添カロ 培地と比較しても PDGF-AA/FGF2が最も高!、値であった。初代培養にお!、て PDGF -AA/FGF2による増殖細胞数は、 PDGF-AAまたは FGF2増殖因子単独添加培地に よるそれより有意に高いことが確認された（* p < 0.05 vs. DMEM10、 CM5 : ** p < 0.0 1 vs. FGF2) 0 (B) 14日間、 PDGF-AA/FGF2により初代培養した下部 DS細胞を継代 培養した。 7日おきに継代し、その間の平均細胞倍カ卩時間（PDT)を算出し、 DMEM10 と比較した。
[図 3]ヒト頭髪由来下部 DS細胞の初代および継代培養の結果である。ヒト頭髪毛包よ り下部 DSを分離し、表 1に記載の培地条件で初代培養した。異なる 2名のボランティ ァ頭髪より独立して 2回の初代培養を行った。その結果、ヒト下部 DSは DMEM10およ び CM5で 50%以上 90%以下の接着およびコロニー形成成功率であった。それに対 して、 PDGF-AA/FGF2では 90%以上であった。また PDGF-AA/FGFでは、接着後の 細胞遊走と増殖が最も早く観察された。（A)各培養条件によりコロニー形成し遊走 ·増 殖した細胞数を、画像解析により計数した。その結果、 PDGF-AA/FGF2によるヒト下 部 DSの増殖細胞数は、 DMEM10の約 14倍であった（* p < 0.05)。また、 CM5 (DMEM 10比で 3.1倍）、 FGF2 (同 1.8倍)または PDGF-AA (同 1.9倍）単独添加培地条件によ る増殖細胞数と比較した場合、 PDGF-AA/FGF2はいずれよりも高い値を示した。こ れらの結果から、 PDGF-AA/FGF2は、 PDGF-AAまたは FGF2単独添カ卩の増殖活性 より有意に高かった（** p< 0.01 vs.CM5 : * p< 0.05 vs. FGF2、 PDGF- AA)。（B)PDG F-AA/FGF2により初代培養したヒト下部 DS細胞を同一培地条件で継代培養し、各 継代における平均細胞倍カ卩時間 (PDT)を計測した。 PDGF-AA/FGF2による継代培 養では第 3継代までは 40時間程度の PDTを維持したが、その後継代数依存的に PDT が増大した。
[図 4]ヒト頭髪由来下部 DS細胞の初代および継代培養の顕微鏡像である。その結果 、PDGF-AA/FGF2の第 1継代力 第 3継代までは小型で紡錘形の細胞形態を維持し ているが、その後徐々に細胞老化を示すストレスファイバーを伴う扁平な形態に変化 した（PDGF_AA/FGF2)。それに対して、 DMEM10では、第第 1継代においてすでに ストレスファイバーを持つ扁平な形態となった（DMEM10)。細胞形態的にも PDGF-A A/FGF2の有効性が示された。 Bar, 200 μ m.
[図 5]ヒト頭髪由来下部 DS細胞の機能解析の結果である。 PDGF-AA/FGF2含有培 地で培養した毛包毛球部 DS細胞の機能を確認する細胞移植実験を行った。長期継 代培養により DS形成能を失った高継代数ラット頰髭 DP細胞にヒト頭髪毛包毛球部 DS 細胞を組み合わせ (表 2)ヌードマウスの背部に移植した。移植 4週間後に細胞移植 部位 (点線円内）における発毛状況の写真撮影および生検を行った。生検組織はホ ルマリン固定およびパラフィン包埋し、厚さ 5 mの連続切片を作成し、 HE染色およ び抗 a -SMA抗体による免疫染色した。（A)高継代ラット DP細胞 (p=40)単独移植群で は,移植細胞による皮膚 (点線円内）は形成されていたが発毛は観察されな力つた。 ( B)高継代ラット DP細胞単独移植群を組織観察した結果、毛幹を形成して!/ヽな 、不完 全な毛包（点線部）が観察された (H&E染色)。（C)これらの毛包では、抗 α -SMA抗体 陽性の DSは確認されなカゝつた。血管内皮細胞は抗 α -SMA抗体陽性である力 管腔 状の構造および血球を内包していることから DSと明確に判別できる（矢印）。
圆 6]図 5と同一条件でのヒト頭髪由来下部 DS細胞の機能解析の結果である。（D)高 継代ラット DP細胞 (p=40)にヒト DS細胞 (p=l)を添加して移植した実験群では明らかに 発毛（点線円内）が観察された。（E)マクロ写真 (C)の点線内組織を生検し、 H&E染色 による観察を行った。その結果、ヒト頭髪由来下部 DS細胞添加群では多数の毛幹形 成を伴う毛包が観察された。（F)さらに、毛包の最外層に抗 α -SMA抗体陽性の細胞 層が観察された (矢頭)。矢印は血管内皮細胞。 HM,毛母； ORS,外毛根鞘； HS,毛幹; P,毛孚 L頭。 Bars in A and D, 1 mm; in B and E, 100 μ m.
圆 7]ラット頰髭由来 DP細胞の初代培養の結果である。ラット頰髭毛包毛球部より DP を分離し、表 1に記載の培養液で 2週間の初代培養を行った。各培養条件によりコロ ニー形成し遊走'増殖した細胞数を、画像解析により計数した。その結果、 PDGF-A A/FGF2は先行特許 (特許文献 2)の DP細胞増殖培地 (CM5)と同等の増殖活性を示 し、 FGF2および PDGF-AA単独よりも高かった。
[図 8]ヒト頭髪由来 DP細胞の初代および継代培養の結果である。男性ボランティアよ り提供された正常頭皮毛包より下部 DPを分離し、表 1に記載された培地条件におい て 14日間初代培養を行った。接着しコロニー形成した増殖細胞数を画像処理により 計数し、一個の DP当たりの増殖細胞数を比較した。（A)PDGF-AA/FGF2は CM5と同 等の高い増殖活性を示した。また、 DMEMIO, FGF2, PDGF-AAと比較しても有意に 高いことが示された（*** pく 0.05 vs. DMEMIO, FGF2, PDGF-AA) 0 (B)初代培養し たヒト DP細胞を、 7日ごとに継代培養し、各継代の平均細胞倍加時間（PDT)を、培地 条件ごとに比較した。その結果、 PDGF-AA/FGF2は第 4継代まで全て DMEM10よりも 高い増殖活性を示した。しかし、 PDGF-AA/FGF2による継代培養では継代数依存 的に徐々に PDT値が増大する傾向であり、それに対して CM5は徐々に減少する傾向 が見られた。
圆 9]ラット頰髭由来上部 DS細胞の継代培養の結果である。ラット頰髭毛包から上部 DSを分離し、 DMEM10および PDGF-AA/FGF2培地で培養した。毛球部 DS細胞に比 ベ増殖が遅ぐ初代培養に 21日要した力 基礎培地 DMEM10に比べ 2倍に細胞が増 殖した。さらに継代培養を行ったところ、 4継代数まで 40時間前後の早い増殖速度を 維持していた力 それ以降は PDT値が増大した。
圆 10]ラット頰髭由来上部 DS細胞の機能解析の結果である。長期継代培養により DS 形成能を失った高継代数ラット頰髭 DP細胞にラット上部 DS細胞を組み合わせてヌー ドマウスの背部に混合移植した。移植 3週間後に細胞移植部位 (点線円内）における 発毛状況の写真撮影および生検を行った。生検組織はホルマリン固定およびバラフ イン包埋し、厚さ 5 μ mの連続切片を作成し、 H&E染色、抗 a - SMA抗体および抗 EG FP抗体による免疫染色を行った。（A)発毛能が回復した移植部位 (点線円内）のマク 口写真。上部 DS細胞添カ卩により発毛能が回復したことが示された。（B)発毛能が回復 した移植部位を生検し、組織学的観察を行った。多数の毛幹形成を伴う毛包が確認 された (H&E)。（C)それらの毛包最外層に抗 a -SMA抗体陽性細胞よりなる DS層が確 認された (矢頭)。矢印は血管内皮細胞。（D)さらに抗 EGFP抗体を用いた免疫染色に より添加したラット上部 DS細胞を追跡したところ、 DSおよび DPにラット上部 DS細胞由 来の細胞が分布して 、ることが示された (矢頭)。（E-G)さらにこれらの毛包を蛍顕微 鏡により詳細に観察したところ、 DPの一部に EGFPを発現している細胞が認められた 。 Hoechst核染色 (E)により毛乳頭の範囲（点線； P,毛乳頭）を確定した。この DP領域 には Dil蛍光を施した高継代 DP細胞 (F)に混じって EGFP蛍光を持つ上部 DS由来細 胞 (G)が認められた。矢印は Gおよび B励起により蛍光を発する赤血球。 Bars in A , 1 mm, in B, 100 μ m and in E, 50 μ m.
発明を実施するための最良の形態
[0034] 本発明の方法において培地に添加する FGF2および PDGF-AAは、培養対象となる 細胞が由来する動物種と同一由来のものが好ましく、ヒト由来の細胞を対象とする場 合には、 FGF2および PDGF-AAはヒト由来のものが好ましい。また、公知の方法で得 られた組替え体や血液から生成したものが好まし 、。ヒト由来の FGF2および PDGF-A Aは、それぞれ市販品を使用することができる（例えばヒト FGF2は UPSTATE社製、ヒト 由来 PDGF-AAは R&D Systems社製など）。
[0035] 培地は、公知の動物細胞用培地、例えば、 Alpha-MEM (大日本製薬株式会社等） 、 ATCC-CRCM 30 (ATCC)、 Coon's modified F12 (SIGMA等）、 DM- 160および DM- 201 (日本製薬株式会社）、 Doulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) with High Glucose (4500mg/L) (大日本製薬株式会社等）、 Doulbecco's modified Eagle's Medi um (DMEM) with Low Glucose (lOOOmg/L) (和光純薬工業株式会社等）、 DMEM : H am's F12混合培地 (1 : 1) (大日本製薬株式会社等）、 DMEM : RPMI1640混合培地 (1 : 1 )、 Eagles basal medium (BME) (大日本製薬株式会社等）、 Eagle's Minimum Essentia 1 Medium (EMEM) (大日本製薬株式会社等）、 EMEM : RPMI1640混合培地 (1:1)、 ES medium (日水製薬株式会社）、 Fischer's Medium (和光純薬工業株式会社等）、 Ham' s F10 (大日本製薬株式会社等）、 Ham's F12 medium (大日本製薬株式会社等）、 Ha m's F12 : RPMI1640混合培地 (1:1)、 Kaighns modification of Ham's F12 (F12K) (大日 本製薬株式会社等）、 Leibovitz's L-15 medium (大日本製薬株式会社等）、 McCoy's 5A (大日本製薬株式会社等)、 RITC80-7培地 (機能性ペプチド研究所)、 HF-C1培 地 (機能性ペプチド研究所）、 MCDB107培地 (機能性ペプチド研究所）、 MCDB201 培地（SIGMA)、 HSMC- C1培地 (機能性ペプチド研究所）、 HEC- C1培地 (機能性ぺ プチド研究所)、 MCDB131培地 (機能性ペプチド研究所)、 HSMC-C2培地 (機能性 ペプチド研究所）、 MCDB153培地 (機能性ペプチド研究所）、 MCDB153HAA培地（ 機能性ペプチド研究所)、 Medium 199 (大日本製薬株式会社等）、 NCTC135 (大日 本製薬株式会社等）、 RPMI1640 (大日本製薬株式会社等）、 Waymouth's MB752/1 medium (大日本製薬株式会社等）、 Williams' medium E (大日本製薬株式会社等）な どである。これらの培地が、無血清培地ある場合には、 1%〜30%程度の血清を添加 する。また、培養対象がヒト由来の細胞である場合は、ヒト由来の血清を使用すること が好ましい。
[0036] これらの動物細胞用培地への FGF2の添カ卩量は、 0.5〜20 ng/ml、好ましくは 2〜20 ng/ml、および PDGF- AAの添カ卩量は、 0.5〜20 ng/ml、好ましくは 2〜20 ng/ml程度で 組み合わせることができる。
[0037] 培養する毛包真皮毛根鞘は、毛球部を含む方が望ま 、。またこれは、抗 a -SMA 抗体陽性である。頭髪、髭毛、体毛由来が好ましい。毛包真皮毛根鞘細胞と他の毛 包形成細胞を同時に培養することが可能である力 この場合の毛包形成細胞は毛乳 頭であることが好ましい。この毛乳頭細胞もまた頭髪、髭毛、体毛由来が好ましい。
[0038] また、毛包真皮毛根鞘前駆細胞は、例えば、毛包上部 1/2から調整することができ る。これは、バルジに接した領域を含む方が好ましい。またこれは抗 α -SMA抗体陰 性である。さらには頭髪、髭毛、体毛由来が好ましい。
[0039] 本発明の毛包真皮毛根鞘細胞の培養方法における培養時間には特に制限はなく 、例えば、単離した毛包真皮毛根鞘細胞力 ¾倍以上、好ましくは 10倍以上、さらに好 ましくは 100倍以上に増殖するまで継続的に、また継代的に培養する。
[0040] また、本発明の毛包真皮毛根鞘前駆細胞の培養方法では、前駆細胞は毛包真皮 毛根鞘細胞に分化するまで、例えば 500時間以上、好ましくは 600時間以上培養する 。なお、前駆細胞が毛包真皮毛根鞘細胞へ分ィ匕したことは、長期継代培養により DS 形成能を失った高継代数ラット頰髭 DP細胞と培養した前駆細胞を組み合わせてヌー ドマウスの背部に混合移植し、下部 DSおよび DPを形成すること等によって確認する ことができる。
実施例
[0041] 以下、実施例を示してこの発明についてさらに詳細かつ具体的に説明する力 この 発明は以下の例によって限定されるものではない。
1. 方法
1-1. 毛包真皮毛根鞘 (DS)および毛乳頭 (DP)の分離
1-1-1. 成体ラット頰髭
6週齢の雄 Wistarラットは、ジェチルエーテル深麻酔により犠牲死せしめ、毛球部を 完全に含むよう 0部皮膚採取を行った。採取したラット頰部皮膚はイソジン（明治製薬
7
)と 70%エタノールで消毒および冷ダルベッコ改変リン酸緩衝生理食塩水（PBS (-)）で 洗浄した。洗浄後の皮膚より毛包を採取した。採取した毛包の立毛筋結合部より上 方 1/2で上下に切断し（図 1、矢印 A部位を切断）、それぞれを 4.76 g/1の HEPES、 0.84 g NaHCO添加し pH 7.4とした 10%牛胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（DM
3
EM10HEPES)中で次工程まで 4°Cにて保存した。この後、（1)下部 1/2毛包より下部 DS および DPを分離、 (2)上部 1/2より上部 DSを分離した。
(1)下部 DSおよび DPは下部 1/2毛包より毛球部を切断分離した。眼科用マイクロメス およびマイクロ鑷子を用いて、毛球部の真皮毛根鞘（dermal sheath ;DS)および毛乳 頭 (dermal papilla; DP)を一塊として、コラーゲン鞘および毛母等の表皮成分と分離し た。 DSと DPは、毛球部最下端に位置する連結部にてマイクロメスにより分離した（図 1、矢印 B線部位を切断)。
(2)毛包の上部 1/2を 1000 units/mlデイスパーゼ（三協純薬工業製）を含む（DMEM1 OHEPES)で 37°C、 10分間処理しデイスパーゼ処理後 DMEM10HEPESにてよく洗浄し た。毛包上部 DSをマイクロ鑷子により分離した。
1-1-2. ヒト頭髪
健康な 34歳と 46歳の男性ボランティアの後頭部有毛部より皮膚の提供を受け採取 した。採取したボランティア頭皮皮膚を毛包の流れに従って分割し、さらに外科用メス を用いて毛包単位 (Follicular Unit)ごとに皮膚および皮下組織を含むブロックとして 分離した。この FUブロックを 1000 units/mlデイスパーゼを含む（DMEM10HEPES)で 3 7°C、 10分間処理した。デイスパーゼ処理後 DMEM10HEPESにてよく洗浄し、 FUと皮 膚および皮下を分離し、用時まで 4°CDMEM1 OHEPES中で保存した。この後、 1-1-1. ラット頰髭と同様に、下部 1/2毛包より下部 DSおよび DPを分離、上部 1/2より上部 DS を分離した。
1-2. ラット頰髭およびヒト頭髪由来 DS細胞と DP細胞の培養
1-2-1. 初代培養および継代培養
分離したヒトボランティア頭皮由来の毛球部 DS、上部 DSおよび DPはプライマリア 24 穴細胞培養プレート (ぺクトンディッキンソン）に 1組織ずつ播種した。ヒト毛球部 DS細 胞と DP細胞は、 DMEM10を基礎培地とする 5種類の培地（表 1)を用いて 2週間初代 培養を行い、 4日に 1度の培地交換を行った。 FGF2 (UPSTATE社）および PDGF- AA (R&D SYSTEMS社）は human recombinantを用いた。初代培養後、 7日ごとに継代培 養を行った。
[表 1] 表 1 DSおよび DP細胞培養に使用した培養培地
Figure imgf000017_0001
ヒト毛包上部 DSは DMEM10および PDGF-AA/FGF2添加 DMEM10でそれぞれ 3週 間初代培養を行い、 4日に 1度の培地交換を行った。初代培養 21日目に、酵素処理 により細胞を剥離し、細胞数を計測した。初代培養後、 7日ごとに継代培養を行った。 また同様にラット頰髭由来の毛球部 DS、上部 DSおよび DPはプライマリア 24穴細胞 培養プレートに 1組織ずつ播種した。毛球部 DS細胞と DP細胞は、 DMEM10を基礎 培地とする 5種類の培地 (表 1)を用いて 2週間初代培養を行い、 4日に 1度の培地交 換を行った。初代培養後、 7日ごとに継代培養を行った。毛包上部 DSは PDGF-AA/F GF2添加 DMEM10で 2週間初代培養を行い、 4日に 1度の培地交換を行った。初代培 養 14日目に、酵素処理により細胞を剥離し、細胞数を計測した。初代培養後、 7日ご とに継代培養を行った。
1-2-2. 細胞増殖速度の測定
初代培養開始後 7日目と 14日目に、各培養液で培養した細胞を PBSで洗浄後、 10 %ホルマリン固定した。固定後生理食塩水で洗浄し、 Hoechstによる蛍光核染色を行 つた。核染色を行った後、細胞コロニー全体をデジタルカメラ（LEICA DC 500)で撮 影し、デジタル画像情報を取得した。この蛍光画像を二階調化した後、 Image J画像 解析ソフトで細胞核数をカウントした。各培地での細胞増殖を比較した。初代培養後 、 7日ごとに継代培養を行った。細胞は 4日に 1度の培地交換を行った。継代時の細 胞数力 細胞倍加時間（PDT)を算出し、各培地で比較した。各条件の増殖細胞数 は Student T検定により統計解析を行った。
1-2-3. 培養により増殖可能な細胞総数の算出
初代培養終了時の 1組織あたりの増殖細胞数 (A)とする。各継代数における、継代 時の回収細胞数 (Harvest)と培養開始時の播種細胞数 (Initial)から、何倍に増えた かを表す細胞増殖倍数 (Harvest /Initial)を求める。この値を (B)とする。 1継代数の 時は (B )と表記した。初代培養で得られた細胞をすベて継代培養し、増殖させたとき
1
、継代 1、 3代までに得られる細胞総数の算出方法は以下の式になる。
継代 1代までに得られる細胞総数 = (A) x(B )
1
継代 3代までに得られる細胞総数 = (A) X (B ) X (B ) X (B )
1 2 3
1-3. ヒト頭髪およびラット頰髭由来 DS細胞の機能アツセィ
1-3-1. 成体ラット足裏真皮由来線維芽細胞の調整 10週齢の雄 Wistarラットは、ジェチルエーテル麻酔により犠牲死させ、足裏皮膚を 切除した。切除足裏皮膚はイソジンと 70%エタノールで滅菌した後に、 PBSで洗浄し た。実体顕微鏡を用いて、無菌環境下において足裏皮膚に付着している皮下組織 をマイクロ剪刀により除去した。除去後、 4等分し、 1000 units/mlになるように DMEM1 0に溶カゝしたディスパーゼ溶液で 4°C、一晩処理した。デイスパーゼ処理した皮膚組 織は生理食塩水でよく洗浄し、表皮と真皮を分離した。この真皮を l-2mm角に細切し 、 60 mm培養ディッシュにェクスプラントして線維芽細胞の初代培養を行った。
[0044] 初代培養後、成体ラット足裏真皮由来線維芽細胞は継代培養を行い、継代 2-4代 までの細胞を移植に用いた。
1-3-2. ラット新生仔表皮細胞の調製
発毛分化能を持つ表皮細胞は、生後 2日齢の Wistarラット新生児の皮膚より調製し た。 Wistarラット新生児をジェチルエーテル麻酔により犠牲死させ、前後肢および尾 部を切除し、躯幹部分のみとした。躯幹部の皮膚を剥離し、イソジンと 70%エタノール で滅菌した後に、 PBSで洗浄し、使用時まで 4°Cにて保存した。無菌環境下において 実体顕微鏡を用いて、新生児皮膚に付着している皮下組織をマイクロ剪刀により除 去した。なお、これ以下の全ての行程はクリーンベンチ内あるいは、無菌器具内にお いて無菌的に行った。
[0045] 皮膚組織は幅約 3 mm、長さ約 10 mm程度の短冊状に切り、 1000 units/mlになるよ うに DMEM10に溶かしたデイスパーゼ溶液で 4°C、ー晚処理した。デイスパーゼ処理 した皮膚組織は冷 PBS (-)でよく洗浄し、表皮と真皮を分離した。
[0046] 分離した表皮は外科用メスを用いて細切し、 0.25%トリプシン EDTA溶液で 37°C、 10 分間処理して浮遊細胞懸濁液とした。細胞懸濁液は 100 μ mおよび 40 μ mのメッシ ュサイズのフィルターを通し、複数の細胞同士接着した集塊を除去した。
1-3-3. DS細胞機能アツセィにおける移植用細胞の調整法
培養 DS細胞の毛幹伸長促進能を検出するために、長期継代培養により真皮毛根 鞘形成能を喪失したラット頰髭由来 DP細胞 (継代数 39, p=39)との混合移植を行！ヽ、 毛幹伸長促進を指標としたアツセィを行った。細胞の機能アツセィは、成体ラット頰髭 DP細胞 (継代数 39)、ヒト頭髪毛包毛球部 DS細胞、ラット頰髭毛包上部 DS細胞、ラッ ト新生仔表皮細胞、ラット足裏真皮由来線維芽細胞を表 2の組み合わせで混合し、ヌ 一ドマウス背部に移植するチャンバ一アツセィ法 (非特許文献 2)を用いた。移植する 細胞を各組み合わせで混合し、 670 g、 5分間遠心し、細胞をスラリー状とした。この移 植細胞ペレットより培地を除去し、スラリー状として移植まで 4°Cで保存した。
[0047] [表 2] 表 2 細胞機能アツセィにおける細胞条件 新規 ·継代 細胞数
移植細胞名
培養数 移植例 1 移植例 2 移植例 3 ラット新生仔由来 Fresh 1 x 10" 1 X 106
表皮細胞 2 x 106
成体ラット頰髭由来
DP細胞 39 3 x 105 3 x 10=
成体ラット足裏真皮
3
由来線維芽細胞 7 x 106 4 x 105 1 .4 X 106 ヒト頭髪毛包由来
1
下部 DS細胞 3 x 105
成体ラット頰髭由来
39
上部 DS細胞 6 x 105
1-3-4. DS細胞機能アツセィにおける細胞移植法 X
4週齢雄ヌードマウス（日本チャールズリバ一社製)を 10%ソムノペンチル (共立製薬) と 8%エタノールを含む PBS (-)を腹腔内投与により麻酔し、滅菌ドレープ上にて自然側 方横臥位とした。外科用イソジン液（明治製薬)および 70%エタノールでマウスの実 幹部全体を消毒した後、側腹部の皮膚を直径 7 mmの円形に全層切除去した。この 部位にドーム部直径 11 mmのグラフト'チャンバ一を挿入し、皮下組織内にハット部を 挿入し、 5-0ナイロン縫合糸によってハット部と皮膚を縫合し固定した。この移植創に 、細胞ペレットをマイクロピペットにて注入した。移植までの全工程は、クリーンベンチ 内にて無菌的に行った。
[0048] 細胞移植 1週間目にグラフト'チャンバ一を除去し、さらに 2週間感染症およびマウス による移植術創への接触行動に注意しながら単独飼育を行った。
1-3-5. DS細胞機能アツセィの経過観察 (マクロにおける発毛）と組織学的観察方法 細胞移植後 3週間目に、移植部位を実体顕微鏡 (ライカ社）にて観察し、発毛の様 子を写真撮影した。撮影後、移植部位を摘出し、マイルドホルム 10N (和光純薬)で 室温一昼夜固定した。その後通法に従いパラフィン包埋し、 5 m厚の連続組織切 片を作成した。糸且織切片はへマトキシリン'ェォジン (HE)染色および毛包真皮毛根 鞘のマーカーである抗ヒト平滑筋型 ocァクチン抗体 (SIGMA社製)を用いた免疫染色 を行った。
2. 結果と考察
2-1.毛球部より分離した下部 DS細胞の初代および継代培養
2-1-1. ラット頰髭由来下部 DS細胞
ラット頰髭毛包毛球部より DSおよび DPを分離し（図 1)、方法 1-2の培養条件で初代 培養した。初代培養開始後 3-5日で組織が培養皿上に接着し、細胞コロニー形成お よび細胞増殖と遊走が観察された。 2週間の初代培養において、各培養条件で増殖 した細胞数を、画像解析により計数した。その結果、 PDGF-AA/FGF2におけるラット 下部 DS細胞の増殖細胞数は、既存の培地である DMEM10の約 8.5倍であった（* p< 0.05、図 2A)。同様に、 DMEM10と比較して、 CM5 (DMEM10比で約 6.1倍）および FG F2単独添加培地（同約 4.3倍）による増殖細胞数は高い値であった。また、 PDGF-AA /FGF2は、比較した培地条件のうち最高であった（* p< 0.05 vs.CM5 : ** p< 0.01 v s. FGF2)。
さらに初代培養後、高 、増殖活性を示した PDGF-AA/FGF2含有培地にっ 、て 7日 ごとに継代培養を行った。継代時の細胞数力 細胞倍加時間（PDT)を算出し、各培 地で比較した（図 2B)。その結果継代培養においても、 PDGF-AA/FGF2添加培地に おいて基礎培地 DMEM10よりも有意に高い増殖活性を示すことが確認された。
2-1-2. ヒト頭髪毛包下部 DS細胞
PDGF-AA/FGF2含有培地により、ラット下部 DS細胞を効果的に増殖させることが 確認されたことから、次により利用価値の高いヒト細胞へ応用可能性について検証し た。ヒト細胞は医療応用や薬剤開発において非常に利用価値が高い。しかし、由来 する個体ごとに十分な細胞数まで増殖できなければ、その利用価値は減少する。さ らに、由来組織の提供頻度と量も最小限であることから、カビゃバクテリア等のコンタ ミネーシヨンのリスクを最小限とすることが重要である。初代培養では細胞が同じ培養 皿内で数週間に渡り馴化することから、コンタミネーシヨンのリスクが非常に高い工程 である。従って、初代培養において細胞増殖速度が高い培地条件であることが望ま れる。そこで、ヒト毛包毛球部より下部 DSおよび DPを分離し（図 1)、方法 1-2の培養条 件で初代培養し、各培地条件による初代培養における細胞増殖速度および継代培 養にぉ 、て得られる細胞数を比較した。
[0050] 初代培養開始後 3〜7日までに下部 DSおよび DP組織はプラスチック培養皿上に接 着し、その後接着した細胞のコロニー形成と細胞増殖'遊走が観察された。 2人のボ ランティア頭髪より独立して二度行った初代培養において、 DMEM 10および CM5によ る組織接着成功率は 50%以上 90%以下であった。それに対して、 PDGF-AA/FGF2 は 90%以上であった。また接着細胞コロニーの増殖と遊走は PDGF-AA/FGF2が最 も早く見られた。コントロールとして用いたヒト DPでは、どの培地においても 80%以上 の組織が接着し、コロニー形成が観察された。
[0051] 各培養条件で 2週間の初代培養を行い、コロニー形成し増殖した細胞数を画像解 析により計数した（図 3A)。その結果、 PDGF-AA/FGF2によるヒト DS細胞の増殖細胞 数は DMEM10に対して約 14倍であった（図 3A, * p< 0.05)。基礎培地 DMEM10に対 して、 CM5 (DMEM10に対して約 3.1倍）、 FGF2 (同約 1.8倍）、 PDGF-AA単独添カロ培 地（同約 1.9倍）のいずれも高い細胞増殖が見られた力 PDGF-AA /FGF2に比して 著しく低力つた（図 3A)。さらに統計学的分析により PDGF-AA/FGF2は、 FGF2および PDGF-AA単独添加条件よりも有意に高 、細胞増殖活性を示すことが確認された（図 3A, ** p< 0.01 vs.CM5 :* p< 0.05 vs. FGF2、 PDGF— AA)。
[0052] 次に、 PDGF-AA/FGF2および DMEM10培地条件により初代培養した下部 DS細胞 を、同培地条件で継代培養 (7 days/passage)し、培地条件ごとに各継代における平 均細胞倍カ卩時間（PDT)を比較した。その結果、 PDGF-AA/FGF2は、計測した全て の継代において DMEM10より高い増殖速度を示した。し力し、 PDGF-AA/FGF2にお いても 3継代以降増殖速度は徐々に低下した（図 3B)。また、 PDGF-AA/FGF2にお ける第 1継代力 第 3継代までは小型で紡錘形の細胞形態を維持して 、るが、その後 徐々に細胞老化を示す兆候である、ストレスファイバーを伴う扁平な形態を見せるよう になった（図 4, p=6, PDGF-AA/FGF2) 0それに対して、 DMEM10では、第 1継代 (p=l )からストレスファイバーを持つ扁平な形態となり（図 4, DMEM10)、細胞形態的にも P DGF-AA/FGF2の有効性が示された。
[0053] 再生医療や医薬品開発においては、短期間で安定的に大量の正常細胞を得られ ることが重要である。そこで、安定的な増殖速度と細胞形態を維持できた第 3継代ま でに得られる最大細胞数を、方法 1-2の計算方法で算出した。その結果、 PDGF-AA /FGFは DMEM10の 450倍であった（表 3)。これらの結果より、 PDGF- AA/FGF2培地 は、ヒト頭髪毛球部由来の下部 DS細胞を、既存の方法 (DMEM10)より短期間で培養 増殖させることができ、治療や医薬品開発に十分利用可能な細胞数を確保できるこ とが示された。
[0054] なお、表 3にお!/、て継代 1代以降の継代培養は、 6.6xl04 cells/ 6 cm dishとなるよ うに播種した。 4日目に培地の全量交換を行い、 7日目に継代を行った。各継代時に 回収した細胞数から、 1-2の方法を用いて継代 3代までに得られる細胞総数を求めた 。 DMEM10を 1とし比較すると、継代 3代までに得られる細胞総数は 450倍であり、 PDG F-AA/FGF2の優位性が示されて!/、る。
[0055] [表 3] 表 3 ヒト頭髪由来下部 DS細胞の初代 ·継代培養と増殖細胞最大数の 培地条件における比較
Figure imgf000023_0001
2-2. 下部 DS細胞の機能解析
特許文献 2に記載された方法で長期継代培養により増殖させたラット頰髭由来 DP 細胞は毛包形成誘導能を保持して ヽるが、形成誘導した毛包から発毛能が減弱し 失われる (特許文献 1)。この問題点を解決する方法として、本発明者らは、長期継代 培養により発毛能が減弱した DP細胞に DS細胞を一定量添加することで、減弱した発 毛誘導能を回復させ、毛包力 発生した毛の成長が顕著に促進されることを見 、だ している（特許文献 1)。本発明の PDGF-AA/FGF2によって培養した下部 DS細胞力 この機能を保持して ヽることを確認するために以下の実験を行った。
[0056] 長期継代培養により DS形成能を失った高継代ラット頰髭 DP細胞 (p=39)にヒト頭髪 由来下部 DS細胞 (p=l)を組み合わせて混合移植し、発毛能の回復と形成誘導され た毛包における DS形成の有無を調べた (表 2、移植例 2)。その結果、高継代ラット DP 細胞移植群では明確な発毛が観察されないのに対し（図 5-A)、 PDGF-AA/FGF2に より培養したヒト DS細胞添加群では明らかに発毛能が回復した（図 6-D)。細胞移植 部位の組織学的観察 (H&E)ではヒト頭髪由来下部 DS細胞添加群では数多くの毛幹 を形成した毛包が観察されたのに対し（図 6-E)、ラット頰髭 DP細胞単独移植群では 毛幹を形成して ヽな 、不完全な毛包が観察された（図 5-B)。さらに同じ連続組織切 片を抗 a -SMA抗体により免疫染色したところ、ヒト頭髪由来下部 DS細胞添加群では 毛包の最外層に α -SMA陽性の細胞層が観察された（図 6_F)。それに対して、非添 加群では毛包最外層に a -SMA陽性細胞層は観察されなカゝつた（図 5-C)。
[0057] 以上の結果より、本発明の PDGF-AA/FGF2により下部 DS細胞を機能維持した状 態で培養増殖できることが証明された。
2-3. PDGF-AA/FGF2による DP細胞の初代および継代培養
DS細胞は DP細胞の前駆細胞を含み、 DS細胞から分化増殖した DP細胞は、毛球 部最下端より毛乳頭柄を経て毛乳頭に供給される。組織学的にも毛球部最下端に おいて毛乳頭柄で連結しており、 DSと DPを組織より分離する際には一繋がりとして分 離される。本発明者らは、長期継代培養により発毛能が減弱した毛乳頭細胞に毛包 真皮毛根鞘細胞細胞を一定量添加することで、減弱した発毛誘導能を回復させ、毛 包力 発生した毛の成長が顕著に促進されることを可能とし、既に特許出願している (特許文献 1)。従って、細胞分ィ匕的観点および構造的に近い DS細胞と DP細胞が同 一条件で培養可能であれば、その方法は非常に高 、利用価値を有すると!、える。
[0058] そこで、ラット頰髭由来 DP細胞の培養に PDGF-AA/FGF2培地が利用できることを 検証した。その結果、 PDGF-AA/FGF2培地は DMEM10よりも有意に高い増殖活性 を示した（図 5, * p< 0.001 vs. DMEM10) o先行して特許出願されている DP細胞増殖 培地 (CM5) (非特許文献 1、特許文献 2)と同等の増殖活性を示した。
[0059] 次に、より利用価値の高いヒト頭髪由来 DP細胞における PDGF-AA/FGF2の効果を 検証した。その結果、初代培養において CM5と PDGF-AA/FGF2における増殖細胞 数は同等であることが示された。また、 PDGF-AA単独では DMEM10と同等であり、 PD GF-AA/FGF2の組成が CM5と同様に有効であることが示された（図 8-A)。
[0060] 次に、 PDGF-AA/FGF2、 CM5、および DMEM10の各培地条件により初代培養した ラット DP細胞を、同培地条件で継代培養 (7 days/passage)し、培地条件ごとに各継 代における平均細胞倍加時間（PDT)を比較した（図 8-B)。その結果、 PDGF-AA/F GF2は、第 2継代までは他の条件より早い増殖速度であつたが、継代 3代以降は PDT 値が増大し CM5より遅くなつた（図 8-B)。しかし、安定的な増殖速度と細胞形態を維 持できた第 3継代までに得られる DP細胞の最大細胞数を比較すると PDGF-AA/FGF 2は CM5より 1.4倍（DMEM10比で約 70倍）であった（表 4)。ヒトおよびラット DP細胞に 対しても、 PDGF-AA/FGF2含有培地は CM5と同等の高 、増殖活性が認められること から、 PDGF-AA/FGF2は DP培養にも有効であることが示された。このことから、 DS細 胞と DP細胞を同条件で同時に培養することが可能であることが示された。なお。表 4 において継代 1代以降の継代培養は、 6.6xl04 cells/ 6 cm dishとなるように播種し た。 4日目に培地の全量交換を行い、 7日目に継代を行った。各継代時に回収した細 胞数から、 1-2の方法を用いて継代 3代まで DMEM10を 1とし比較すると、継代 3代まで に得られる細胞総数は CM5より 1.4倍多ぐ 70倍であった。これらの結果はヒト DSとは 異なるものであつたが、ヒト DS/DP細胞の両方に対して PDGF-AA/FGF2含有培地で 最も高い増殖活性が認められた
[0061] [表 4] 表 4 ヒト頭髪由来 DP細胞の初代-継代培養と増殖細胞最大数の培地
条件における比較
培地条件 D EM1 0 CM5 PDGF-AA/FGF2 培養日数 [days] 細胞数 |x 103 cellsl
初代培養 14 3.0 14.0 12.1
1 7 645.0 782.5 1540.0
銳
2 7 540.0 124.0 1438.0
3 7 293.0 1145.0 832.5
第 3継代までに得られる総細胞
数の比較（DMEM10を 1とした 1.0 50.2 70.2 相対値）
2-4. 上部 DS細胞の PDGF- AA/FGF2培地による初代および継代培養
一般的に DSは毛包の外側を包み、かつ抗 oc -SMA抗体陽性の真皮性細胞よりなる 組織と定義されている。しかし、抗 α -SMA抗体抗体陽性の DS細胞は毛周期の休止 期にお 、て消失することから、 DS細胞の前駆細胞が存在することが仮定されて 、る。 本発明者らは成長期毛包のバルジ領域を取り囲む抗 (X -SMA抗体陰性かつ抗ビメン チン抗体陽性であり、バルジ領域より下方に分布する抗 ex -SMA抗体陽性の DS (便 宜的に下部 DSと呼称)と構造的に連続している真皮性細胞よりなる構造 (上部 DSと呼 称）に注目した（図 1)。この上部 DS細胞が下部 DSおよび DP細胞の前駆細胞であると 仮定すると、下部 DS細胞の機能アツセィと同様に細胞移植を行うと上部 DS細胞由来 の下部 DSと DPが形成されると考えられる。そこで、この仮説に基づいて、上部 DSに 下部 DS細胞および DP細胞の前駆細胞が含まれることを検証することとした。しかし、 この検証実験には多量の上部 DS細胞が必要であることから、まず下部 DS細胞と同様 にラット頰髭およびヒト頭髪由来上部 DS細胞が培養可能であることを確認した。 2-4-1. ラット頰髭由来上部 DS細胞
ラット頰髭毛包から 1-1に記載の方法で上部 DSを分離し、 DS細胞の培養に有効で あった PDGF-AA/FGF2培地で培養した。毛球部 DS細胞に比べ増殖が遅ぐ初代培 養に 21日要した力 増殖細胞数は DMEM10と比較して 2倍であった。さらに継代培養 を行ったところ、 4継代数まで 40時間前後の早い増殖速度を維持していたが、それ以 降は PDT値が増大した（図 9)。 2-4-2. ヒト頭髪由来上部 DS細胞
ヒト頭髪毛包から、 1-1に記載の方法で上部 DSを分離し、 PDGF-AA/FGF2により初 代培養および «代培養を行った。初代培養において PDGF- AA/FGF2は、ラットの結 果と同様に DMEM10に比べ 2.2倍の増殖活性を示した。また、初代培養から第 3継代 までに得られる細胞総数を方法 1-4の計算方法で算出したところ、 PDGF-AA/FGF2 は DMEM10の約 2.2倍であった（表 5)。なお、表 5において継代 1代以降の継代培養 は、 6.6xl04 cells/ 6 cm dishとなるように播種した。 4日目に培地の全量交換を行い 、 7日目に継代を行った。各継代時に回収した細胞数から、 1-2の方法を用いて継代 1代までに得られる細胞総数を求めた。 DMEM10を 1とし比較すると、継代 1代までに 得られる細胞総数は 2.2倍になった。
[表 5] 表 5 ヒト頭髪由来上部 DS細胞の初代 ·継代培養と増殖細胞最大数の
培地条件における比較
培地条件 DMEM1 0 PDGF-AA/FGF2
継代数. 、~\
培養日数 [days] 細胞数 103 cells]
初代培養 21 1 .5 2.2
第 1継代 7 8.1 18.0
第 1継代までに得られる総細胞
数の比較（DMEM10による増 1 .0 2.2
殖細胞を 1とした相対値） 以上のことより、上部 DS細胞も、 PDGF-AA/FGF2によって、効果的に増殖できるこ とが示された。
2-5. PDGF-AA/FGF2培地により培養した上部 DS細胞の機能解析
上部 DS細胞が下部 DSおよび DP細胞の前駆細胞であると仮定すると、方法 1-3によ り細胞移植すると上部 DS細胞は下部 DSと DP細胞に分ィ匕できるはずである。そこで、 上部 DSに下部 DS細胞および DP細胞の前駆細胞が含まれることを検証することとした 。 PDGF- AA/FGF2で培養した EGFPトランスジエニック (EGFP- Tg.)ラット頰髭由来上 部 DS細胞を、高継代ラット DP細胞と混合移植し (表 2、移植例 3)、発毛能の回復と組 織学的分析を行った。その結果、高継代 DP細胞 (p=39)移植群では発毛が観察され な 、のに対し（図 5-A)、ラット頰髭由来上部 DS細胞 (p=l)添加群では明らかに発毛 の回復が認められた（図 10-A)。組織学的観察においてもラット頰髭毛包上部 DS細 胞添加群では数多くの毛幹を形成した毛包が観察された。また、連続組織切片を DS のマーカーである抗 a -SMA抗体を用いて免疫染色を行ったところ、ラット頰髭毛包 上部 DS細胞添加群では毛包の最外層に抗 a -SMA抗体陽性の細胞層が観察され た（図 10-C)。それに対して、高継代 DP細胞のみでは、毛包最外層に抗 α -SMA抗 体陽性細胞は認められな力つた（図 5-B)。また、移植した DS細胞は EGFP-Tg.ラット 由来であることから、抗 ex -SMA抗体陽性毛包の連続切片を GFP蛍光幹津および抗 EGFP抗体免疫染色し、移植上部 DS細胞由来であることを検証した。その結果、上部 DS細胞添カ卩により発毛能を回復した毛包の下部 DSは EGFPを発現していることが明 らカとなった（図 10-D)。さらに同一実験群の DPの一部に EGFP発現細胞が観察され た（図 10- E, F, G)。
[0063] 上述した実験に用いた上部 DS細胞の由来組織は、 in vivoにお!/、て抗 α -SMA抗体 陰性の組織である。これまで、特定部位を除去した毛包の移植実験や (非特許文献 1 2、 13)、 DMEM10のみで培養した上部 DS細胞の移植実験 (非特許文献 7)結果より、 上部 DS細胞は下部 DS細胞とは異なり、 DP細胞に分ィ匕しないことが報告されてきた。 そのために、これまでは上部 DSは、下部 DSおよび DP細胞の前駆細胞を含まないで はないと考えられてきた。しかし、今回初めて本発明により培養したラット頰髭上部 DS 細胞が、下部 DSおよび DPに分ィ匕し発毛能回復機能を有することを確認した。この結 果より、上部 DS細胞は下部 DSおよび DP細胞に分ィ匕能を持つ前駆細胞であることが 示された。
[0064] 以上のように、本発明は下部 DS細胞を機能維持した状態で増殖させるのみならず 、上部 DSに含まれる前駆細胞より下部 DS細胞と同等の機能を持つ細胞を培養増殖 させることを可能とした。また、本発明による培養方法は、分ィ匕マーカーを発現しない 低分化な DS前駆細胞の分化傾向制御し、増殖させる方法ということもできる。

Claims

請求の範囲
[1] 毛包真皮毛根鞘細胞を、機能を維持した状態で増殖させる培養方法であって、血小 板由来増殖因子 AA(PDGF-AA)および線維芽細胞増殖因子 2 (FGF2)を添加した動 物細胞用培地で毛包真皮毛根鞘細胞を培養することを特徴とする培養方法。
[2] 毛包真皮毛根鞘細胞が毛包下部真皮毛根鞘由来の細胞である請求項 1の培養方 法。
[3] 動物細胞用培地が、 1%〜30%血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM10) である請求項 1の培養方法。
[4] 毛包真皮毛根鞘細胞を、他の毛包形成細胞とともに培養する請求項 1の培養方法。
[5] 毛包真皮毛根鞘前駆細胞を、真皮毛根鞘細胞へと分化、増殖させる方法であって、 血小板由来増殖因子 AA(PDGF-AA)および線維芽細胞増殖因子 2 (FGF2)を添カロ した動物細胞用培地で毛包真皮毛根鞘前駆細胞を培養することを特徴とする培養 方法。
[6] 毛包真皮毛根鞘前駆細胞が毛包下部真皮毛根鞘由来の細胞である請求項 5の培 養方法。
[7] 動物細胞用培地が、 1%〜30%血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM10) である請求項 5の培養方法。
[8] 血小板由来増殖因子 AA(PDGF-AA)および線維芽細胞増殖因子 2 (FGF2)を添カロ した動物細胞用培地で培養することによって真皮毛根鞘細胞へと分ィヒすることがで きる毛包真皮毛根鞘前駆細胞。
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