WO2014200025A1

WO2014200025A1 - 毛包形成用の組成物の品質管理方法

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Publication number: WO2014200025A1
Application number: PCT/JP2014/065485
Authority: WO
Inventors: 雄三吉田; 勤相馬; 治代山西
Original assignee: 株式会社資生堂
Priority date: 2013-06-12
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2014-12-18
Also published as: TW201504435A

Abstract

　毛包誘導能を有する組成物、並びに当該組成物の品質管理方法の提供。真皮毛根鞘(「ＤＳ」:dermal sheath)由来のＤＳ細胞のうち、ＣＤ３６発現性のＤＳ細胞を選別することにより、毛包誘導能が高い組成物を取得することができる。また、毛包形成用の組成物において、ＣＤ３６発現性のＤＳ細胞の割合を測定することにより、当該組成物の毛包誘導能について品質管理することができる。

Description

毛包形成用の組成物の品質管理方法

　真皮毛根鞘（「ＤＳ」：dermal seath)由来のＣＤ３６陽性細胞を含む毛包形成用の組成物の毛包誘導能について品質を管理する方法に関する。

　毛髪は美的外観上極めて重要視される。従って、先天的又は後天的要因による脱毛は多くの人々にとって深刻な悩みである。特に高齢化社会、ストレス社会といわれる現代社会では、頭部毛髪が様々な後天的な原因により、脱毛の危機にさらされる機会がますます多くなってきている。これに対応して、発毛や毛髪の太毛化の促進を含む育毛効果を発揮するより優れた育毛剤を提供すべく、様々な試みがなされている。

　毛包は成熟した生体で自己再生をほぼ一生涯を通じて繰り返す例外的な器官である。その自己再生の仕組みを解明することは、組織や細胞移植による脱毛治療、毛包や皮脂腺を含有する自然に近い機能的にも優れた皮膚シートの構築など、ニーズの高い臨床応用に繋がるものと期待される。近年、幹細胞研究への関心の高まりと共に毛包上皮幹細胞（上皮細胞）の研究が急速に進展し、また毛包特異的な間葉系細胞たる毛乳頭（「ＤＰ」：dermal papilla）細胞についてもその性質が少しずつ判ってきた。毛乳頭細胞は毛包の自己再生のために毛包上皮幹細胞に活性化シグナルを送るいわば司令塔の役割を担い、毛包再構成評価系においては毛包上皮幹細胞と共に欠くことのできない細胞であることが判っている（Kishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), Vol.96, pp. 7336-7341；非特許文献１）。

　毛球内に存在するＤＰと、毛根の周囲を取り巻くＤＳは、共に、毛包の大部分を構成する上皮系細胞とは異なり、間葉系由来の細胞群で構成される。ＤＳについて、毛包形成に対する重要性を示唆する知見が、近年、多数報告されている。ラットヒゲの毛球部から毛乳頭を切断した毛包を移植する実験においては、ＤＳからＤＰが再生されること、マウスで、下２分の１を切断した毛包のＤＳを移植することで、毛包再生が誘導されることも報告されている（Jahoda CA, et al., Development.1992 Apr:114(4):887-97；非特許文献２）。また、ＤＳをヒトに移植することで、毛包の再構築を誘導できることも報告している（Horne KA and Jahoda CA. Development.1992 Nov:116(3):563-71；非特許文献３）。さらに、Tobin, Pausらのグループは、マウス毛周期において、ＤＳとＤＰ間の細胞の移動が起こり、発毛期において増殖を開始するＤＰ細胞に先駆けて結合組織鞘（ＤＳ）細胞の増殖が開始することを報告している（Tobin DJ et al., J.Invest.Dermatol., 120:895-904, 2003；非特許文献４）。

　このように、ＤＳは毛包形成に対して重要な役割を果たしている可能性が高いが、その作用機序については不明な点がほとんどである。その中で、ＤＳのうち一部の細胞において、血管関連因子の発現量が高いことが見いだされた。そしてＣＤ３６発現性のＤＳ細胞が、ＨＧＦの発現を介して、血管内皮細胞の増殖を促進し、それにより毛乳頭への分化又は毛乳頭の活性化に寄与する可能性が示され、ＣＤ３６発現性の結合組織鞘細胞を含む毛包再生するための組成物が知られている（特許文献１）。

特開２０１０－２７５２５６号公報

Kishimoto et al., Proc. Natl. Acai. USA (1999), Vol.96, pp. 7336-7341 Jahoda CA et al., Development.1992 Apr;114(4):887-97. Horne KA and Jahoda CA.Development.1992 Nov;116(3):563-71. Tobin DJ et al., J.Invest.Dermatol., 120:895-904, 2003 J.Linder et al., Federation of American Societies for Experimental Biology, 14(2), 319(2000) Machiko Iida, et al., Dev. Growth Differ., 49, 185-195 (2007) Palmqvist L, Glover CH, Hsu L, Lu M, Bossen B et al. (2005) Stem cells (Dayton, Ohio) 23(5): 663-680 Handjiski BK et al., The British journal of dermatology 131(3): 303-310 Cho H, Kozasa T, Bondjers C, Betsholtz C, Kehrl JH (2003) Faseb J 17(3): 440-442 Paquet-Fifield S, et al. (2009) The Journal of clinical investigation 119(9): 2795-2806 Winkler EA, Bell RD, Zlokovic BV Molecular neurodegeneration 5: 32 Jones EA, Kinsey SE, English A, Jones RA, Straszynski L et al. (2002), 46(12): 3349-3360 Quirici N, Soligo D, Bossolasco P, Servida F, Lumini C et al. (2002), 30(7): 783-791 Mendez-Ferrer S, Michurina TV, Ferraro F, Mazloom AR, Macarthur BD et al. Nature 466(7308): 829-834 Zheng Y, Du X, Wang W, Boucher M, Parimoo S, et al. J Invest Dermatol (2005) 124: 867-876.

　本発明の課題は、真皮毛根鞘（ＤＳ）由来のＣＤ３６発現性の細胞を含む組成物の品質向上を目的とする。

　真皮毛根鞘の細胞のうち、ＣＤ３６発現性の細胞は、ＨＧＦの発現を介して、血管内皮細胞の増殖を促進し、それにより毛乳頭への分化又は毛乳頭の活性化に寄与する可能性が示されていた。しかしながらＣＤ３６発現性ＤＳ細胞と、毛包誘導能との関係までもが明らかにされていたわけではなかった。

　本発明者らは、ＤＳ細胞がヘテロな細胞集団であることから、継代培養を行うことで、毛包誘導能を有さない細胞も増殖されること、さらには継代培養を行うにつれ毛包誘導能を失った細胞が生じうることを見いだした。そこで、ＣＤ３６発現性のＤＳ細胞を含む毛包を形成するための組成物が、適切な毛包誘導能を有することを確認することにより、組成物の品質管理をする必要性がある点に着目した。品質管理の方法として、３次元培養皮膚モデルにおいて毛包誘導能を直接確認することも可能ではあるが、時間、手間、及び/又はコストの点からは好ましくなかった。そこで、本発明者らが毛包を形成するための組成物と毛包誘導能との関係について鋭意研究を行ったところ、当該組成物中に含まれるＣＤ３６陽性細胞において毛包誘導能と関連があるとされるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性が高いことが見いだされた（図３、図４及び図５）。ＡＬＰ活性は、成長期の毛乳頭のマーカーとして用いられているが、一方で真皮毛根鞘においても、毛周期の成長期の初期にのみ活性が見られることが知られていた（非特許文献６）。これらの知見を統合して、ＤＳ細胞の中でも特にＣＤ３６陽性細胞が、毛乳頭へと分化又は毛乳頭を活性化できるとの仮説を立てることができる。本発明者らは、さらにＣＤ３６陽性ＤＳ細胞の遺伝子発現について研究を行ったところ、驚くべきことにＣＤ３６陽性ＤＳ細胞が、ＣＤ３６陰性ＤＳ細胞と比べて、ＲＧＳ５をはじめ複数の間葉系幹細胞関連因子を高発現していることを見いだした（図６及び７）。これにより、ＣＤ３６陽性細胞が間葉系幹細胞としての能力、すなわち自己増殖性と多能性も持つことが明らかとなり、これらの能力を有する細胞が毛包の再生能力、すなわち、毛包誘導能力を発揮することが理解される。さらに、本発明者らは、ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞を含む移植物と、ＣＤ３６陰性ＤＳ細胞を含む移植物とをそれぞれ、免疫不全マウスに移植し、毛包誘導能を調べたところ、ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞群では明らかに高い毛包誘導能を示した（図８及び９）。これにより、ＣＤ３６陽性細胞の割合を指標とすることによる真皮毛根鞘由来のＣＤ３６陽性細胞を含む毛包形成用の組成物の毛包誘導能について品質を管理する方法を完成させた。

　　従って、本願は以下の発明を包含する：
［１］　真皮毛根鞘由来のＣＤ３６陽性細胞を含む毛包形成用の組成物の毛包誘導能の品質を管理する方法であって、
　　組成物中の一部又は全部の細胞群を取得し、
　　ＤＳ細胞中のＣＤ３６の発現を指標として、ＣＤ３６発現が所定の値より高い場合に、当該組成物が毛包誘導能を決定する
　を含む、前記品質管理方法。
［２］　　前記指標が、ＤＳ細胞中のＣＤ３６陽性ＤＳ細胞の割合であり、当該割合が所定の割合以上の場合に、毛包誘導能を有すると決定する、項目［１］に記載の品質管理方法。
［３］　ＤＳ細胞中のＣＤ３６陽性ＤＳ細胞の割合が、所定の割合以下の場合、前記組成物に対して、ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞を選別する細胞ソーティングにかけて、所定の割合以上のＣＤ３６陽性ＤＳ細胞を取得することを含む、項目［２］に記載の品質管理方法。
［４］　さらに組成物中の一部の細胞群を取得し、
　当該細胞群に対しアルカリホスファターゼ活性を測定し、
　アルカリホスファターゼ活性を指標としてアルカリホスファターゼ活性が所定の値より高い場合に、当該組成物が毛包誘導能を有すると決定する、
　を含む、項目１～３のいずれか１項に記載の品質管理方法。
［５］　さらにＲＧＳ５発現性ＤＳ細胞の割合を指標として、当該割合が所定の値よりも高い場合に、当該組成物が高い毛包誘導能を有すると決定することを含む、項目［１］～［４］のいずれか１項に記載の品質管理方法。
［６］　前記真皮毛根鞘由来の細胞が、真皮毛根鞘カップ由来の細胞である、項目［１］～［５］のいずれか１項に記載の品質管理方法。
［７］　真皮毛根鞘（ＤＳ）由来のＣＤ３６陽性細胞を含む毛包形成用の組成物であって、ＤＳ細胞中のＣＤ３６陽性ＤＳ細胞の割合が所定の値以上である、前記組成物。
［８］　前記真皮毛根鞘由来の細胞が、真皮毛根鞘カップ（ＤＳＣ）由来の細胞である、項目［６］に記載の組成物。

　本発明の真皮毛根鞘由来のＣＤ３６陽性細胞を含む毛包形成用の組成物の毛包誘導能の品質を管理する方法を用いることにより、移植前の組成物の品質の管理が容易になる。

毛包組織の構造を示す模式図。抗ＣＤ３６抗体を用いた毛包の蛍光染色写真。ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞とＣＤ３６陰性ＤＳ細胞とにおけるアルカリホスファターゼ活性の差異を示す写真。ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞とＣＤ３６陰性ＤＳ細胞とにおけるアルカリホスファターゼ活性を数値化して示した表。ＣＤ３６陽性のＤＳＣ由来の細胞と、ＣＤ３６陰性のＤＳＣ由来の細胞とにおけるアルカリホスファターゼ活性の差異を示す写真。ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞とＣＤ３６陰性ＤＳ細胞において、ＣＤ３６とＲＧＳ５を免疫染色して示す写真。ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞と、ＣＤ３６陰性ＤＳ細胞における間葉系幹細胞発現性遺伝子の差を示す表。ヒトＤＳ細胞（ＣＤ３６陰性又は陽性）と、マウス真皮細胞と、マウス表皮細胞とを混合した移植物を免疫不全マウスの皮膚に移植し、移植後の毛包再生能力を示す写真。ヒトＤＳ細胞（ＣＤ３６陰性又は陽性）と、マウス真皮細胞と、マウス表皮細胞とを混合した移植物において、マウス真皮細胞の細胞数を変化させ、免疫不全マウスの皮膚に移植し、移植後の毛包再生能力を示す写真。

　本発明は、ＤＳ細胞中のＣＤ３６発現を指標とする、真皮毛根鞘由来のＣＤ３６陽性細胞を含む毛包形成用の組成物について毛包誘導能の品質を管理する方法を提供する。かかる方法は以下の：
　　組成物中の一部又は全部の細胞群を取得し、
　　ＤＳ細胞中のＣＤ３６の発現を指標として、ＣＤ３６発現が所定の値より高い場合に、当該組成物が毛包誘導能を決定する
　ことにより、毛包誘導能について品質を管理することができる。

　本発明で用いられる真皮毛根鞘由来のＣＤ３６陽性細胞とは、真皮毛根鞘に由来する細胞のうち、細胞表面にＣＤ３６を発現している細胞であり、抗ＣＤ３６抗体により認識が可能な細胞のことをいう。一方でＣＤ３６発現性細胞とは、ＣＤ３６遺伝子を発現している細胞であり、転写されたＣＤ３６のｍＲＮＡがＰＣＲなどにより検出可能であればよく、ＣＤ３６陽性細胞とＣＤ３６発現性細胞は、厳密な意味では異なるものの、同じ意味で使用される場合もある。

　ＣＤ３６抗原はトロンボスポンジン受容体とも称される。ＣＤ３６は脊椎動物の多くの細胞型の表面に見られる膜内在性タンパク質であり、ＦＡＴ、ＳＣＡＲＢ３、ＧＰ８８、糖タンパク質ＩＶ（ｇｐＩＶ）や糖タンパク質ＩＩＩｂ（ｇｐＩＩＩｂ）としても知られている。ＣＤ３６は細胞表面タンパク質のクラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである。ＣＤ３６はトロンボスポンジンの他に、コラーゲン、熱帯熱マラリア原虫が寄生した赤血球、酸化低密度リポタンパク質、天然リポタンパク質、酸化リン脂質、長鎖脂肪酸などの多くのリガンドと結合する。遺伝子改変齧歯動物を用いる最近の研究では、脂肪酸や糖代謝、心臓病、味覚、及び腸内の食物性脂肪輸送において、ＣＤ３６の明確な役割を確認してきた。ＣＤ３６は、耐糖能障害、粥状動脈硬化、動脈高血圧症、糖尿病、心筋症、及びアルツハイマー病に関与しうる。

　ＣＤ３６発現性のＤＳ細胞が、ＨＧＦの発現を介して、血管内皮細胞の増殖を促進し、それにより毛乳頭への分化又は毛乳頭の活性化に寄与する可能性が示され、ＣＤ３６発現性の結合組織鞘細胞を含む毛包再生するための組成物が知られている（特許文献１）。さらに本発明者らにより、ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞が、高いアルカリホスファターゼ活性を示し（図３及び図４）、かつＲＧＳ５をはじめ複数の間葉系幹細胞関連因子（ＮＧＦＲ、Ｎｅｓｔｉｎ、ＡＬＣＡＭ、ＰＤＧＦＲβ）の発現量が高いことが示されたことから、ＣＤ３６を発現するＤＳ細胞が、間葉系幹細胞としての能力、すなわち自己増殖性と多能性も持つと考えられる。ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞のこれらの能力により、毛包の再生能力、すなわち、毛包誘導能力を発揮される。しかしながら、ＣＤ３６をマーカーとして選択されたＣＤ３６陽性細胞を含む毛包形成用の組成物であっても、その毛包誘導能は培養条件などに左右されて異なるものであり、所望される毛包誘導能が達成されていないことがある。そこで、本発明の品質管理方法により、毛包形成用組成物の毛包誘導能を管理することができる。

　ＣＤ３６の発現は、細胞生物学の分野で知られている抗体を用いた任意の方法により検出してもよいし、定量的ＰＣＲを用いて検出してもよい。抗体を用いた方法として、ウエスタンブロットや蛍光免疫染色が挙げられる。ＣＤ３６陽性細胞の割合は、蛍光免疫染色を行った後に目視により、又は市販のプログラムを用いて計数を行うことにより決定することができるし、フローサイトメトリーにより割合を算出することもできる。

　指標となるＣＤ３６の発現は、「所定の値」と記載されており、ＣＤ３６の発現がかかる所定の値を超えた場合に、毛包誘導能を有すると決定することができる。所定の値については、必要とされる毛包誘導能に応じて適宜選択することができ、所定の値以下において毛包誘導能が生じないことを規定するものではない。ＣＤ３６発現の所定の値は、使用するＣＤ３６発現の計測方法によって変わりうる。当業者であれば、３次元培養皮膚モデルや実験動物への投与を行うことにより、各計測系に応じて指標となるＣＤ３６の発現の値を適宜決定することが可能である。一方で、毛髪を再生のため、ヒトへの移植を行う観点からは、指標となる値はヒトへのインビトロ又はインビボ試験を介して決定されるべきである。指標は、好ましくはＤＳ細胞中のＣＤ３６陽性ＤＳ細胞の割合であり、指標となる割合は、所望の発毛を達成する観点と、所望の毛密度を達成する観点から適宜選択することができる。

　本発明で品質管理が行われる毛包形成用の組成物は、ＣＤ３６陽性細胞を含んでおり、ＤＳから細胞を培養した培養物であってもよいし、ＣＤ３６に対する抗体を利用したセルソーティング技術を用いることにより、ヘテロな細胞群であるＤＳ細胞群からＣＤ３６発現性の細胞を選別することにより取得されてもよい。セルソーティングの方法としては、発現するタンパク質に基づき細胞を分離することができれば任意の方法であってよく、磁気ビーズを用いた方法（ＭＡＣＳ）であってもよいし、フローサイトメトリーを用いた方法（ＦＡＣＳ）であってもよい。本発明で品質管理される組成物は、ＣＤ３６発現性のＤＳ由来の細胞に対しセルソーティングを行い選別した細胞を培養に供して増殖させて組成物としてもよいし、選別した細胞群をそのまま組成物としたものであってもよい。

　本発明の品質管理方法により、ＣＤ３６発現が所定の値より低い場合には、当該組成物を廃棄してもよい。さらに別の態様では、ＣＤ３６発現が所定の値より低い場合には、さらにＣＤ３６抗体を用いたセルソーティングを行うことで、ＣＤ３６発現が高い組成物を取得する工程を含んでもよい。その場合、再度、本発明の品質管理方法により、毛包誘導能を確認することが必要となる。

　本発明の品質管理方法は、間葉系幹細胞関連因子の発現を指標として、組成物が高い毛包誘導能を有するか否かを決定することもできる。間葉系幹細胞関連因子の発現を指標とした品質管理方法は、本発明のＣＤ３６発現を指標とした品質管理方法に加えて行われてもよいし、独立に行われてもよい。

　本発明において「間葉系幹細胞関連因子」とは、ＲＧＳ５、ＰＤＧＦβ、ＮＧＦＲ、ネスチン、ＡＬＣＡＭなどを指し、これらの因子は間葉系幹細胞で発現し、間葉系幹細胞としての能力、すなわち自己増殖性と多能性に寄与すると考えられる。したがって、これらの因子を発現を指標とすることにより、ＣＤ３６陽性細胞を含む毛包形成用組成物の毛包誘導能を確認することができる。

　間葉系幹細胞関連因子の一種であるＲＧＳ５は、Ｇタンパク質シグナル調節タンパク質であり、細胞質内に存在し、主に血管周囲の周皮細胞で発現することが知られている(非特許文献９）。また、皮膚中の血管周皮細胞が一種の間葉系幹細胞としての役割を担い、皮膚再生に再構成に関与することが近年報告されている(非特許文献１０)。これらより、ＲＧＳ５を発現する細胞は、周皮細胞としての性質を持ちつつも、間葉系幹細胞として働くことが理解される。さらに、本発明者らが、ＲＧＳ５が、ＣＤ３６陽性のＤＳ細胞において高発現していることを見いだした（図６及び７）ことから、ＲＧＳ５の発現を毛包誘導能の指標として用いて、当該組成物がさらに高い毛包誘導能を有することを決定してもよい。

　間葉系幹細胞関連因子の一種であるＰＤＧＦＲｂｅｔａは血小板由来成長因子受容体であり、血管周皮細胞特異的な発現が報告されており、ＲＧＳ５と同様に間葉系幹細胞として働くことが理解される（Winkler EA, Bell RD, Zlokovic BV Pericyte-specific expression of PDGF beta receptor in mouse models with normal and deficient PDGF beta receptor signaling. Molecular neurodegeneration 5: 32；非特許文献１１）。

　間葉系幹細胞関連因子の一種であるＮＧＦＲ(nerve growth factor receptor, p75NTR) は、ＬＮＧＦＲならびにＴＮＦＲスーパーファミリーに属しており、中枢神経系および末梢神経系の細胞に発現している分子として見いだされ、神経細胞の発生、生存、分化に関わることが示唆されていた。近年、神経系以外では間葉系幹細胞、骨髄ストローマ細胞で発現するマーカー因子として認識されている（Jones EA, Kinsey SE, English A, Jones RA, Straszynski L et al. (2002) Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells. Arthritis and rheumatism 46(12): 3349-3360；非特許文献１２及びQuirici N, Soligo D, Bossolasco P, Servida F, Lumini C et al. (2002) Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies. Experimental hematology 30(7): 783-791；非特許文献１３）。

　細胞内中間径フィラメントの一種であるＮｅｓｔｉｎも、神経系で発現する神経幹細胞のマーカーとして認識されていたが、近年では様々な間葉系幹細胞でも発現する因子として報告されている（Mendez-Ferrer S, Michurina TV, Ferraro F, Mazloom AR, Macarthur BD et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature 466(7308): 829-834；非特許文献１４）。ＡＬＣＡＭ(Activaed leukocyte cell adhesion molecule)も同様に、間葉系幹細胞での発現が知られている。

　間葉系幹細胞関連因子の発現は、細胞生物学の分野で知られている抗体を用いた任意の方法により検出してもよいし、定量的ＰＣＲを用いて検出してもよい。抗体を用いた方法として、ウエスタンブロットや蛍光免疫染色が挙げられる。ＲＧＳ５陽性細胞の割合は、蛍光免疫染色を行った後に目視により、又は市販のプログラムを用いて計数を行うことにより決定することができるし、フローサイトメトリーにより割合を算出することもできる。

　指標となる間葉系幹細胞関連因子の発現は、「所定の値」と記載されており、間葉系幹細胞関連因子の発現がかかる所定の値を超えた場合に、毛包誘導能を有すると決定することができる。本発明に使用されうる間葉系幹細胞関連因子は、個別に独立して、又は組み合わせて使用することができる。所定の値については、必要とされる毛包誘導能に応じて適宜選択することができ、所定の値以下において毛包誘導能が生じないことを規定するものではない。間葉系幹細胞関連因子発現の所定の値は、使用する間葉系幹細胞関連因子発現の計測方法によって変わりうる。当業者であれば、３次元培養皮膚モデルや実験動物への投与を行うことにより、各計測系に応じて指標となる間葉系幹細胞関連因子の発現の値を適宜決定することが可能である。一方で、毛髪を再生のため、ヒトへの移植を行う観点からは、指標となる値はヒトへのインビトロ又はインビボ試験を介して決定されるべきである。指標は、好ましくはＤＳ細胞中の間葉系幹細胞関連因子発現性ＤＳ細胞の割合であり、指標となる割合は、所望の発毛を達成する観点と、所望の毛密度を達成する観点から選択することができる。

　本発明の品質管理方法により、間葉系幹細胞関連因子発現が所定の値より低い場合には、当該組成物を廃棄してもよい。さらに別の態様では、間葉系幹細胞関連因子発現が所定の値より低い場合には、さらにＣＤ３６抗体を用いたセルソーティングを行うことで、間葉系幹細胞関連因子の発現が高い組成物を取得する工程を含んでもよい。その場合、再度、本発明の品質管理方法により、毛包誘導能を確認することが必要となる。

　本発明の品質管理方法により、毛包誘導能を有する組成物を均一に生産することが可能になることから、本発明の品質管理方法は、製造方法ということもできる。

　毛包誘導能とは、皮膚又は３次元培養皮膚モデルにおいて、毛包の形成を促す能力をいい、さらに毛周期の退行期や休止期にある毛包を活性化し成長期へと誘導する能力をいうこともある。毛包誘導能を有する組成物は、移植後に、毛包を形成することを介して発毛を促進することができ、さらには毛髪密度や毛髪径の増大することができる。

　アルカリホスファターゼは、アルカリ性条件下でリン酸エステル化合物を加水分解する酵素のことをいう。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性を有する未分化細胞がアルカリホスファターゼ活性を有することが知られており、多能性マーカーとして用いられている(非特許文献７）。一方で、成長期の毛乳頭細胞において、特異的にアルカリホスファターゼ活性が見られることが知られており(非特許文献８)、さらには、ＤＳ領域の一部において、成長期の初期にアルカリホスファターゼ活性が高いことが知られていた（非特許文献６）。これらの知見により、ＡＬＰ活性は発毛との関連が示唆され、毛乳頭やＤＳなどの毛包における間葉系細胞におけるＡＬＰ活性は、発毛誘導能と相関を示すことが分かり、実際に毛包誘導能が低下した毛乳頭細胞ではＡＬＰ活性が低下していることを我々は確認している。（未公表実験結果）。これらの知見を統合して、ＤＳ領域においてアルカリホスファターゼ活性を有する細胞が、毛乳頭へと分化又は毛乳頭を活性化でき、毛包誘導能が高いと考えられる。本実施例において、ＣＤ３６抗体によりセルソーティングされたＣＤ３６陽性細胞が、ＣＤ３６陰性細胞に比較して高いＡＬＰ活性を示すことが明らかにされ（図３、図４、及び図５）、ＣＤ３６陽性細胞と毛包誘導能との関係が示された。

　したがって、本発明のさらなる態様では、本発明の品質管理方法は、ＡＬＰ活性を指標として、ＣＤ３６陽性細胞を含む毛包形成用の組成物が高い毛包誘導能を有するか否かを決定することもできる。ＡＬＰ活性を指標とした品質管理方法は、本発明のＣＤ３６発現を指標とした品質管理方法に加えて行われてもよいし、独立に行われてもよい。

　ＡＬＰ活性の測定は、細胞生物学の分野で用いられるＡＬＰ活性測定方法であれば任意の方法を用いることができる。ＡＬＰ活性測定方法の一例として、細胞に対し基質としてナフトールASMXリン酸エステルを添加して、アルカリホスファターゼの作用によりナフトール誘導体を生成し、かかるナフトールをジアゾニウム染色することで紫色の呈色を生成することで測定することができる。細胞におけるＡＬＰ活性を測定する方法として、染色法や細胞溶解液を用いる手法があるが、ＡＬＰは、細胞膜、細胞内に存在しているため、生細胞を用いて評価することは不可能であり、生細胞において高ＡＬＰ活性すなわち高毛包誘導活性を示すものを選別、濃縮することは不可能である。したがって、ＡＬＰ活性を指標とする毛包形成用組成物の管理方法では、組成物中から一部の細胞群を取得する工程が含まれる。この工程ではさらに、細胞数を計測して、シャーレやプレパラートなどに所定数の細胞を配置する工程が含まれうる。一部の細胞群を取得後に、配置された所定数の細胞に対してＡＬＰ染色を行い、吸光度の測定によりＡＬＰ活性を決定することもできる。この際、細胞を溶解させてＡＬＰ活性を測定してもよいし、細胞を固定してＡＬＰ活性を測定してもよい。一方で、吸光度ではなく、染色された細胞数の割合を算出することでＡＬＰ活性を決定することもできる。染色された細胞数の割合は、目視で観察して算出することもできるし、市販のプログラムを用いて算出されてもよい。

　指標となるＡＬＰ活性の値は、「所定の値」と記載されており、ＡＬＰ活性がかかる所定の値を超えた場合に、毛包誘導能を有すると決定することができる。所定の値については、必要とされる毛包誘導能に応じて適宜選択することができ、所定の値以下において毛包誘導能が生じないことを規定するものではない。ＡＬＰ活性の所定の値は、使用するアルカリホスファターゼ活性測定方法によって変わりうるが、当業者であれば、３次元培養皮膚モデルや実験動物への投与を行うことにより、活性測定方法に応じて指標となるＡＬＰ活性を適宜決定することが可能である。一方で、毛髪を再生のため、ヒトへの移植を行う観点からは、指標となる値はヒトへのインビトロ又はインビボ試験を介して決定されるべきである。

　本発明の品質管理方法により、ＡＬＰ活性が所定の値より低い場合には、当該組成物を廃棄してもよい。さらに別の態様では、ＡＬＰ活性が所定の値より低い場合には、さらにＣＤ３６抗体を用いたセルソーティングを行うことで、ＡＬＰ活性が高い組成物を取得する工程を含んでもよい。その場合、再度、本発明の品質管理方法により、毛包誘導能を確認することが必要となる。

　ＡＬＰ活性測定のためのキットが各種市販されており、例えばＢＭ　ｐｕｒｐｌｅ(Roche)やラボアッセイＡＬＰ（Wako）などを用いて染色することができる。しかしながら、通常ＡＬＰ活性の計測には細胞を固定又は溶解する必要があることから、組成物の全てに対してＡＬＰ活性を測定することはできず、一部の細胞群をサンプリングして、ＡＬＰ活性測定に供される。

　毛包は、毛を取り囲む組織であり、毛とともに毛器官を構成する。毛包は、上皮性成分から構成される内毛根鞘及び外毛根鞘と、結合組織性成分から構成される真皮毛根鞘（ＤＳ）とから構成されており、その境界は基底膜により隔てられている（図１）。毛器官の最深部には球状に膨れた毛球が存在しており、毛球中に毛乳頭を取り囲むように毛母細胞が存在し、毛母細胞が増殖、分化、角化することにより毛が形成される。毛球部を取り囲んでいる真皮毛根鞘（ＤＳ）のうち毛乳頭に近い基底部位を特に真皮毛根鞘カップ（ＤＳＣ：Dermal Sheath Cup）と呼び、ＤＳＣに存在する細胞が毛乳頭への分化及び毛乳頭の活性化に寄与していると考えられている。

　本発明における「毛包形成」とは、毛器官のうち毛包を形成することをいい、３次元培養皮膚モデルにおいて毛包を形成すること、又は哺乳動物、特にヒトにおいて毛包を形成することをいう。哺乳動物に本発明により品質管理された組成物を移植する場合、新たに毛包が形成してもよいし、休止期にある毛包に作用して、毛包の再活性化を促進してもよい。毛包の新たな形成と毛包の再活性化とを区別して、又は区別せずに、毛包の再生という用語を使うこともある。本発明により品質管理された組成物は、毛包の形成を通して新しい毛の伸張及び／又は発毛を促進することができる。組成物が、毛包の形成を促進することができる能力を、毛包誘導能という。

　真皮毛根鞘（ＤＳ）細胞は、真皮毛根鞘に存在する細胞であり、間葉系細胞の一種である。真皮毛根鞘（ＤＳ；Dermal seath)は、結合組織性毛鞘や結合組織鞘とも呼ばれることもあり、上皮性の外毛根鞘を取り囲む真皮性の組織である。本発明により品質管理された組成物に含まれるＤＳ細胞は、好ましくは真皮毛根鞘（ＤＳ）のうち特に毛乳頭に隣接する基底部位から毛乳頭の高さ付近までにあたる領域である真皮毛根鞘カップ（ＤＳＣ）領域に存在する細胞である。ＤＳ細胞は、組織から初代培養により取得された細胞であってもよいし、継代培養により取得された細胞であってもよく、また、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、及びＥＳ細胞から分化誘導されて得られた細胞であってもよい。移植を行う観点から、移植対象のＤＳから取得した細胞を継代培養により増殖させた細胞が好ましい。

　ＤＳ細胞は、ＤＰ細胞と同様に間葉系細胞に分類され、ＤＰはＤＳ、特にＤＳＣに由来するとされ、発毛期でのＤＰ増殖に先駆けてＤＳが増殖することから、ＤＳ、特にＤＳＣがＤＰ細胞を供給すると考えられている（Tobin DJ et al., J. Invest. Dermatol., 120:895-904, 2003;非特許文献４)。ＤＳは、ヘテロな細胞群から構成されており、毛周期の休止期から成長期のあいだに分裂と移動を伴い下降し、その一部が毛乳頭（ＤＰ）へと分化して、毛の伸張が開始されると考えられている。

　本発明により品質管理された組成物に含まれるＤＳ細胞は、あらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットの表皮に由来し得るが、ヒトへの移植や、研究用の３次元培養皮膚モデルの製造の観点から、ヒト由来の細胞が好ましい。また、その表皮部位は有毛部位、例えば頭皮でも、無毛部位、例えば包皮であってもよい。

　ＤＳ細胞及びＤＰ細胞は、任意の方法により単離されてもよく、例えば毛包組織をバイオプシーにより取得し、ダイセクションにより外毛根鞘や内毛根鞘を除去し、目的の部位、例えばＤＳ、特にＤＳＣ、又はＤＰを分離した後に、酵素処理を経て、培地中で培養することができる。酵素処理としては、細胞分離に用いられる任意の酵素が用いられてもよいが、例えばコラゲナーゼやliberase（Roche Applied Science）を用いることができる。当業者であれば目的の細胞を培養するのに適した培地を適宜選択することができ、例えばＤＳ、ＤＳＣ、及びＤＰの培養には、間葉系細胞の培養に用いられる培地を用いることができる。この培地は、血清添加培地又は無血清培地のいずれであってもよいが、ヒトへの移植を行う観点では、無血清培地が好ましい。

　本発明により品質管理された毛包を形成するための組成物は、移植後の皮膚において、又は３次元培養皮膚において毛包を形成又は再生して、毛器官を形成することを目的としており、最終的には毛の伸張及び/又は発毛の促進を目的とする。毛包の形成に寄与する細胞は、必ずしも単一の細胞ではなく、ヘテロな細胞群が共同的に作用することで毛包が形成又は再生すると考えられることから、本発明により品質管理された毛包を形成するための組成物は、ＤＳ細胞のみであってもよいし、ＤＳ細胞の他に上皮及び毛器官に存在する任意の細胞を含んでいてもよい。ＤＳ細胞以外の細胞として、ＤＳ細胞以外の間葉系細胞、例えば毛乳頭（ＤＰ）細胞、や上皮系細胞、例えば内毛根鞘又は外毛根鞘の細胞が含まれてもよい。

　本発明により品質管理された組成物中に、ＤＰ細胞が含まれる場合、組成物中に含まれるＤＳ細胞、対、ＤＰ細胞の使用する比率は限定されるわけではないが、好ましく組成物の中に１：１０～１０：１、より好ましくは１：３～３：１で含ませてもよい。さらに、ＤＳ細胞とＤＰ細胞の総量に対し、上皮系細胞を１：１０～１０：１、更に好ましくは１：１～１０：１、更により好ましくは１：１～３：１、最も好ましくは１：１にて含ませてもよい。

　毛乳頭（ＤＰ）細胞とは、間葉系細胞として毛包基底部に位置し、毛包の自己再生のために毛包上皮幹細胞に活性化シグナルを送る、いわば司令塔の役割を担っている細胞をいう。活性化毛乳頭細胞のみを含有する毛乳頭細胞調製品は、例えばトランスジェニックマウスを使用したKishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), Vol.96, pp. 7336-7341に記載の方法により調製できる。

　「上皮系細胞」は、皮膚の表皮または上皮の大部分を構成する細胞であり、真皮に接する１層の基底細胞から生じる。マウスを例にすると、上皮系細胞としては新生仔（もしくは胎児）に由来する上皮系細胞が好ましく使用できるが、成熟した皮膚、例えば休止期毛の上皮又は成長期毛の上皮に由来する細胞でも、ケラチノサイトの形態にある細胞の培養物であってもよい。かような細胞は、当業者周知の方法により所望のドナー動物の皮膚から調製することができる。

　本発明により品質管理された組成物中に含まれるＤＰ細胞や上皮系細胞は、ＤＳ細胞と同様、あらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットの皮膚に由来し得るが、ヒトへの移植や、研究用の３次元培養皮膚モデルの製造の観点から、ヒト由来の細胞が好ましい。

　本発明により品質管理された組成物をレシピエント動物に移殖する方法は、それ自体公知の移殖方法によることができる。例えば、Weinberg et al, J. Invest. Dermatol. Vol.100(1993), pp.229-236を参照のこと。さらに別の方法として、本発明により品質管理された組成物を注射針等の細胞移植用デバイスにより皮膚へ投与する方法により移植が行われる。任意の皮膚領域を選択することができるが、ヒトに用いる観点から、好ましくは頭皮、特に頭皮のうち毛が少ない領域に組成物が移植される。頭皮の上皮又は表皮に移植された細胞は、損傷を受けた毛包や休眠毛包へと移動し、毛包の活性化を促すこともあるし、新たな毛包の形成を促すこともある。ヒトを含む動物に発毛を目的に移植を行う場合には、医師や獣医により適切な方法が適宜決定されるであろう。

　更に、本発明により品質管理された組成物を３次元培養皮膚モデルに含包させることで、再生毛包を担持する３次元培養皮膚モデルを提供することができる。ただし、この場合には、発毛の司令塔となる毛乳頭細胞は必須である。３次元培養皮膚モデルは当業者周知の方法（Exp.Cell Res. Amano S. et al., (2001), Vol.271, pp.249‐362）により、例えば下記のようにして作製することができる。３次元培養皮膚モデルはＤＳｃ及びＤＰｃをそれぞれ１×１０⁶～１０⁸個／ｃｍ²、好ましくは１．０～１．５×１０⁷個／ｃｍ²、より好ましくは約１．２７×１０⁷個／ｃｍ²の量で含む。

　３次元培養皮膚モデルは、従来技術で知られている３次元培養皮膚モデルの製法において、本発明により品質管理された組成物を使用することにより製造することができる。例えば、ヒト線維芽細胞を０．１％コラーゲン溶液／ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに適当量分散させ、シャーレに分注し、直ちに３７℃のＣＯ₂インキュベータに静置する。ゲル化後、シャーレ壁面および底面よりゲルを剥がし、シャーレの中で浮遊するようにさせる。コラーゲンゲルを揺らしながら培養し、ゲルを約５分の１に収縮させ真皮モデルとする。真皮モデルをステンレスグリッドの上に置き、その上にガラスリングをセットし、ＫＧＭ（表皮細胞培養用培地）に分散したヒト培養表皮細胞（１．０×１０⁶細胞数／ｍｌ）を０．４ｍｌ、ガラスリング内に注入し、培養する。このとき、本発明により品質管理された組成物を同時に混合して注入する。ヒト培養表皮細胞の代替としてマウス新生児表皮細胞を用いることもできる。シャーレ内にＤＭＥＭ‐ＫＧＭ‐５％ＦＢＳ＋Ｃａ²⁺の培地を、真皮モデルの上部が空気に晒される程度に入れ、培養し、約一週間後に皮膚モデルを観察し、毛包原基形成の有無と再現性を判定する。

　再構成毛包を担持した３次元培養皮膚モデルは、毛包の再生の機構を研究・解明や発毛・脱毛に有効な薬剤・生薬のスクリーニングに利用できる。

実施例１：細胞培養
　ヒト頭皮組織を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ（Gibco/invitrogen）中で、真皮部分をメスで除去し、切断面より毛包を取り出した。精密ピンセットを用いて毛包から、ＯＲＳを含む毛幹を除去しＤＳ領域及びＤＳＣ領域を取り出した。単離ＤＳ及び単離ＤＳＣに対し、３７℃にてコラゲナーゼ（sigma社）処理を４０分間行った後、medium-1(１０％ウシ胎児血清、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、０．０００７５％　βメルカプトエタノール、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ（力価）、ストレプトマイシン　０．１ｍｇ／ｍｌ（力価）、アンフォテリシンＢ　０．２５μｇ／ｍｌ（力価）含有ニッスイ繊維芽細胞用低血清培地)を含むコラーゲンコート３５ｍｍディッシュ（Iwaki）上で静置培養した。１週間経過後、増殖を確認したのち、ＤＳ細胞として実験サンプルとして用いた。

　単離したＤＳ細胞及びＤＳＣ細胞はmedium-1により７～１０日、静置培養を行った。その後、トリプシンを用い細胞の継代をおこなった。培養条件は３７℃、５％ＣＯ₂で、コラーゲンコートフラスコＴ－７５（Iwaki）を培養容器として用いた。実験に供した各細胞は１回～３回継代したものを用い、継代中、実験時にはＭｅｓｅｎＰｒｏ　ＲＳ　ｍｅｄｉｕｍ　（Life technologies）を培地として用い、２～３日ごとに培地交換した。

実施例２：細胞ソーティング
　ＭｉｎｉＭＡＣＳｓｅｐａｒａｔｏｒ（Miltenyl Biotec）を用いて細胞を分画した。操作条件はMiltenyl Biotecの提示したプロトコールに従って行った。トリプシン溶液を用いて、実施例１で培養された細胞を剥離後、細胞懸濁液をＰｒｅ－ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｆｉｌｔｅｒ(Miltenyl Biotec)に通し、細胞数をカウントした。５００～８００万個の細胞を１００μｌのＢｕｆｆｅｒ１　（０．５％　ＢＳＡ（sigma）、２ｍＭ　ＥＤＴＡ含有のＰＢＳ溶液）にて懸濁し、その中にＣＤ３６抗体（Abcam,ab17044）を５０倍希釈となるように加えて、１５分ほど冷蔵庫にて反応させた。Ｂｕｆｆｅｒ１を用いて洗浄、遠心操作にて細胞を回収後、８０μｌのＢｕｆｆｅｒ１にて再懸濁し、２０μｌの抗マウスＩｇＧ１　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Miltenyl Biotec）を加え、冷蔵庫にて１５分反応させた。Ｂｕｆｆｅｒ１を用いて洗浄、遠心操作にて細胞を回収後、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ１を加え、Ｍｉｎｉ　ＭＡＣＳ　ｓｅｐａｒａｔｏｒ、ＭＳ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（Miltenyl Biotec）を用いて、ＣＤ３６陽性細胞をソーティングした。Ｂｕｆｆｅｒ１にて洗浄中に流出した細胞をＣＤ３６陰性細胞とし、３回洗浄後に磁石により間接的に吸着している細胞を回収し、これをＣＤ３６陽性細胞とした。回収されたＣＤ３６陽性、陰性ＤＳ細胞、及びＣＤ３６陽性、陰性ＤＳＣ細胞は、ＭｅｓｅｎＰｒｏ　ＲＳ　ｍｅｄｉｕｍ（Life technologies）にて懸濁後、ＴｙｐｅＩＶコラーゲンコートフラスコＴ－２５（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培養容器として用い、３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で４～８日培養したものを続く実験に用いた。

実施例３：アルカリホスファターゼ活性の測定
　実施例２にてソーティングされたＣＤ３６陽性ＤＳ細胞及びＣＤ３６陰性ＤＳ細胞、並びにＣＤ３６陽性ＤＳＣ細胞及びＣＤ３６陰性ＤＳＣ細胞をそれぞれ６ウェルディッシュ(BD biosciences)に播種後、３７℃５％ＣＯ₂条件下で、セミコンフルエントになるまで培養を行った。ＰＢＳで洗浄した後、４％ＰＦＡで１５分間インキュベートして固定し、ＰＢＳにて洗浄し、ＢＭ　ｐｕｒｐｌｅ (Roche)を加えて発色反応を３０分ほど行い、ＰＢＳにて洗浄した。ＡＬＰ活性を示す青色に染色された細胞を顕微鏡（Olympus）を用い撮影を行った（図３及び図５）。

　実施例２にてソーティングされたＣＤ３６陽性ＤＳ細胞及びＣＤ３６陰性ＤＳ細胞をそれぞれ６ウェルディッシュ(BD biosciences)に播種後、セミコンフルエントになるまで培養を行い、ＰＢＳで洗浄した後、０．０５％トリトンＸ含有のＰＢＳを各ウェルに１００μＬ添加しスクレーバーを用いて、細胞溶解液をアシストチューブに回収した。凍結融解を二回繰り返した後、４℃、１５分、１５，０００ｒｐｍにて遠心処理して、上澄みを新しいアシストチューブに移しこれをサンプルとした。続けて、ラボアッセイＡＬＰ（Ｗａｋｏ）を用いて、Ｗａｋｏの提示したプロトコールに従って行った。サンプル中のＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）によりｐ－ニトロフェニルリン酸はｐ－ニトロフェノールとリン酸に分解され、生成したｐ－ニトロフェノールはアルカリ性側で黄色を呈する。この４０５ｎｍの吸光度を吸光プレートリーダーで測定することにより検体中のアルカリホスファターゼ活性値を求めた。なお、基質反応条件は３７度、１５分である。ＡＬＰ活性が既知の標準液希釈系の４０５ｎｍの吸光度を求め、検量線をひき、これをもとにサンプル中のＡＬＰ活性を算出して示した（図４）。

実施例４：免疫細胞染色
　ＣＤ３６抗体、ＲＧＳ５抗体を用いた細胞染色について、ＴｙｐｅＩ　コラーゲンコート８穴チャンバースライド（BD biosciences）にＤＳｃを播種した後、３－５日培養したものを用いた。ＰＢＳで洗浄した後、４％ＰＦＡで１５分固定、ＰＢＳにて洗浄、３％ＢＳＡ　含有ＰＢＳにて３０分ブロッキング処理を行い、ＣＤ３６抗体（Abcam,ab17044）、ＲＧＳ５抗体（proteintech）を３％ＢＳＡ含有ＰＢＳにてそれぞれ５０倍希釈、200倍希釈した１次抗体溶液にて１時間反応させた。ＰＢＳにて４回洗浄後、Ａｌｅｘａ　５９４標識抗マウスＩｇＧ抗体（Life technologies）、Ａｌｅｘａ　４８８標識抗ラビットＩｇＧ抗体（Life technologies）を３％ＢＳＡ含有ＰＢＳにて２００倍希釈した２次抗体溶液にて１時間反応させた。核染色のためＤＡＰＩ溶液にて反応後、ＰＢＳにて４回洗浄し、褪色防止封入剤Ｖｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ（Vector）とカバーガラスにより封入した。蛍光顕微鏡（Olympus）を用い観察を行った（図６）。

実施例５：組織染色
　ヒト頭皮組織を凍結組織包埋剤ＯＴＣコンパウンド（Sakura Finetek）にて包埋し、凍結切片作成装置クライオスタット（Leica）にて凍結切片スライドを作成した。４％ＰＦＡにて１５分固定した後、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに５％スキムミルク、１％ロバ血清、０．１％ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を加えたブロッキング溶液を用いて１時間反応させた。次に、マウスＣＤ３６抗体溶液（Abcam,ab17044）をブロッキング溶液にて５０倍希釈した１次抗体溶液を用いて、常温１時間あるいは４℃一晩反応させた。ＰＢＳにて３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ　５９４標識抗マウスＩｇＧ抗体（Invitrogen）をブロッキング溶液にてそれぞれ２００倍希釈した２次抗体溶液を用いて常温で１時間反応させた。ＤＡＰＩ溶液にて反応後、ＰＢＳにて３回洗浄し、褪色防止剤Ｐｒｏｌｏｎｇ　Ｇｏｌｄ　Ａｎｔｉｆａｄｅ　Ｒｅａｇｅｎｔとカバーガラスにより封入した。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用い観察を行った。結果を図２に示す。

実施例６：間葉系幹細胞関連因子の定量的ＰＣＲ
　実施例２でソーティングされたＣＤ３６陽性ＤＳ細胞及びＣＤ３６陰性ＤＳ細胞に対して、TRIzol(Invitrogen)を用い、提供されたプロトコールを用いてこれらの細胞からRNAを回収した。回収したRNAは濃度を核酸定量装置Nanodrop(Thermo scientific)により測定した。RNA濃度をそろえた上で、アプライドバイオシステムズ社のプロトコールを用いて、High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitsによりRNAからcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型に反応試薬LightCycler（商標） FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green (Roche)、反応装置LightCycler(Roche)を用いて定量的RT-PCRを行った。組成条件はRocheのプロトコールに従って行った。使用したプライマーは以下の通りである：
G3PDH Forward: 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3',
       Reverse: 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3',
CD36  Forward: 5'-GAGGAACTATATTGTGCCTATTCTTTGGC-3',
       Reverse: 5'-CATAAAAGCAACAAACATCACCACACCAAC-3',
RGS5  Forward: 5'- TGCAAAGGACTTGCAGCTTTGCC-3',
       Reverse: 5'- TCTGGGTCTTGGCTGGTTTCTC-3',
NGFR  Forward: 5'- AAGCAGAACACCGTGTGCGAG-3',
       Reverse: 5'- TGTAATCCAACGGCCAGGGATC-3',
Nestin Forward: 5'- TCAAGATGTCCCTCAGCCTGG-3',
        Reverse: 5'- ACTGGGAGCAAAGATCCAAGACG-3',
PDGFRβ Forward: 5'-AGCCAGAGCTGGAACAGTTG -3',
         Reverse: 5'-CCAGAAGGGGACAGCTGATA-3'
ALCAM   Forward: 5'- GCCTTGGATGGTATACTGTAAATTCAGC -3'
        Reverse: 5'- GGTACATCGTCGTACTGCACAC-3'
　附属のソフトウェアを用いて、各遺伝子の発現量を測定した。なお、G3PDHは内部標準として、用い、各遺伝子それぞれの定量時において、これを用い対照群のcDNA量を補正した。結果を図７に示す。

実施例７：ヒトＤＳ細胞の移植実験
　ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞の毛包再生能力を確認するために、毛包再構成評価系であるパッチアッセイ法を用いて評価を行った。評価対象の細胞を移植するパッチアッセイ法は、非特許文献１５に報告されており、具体的に下記の方法により行った。

パッチアッセイ方法
細胞の調製
　Ｂ５７Ｂ６新生児から皮膚を摘出し、ディスパーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）溶液中にて４℃で一晩静置し、表皮と真皮を分離した。分離された表皮に対しＡｃｃｕｍｍａｘ（Innovative Cell Technologies）を用いることにより、表皮から表皮細胞を分散させた。分散させた表皮細胞を４０μｍナイロンセルストレイナー（ＢＤ　biosciences）に通して、表皮細胞を採取した。分離された真皮に対しディスパーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）及びコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）溶液中で処理することによりさらに酵素分解を行い、真皮細胞を分散させた。分散させた真皮細胞を４０μｍナイロンセルストレイナーに通して、真皮細胞を採取した。

細胞の計数
　調製された表皮細胞及び真皮細胞、並びに実施例２で調製したＣＤ３６陽性ＤＳ細胞及びＣＤ３６陰性ＤＳ細胞の細胞懸濁液の一部を別のチューブに移し、等量のトリパンブルー溶液を添加し、血球計算盤にて細胞数を算出した。これらの細胞を、表１で示す組成で混合し、移植物とした。

移植実験
　イソフルラン麻酔下のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの背中を、移植前に予めバリカンにより毛刈りをしておき、背中皮膚下に、18Gのニードルを刺し、そしてマイクロピペットを用いて上記で調製した移植物を導入した。２週間後、移植部位の皮膚外観及び、皮膚下から再構成毛包の有無等を実体顕微鏡ＳＭＺ　７４５Ｔ（ニコン社）を用いて観察し、ＤＭＣ－ＧＭ１（パナソニック社）を用いて写真撮影した。表１で示す組成の移植物を移植した結果を図８に示す。ヒトＤＳ細胞を含まない場合に比べ、ヒトＣＤ３６陽性ＤＳ細胞を含む移植物を導入した場合、再構成毛包の数が明らかに多くなっており、大きく盛り上がっている像がみとめられた。一方、ヒトＣＤ３６陰性ＤＳ細胞を含む場合は、再構成毛包の数は、ヒトＤＳ細胞を含まないものと比べ、大きな変化は認められなかった。また、ヒトＣＤ３６陽性ＤＳ細胞を含む場合、再構成毛包の周囲に血管が誘導され、血液量が多いことが認められたが、ヒトＣＤ３６陰性ＤＳ細胞を含む場合と、ヒト細胞を含まない移植物の場合、血管の誘導はあまり見られず、血液量が少ないことが認められた。

　次に表２で示す組成の細胞懸濁液を、上記の移植実験と同じ手法により、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの背中皮膚下に移植し、移植後２週間経過時に、移植部位を観察し、写真撮影を行った。

　結果を図９に示す。ヒトＣＤ３６陽性ＤＳ細胞の毛包再生効果をより明確にみるため、マウス真皮細胞の数を減らした移植物を導入した結果、いずれの結果においても、ヒトＣＤ３６陽性ＤＳ細胞を含む場合は、ヒトＣＤ３６陰性ＤＳ細胞を含む場合に比べて、明らかに再構成毛包の数が多かった。以上の結果より、ヒトＣＤ３６陽性ＤＳ細胞は毛包の再構成を促進する能力、すなわち毛包再生を促進する能力を持つ細胞集団であることが示された。

Claims

　真皮毛根鞘（ＤＳ）由来のＣＤ３６陽性細胞を含む毛包形成用の組成物の品質管理方法であって、
　　組成物中の一部又は全部の細胞群を取得し、
　　ＤＳ細胞中のＣＤ３６の発現を指標として、ＣＤ３６発現が所定の値より高い場合に、当該組成物の毛包誘導能を決定する
　を含む、前記品質管理方法。
　前記指標が、ＤＳ細胞中のＣＤ３６陽性ＤＳ細胞の割合であり、当該割合が所定の値以上の場合に、毛包誘導能を有すると決定する、請求項１に記載の品質管理方法。
　ＤＳ細胞中のＣＤ３６陽性ＤＳ細胞の割合が、所定の値以下の場合、前記組成物に対して、ＣＤ３６陽性ＤＳ細胞を選別する細胞ソーティングにかけて、所定の値以上のＣＤ３６陽性ＤＳ細胞を取得することを含む、請求項２に記載の品質管理方法。
　さらにアルカリホスファターゼ活性を指標とし、アルカリホスファターゼ活性が所定の値より高い場合に、当該組成物が毛包誘導能を有すると決定することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の品質管理方法。
　さらにＤＳ細胞における間葉系幹細胞関連因子発現を指標とし、発現が所定の値よりも高い場合に、当該組成物が高い毛包誘導能を有すると決定することを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の品質管理方法。
　前記真皮毛根鞘由来の細胞が、真皮毛根鞘カップ由来の細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の品質管理方法。