WO2023171395A1 - 間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法 - Google Patents
間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023171395A1 WO2023171395A1 PCT/JP2023/006552 JP2023006552W WO2023171395A1 WO 2023171395 A1 WO2023171395 A1 WO 2023171395A1 JP 2023006552 W JP2023006552 W JP 2023006552W WO 2023171395 A1 WO2023171395 A1 WO 2023171395A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- cells
- gene
- cell
- genes
- hair
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 230000003660 hair regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 276
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 102
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims abstract description 29
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims abstract description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 406
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 claims description 69
- 210000004918 root sheath Anatomy 0.000 claims description 42
- 230000003661 hair follicle regeneration Effects 0.000 claims description 31
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 5
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 claims description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 abstract description 40
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 54
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 22
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 8
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 5
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 5
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 4
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000003645 female-pattern hair loss Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000003273 male-pattern hair loss Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 210000002107 sheath cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 description 3
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 description 3
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000601048 Homo sapiens Nidogen-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100037371 Nidogen-2 Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 206010068168 androgenetic alopecia Diseases 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000031774 hair cycle Effects 0.000 description 2
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 2
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001208 inner root sheath cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012174 single-cell RNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000003813 thin hair Effects 0.000 description 2
- 102100026423 Adhesion G protein-coupled receptor E5 Human genes 0.000 description 1
- 102100034594 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037150 BMP and activin membrane-bound inhibitor homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100026252 Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022145 Collagen alpha-1(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100024330 Collectin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 208000003024 Diffuse alopecia Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100021699 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Human genes 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150051115 GREM2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100033299 Glia-derived nexin Human genes 0.000 description 1
- 102100038353 Gremlin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101000718243 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor E5 Proteins 0.000 description 1
- 101000924552 Homo sapiens Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000740070 Homo sapiens BMP and activin membrane-bound inhibitor homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000913913 Homo sapiens Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000901150 Homo sapiens Collagen alpha-1(IV) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000909528 Homo sapiens Collectin-12 Proteins 0.000 description 1
- 101000896557 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Proteins 0.000 description 1
- 101100176574 Homo sapiens GREM2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000997803 Homo sapiens Glia-derived nexin Proteins 0.000 description 1
- 101001032861 Homo sapiens Gremlin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000599782 Homo sapiens Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000972488 Homo sapiens Laminin subunit alpha-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000995801 Homo sapiens Neural proliferation differentiation and control protein 1 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037920 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102100022743 Laminin subunit alpha-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100026261 Metalloproteinase inhibitor 3 Human genes 0.000 description 1
- ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N Minoxidil Chemical compound NC1=[N+]([O-])C(N)=CC(N2CCCCC2)=N1 ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100034619 Neural proliferation differentiation and control protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 102100021258 Regulator of G-protein signaling 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710140412 Regulator of G-protein signaling 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010031429 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002867 adherens junction Anatomy 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 208000004631 alopecia areata Diseases 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000002996 androgenic alopecia Diseases 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000003778 catagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229960004039 finasteride Drugs 0.000 description 1
- DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N finasteride Chemical compound N([C@@H]1CC2)C(=O)C=C[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)NC(C)(C)C)[C@@]2(C)CC1 DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003695 hair diameter Effects 0.000 description 1
- 230000034756 hair follicle development Effects 0.000 description 1
- 238000007417 hierarchical cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 238000003064 k means clustering Methods 0.000 description 1
- 230000003780 keratinization Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 229960003632 minoxidil Drugs 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229940028444 muse Drugs 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126701 oral medication Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 201000001297 telogen effluvium Diseases 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Definitions
- the present invention relates to a method for evaluating the hair regeneration ability of a cell population containing mesenchymal cells.
- hair is produced by hair follicles present in the skin.
- a hair follicle is a tissue layer that surrounds hair, and is composed of the ectoderm-derived hair matrix (hair matrix cells), inner root sheath, and outer root sheath, as well as the mesoderm-derived dermal root sheath, dermal papilla, etc. .
- Hair matrix cells surrounding the dermal papilla are induced to divide repeatedly by nutrients and proteins supplied from the dermal papilla, and form hair by keratinization.
- Thinning hair and alopecia occur due to problems with hair growth. Thinning hair and alopecia include alopecia in the middle years, alopecia areata, and telogen effluvium, with the most common being alopecia in the middle years. Middle age alopecia is mainly caused in men by the influence of male hormones, and is also called androgenetic alopecia. Hair is regrown while repeating a hair cycle consisting of a growth phase, a regression phase, and a resting phase. Male pattern baldness is a symptom caused by a shortening of the growth phase in this hair cycle and an increase in the proportion of thin and short hair.
- the topical drug minoxidil and the oral drug finasteride are mainly used to treat middle-aged hair loss. All of these treatments have been confirmed to be effective and safe, but they are not necessarily effective for all cases of middle age alopecia.
- autologous hair transplantation is being carried out as a treatment for middle age alopecia.
- Autologous hair transplantation is a surgical procedure in which hair including hair roots collected from the temporal region or the back of the head is transplanted to the hair loss area of one's own body.
- this surgical method involves transplanting the patient's own hair to another location, it does not increase the total number of hair.
- Non-patent Document 4 Non-patent Document 1
- An object of the present invention is to provide a method for evaluating the hair regeneration ability of a cell population containing mesenchymal cells.
- DSC cells have been shown to have the potential to be an effective means for hair regeneration, they are considered to be a heterogeneous cell population due to their cell morphology, and the proportion of some cell populations contained in DSC cells may be limited. Increasing the number of cells or activating the cell population was considered effective for improving efficacy. However, until now, no method has been established to identify cell subpopulations that contribute to efficacy contained in DSC cells.
- the present invention includes the following inventions.
- a method for evaluating the hair regeneration ability of a cell population containing mesenchymal cells comprising: (1) A first cell group containing hair bulb root sheath (DSC) cells derived from a specimen evaluated to have hair regeneration ability; and DSC cells derived from a specimen evaluated to have low or no hair regeneration ability determining the expression level of each gene in each single cell included in each of the second cell groups, and creating a gene expression data set including a component indicating the expression level of each gene in each single cell; (2) performing dimension reduction on the gene expression data set of each single cell to create a dimension reduction component of each single cell; (3) Performing clustering processing on the data set representing each single cell plotted based on the dimension reduction component, and identifying a first gene group that characterizes a subpopulation (first cluster) of high-efficiency DSC cells.
- DSC hair bulb root sheath
- the first gene group is significantly highly expressed in the DSC cells of the first cluster compared to subpopulations of DSC cells of the first cell group and second cell group that are not included in the first cluster.
- the evaluation cell population including the mesenchymal cells to be evaluated the expression level of one or more genes included in the first gene group in each single cell or the entire cell population. and evaluating the hair follicle regeneration ability of the evaluation cell population using the level as an index; including methods.
- the step (4) determines the expression level of a gene in each single cell, creates a gene expression data set including components indicating the expression level of each gene in each single cell, and Dimension reduction is performed on the gene expression data set of one cell to create a dimension reduction component for each single cell, and based on the data representing each single cell plotted based on the dimension reduction component, calculating the proportion of cells arranged in the vicinity of one cluster and evaluating the hair follicle regeneration ability of the evaluation cell population; The method described in item 1.
- the first gene group includes the following genes: The method according to item 1 or 2, comprising: [4]
- the first gene group includes the following genes: The method according to item 1 or 2, comprising: [5]
- the first gene group includes the following genes: The method according to item 1 or 2, comprising: [6]
- the step (3) is (3') Clustering is performed on the data set showing each single cell plotted based on the dimension reduction component, and a first gene group characterizing a subpopulation (first cluster) of high-efficiency DSC cells and a low a second gene group characterizing a subpopulation (second cluster) of efficient DSC cells, the step of identifying a second gene group,
- the first gene group is significantly highly expressed in the DSC cells of the first cluster compared to subpopulations of DSC cells of the first cell group and second cell group that are not included in the first cluster.
- the step (4) is (4') For the evaluation cell population including mesenchymal cells to be evaluated, determine the expression level of one or more genes included in the first gene group and the second gene group in each single cell or the entire cell population. 6. The method according to any one of items 1 to 5, wherein the hair follicle regeneration ability of the evaluation cell population is evaluated using the determined level as an index.
- the second gene group includes the following genes: The method according to item 6, comprising: [8]
- the second gene group includes the following genes: The method according to item 6, comprising: [9]
- the dimensionality reduction may be performed using principal component analysis, local linear embedding, local linear isometric mapping (ISOMAP), t-distributed stochastic neighborhood embedding (t-SNE), or thermal diffusion for affinity-based trajectory embedding.
- ISOMAP local linear isometric mapping
- t-SNE t-distributed stochastic neighborhood embedding
- thermal diffusion for affinity-based trajectory embedding.
- Potential of Heat-Diffusion for Affinity Based Trajectory Embedding (PHATE), and Uniform Manifold Approximation and Projection (PHATE) Item 1 carried out by a process selected from the group consisting of 8. The method according to any one of items 8 to 8.
- the first gene group further includes the following genes: The method according to item 10, comprising: [12]
- the first gene group includes the following genes: The method according to item 10, comprising: [13]
- the method according to any one of items 10 to 12 comprising using as an index the expression level of one or more genes selected from the second gene group consisting of.
- the present invention it is possible to identify cells having hair follicle regeneration ability that are included in a group of hair follicle-derived cells, such as hair bulb root sheath cells and/or upper hair root sheath cells that have a high effect on hair follicle regeneration. , it becomes possible to evaluate the quality of a composition for regenerating hair follicles containing cell groups derived from hair follicles.
- Figure 3 shows a Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) plot of a DSC cell. The percentage of cell populations in each cluster is shown.
- Figure 3-1 shows a heat map of the top 10 highly expressed genes in each cluster, and the expression levels of genes #1 to 138 in Figure 3-2 are shown in this order. . Same as above. The percentage of cells expressing HE marker genes and LE marker genes is shown. The results of visualizing DSC cells highly expressing HE marker genes and LE marker genes on a UMAP plot are shown. Same as above.
- FIG. 2 is a diagram showing the overlapping relationship of differentially expressed genes (DEGs) in clusters 1, 4, 5, and 9. It shows which cluster the HE marker and LE marker are included in.
- DEGs differentially expressed genes
- the median value of gene expression and the number of cells in cells expressing the HE marker gene and LE marker gene at a certain threshold or higher in each cluster are shown. Same as above. Same as above. Same as above. Same as above. A list of genes in clusters 1 and 4 included in GO terms that were significantly enriched by Gene Ontology (GO) enrichment analysis of differentially expressed genes (DEGs) is shown. Same as above. The results of searching the hair follicle expression of ligands or receptors of factors whose expression is increased in cluster 1 using the receptor-ligand database (http://fantom.gsc.riken.jp/5/suppll/Ramilowski_et_al_2015/) are shown. FIG.
- FIG. 2 is a schematic diagram showing the hair growth promoting effect due to the interaction between cluster 1 or 4 DSC cells and hair follicles.
- the test was conducted on DSC cells derived from four subjects (ID_1, ID_2, ID_3, ID4).
- the solid line in the figure shows the distribution when each antibody is used, and the dotted line shows the distribution when the corresponding isotype control antibody is used.
- first means one element from another; for example, a first element is distinguished from a second element.
- the second element may similarly be referred to as the first element without departing from the scope of the invention.
- the deepest swollen part of the hair inside the skin is called the hair bulb, and the part made of mesenchymal cells in the center of the hair bulb is called the dermal papilla.
- the dermal papilla is filled with capillaries and nerves that take in nutrients and oxygen from food and are responsible for hair development and growth.
- HF Heair Follicle
- hair matrix hair matrix cell
- inner root sheath and outer root sheath, which are epithelial cells
- dermal hair root which is mesenchymal cells.
- the tissues or cells used in the present invention may be derived from any animal, but are preferably derived from vertebrates, more preferably from mammals, and most preferably from humans.
- DS skin sheath
- dermal sheath is a tissue consisting of one or several dermal cell layers surrounding the outermost layer of the hair follicle, and is composed of smooth muscle-type ⁇ -actin ( ⁇ - Contains SMA) positive cells.
- the dermal hair root sheath is continuous with the dermal papilla at the lowest end of the hair bulb.
- the dermal root sheath includes the hair bulb root sheath and the upper dermal hair root layer.
- DSC skin sheath cup
- hair bulb root sheath cells are cells that constitute the hair bulb root sheath.
- Hair bulb root sheath cells are known to be precursor cells of dermal papilla cells, and it is known that transplanting hair bulb root sheath cells into the skin induces hair follicles at the transplant site. ing.
- a hair follicle-derived cell group containing a high proportion of hair bulb root sheath cells and/or a high activity thereof is used. If a cell group or composition can be selected, it is possible to provide a hair follicle-derived cell group with higher hair follicle-inducing ability or a composition for regenerating hair follicles containing a hair follicle-derived cell group. becomes.
- UDS cells refer to cells of the dermal hair root sheath excluding the above-mentioned hair bulb root sheath portion.
- a composition for regenerating a hair follicle containing a group of hair follicle-derived cells includes, for example, a biocompatible substance in addition to a group of hair follicle-derived cells.
- biocompatible substances include water, physiological saline, phosphate buffer, cell culture medium, biocompatible hydrogels (chitosan gel, collagen gel, gelatin, peptide gel, laminin gel, fibrin gel, etc.), etc. It may be possible, but is not limited to these.
- the present inventors investigated single cell DSC cells of specimens evaluated to have hair regeneration ability (HE group) and DSC cells of specimens evaluated to have low or no hair regeneration ability (LE group).
- HE group hair regeneration ability
- LE group low or no hair regeneration ability
- a first gene group characterizing a subpopulation (first cluster) of highly efficient DSC cells was identified.
- a method for evaluating the hair regeneration ability of a cell population containing mesenchymal cells comprising: (1) A first cell group containing hair bulb root sheath (DSC) cells derived from a specimen evaluated to have hair regeneration ability; and DSC cells derived from a specimen evaluated to have low or no hair regeneration ability determining the expression level of each gene in each single cell included in each of the second cell groups, and creating a gene expression data set including a component indicating the expression level of each gene in each single cell; (2) performing dimension reduction on the gene expression data set of each single cell to create a dimension reduction component of each single cell; (3) Performing clustering processing on the data set representing each single cell plotted based on the dimension reduction component, and identifying a first gene group that characterizes a subpopulation (first cluster) of high-efficiency DSC cells.
- DSC hair bulb root sheath
- the first gene group is significantly highly expressed in the DSC cells of the first cluster compared to subpopulations of DSC cells of the first cell group and second cell group that are not included in the first cluster.
- the expression level of one or more genes included in the first gene group in each single cell or the entire cell population.
- determining the expression level of a protein expressed from the gene and using that level as an index to evaluate the hair follicle regeneration ability of the evaluated cell population including methods.
- a "specimen evaluated to have hair regeneration ability” refers to a specimen evaluated to have a relatively hair regeneration ability when compared with a "sample evaluated to have low or no hair regeneration ability.” Refers to the sample from which the evaluated DSC cells were collected.
- a specimen evaluated to have low or no hair regeneration ability refers to a specimen evaluated to have a relatively low or no hair regeneration ability when compared with a "sample evaluated to have a hair regeneration ability”. Refers to the sample from which the evaluated DSC cells were collected.
- the hair regeneration ability of DSC cells for example, see the literature by Tsuboi et al.
- step (1) the expression level of each gene in a single cell is determined by, for example, a method based on known single cell RNA sequencing (scRNA-seq) technology using a next-generation sequencer.
- scRNA-seq single cell RNA sequencing
- a known dimension reduction process can be performed on the gene expression data set of each single cell obtained in step (1) to create a dimension reduction component of each single cell.
- Dimension reduction processing may be performed using known methods, such as principal component analysis, local linear embedding, local linear isometric mapping (ISOMAP), t-distributed stochastic neighborhood embedding (t-SNE), affinity-based Potential of Heat-Diffusion for Affinity Based Trajectory Embedding (PHATE) and Uniform Manifold Approximation and Projection (Uniform) 1 from the group consisting of Manifold Approximation and Projection (UMAP) or It may be performed by a plurality of selected steps, preferably principal component analysis, t-distributed stochastic neighborhood embedding (t-SNE), Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) or A reduced dimension component may be created by a combination thereof, more preferably by Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP).
- ISOMAP local linear iso
- a clustering process is performed on a data set showing each single cell plotted based on the dimension-reduced components obtained in step (2), and a clustering process is performed on the data set showing each single cell plotted based on the dimension-reduced component obtained in step (2). ”) is performed (step (3)).
- Clustering processing can be performed using known software packages using languages such as "R” and "Python” that can perform machine learning and statistical analysis, as well as other software that can perform clustering, such as 10X Genomics. This may be performed using Loupe Browser (trademark) or the like. Further, the clustering process may be performed by, for example, hierarchical clustering, k-means clustering, density-based clustering, or the like.
- a clustering process is performed to identify a subpopulation of highly efficient DSC cells, that is, a first gene group that characterizes the first cluster.
- the first gene group refers to genes that are significantly highly expressed in DSC cells of the first cluster compared to subpopulations of DSC cells of the first cell group and second cell group that are not included in the first cluster.
- the nucleic acid sequence or amino acid of the gene included in the first gene group described above is, for example, e! It can be specified by inputting the above "Ensemble ID” at Ensemble ASIA (https://asia.ensembl.org/). It can also be obtained from GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
- the specific sequence of the gene used in the present invention is not limited to the sequence obtained by Ensemble ID listed in each table of this specification, but for example, the nucleotide sequence or amino acid sequence specified in each table.
- the gene may be derived from any animal, but is preferably derived from a vertebrate, more preferably a mammal, and most preferably a human.
- the genes listed as “Y” in the “adhesions junction factor (GO term)” column are single cell transfected in DSC cells of subjects with high therapeutic efficacy and DSC cells of subjects with low therapeutic efficacy.
- Cryptom analysis was performed and Gene Ontology (GO) enrichment analysis of differentially expressed genes (DEGs) showed genes whose expression was statistically significantly elevated in cell groups characteristic of HE. .
- ⁇ Y'' in the column ⁇ Adherens junction factor (GO term)'' are expressed in single cells of DSC cells of subjects with a high therapeutic effect and DSC cells of subjects with a low therapeutic effect.
- GO gene ontology
- the genes marked “Y” in the “Positive regulator of cell migration (GO term)” column are the single cell transcripts of DSC cells from subjects with a high therapeutic effect and DSC cells from subjects with a low therapeutic effect.
- GO gene ontology
- DEGs differentially expressed genes
- Genes marked “Y” in the “Cellular response factor to endogenous stimulation (GO term)” column are single cells of DSC cells of subjects with high therapeutic effects and DSC cells of subjects with low therapeutic effects.
- the genes included in the term "cell response factors to endogenous stimuli" are shown.
- the evaluation cell population including mesenchymal cells to be evaluated determine the expression level of one or more genes included in the first gene group in each single cell or the entire cell population, and use that level as an indicator. a step of evaluating the hair follicle regeneration ability of the evaluation cell population; By performing this, the hair follicle regeneration ability of the evaluation cell population containing mesenchymal cells can be evaluated. For example, in the evaluation cell population, when the expression of one or more genes among the genes included in the first gene group is increased more than a predetermined threshold value, it can be evaluated that the hair regeneration ability is high. Conversely, when the expression of one or more genes among the genes included in the first gene group is lower than a predetermined threshold value, it can be evaluated that the hair regeneration ability is low.
- mesenchymal cells refer to cells that constitute non-epithelial mesenchyme such as connective tissue, bone, muscle, and fat; for example, hair bulb sheath (DSC) cells, hair root sheath cells, Included are sheath (DS) cells, dermal papilla (DP) cells, fibroblasts, mesenchymal stem cells or combinations thereof.
- the method of the present invention determines the expression level of one or more genes included in the first gene group and/or the second gene group for an evaluation cell population including mesenchymal cells, and uses the level as an index. , the hair follicle regeneration ability of the evaluated cell population can be evaluated.
- the evaluated cell population includes mesenchymal cells, such as hair bulb sheath (DSC) cells, root sheath (DS) cells, dermal papilla (DP) cells, fibroblasts, mesenchymal stem cells, or combinations thereof. It is preferable that the cells contain DSC cells. Furthermore, the evaluation cell population may include mesenchymal cells isolated from a living body, and may include cells obtained by subculturing and/or culturing isolated mesenchymal cells in vitro. It may also contain mesenchymal cells induced to differentiate from pluripotent stem cells such as ES cells, iPS cells, or Muse cells.
- DSC hair bulb sheath
- DS root sheath
- DP dermal papilla
- fibroblasts mesenchymal stem cells, or combinations thereof. It is preferable that the cells contain DSC cells.
- the evaluation cell population may include mesenchymal cells isolated from a living body, and may include cells obtained by subculturing and/or cult
- the step (4) includes determining the expression level of the gene in each single cell, creating a gene expression dataset including a component indicating the expression level of each gene in each single cell, and Dimensionality reduction is performed on the gene expression dataset of each single cell to create a dimensionality reduction component for each single cell, and based on the data representing each single cell plotted based on the dimensionality reduction component,
- the method may be a step of calculating a proportion of cells arranged in the vicinity of the first cluster and evaluating the hair follicle regeneration ability of the evaluation cell population.
- the method for calculating the proportion of cells located in the vicinity of the first cluster among the cells included in the evaluation cell population is the "R" or "R” that can perform the aforementioned machine learning and statistical analysis used in the clustering process.
- clustering may be performed using other software that can perform clustering, such as Loupe Browser (trademark) provided by 10X Genomics, but is not particularly limited.
- Loupe Browser trademark
- the neighborhood of the first cluster preferably a two-dimensional or By calculating the percentage of cells included in the three-dimensional range, the hair follicle regeneration ability of the evaluation cell population can be evaluated.
- the step (3) is (3') Clustering is performed on the data set showing each single cell plotted based on the dimension reduction component, and a first gene group characterizing a subpopulation (first cluster) of high-efficiency DSC cells and a low a second gene group characterizing a subpopulation (second cluster) of efficient DSC cells, the step of identifying a second gene group,
- the first gene group is significantly highly expressed in the DSC cells of the first cluster compared to subpopulations of DSC cells of the first cell group and second cell group that are not included in the first cluster.
- the step (4) is (4') For the evaluation cell population including the DSC cells to be evaluated, determine the expression level of one or more genes included in the first gene group and the second gene group in each single cell or the entire cell population.
- the method may be a step of evaluating the hair follicle regeneration ability of the evaluation cell population using the level as an index.
- step (3') a clustering process is performed to identify a subpopulation of high-efficiency DSC cells, that is, a first gene group that characterizes the first cluster, and a subpopulation of low-efficiency DSC cells, that is, a second cluster.
- the first gene group is as described above.
- the second gene group refers to the first cell group not included in the second cluster and the subpopulation of DSC cells of the first cell group and second cell group that are not included in the second cluster.
- the genes listed as “Y” in the “basement membrane (GO term)” column are the single cell transcripts of DSC cells of subjects with high therapeutic efficacy and DSC cells of subjects with low therapeutic efficacy.
- GO terms were found to be statistically significantly enriched in cell groups characteristic of the LE group by gene ontology (GO) enrichment analysis of differentially expressed genes (DEGs). This shows the genes contained in the basement membrane.
- the genes listed as “Y” in the “vascular development (GO term)” column are the single cell transcripts of DSC cells of subjects with high therapeutic effects and DSC cells of subjects with low therapeutic effects. GO terms were found to be statistically significantly enriched in cell groups characteristic of the LE group by gene ontology (GO) enrichment analysis of differentially expressed genes (DEGs). The genes involved in ⁇ vascular development'' are shown.
- the genes listed as “Y” in the column “Formation of extracellular matrix (GO term)” are single genes in DSC cells of subjects with a high therapeutic effect and DSC cells of subjects with a low therapeutic effect.
- Cell transcriptome analysis was performed, and Gene Ontology (GO) enrichment analysis of differentially expressed genes (DEGs) was found to be statistically significantly enriched in cell groups characteristic of the LE group.
- DEGs differentially expressed genes
- the evaluation cell population including mesenchymal cells to be evaluated determine the expression level of one or more genes included in the first gene group and the second gene group in each single cell or the entire cell population.
- the hair follicle regeneration ability of the evaluation cell population can be evaluated by performing the step of determining the level and evaluating the hair follicle regeneration ability of the evaluation cell population using the level as an index. For example, one or more genes included in the first gene group are expressed more than a predetermined threshold, and/or one or more genes included in the second gene group are expressed. When the expression of the gene is lower than a predetermined threshold value, it can be evaluated that the hair regeneration ability is high.
- the expression of one or more genes among the genes included in the first gene group is lower than a predetermined threshold, and/or the expression of one or more genes among the genes included in the second gene group is lower than a predetermined threshold.
- a predetermined threshold value When the expression of a plurality of genes is increased more than a predetermined threshold value, it can be evaluated that the hair regeneration ability is low.
- a cell population containing mesenchymal cells such as hair bulb root sheath (DSC) cells, hair root sheath (DS) cells, and/or dermal papilla (DP) cells, is evaluated after culture. By doing so, it is also possible to predict the hair follicle regeneration effect before applying it to a subject.
- DSC hair bulb root sheath
- DS hair root sheath
- DP dermal papilla
- RNA expression level refers to something that can be determined by detecting and measuring a transcript transcribed from any gene or a translation product translated using the transcript as a template.
- the transcription product refers to, for example, an RNA strand that is transcribed using the DNA of a gene as a template, that is, an RNA strand that is synthesized by RNA polymerase, and an RNA strand that is modified within a cell after transcription.
- An example of the RNA strand included in the transcription product is messenger RNA (mRNA). These RNA strands also include those that are processed within the cell after transcription.
- Translation products are, for example, polypeptide chains that are translated using transcripts transcribed by genes as templates, that is, polypeptide chains that are synthesized by ribosomes, and proteins that are formed by the folding of the polypeptide chains. means. Translation products also include polypeptide chains or protein fragments.
- the expression level of the gene can be measured using known methods. For example, when measuring gene transcription products to measure gene expression levels, appropriate probes are designed by referring to the sequence of the gene of interest, and these are used to perform quantitative PCR (qPCR). It can be measured by using a method such as a method), an in situ hybridization method, a Northern blotting method, or a DNA microarray method.
- qPCR quantitative PCR
- an antibody that detects a protein translated by the gene of interest may be used, such as Western blotting or flow cytometry (FACS). method), ELISA method, etc.
- the expression levels of genes can be compared by normalizing (standardization) by the expression level of any housekeeping gene.
- Housekeeping genes that can be used for comparison include, for example, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ⁇ -actin, ⁇ 2-microglobulin, and HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransfer). 1), etc.
- "using the gene expression level as an indicator” means that the expression level of a gene is higher than or equal to a predetermined level (for example, the signal of a negative control sample or higher) or lower than a predetermined level (for example, the signal of a negative control sample is higher than or equal to a predetermined level) in a group of cells derived from hair follicles. It may also be to detect the proportion of cells expressing the gene (below the signal). This makes it possible to evaluate the proportion of hair bulb root sheath cells included in the hair follicle-derived cell group.
- a predetermined level for example, the signal of a negative control sample or higher
- a predetermined level for example, the signal of a negative control sample or higher
- a predetermined level for example, the signal of a negative control sample is higher than or equal to a predetermined level
- "using the expression level of a gene as an index” means detecting the expression level of any gene in the entire hair follicle-derived cell group and comparing it with the expression level of the same gene in other samples. It may be something. Thereby, it is possible to evaluate whether genes expressed in cells having hair follicle regeneration ability are enhanced or decreased in the entire hair follicle-derived cell group.
- "activity of cells capable of regenerating hair follicles” refers to the expression level of the above gene expressed in cells capable of regenerating hair follicles.
- the present invention can be applied to a hair follicle-derived cell population containing mesenchymal cells cultured in vitro.
- a hair follicle-derived cell population containing mesenchymal cells cultured in vitro.
- cells with hair follicle regeneration ability included in the hair follicle-derived cell group such as hair bulb root sheath (DSC) cells and/or upper hair root sheath (UDS) cells, which have a high effect on hair follicle regeneration, are It is also possible to evaluate whether the proportion or its properties have changed before and after culturing.
- the present invention can use a population of hair follicle-derived cells that have been passaged one or more times.
- the method for culturing and subculturing hair follicle-derived cells in vitro is not limited and may be any known method.
- the present invention evaluates the hair regeneration ability of a cell population containing mesenchymal cells using the expression level of one or more genes selected from the first gene group listed in Table 11 above as an index. provide a method.
- the present invention provides a method for measuring the hair regeneration ability of a cell population containing mesenchymal cells using the expression level of one or more genes selected from the second gene group listed in Table 12 above as an indicator. Provide a method for evaluation.
- the present invention provides one or more genes selected from the first gene group listed in Table 11 above, and/or one or more genes selected from the second gene group listed in Table 12 above.
- the present invention provides a method for evaluating the hair regeneration ability of a cell population including mesenchymal cells, using the expression level of a gene containing mesenchymal cells as an index.
- Method 1-1 Preparation of DSC cells Tsuboi et al. (Autologous cell-based therapy for male and female pattern hair loss using dermal sheath cup cells: A randomized placebo-controlled double-blinded dose-finding clinical study. Tsuboi R, Niiyama S, Irisawa R, DSC cells were prepared according to the method described in Harada K, Nakazawa Y, Kishimoto J. J Am Acad Dermatol. 2020 Jul;83(1):109-116.).
- Hierarchical clustering analysis was performed using two scripts. Ward. of Euclidean distance is used as a clustering method. D2 method was used. Based on the tree diagram of the clustering results, groups belonging to the same branch were classified into a group with a high overall therapeutic effect (HE group) and a group with a low overall therapeutic effect (LE group).
- HE group high overall therapeutic effect
- LE group low overall therapeutic effect
- flow cytometry Flow cytometry was performed by labeling a DSC cell suspension using a FITC-labeled anti-ITGA6 antibody (Biolegend), and then detecting positive cells using Guava easy cyto HT (trademark) (Luminex). As a negative control, a non-specific antibody of the same type as the antibody used was used.
- All clusters identified contained cells from all IDs used ( Figure 2).
- the proportion of cells contained in each cluster varied greatly between samples, with cells derived from the HE group containing many clusters 1, whereas cells derived from the LE group were not concentrated in one cluster but were dispersed into many clusters. .
- Figure 3-1 shows the top 10 genes with increased expression in each cluster.
- the upregulated genes in some clusters were strongly expressed in specific samples, and non-uniform expression was observed between samples.
- DEGs differentially expressed genes
- HE group high treatment effect
- LE group DSC cells of subjects with a low treatment effect
- HE marker factors 9: GREM2, SERPINE2, TIMP3, RGS2, NPDC1, CAMK2N1, COLEC12, IGF2BP3 and ADGRE5
- LE marker factors 3: NID2, BAMBI, ANGPT1
- the HE marker was highly expressed in many HE-derived cells, and the LE marker was highly expressed in many LE-derived cells (FIG. 4).
- cluster 1 included 7 genes out of 9 HE marker genes.
- all LE marker 3 genes were included in cluster 4.
- the number of cells included in each cluster of cells with HE marker expression equal to or higher than the threshold value in cluster 1 was the highest in cluster 1, and the highest number of cells highly expressing LE markers was in cluster 4 ( Figure 7-1 to Figure 7-5).
- cluster 1 contained many cells expressing the characteristics of HE
- cluster 4 contained many cells expressing the characteristics of LE.
- Gene ontology (GO) analysis of DEGs revealed that cluster 1 was statistically significantly enriched in factors involved in adherens junctions, cell migration, and response to endogenous stimuli.
- cluster 4 factors important for basement membrane composition and factors involved in angiogenesis were significantly enriched, and representative basement membrane factors such as COL4A1 and LAMA4 were upregulated in addition to NID2, which was identified as a LE marker.
- DSC cell subpopulations were identified by flow cytometry using an antibody for ITGA6, a HE marker included in the first gene group.
- ITGA6 content of DSC cells derived from four subjects (ID_1, ID_2, ID_3, ID4) was different, and it was possible to predict the effect of DSC cells based on these.
Abstract
間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法であって、 （１）毛髪再生能を有すると評価された検体由来の毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第１細胞群；及び毛髪再生能が低い又は有さないと評価された検体由来のＤＳＣ細胞を含む第２細胞群のそれぞれに含まれる各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを決定し、前記各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成する工程； （２）前記各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して次元削減を行い、各単一細胞の次元削減成分を作成する工程； （３）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群を特定する工程；及び （４）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、を含む、方法を提供する。
Description
本発明は、間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法に関する。
毛髪は皮膚に存在する毛包によって産生される。毛包とは、毛を取り囲む組織層であり、外胚葉由来の毛母（毛母細胞）、内毛根鞘、外毛根鞘や、中胚葉由来の真皮毛根鞘、毛乳頭などから構成されている。毛乳頭を取り囲む毛母細胞が、毛乳頭から供給される栄養やタンパク質によって誘導されて分裂を繰り返し、角質化することによって毛を形成する。
毛髪の発育に問題が生じることで薄毛・脱毛症が生じる。薄毛・脱毛症には、壮年性脱毛症、円形脱毛症、休止期脱毛症などがあり、最も頻度が多いのが壮年性脱毛症である。壮年性脱毛症は、男性において、主に男性ホルモンの影響によって引き起こされるものであり、男性型脱毛症とも呼ばれる。毛は、成長期、退行期及び休止期からなるヘアサイクルを繰り返しながら生え替わる。男性型脱毛症は、このヘアサイクルの中でも成長期が短くなり、細く短い毛髪の割合が増えることで引き起こされる症状である。
現在、壮年性脱毛症の治療として、外用剤のミノキシジルや、経口薬のフィナステリドが主に用いられている。これらの治療法は、いずれも有効性や安全性が確認されているが、必ずしも全ての壮年性脱毛症に有効というわけではない。
その他、壮年性脱毛症の治療として、自家植毛術が実施されている。自家植毛術とは、側頭部や後頭部から採取した毛根を含む毛髪を、自己の脱毛部に移植する術式である。しかしながら、当該術式は、自己の毛髪を別の場所へ植え替える術式であるため、毛髪の総数を増やすものではない。
近年、様々な疾患に対する再生医療技術が開発されており、毛髪再生分野においても新たな技術が研究開発されている。例えば、毛包の中でも、毛包の再外層に位置する真皮毛根鞘、特に毛球部の底部に位置する毛球部毛根鞘（ｄｅｒｍａｌ ｓｈｅａｔｈ ｃｕｐ ｃｅｌｌ：ＤＳＣ）には高い毛包誘導能力を有することが示唆されており、マウスを用いた試験でＤＳＣ細胞の移植により発毛が認められること、ヒトにおいても脱毛症の治療に有効であることが報告されている（非特許文献１、２）。また、ＤＳＣ細胞が、発毛において重要な役割を有する毛乳頭（Ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ：ＤＰ）細胞の前駆細胞であることも示されており、ＤＳＣ細胞に注目が集まっている（非特許文献３）。
毛髪再生の分野において毛包由来の細胞群を用いた治療法が開発されつつあるが、毛包の誘導能力を有する細胞を同定する方法はなかった。また、毛包の誘導能力を有する毛球部毛根鞘細胞は、現在のところ目視にて毛球部周辺底部の細胞を採取するしか方法がなく、特異的なマーカーは知られていなかった。また、採取した毛球部毛根鞘細胞をインビトロで培養後、毛包の誘導能力が有する細胞がどのくらい残存しているかを評価することができなかった。
これまでにｉｎ ｔａｃｔな毛包中の毛球部毛根鞘に特異的に発現する遺伝子を同定することによりＧＲＥＭ２遺伝子の発現レベルを指標とすることを特徴とする、毛包由来の細胞群における毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の同定方法を報告してきたが、毛包の誘導能力を評価し、臨床的な効果を予測するためには十分とは言えなかった（非特許文献４、特許文献１）。
Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla. McElwee KJ, Kissling S, Wenzel E, Huth A, Hoffmann R. J Invest Dermatol. 2003 Dec;121(6):1267-75.
Autologous cell-based therapy for male and female pattern hair loss using dermal sheath cup cells: A randomized placebo-controlled double-blinded dose-finding clinical study. Tsuboi R, Niiyama S, Irisawa R, Harada K, Nakazawa Y, Kishimoto J. J Am Acad Dermatol. 2020 Jul;83(1):109-116.
Hair follicle dermal stem cells regenerate the dermal sheath, repopulate the dermal papilla, and modulate hair type. Rahmani W, Abbasi S, Hagner A, Raharjo E, Kumar R, Hotta A, Magness S, Metzger D, Biernaskie J. Dev Cell. 2014 Dec 8;31(5):543-58.
Gene Expression Profiling of the Intact Dermal Sheath Cup of Human Hair Follicles. Niiyama S, Ishimatsu-Tsuji Y, Nakazawa Y, Yoshida Y, Soma T, Ideta R, Mukai H, Kishimoto J. Acta Derm Venereol. 2018 Jul 11;98(7):694-698.
本発明は、間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法を提供することを課題とする。
ＤＳＣ細胞は、毛髪再生において有効な手段となり得る可能性が示されている一方、その細胞の形態から不均一な細胞集団であると考えられ、ＤＳＣ細胞に含まれる一部の細胞集団の割合を増加させること、或いは、その細胞集団の賦活化が、有効性向上のために有効と考えられた。しかしながら、これまでＤＳＣ細胞に含まれる有効性に寄与する細胞亜集団を同定する方法は確立されていなかった。
本発明者らが鋭意研究を行った結果、毛包再生能を有する細胞において発現亢進または抑制される遺伝子、特に毛包再生への高い効果を有する毛球部毛根鞘細胞において発現亢進または抑制される遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］ 間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法であって、
（１）毛髪再生能を有すると評価された検体由来の毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第１細胞群；及び毛髪再生能が低い又は有さないと評価された検体由来のＤＳＣ細胞を含む第２細胞群のそれぞれに含まれる各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを決定し、前記各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成する工程；
（２）前記各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して次元削減を行い、各単一細胞の次元削減成分を作成する工程；
（３）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群を特定する工程であって、
ここで前記第１遺伝子群は、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットである；及び
（４）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、
を含む、方法。
［２］ 前記工程（４）が、各単一細胞の遺伝子の発現レベルを決定し、前記各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成し、前記各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して次元削減を行い、各単一細胞の次元削減成分を作成し、前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータを基に、前記第１クラスタの近傍に配置される割合を算出し、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、
である、項目１に記載の方法。
［３］ 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
を含む、項目１又は２に記載の方法。
［４］ 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
を含む、項目１又は２に記載の方法。
［５］ 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
を含む、項目１又は２に記載の方法。
［６］ 前記工程（３）が、
（３’）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群と、低効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第２クラスタ）を特徴づける第２遺伝子群とを特定する工程であって、
ここで前記第１遺伝子群は、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットであり、
ここで前記第２遺伝子群は、前記第２クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第２クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットであり、
前記工程（４）が、
（４’）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群及び前記第２遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程
である、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
［７］ 前記第２遺伝子群が、以下の遺伝子：
を含む、項目６に記載の方法。
［８］ 前記第２遺伝子群が、以下の遺伝子：
を含む、項目６に記載の方法。
［９］ 前記次元削減が、主成分分析、局所線形埋め込み、局所線形アイソメトリックマッピング（ＩＳＯＭＡＰ）、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）、親和性に基づく軌道埋め込みのための熱拡散の可能性（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｈｅａｔ－Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂａｓｅｄ Ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）（ＰＨＡＴＥ）、及び一様多様体近似及び投影（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＭＡＰ）からなる群から選択される工程により実施される、項目１～８のいずれか１項に記載の方法。
［１０］ 以下の遺伝子：
からなる第１遺伝子群から１又は複数選択される遺伝子の発現レベルを指標とする、間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法。
［１１］ 前記第１遺伝子群が、さらに、以下の遺伝子：
を含む、項目１０に記載の方法。
［１２］ 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
を含む、項目１０に記載の方法。
［１３］ さらに、以下の遺伝子：
からなる第２遺伝子群から１又は複数選択される遺伝子の発現レベルを指標とする
を含む、項目１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
［１４］ さらに、以下の遺伝子：
からなる第２遺伝子群から１又は複数選択される遺伝子の発現レベルを指標とする
を含む、項目１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
（１）毛髪再生能を有すると評価された検体由来の毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第１細胞群；及び毛髪再生能が低い又は有さないと評価された検体由来のＤＳＣ細胞を含む第２細胞群のそれぞれに含まれる各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを決定し、前記各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成する工程；
（２）前記各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して次元削減を行い、各単一細胞の次元削減成分を作成する工程；
（３）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群を特定する工程であって、
ここで前記第１遺伝子群は、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットである；及び
（４）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、
を含む、方法。
［２］ 前記工程（４）が、各単一細胞の遺伝子の発現レベルを決定し、前記各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成し、前記各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して次元削減を行い、各単一細胞の次元削減成分を作成し、前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータを基に、前記第１クラスタの近傍に配置される割合を算出し、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、
である、項目１に記載の方法。
［３］ 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
［４］ 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
［５］ 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
［６］ 前記工程（３）が、
（３’）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群と、低効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第２クラスタ）を特徴づける第２遺伝子群とを特定する工程であって、
ここで前記第１遺伝子群は、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットであり、
ここで前記第２遺伝子群は、前記第２クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第２クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットであり、
前記工程（４）が、
（４’）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群及び前記第２遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程
である、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
［７］ 前記第２遺伝子群が、以下の遺伝子：
［８］ 前記第２遺伝子群が、以下の遺伝子：
［９］ 前記次元削減が、主成分分析、局所線形埋め込み、局所線形アイソメトリックマッピング（ＩＳＯＭＡＰ）、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）、親和性に基づく軌道埋め込みのための熱拡散の可能性（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｈｅａｔ－Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂａｓｅｄ Ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）（ＰＨＡＴＥ）、及び一様多様体近似及び投影（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＭＡＰ）からなる群から選択される工程により実施される、項目１～８のいずれか１項に記載の方法。
［１０］ 以下の遺伝子：
［１１］ 前記第１遺伝子群が、さらに、以下の遺伝子：
［１２］ 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
［１３］ さらに、以下の遺伝子：
を含む、項目１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
［１４］ さらに、以下の遺伝子：
を含む、項目１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
本発明によれば、毛包由来の細胞群に含まれる毛包再生能を有する細胞、例えば毛包再生への高い効果を有する毛球部毛根鞘細胞及び／又は上部毛根鞘細胞を識別可能となり、毛包由来の細胞群を含有する毛包を再生するための組成物の品質を評価することが可能となる。また、単離した毛包由来の細胞群をインビトロで培養して増殖させた後においても、毛包再生能を有する細胞、例えば毛包再生への高い効果を有する毛球部毛根鞘細胞及び／又は上部毛根鞘細胞が残存しているかどうか評価することが可能となり、毛包誘導能が高い毛包を再生するための組成物を選択することが可能となる。
以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されない。なお、本明細書で引用されている先行技術文献は、参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書において、「第１」「第２」・・・等の用語は、１つの要素をもう１つの要素と区別するために用いており、例えば、第１の要素を第２の要素と表現し、同様に第２の要素を第１の要素と表現してもよく、これによって本発明の範囲を逸脱するものではない。
特段の定義がない限り、本明細書で使用する用語（技術的用語および科学的用語）は、当業者が一般に理解している用語と同一の意味を有する。
毛の皮膚内部最深部の膨らんだ部分を毛球部（ｈａｉｒ ｂｕｌｂ）といい、毛球部の中央部にある間葉系細胞からなる部分を毛乳頭（ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ）という。毛乳頭には毛細血管や神経が入り込んでいて、食物からの栄養や酸素を取り入れ、毛の発生や成長をつかさどっている。毛乳頭に接したところに毛母細胞（ｈａｉｒ ｍａｔｒｉｘ ｃｅｌｌ）があり、毛はこの部位で産生される。すなわち毛母細胞は、毛乳頭に入り込んでいる毛細血管から栄養や酸素を取り込み、分裂を繰り返すことにより毛が形成される。
本明細書において、「毛包（Ｈａｉｒ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ：ＨＦ）」とは、上皮系細胞であるの毛母（毛母細胞）、内毛根鞘、外毛根鞘や、間葉系細胞であるの真皮毛根鞘、毛乳頭、及びメラノサイトなどを含む、毛を取り囲む組織層をいう。本発明において使用される組織又は細胞は、いずれの動物由来であってもよいが、脊椎動物由来が好ましく、哺乳動物由来がより好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。
本明細書において、「真皮毛根鞘（Ｄｅｒｍａｌ Ｓｈｅａｔｈ：ＤＳ）」とは、毛包の最外層を包む一層又は数層の真皮性細胞層よりなる組織であって、平滑筋型αアクチン（α－ＳＭＡ）陽性細胞を含む。真皮毛根鞘は、毛球部の最下端において毛乳頭と連続している。後述するように、本明細書において、真皮毛根鞘には、毛球部毛根鞘と上部真皮毛根層が含まれる。
本明細書において、「毛球部毛根鞘（ｄｅｒｍａｌ ｓｈｅａｔｈ ｃｕｐ：ＤＳＣ）」とは、真皮毛根鞘の一部であり、毛球部の底部に位置する組織をいう（例えば、国際公開第２０１９／１７６８８１号の図１を参照）。「毛球部毛根鞘（ｄｅｒｍａｌ ｓｈｅａｔｈ ｃｕｐ：ＤＳＣ）細胞」とは、毛球部毛根鞘を構成する細胞である。毛球部毛根鞘細胞は、毛乳頭細胞の前駆細胞であることが知られており、毛球部毛根鞘細胞を皮膚に移植することにより、移植部位において毛包が誘導されることが知られている。すなわち、毛包由来の細胞群又は毛包由来の細胞群を含有する毛包を再生するための組成物において、毛球部毛根鞘細胞の割合が高い及び／又はその活性が高い毛包由来の細胞群又は組成物を選択することができれば、より毛包誘導能が高い毛包由来の細胞群又は毛包由来の細胞群を含有する毛包を再生するための組成物を提供することが可能となる。
本明細書において、「上部毛根鞘（Ｕｐｐｅｒ Ｄｅｒｍａｌ Ｓｈｅａｔｈ：ＵＤＳ）細胞」とは、真皮毛根鞘のうち、上記の毛球部毛根鞘の部分を除いた組織の細胞をいう。
本明細書において、「毛包由来の細胞群」とは、上記の毛包を構成する細胞を含む細胞群をいう。また、本明細書において、「毛包由来の細胞群を含む毛包を再生するための組成物」とは、毛包由来の細胞群の他、例えば、生体適合可能な物質を含むものである。生体適合可能な物質とは、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、細胞培養培地、生体適合性ハイドロゲル（キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、ラミニンゲル及びフィブリンゲルなど）等であってもよく、これらに限定されない。
本発明者らは、毛髪再生能を有すると評価された検体（ＨＥ群）のＤＳＣ細胞と、毛髪再生能が低い又は有さないと評価された検体（ＬＥ群）のＤＳＣ細胞について、シングルセルトランスクリプトームを実施し、クラスタリング解析を行った結果、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群を特定した。当該遺伝子群に含まれる遺伝子の遺伝子の発現レベルあるいはその遺伝子から発現するタンパク質の発現レベルを指標とすることにより、評価対象となる間葉系細胞を含む細胞集団の毛包再生能を評価することが可能となった。すなわち、一実施態様において、本発明は、以下の態様を含み得る。
間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法であって、
（１）毛髪再生能を有すると評価された検体由来の毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第１細胞群；及び毛髪再生能が低い又は有さないと評価された検体由来のＤＳＣ細胞を含む第２細胞群のそれぞれに含まれる各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを決定し、前記各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成する工程；
（２）前記各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して次元削減を行い、各単一細胞の次元削減成分を作成する工程；
（３）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群を特定する工程であって、
ここで前記第１遺伝子群は、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットである；及び
（４）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルあるいはその遺伝子から発現するタンパク質の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、
を含む、方法。
（１）毛髪再生能を有すると評価された検体由来の毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第１細胞群；及び毛髪再生能が低い又は有さないと評価された検体由来のＤＳＣ細胞を含む第２細胞群のそれぞれに含まれる各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを決定し、前記各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成する工程；
（２）前記各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して次元削減を行い、各単一細胞の次元削減成分を作成する工程；
（３）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群を特定する工程であって、
ここで前記第１遺伝子群は、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットである；及び
（４）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルあるいはその遺伝子から発現するタンパク質の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、
を含む、方法。
本明細書において、「毛髪再生能を有すると評価された検体」とは、「毛髪再生能が低い又は有さないと評価された検体」との比較において、相対的に毛髪再生能を有すると評価されたＤＳＣ細胞が採取された検体をいう。また「毛髪再生能が低い又は有さないと評価された検体」とは、「毛髪再生能を有すると評価された検体」との比較において、相対的に毛髪再生能が低い又は有さないと評価されたＤＳＣ細胞が採取された検体をいう。ＤＳＣ細胞による毛髪再生能については、例えば、Tsuboiらの文献（Autologous cell-based therapy for male and female pattern hair loss using dermal sheath cup cells: A randomized placebo-controlled double-blinded dose-finding clinical study. Tsuboi R, Niiyama S, Irisawa R, Harada K, Nakazawa Y, Kishimoto J. J Am Acad Dermatol. 2020 Jul;83(1):109-116.）を参考に分類することが可能である。
工程（１）において、単一細胞の各遺伝子の発現レベルを決定する方法は、例えば、次世代シークエンサーを用いた、公知のシングルセルＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）技術に基づく方法によって、全トランスクリプトームをプロファイリングし、核酸配列の情報を得ると同時に、各遺伝子の発現レベルを決定することによって、各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成することが可能である。
工程（１）によって得られた各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して、公知の次元削減処理を実施し、各単一細胞の次元削減成分を作成することができる。次元削減処理としては、公知の方法により実施すればよく、例えば、主成分分析、局所線形埋め込み、局所線形アイソメトリックマッピング（ＩＳＯＭＡＰ）、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）、親和性に基づく軌道埋め込みのための熱拡散の可能性（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｈｅａｔ－Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂａｓｅｄ Ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）（ＰＨＡＴＥ）、及び一様多様体近似及び投影（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＭＡＰ）からなる群から１又は複数選択される工程により実施されてもよく、好ましくは、主成分分析、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）、一様多様体近似及び投影（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＭＡＰ）又はその組み合わせ、より好ましくは、一様多様体近似及び投影（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＭＡＰ）により次元削減成分を作成してもよい。
一実施態様において、工程（２）によって得られた次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについて、クラスタリング処理を行い、毛髪再生能が高いＤＳＣ細胞（「高効率ＤＳＣ細胞」）の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群を特定する工程が実施される（工程（３））。クラスタリング処理は、機械学習及び統計解析を実施可能な「Ｒ」や「Ｐｙｔｈｏｎ」などの言語を利用した公知のソフトウェアパッケージの他、クラスタリングを実施可能な他のソフトウェア、例えば、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社が提供するＬｏｕｐｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（商標）などを用いて実施してもよい。また、クラスタリング処理は、例えば、階層的クラスタリング、ｋ－平均クラスタリング、または密度に基づくクラスタリングなどが実施されてもよい。
工程（３）において、クラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団、すなわち、第１クラスタを特徴づける第１遺伝子群を特定する。第１遺伝子群とは、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットである。本発明者らは、工程（１）～（３）を実施することにより、第１クラスタに含まれるＤＳＣ細胞を特徴づける第１遺伝子群は、以下の遺伝子が含まれることを見出した。
上述の第１遺伝子群に含まれる遺伝子の核酸配列またはアミノ酸は、例えばｅ！Ｅｎｓｅｍｂｌｅ ＡＳＩＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｉａ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／）において、上記の「ＥｎｓｅｍｂｌｅＩＤ」を入力することにより特定可能である。また、ＧｅｎｅＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から取得することができる。本発明に用いられる遺伝子の具体的な配列は、本明細書の各表に記載のＥｎｓｅｍｂｌｅＩＤによって取得される配列に限定されるものではなく、例えば、各表によって特定されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上同一の配列や、それらのスプライシング変異体なども含まれる。また、その遺伝子の由来は、いずれの動物由来であってもよいが、脊椎動物由来が好ましく、哺乳動物由来がより好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。
上記表１１において、「ＨＥマーカー」の列で「Ｙ」と記載されている遺伝子は、治療効果の高い被験者のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者のＤＳＣ細胞との間のマイクロアレイアッセイにより、その発現量に差がみられた遺伝子について、定量的ＰＣＲを行った結果、ＨＥマーカーとして特徴付けられた遺伝子を示している（実施例を参照のこと）。
上記表１１において、「接着結合因子（ＧＯ ｔｅｒｍ）」の列で「Ｙ」と記載されている遺伝子は、治療効果の高い被験者のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者のＤＳＣ細胞のシングルセルトランスクリプトームを実施し、発現変動遺伝子（Ｄｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ：ＤＥＧ）の遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によって、ＨＥに特徴的な細胞群で統計的に有意に発現亢進している遺伝子を示している。
上記表１１において、「「接着結合因子（ＧＯ ｔｅｒｍ）」の列で「Ｙ」と記載されている遺伝子は、治療効果の高い被験者のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者のＤＳＣ細胞のシングルセルトランスクリプトームを実施し、発現変動遺伝子（Ｄｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ：ＤＥＧ）の遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によって、ＨＥに特徴的な細胞群で統計的に有意に濃縮されてことが見いだされたＧＯ ｔｅｒｍである「接着結合」に含まれる遺伝子を示している。
「細胞遊走の正の制御因子（ＧＯ ｔｅｒｍ）」の列で「Ｙ」と記載されている遺伝子は、治療効果の高い被験者のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者のＤＳＣ細胞のシングルセルトランスクリプトームを実施し、発現変動遺伝子（Ｄｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ：ＤＥＧ）の遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によって、ＨＥに特徴的な細胞群で統計的に有意に濃縮されてことが見いだされたＧＯ ｔｅｒｍである「細胞遊走の正の制御」に含まれる遺伝子を示している。
「内因性の刺激への細胞応答因子（ＧＯ ｔｅｒｍ）」の列で「Ｙ」と記載されている遺伝子は、治療効果の高い被験者のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者のＤＳＣ細胞のシングルセルトランスクリプトームを実施し、発現変動遺伝子（Ｄｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ：ＤＥＧ）の遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によって、ＨＥに特徴的な細胞群で統計的に有意に濃縮されてことが見いだされたＧＯ ｔｅｒｍである「内因性の刺激への細胞応答因子」に含まれる遺伝子を示している。
上記表１１において、「毛根鞘で発現するレセプター」の列に記載されている遺伝子は、受容体－リガンドデータベース（Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）（ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／５／ｓｕｐｐｌ／Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ＿ｅｔ＿ａｌ＿２０１５／）において、当該遺伝子（因子）と相互作用するものとして登録されているレセプター遺伝子であって、これまでに毛根鞘での発現が報告されている因子を示している。
上記表１１において、「毛根鞘で発現するリガンド」の列に記載されている遺伝子は、受容体－リガンドデータベース（Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）（ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／５／ｓｕｐｐｌ／Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ＿ｅｔ＿ａｌ＿２０１５／）において、当該遺伝子（因子）と相互作用するものとして登録されているリガンド遺伝子であって、これまでに毛根鞘での発現が報告されている因子を示している。
上記（１）～（３）により特定された、第１遺伝子群に含まれる遺伝子に基づき、さらに、
（４）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、
を実施することにより、間葉系細胞を含む評価細胞集団の毛包再生能を評価することができる。例えば、評価細胞集団において、第１遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が亢進している場合、毛髪再生能が高いと評価することができる。逆に、第１遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が低下している場合、毛髪再生能が低いと評価することができる。
（４）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、
を実施することにより、間葉系細胞を含む評価細胞集団の毛包再生能を評価することができる。例えば、評価細胞集団において、第１遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が亢進している場合、毛髪再生能が高いと評価することができる。逆に、第１遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が低下している場合、毛髪再生能が低いと評価することができる。
本明細書において、「間葉系細胞」とは、結合組織、骨、筋、脂肪などの非上皮系の間葉を構成する細胞をいい、例えば、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞、毛根鞘（ＤＳ）細胞、毛乳頭（ＤＰ）細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞又はそれらの組み合わせが含まれる。本発明の方法は、間葉系細胞を含む評価細胞集団について、第１遺伝子群および／又は第２遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標することにより、評価細胞集団の毛包再生能を評価することができる。評価細胞集団は、間葉系細胞、例えば、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞、毛根鞘（ＤＳ）細胞、毛乳頭（ＤＰ）細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞又はそれらの組み合わせが含まれるのであってもよく、ＤＳＣ細胞を含むことが好ましい。また、評価細胞集団は、生体から単離した間葉系細胞を含むものであってもよく、単離した間葉系細胞をインビトロで継代及び／又は培養して得られた細胞を含むものであってもよく、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又はＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導された間葉系細胞を含むものであってもよい。
一実施態様において、前記工程（４）は、各単一細胞の遺伝子の発現レベルを決定し、前記各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成し、前記各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して次元削減を行い、各単一細胞の次元削減成分を作成し、前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータを基に、前記第１クラスタの近傍に配置される細胞の割合を算出し、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程であってもよい。
前記評価細胞集団に含まれる細胞のうち、第１クラスタの近傍に配置される細胞の割合を算出する方法は、クラスタリング処理に利用した前述の機械学習及び統計解析を実施可能な「Ｒ」や「Ｐｙｔｈｏｎ」などの言語を利用した公知のソフトウェアパッケージの他、クラスタリングを実施可能な他のソフトウェア、例えば、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社が提供するＬｏｕｐｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（商標）などを用いて実施すればよく、特に限定されないが、例えば、評価細胞集団において前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータについて、第１クラスタの近傍、好ましくは、第１クラスタを包含するように任意に規定した２次元又は３次元の範囲に含まれる細胞の割合を算出することにより、評価細胞集団の毛包再生能を評価することができる。つまり、第１クラスタを包含するように任意に規定した２次元又は３次元の範囲に含まれる細胞の割合が高いほど毛包再生能が高く、第１クラスタを包含するように任意に規定した２次元又は３次元の範囲に含まれる細胞の割合が低いほど毛包再生能が低いと評価するものであってもよい。
他の態様において、
前記工程（３）が、
（３’）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群と、低効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第２クラスタ）を特徴づける第２遺伝子群とを特定する工程であって、
ここで前記第１遺伝子群は、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットであり、
ここで前記第２遺伝子群は、前記第２クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第２クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットであり、
前記工程（４）が、
（４’）評価対象のＤＳＣ細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群及び前記第２遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程
であってもよい。
前記工程（３）が、
（３’）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群と、低効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第２クラスタ）を特徴づける第２遺伝子群とを特定する工程であって、
ここで前記第１遺伝子群は、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットであり、
ここで前記第２遺伝子群は、前記第２クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第２クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットであり、
前記工程（４）が、
（４’）評価対象のＤＳＣ細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群及び前記第２遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程
であってもよい。
工程（３’）において、クラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団、すなわち、第１クラスタを特徴づける第１遺伝子群と、低効率ＤＳＣ細胞の亜集団、すなわち第２クラスタを特定する。第１遺伝子群とは、上述の通りである。
第２遺伝子群とは、前記第２クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第２クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第２クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットである。本発明者らは、工程（１）、（２）及び（３’）を実施することにより、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）に含まれるＤＳＣ細胞を特徴づける第１遺伝子群とともに、低効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第２クラスタ）に含まれるＤＳＣ細胞を特徴づける第２遺伝子群には、以下の遺伝子が含まれることを見出した。
上記表１２において、「ＬＥマーカー」の列で「Ｙ」と記載されている遺伝子は、治療効果の高い被験者のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者のＤＳＣ細胞との間のマイクロアレイアッセイにより、その発現量に差がみられた遺伝子について、定量的ＰＣＲを行った結果、ＬＥマーカーとして特徴付けられた遺伝子を示している（実施例を参照のこと）。
上記表１２において、「基底膜（ＧＯ ｔｅｒｍ）」の列で「Ｙ」と記載されている遺伝子は、治療効果の高い被験者のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者のＤＳＣ細胞のシングルセルトランスクリプトームを実施し、発現変動遺伝子（Ｄｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ：ＤＥＧ）の遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によって、ＬＥ群に特徴的な細胞群で統計的に有意に濃縮されてことが見いだされたＧＯ ｔｅｒｍである「基底膜」に含まれる遺伝子を示している。
上記表１２において、「血管発生（ＧＯ ｔｅｒｍ）」の列で「Ｙ」と記載されている遺伝子は、治療効果の高い被験者のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者のＤＳＣ細胞のシングルセルトランスクリプトームを実施し、発現変動遺伝子（Ｄｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ：ＤＥＧ）の遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によって、ＬＥ群に特徴的な細胞群で統計的に有意に濃縮されてことが見いだされたＧＯ ｔｅｒｍである「血管発生」に含まれる遺伝子を示している。
上記表１２において、「細胞外マトリクスの形成（ＧＯ ｔｅｒｍ）」の列で「Ｙ」と記載されている遺伝子は、治療効果の高い被験者のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者のＤＳＣ細胞のシングルセルトランスクリプトームを実施し、発現変動遺伝子（Ｄｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ：ＤＥＧ）の遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によって、ＬＥ群に特徴的な細胞群で統計的に有意に濃縮されてことが見いだされたＧＯ ｔｅｒｍである「細胞外マトリクスの形成」に含まれる遺伝子を示している。
上記表１２において、「毛根鞘で発現するレセプター」の列に記載されている遺伝子は、受容体－リガンドデータベース（Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）（ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／５／ｓｕｐｐｌ／Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ＿ｅｔ＿ａｌ＿２０１５／）において、当該遺伝子（因子）と相互作用するものとして登録されているレセプター遺伝子であって、これまでに毛根鞘での発現が報告されている因子を示している。
上記表１２において、「毛根鞘で発現するリガンド」の列に記載されている遺伝子は、受容体－リガンドデータベース（Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）（ｈｔｔｐ：／／ｆａｎｔｏｍ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／５／ｓｕｐｐｌ／Ｒａｍｉｌｏｗｓｋｉ＿ｅｔ＿ａｌ＿２０１５／）において、当該遺伝子（因子）と相互作用するものとして登録されているリガンド遺伝子であって、これまでに毛根鞘での発現が報告されている因子を示している。
上記（１）、（２）及び（３’）により特定された、第１遺伝子群及び第２遺伝子群に含まれる遺伝子に基づき、さらに、
（４’）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群及び前記第２遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程
を実施することにより、評価細胞集団の毛包再生能を評価することができる。例えば、第１遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が亢進している、並びに／あるいは、第２遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が低下している場合、毛髪再生能が高いと評価することができる。逆に、第１遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が低下している、並びに／あるいは、第２遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が亢進している場合、毛髪再生能が低いと評価することができる。
（４’）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群及び前記第２遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程
を実施することにより、評価細胞集団の毛包再生能を評価することができる。例えば、第１遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が亢進している、並びに／あるいは、第２遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が低下している場合、毛髪再生能が高いと評価することができる。逆に、第１遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が低下している、並びに／あるいは、第２遺伝子群に含まれる遺伝子のうち、１又は複数の遺伝子について、所定の閾値よりも発現が亢進している場合、毛髪再生能が低いと評価することができる。
上記遺伝子の発現レベルを指標として、培養後の間葉系細胞、例えば毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞、毛根鞘（ＤＳ）細胞及び／又は毛乳頭（ＤＰ）細胞を含む細胞集団を評価することによって、対象に適用する前に、毛包再生効果を予測することも可能となる。
また、上記遺伝子の発現レベルを指標として、例えば、第１遺伝子群に含まれる遺伝子を高発現する及び／又は第２遺伝子群に含まれる遺伝子を低発現する間葉系細胞を選択することにより、毛包再生効果が高い細胞集団を分取することも可能となる。
本明細書において、「遺伝子の発現レベル」とは、任意の遺伝子から転写された転写産物、又はその転写産物を鋳型として翻訳された翻訳産物を検出し、測定することによって決定することができるものをいう。転写産物とは、例えば、遺伝子のＤＮＡを鋳型として転写されるＲＮＡ鎖、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼにより合成されるＲＮＡ鎖、及び転写後細胞内で修飾されたＲＮＡ鎖を意味する。転写産物に含まれるＲＮＡ鎖としては、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。これらのＲＮＡ鎖は、転写後、細胞内でプロセッシングされたものも含む。翻訳産物とは、例えば、遺伝子によって転写された転写産物を鋳型として翻訳されるポリペプチド鎖、すなわち、リボソームによって合成されるポリペプチド鎖、及びそのポリペプチド鎖がフォールデングすることで形成されるタンパク質を意味する。翻訳産物には、ポリペプチド鎖又はタンパク質のフラグメントも含まれる。
遺伝子の発現レベルは、公知の方法を用いることによって測定することができる。例えば、遺伝子の発現レベルを測定するために、遺伝子の転写産物を測定する場合、目的の遺伝子の配列を参考にすることによって適切なプローブを設計し、それらを用いて、定量的ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ法）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法などの方法を用いることによって測定することができる。
また、例えば、遺伝子の発現レベルを測定するために、遺伝子の翻訳産物を測定する場合、目的の遺伝子によって翻訳されるタンパク質を検出する抗体を用い、例えば、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法（ＦＡＣＳ法）、ＥＬＩＳＡ法などによって測定することができる。
一実施態様において、遺伝子の発現レベルは、任意のハウスキーピング遺伝子の発現レベルによって正規化（標準化）することによって比較することができる。比較のために用いることができるハウスキーピング遺伝子としては、例えば、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、β－アクチン、β２－マイクログロブリン、ＨＰＲＴ １（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）などが挙げられる。本発明に用いられる上述の遺伝子と同様の方法により、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定し、当該ハウスキーピング遺伝子の発現レベルによって正規化（標準化）することによって、異なるサンプル間で比較することができる。
一実施態様において、「遺伝子の発現レベルを指標とする」とは、毛包由来の細胞群において、所定のレベル以上（例えば、ネガティブコントロールのサンプルのシグナル以上）または以下（例えばネガティブコントロールのサンプルのシグナル以下）の、遺伝子を発現する細胞の割合を検出することであってもよい。これにより、毛包由来の細胞群に含まれる毛球部毛根鞘細胞の割合を評価することが可能となる。
一実施態様において、「遺伝子の発現レベルを指標とする」とは、毛包由来の細胞群全体において、任意の遺伝子の発現レベルを検出し、他のサンプルの同一の遺伝子の発現レベルと比較することであってもよい。これにより、毛包由来の細胞群全体として、毛包再生能を有する細胞で発現する遺伝子が亢進または低下されているかどうかを評価することができる。
一実施態様において、「毛包再生能を有する細胞の活性」とは、毛包再生能を有する細胞において発現する上記の遺伝子の発現レベルである。異なるサンプル間において、上記の遺伝子の発現レベルを比較することにより、毛包由来の細胞群に含まれる毛包再生能を有する細胞、例えば毛包再生への高い効果を有する毛球部毛根鞘細胞及び／又は上部毛根鞘細胞の相対的な活性を比較することができる。
一実施態様において、本発明は、インビトロで培養された間葉系細胞を含む毛包由来の細胞群に適用することができる。これにより、毛包由来の細胞群に含まれる毛包再生能を有する細胞、例えば毛包再生への高い効果を有する毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞及び／又は上部毛根鞘（ＵＤＳ）細胞が、培養の前後に、その割合又はその性質が変化していないかを評価することもできる。また、他の態様において、本発明は、１回以上継代された毛包由来の細胞群を用いることができる。毛包由来の細胞群をインビトロで培養し、継代する方法については公知の方法を採用すればよく、限定されない。
一実施態様において、本願発明は、上記表１１に記載の第１遺伝子群から１又は複数選択される遺伝子の発現レベルを指標とする、間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法を提供する。
また、一実施態様において、本願発明は、上記表１２に記載の第２遺伝子群から１又は複数選択される遺伝子の発現レベルを指標とする、間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法を提供する。
また、他の態様において、本願発明は、上記表１１に記載の第１遺伝子群から１又は複数選択される遺伝子、並びに／あるいは、上記表１２に記載の第２遺伝子群から１又は複数選択される遺伝子の発現レベルを指標とする、間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法を提供する。
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
１．方法
１－１．ＤＳＣ細胞の調製
Tsuboiらの文献（Autologous cell-based therapy for male and female pattern hair loss using dermal sheath cup cells: A randomized placebo-controlled double-blinded dose-finding clinical study. Tsuboi R, Niiyama S, Irisawa R, Harada K, Nakazawa Y, Kishimoto J. J Am Acad Dermatol. 2020 Jul;83(1):109-116.）に記載の方法に従って、ＤＳＣ細胞を調製した。
１－１．ＤＳＣ細胞の調製
Tsuboiらの文献（Autologous cell-based therapy for male and female pattern hair loss using dermal sheath cup cells: A randomized placebo-controlled double-blinded dose-finding clinical study. Tsuboi R, Niiyama S, Irisawa R, Harada K, Nakazawa Y, Kishimoto J. J Am Acad Dermatol. 2020 Jul;83(1):109-116.）に記載の方法に従って、ＤＳＣ細胞を調製した。
１－２．評価被験者の分類
Tsuboiらの文献（Autologous cell-based therapy for male and female pattern hair loss using dermal sheath cup cells: A randomized placebo-controlled double-blinded dose-finding clinical study. Tsuboi R, Niiyama S, Irisawa R, Harada K, Nakazawa Y, Kishimoto J. J Am Acad Dermatol. 2020 Jul;83(1):109-116.）で評価した被験者のうち、治療効果の高い被験者と、治療効果の低い被験者に注入したＤＳＣ細胞を用いて、以下の解析を行った。治験効果の高い被験者と低い被験者の分類は、臨床研究で得られた試験開始時、及び試験開始から３、６、９、１２カ月後の積算毛髪径の計測値を用いて解析を行った。開始時比及びプラセボ比のデータについて統計解析ソフトＲ ｓｔｕｄｉｏのｇｐｌｏｔｓ／ ｈｅａｔｍａｐ．２スクリプトにより階層的クラスタリング解析を実施した。クラスタリング手法としてユークリッド距離のｗａｒｄ．Ｄ２法を用いた。クラスタリング結果の樹形図で同じ枝に属する群から、全体的に治療効果が高いグループ（ＨＥ群）、治療効果が低いグループ（ＬＥ群）を分類した。
Tsuboiらの文献（Autologous cell-based therapy for male and female pattern hair loss using dermal sheath cup cells: A randomized placebo-controlled double-blinded dose-finding clinical study. Tsuboi R, Niiyama S, Irisawa R, Harada K, Nakazawa Y, Kishimoto J. J Am Acad Dermatol. 2020 Jul;83(1):109-116.）で評価した被験者のうち、治療効果の高い被験者と、治療効果の低い被験者に注入したＤＳＣ細胞を用いて、以下の解析を行った。治験効果の高い被験者と低い被験者の分類は、臨床研究で得られた試験開始時、及び試験開始から３、６、９、１２カ月後の積算毛髪径の計測値を用いて解析を行った。開始時比及びプラセボ比のデータについて統計解析ソフトＲ ｓｔｕｄｉｏのｇｐｌｏｔｓ／ ｈｅａｔｍａｐ．２スクリプトにより階層的クラスタリング解析を実施した。クラスタリング手法としてユークリッド距離のｗａｒｄ．Ｄ２法を用いた。クラスタリング結果の樹形図で同じ枝に属する群から、全体的に治療効果が高いグループ（ＨＥ群）、治療効果が低いグループ（ＬＥ群）を分類した。
１－３．マイクロアレイアッセイ及び定量的ＰＣＲ
治療効果の高い被験者（ＨＥ群）のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者（ＬＥ群）のＤＳＣ細胞における遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイアッセイで調べ、その結果、ｐ－ｖａｌｕｅ ０．０５以下、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ１．５倍の以上条件で発現が変動する遺伝子を見出した。
治療効果の高い被験者（ＨＥ群）のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者（ＬＥ群）のＤＳＣ細胞における遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイアッセイで調べ、その結果、ｐ－ｖａｌｕｅ ０．０５以下、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ１．５倍の以上条件で発現が変動する遺伝子を見出した。
１－４．シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ
ＨＥ群より１つ、ＬＥ群より２つの凍結細胞サンプル（以下、ぞれぞれのサンプルを「ＨＥ」、「ＬＥ１」、「ＬＥ２」と称する。）を ＴｏｔａｌＳｅｑ（商標）－Ｂ０２５２ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｈａｓｈｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で別々に標識後、 混合して、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ （１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ， ＣＡ）を用いて単細胞バーコード化し、ライブラリーの調製を行った。シークエンスは ＤＮＢＳＥＱ－Ｇ４００（ＭＧＩ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｃｈｉｎａ）により 実施し、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ４．０．０ で ＧＲＣｈ３８ ゲノムを参照にアラインメントした。合計 ６７４６個の細胞を解析し、５２６４個の標識化された細胞が検出された。
ＨＥ群より１つ、ＬＥ群より２つの凍結細胞サンプル（以下、ぞれぞれのサンプルを「ＨＥ」、「ＬＥ１」、「ＬＥ２」と称する。）を ＴｏｔａｌＳｅｑ（商標）－Ｂ０２５２ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｈａｓｈｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で別々に標識後、 混合して、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ （１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ， ＣＡ）を用いて単細胞バーコード化し、ライブラリーの調製を行った。シークエンスは ＤＮＢＳＥＱ－Ｇ４００（ＭＧＩ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｃｈｉｎａ）により 実施し、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ４．０．０ で ＧＲＣｈ３８ ゲノムを参照にアラインメントした。合計 ６７４６個の細胞を解析し、５２６４個の標識化された細胞が検出された。
１－５．データ解析
データの品質管理として、発現遺伝子数が１２００未満、遺伝子の発現カウントが３８００未満の細胞、ミトコンドリア遺伝子が １０％を超えて発現している細胞、または ＨＥ、 ＬＥ１、 ＬＥ２ でそれぞれ３２，０００、４０，０００、５０，０００カウントを超えて発現している細胞を除去した。合計３６２０個の細胞を最終解析に使用した。
データは Ｓｅｕｒａｔ ｐａｃｋａｇｅ、バージョン ４．０．０（Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）でＵＭＡＰ投影によって次元削減され、細胞サンプル間で同種の細胞が重なるようにｂａｔｃｈ ｅｆｆｅｃｔ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを実施した数値について、教師なしのグラフベースクラスタリングにより分類し、可視化された。
データの品質管理として、発現遺伝子数が１２００未満、遺伝子の発現カウントが３８００未満の細胞、ミトコンドリア遺伝子が １０％を超えて発現している細胞、または ＨＥ、 ＬＥ１、 ＬＥ２ でそれぞれ３２，０００、４０，０００、５０，０００カウントを超えて発現している細胞を除去した。合計３６２０個の細胞を最終解析に使用した。
データは Ｓｅｕｒａｔ ｐａｃｋａｇｅ、バージョン ４．０．０（Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）でＵＭＡＰ投影によって次元削減され、細胞サンプル間で同種の細胞が重なるようにｂａｔｃｈ ｅｆｆｅｃｔ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを実施した数値について、教師なしのグラフベースクラスタリングにより分類し、可視化された。
１－６．フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、ＤＳＣ細胞懸濁液をＦＩＴＣ標識抗ＩＴＧＡ６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）用いて標識した後、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙ ｃｙｔｅ ＨＴ （商標） （Ｌｕｍｉｎｅｘ）を用いて陽性細胞を検出した。陰性対照として、用いた抗体と同型の非特異的抗体を用いた。
フローサイトメトリーは、ＤＳＣ細胞懸濁液をＦＩＴＣ標識抗ＩＴＧＡ６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）用いて標識した後、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙ ｃｙｔｅ ＨＴ （商標） （Ｌｕｍｉｎｅｘ）を用いて陽性細胞を検出した。陰性対照として、用いた抗体と同型の非特異的抗体を用いた。
２．結果
培養したＤＳＣは不均一な細胞集団であることが細胞の継代画像からも示唆されていた。そこで、シングルセルトランスクリプトームによりＨＥ群のＩＤに由来する細胞群及びＬＥ群のＩＤに由来する細胞群を解析し、高い有効性を示す細胞集団の同定を試みた。
培養したＤＳＣは不均一な細胞集団であることが細胞の継代画像からも示唆されていた。そこで、シングルセルトランスクリプトームによりＨＥ群のＩＤに由来する細胞群及びＬＥ群のＩＤに由来する細胞群を解析し、高い有効性を示す細胞集団の同定を試みた。
細胞のデータ解析の結果、異なる発現プロファイルを持つ１８のクラスタが得られた（図１）。
同定されたすべてのクラスタは、用いた全てのＩＤ由来の細胞を含んでいた（図２）。各クラスタに含まれる細胞数の割合はでサンプル間で大きく異なり、ＨＥ群由来細胞はクラスタ１を多く含むのに対し、ＬＥ群由来細胞は一つのクラスタに偏らず多くのクラスタに分散していた。
図３－１に、各クラスタの発現亢進遺伝子の上位１０遺伝子を示す。一部のクラスタの発現亢進遺伝子は、特定のサンプルで強く発現し、サンプル間では非一様な発現が認められた。例えはクタスター１については、ＨＥ群とＬＥ群との遺伝子発現の差が大きい遺伝子、すなわちよりＨＥ群サンプルで顕著に変動する遺伝子が発現変動遺伝子（Ｄｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ：ＤＥＧ）として数多く検出されたと考えられる。
上記のクラスリング解析とは別に、治療効果の高い被験者（ＨＥ群）のＤＳＣ細胞と、治療効果の低い被験者（ＬＥ群）のＤＳＣ細胞における遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイアッセイで調べて有意差があったＨＥマーカー因子（９個：ＧＲＥＭ２、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＴＩＭＰ３、ＲＧＳ２、ＮＰＤＣ１、ＣＡＭＫ２Ｎ１、ＣＯＬＥＣ１２、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＡＤＧＲＥ５）及びＬＥマーカー因子（３個：ＮＩＤ２、ＢＡＭＢＩ、ＡＮＧＰＴ１）の発現は、シングルセル解析においても同様であり、ＨＥマーカーはＨＥ由来細胞の多くの細胞で高発現し、ＬＥマーカーはＬＥ由来細胞の多くの細胞で高発現していた（図４）。
ＵＭＡＰ上でのＨＥマーカー及びＬＥマーカー遺伝子を高発現する細胞の分布には差異が認められた（図５－１～５－２）。
各クラスタのＤＥＧには一部重複があったが、そのうち、クラスタ１にはＨＥマーカー９遺伝子のうち７遺伝子が含まれていた。一方で、ＬＥマーカー３遺伝子は全てクラスタ４に含まれていた。
クラスタ１に含まれたＨＥマーカーの発現が閾値以上の細胞の各クラスタに含まれる細胞数は、いずでもクラスタ１で最も多く、ＬＥマーカーを高発現する細胞はクラスタ４で最も多かった（図７－１～図７－５）。
ＨＥマーカーがクラスタ１に多く含まれたことから、クラスタ１にＨＥの特性を表す細胞が多く含まれ、また、クラスタ４にはＬＥの特性を表す細胞が多く含まれると考えられた。ＤＥＧの遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析の結果、クラスタ１には接着結合、細胞遊走、内因性刺激への応答に関与する因子が統計的に有意に濃縮されていた。一方で、クラスタ４では基底膜構成に重要な因子及び血管形成に関与する因子が有意に濃縮され、ＬＥマーカーとして同定したＮＩＤ２に加えてＣＯＬ４Ａ１及びＬＡＭＡ４といった代表的な基底膜因子が発現亢進していた（図８－１～８－２）。
ＤＳＣの細胞亜集団と毛包の潜在的な相互作用を明らかにするために、受容体－リガンドデータベース（Ramilowski et al.2015）（http://fantom.gsc.riken.jp/5/suppl/Ramilowski_et_al_2015/）を検索した。さらに、クラスタ１またはクラスタ４で発現亢進する因子のリガンドまたはレセプターの毛包での発現について、これまでに報告された毛根鞘の網羅的遺伝子発現データを検索した。
その結果、クラスタ１または４細胞に対する複数のリガンドまたはレセプターの毛包で発現することが示唆された。これらの因子を介した相互作用が、ＤＳＣ細胞の毛成長促進効果に寄与する可能性がある（図９、１０）
なお、図９に記載の参考文献は、以下の通り：
＃１ Single-Cell RNA Profiling of Human Skin Reveals Age-Related Loss of Dermal Sheath Cells and Their Contribution to a Juvenile Phenotype.
Ahlers JMD, et al. Front Genet. 2022.
＃２ Gene Expression Profiling of the Intact Dermal Sheath Cup of Human Hair Follicles. Niiyama S, et al. Acta Derm Venereol. 2018 Jul 11;98(7):694-698.
＃３ Dysfunction of Hair Follicle Mesenchymal Progenitors Contributes to Age-Associated Hair Loss. Shin W, et al. Dev Cell. 2020 Apr 20;53(2):185-198.e7.
＃１ Single-Cell RNA Profiling of Human Skin Reveals Age-Related Loss of Dermal Sheath Cells and Their Contribution to a Juvenile Phenotype.
Ahlers JMD, et al. Front Genet. 2022.
＃２ Gene Expression Profiling of the Intact Dermal Sheath Cup of Human Hair Follicles. Niiyama S, et al. Acta Derm Venereol. 2018 Jul 11;98(7):694-698.
＃３ Dysfunction of Hair Follicle Mesenchymal Progenitors Contributes to Age-Associated Hair Loss. Shin W, et al. Dev Cell. 2020 Apr 20;53(2):185-198.e7.
なお、本実施例において同定したクラスタ１に含まれるＤＳＣ細胞の亜集団を特徴づける遺伝子群は、表１１に記載しており、クラスタ４に含まれるＤＳＣ細胞の亜集団を特徴づける遺伝子群は、表１２に記載している。
第１遺伝子群に含まれるＨＥマーカーであるＩＴＧＡ６の抗体を用いたフローサイトメトリーにより、ＤＳＣ細胞亜集団の識別を行った。４名の被験者（ＩＤ＿１、ＩＤ＿２、ＩＤ＿３、ＩＤ４）由来のＤＳＣ細胞のＩＴＧＡ６の含有率は異なっており、これらによるＤＳＣ細胞の効果予測が可能だった。
Claims (14)
- 間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法であって、
（１）毛髪再生能を有すると評価された検体由来の毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第１細胞群；及び毛髪再生能が低い又は有さないと評価された検体由来のＤＳＣ細胞を含む第２細胞群のそれぞれに含まれる各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを決定し、前記各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成する工程；
（２）前記各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して次元削減を行い、各単一細胞の次元削減成分を作成する工程；
（３）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群を特定する工程であって、
ここで前記第１遺伝子群は、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットである；及び
（４）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、
を含む、方法。 - 前記工程（４）が、各単一細胞の遺伝子の発現レベルを決定し、前記各単一細胞の各遺伝子の発現レベルを示す成分を含む遺伝子発現データセットを作成し、前記各単一細胞の遺伝子発現データセットに対して次元削減を行い、各単一細胞の次元削減成分を作成し、前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータを基に、前記第１クラスタの近傍に配置される細胞の割合を算出し、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程、
である、請求項１に記載の方法。 - 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
- 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
- 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
- 前記工程（３）が、
（３’）前記次元削減成分に基づいてプロットされた各単一細胞を示すデータセットについてクラスタリング処理を行い、高効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第１クラスタ）を特徴づける第１遺伝子群と、低効率ＤＳＣ細胞の亜集団（第２クラスタ）を特徴づける第２遺伝子群とを特定する工程であって、
ここで前記第１遺伝子群は、前記第１クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第１クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットであり、
ここで前記第２遺伝子群は、前記第２クラスタに含まれない前記第１細胞群及び第２細胞群のＤＳＣ細胞の亜集団と比較して、前記第２クラスタのＤＳＣ細胞において有意に高く発現する遺伝子のセットであり、
前記工程（４）が、
（４’）評価対象の間葉系細胞を含む評価細胞集団について、各単一細胞又は細胞集団全体の前記第１遺伝子群及び前記第２遺伝子群に含まれる１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定し、そのレベルを指標として、前記評価細胞集団の毛包再生能を評価する工程
である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。 - 前記第２遺伝子群が、以下の遺伝子：
- 前記第２遺伝子群が、以下の遺伝子：
- 前記次元削減が、主成分分析、局所線形埋め込み、局所線形アイソメトリックマッピング（ＩＳＯＭＡＰ）、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）、親和性に基づく軌道埋め込みのための熱拡散の可能性（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｈｅａｔ－Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂａｓｅｄ Ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）（ＰＨＡＴＥ）、及び一様多様体近似及び投影（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＵＭＡＰ）からなる群から選択される工程により実施される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
- 以下の遺伝子：
- 前記第１遺伝子群が、さらに、以下の遺伝子：
- 前記第１遺伝子群が、以下の遺伝子：
- さらに、以下の遺伝子：
を含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。 - さらに、以下の遺伝子：
を含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022-036402 | 2022-03-09 | ||
| JP2022036402 | 2022-03-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2023171395A1 true WO2023171395A1 (ja) | 2023-09-14 |
Family
ID=87935017
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/006552 WO2023171395A1 (ja) | 2022-03-09 | 2023-02-22 | 間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2023171395A1 (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014200025A1 (ja) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | 株式会社資生堂 | 毛包形成用の組成物の品質管理方法 |
| WO2020095631A1 (ja) * | 2018-11-08 | 2020-05-14 | 国立大学法人横浜国立大学 | 毛包原基、毛包原基の製造方法、及び毛包原基に含まれる細胞の活性化方法 |
| JP2020186218A (ja) * | 2019-05-17 | 2020-11-19 | ロート製薬株式会社 | 発毛因子産生促進剤及び／又は毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤 |
| WO2021015209A1 (ja) * | 2019-07-22 | 2021-01-28 | 株式会社 資生堂 | 毛球部毛根鞘細胞を同定する方法 |
-
2023
- 2023-02-22 WO PCT/JP2023/006552 patent/WO2023171395A1/ja unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014200025A1 (ja) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | 株式会社資生堂 | 毛包形成用の組成物の品質管理方法 |
| WO2020095631A1 (ja) * | 2018-11-08 | 2020-05-14 | 国立大学法人横浜国立大学 | 毛包原基、毛包原基の製造方法、及び毛包原基に含まれる細胞の活性化方法 |
| JP2020186218A (ja) * | 2019-05-17 | 2020-11-19 | ロート製薬株式会社 | 発毛因子産生促進剤及び／又は毛再生剤及び／又は脱毛抑制剤 |
| WO2021015209A1 (ja) * | 2019-07-22 | 2021-01-28 | 株式会社 資生堂 | 毛球部毛根鞘細胞を同定する方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YUMIKO TSUJI: "O-18-2 Identification of cell groups responsible for the effectiveness of hair bulb root sheath cell products (S-DSC) by single cell analysis", REGENERATIVE MEDICINE, JAPANESE SOCIETY FOR REGENERATIVE MEDICINE, JP, vol. 21, no. Suppl., 17 March 2022 (2022-03-17), JP , pages O - 18, XP009549424, ISSN: 1347-7919 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Grünwald et al. | Spatially confined sub-tumor microenvironments in pancreatic cancer | |
| Belote et al. | Human melanocyte development and melanoma dedifferentiation at single-cell resolution | |
| Rajasekhar et al. | Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes | |
| Takahashi et al. | Defining transcriptional signatures of human hair follicle cell states | |
| Jain et al. | Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects | |
| Nevo et al. | Identification of molecular pathways facilitating glioma cell invasion in situ | |
| TWI811306B (zh) | 毛球部毛根鞘細胞(dscc)之鑑定方法、及用於使毛囊再生之組合物之評估方法 | |
| Shim et al. | Integrated analysis of single-cell and spatial transcriptomics in keloids: highlights on fibrovascular interactions in keloid pathogenesis | |
| JP2015527630A (ja) | ヘア／頭皮ケア組成物向け化粧剤の同定システム及び方法 | |
| WO2022191149A1 (ja) | 毛包再生能を有する細胞の同定方法、及び毛包を再生するための組成物の評価方法 | |
| Leelatian et al. | Unsupervised machine learning reveals risk stratifying glioblastoma tumor cells | |
| Murrow et al. | Mapping hormone-regulated cell-cell interaction networks in the human breast at single-cell resolution | |
| Dubois et al. | Defining the skin cellular community using single-cell genomics to advance precision medicine | |
| Jiao et al. | Discovering metabolic disease gene interactions by correlated effects on cellular morphology | |
| CN110106244A (zh) | 一种乳腺癌无创分子分型试剂盒及方法 | |
| WO2023171395A1 (ja) | 間葉系細胞を含む細胞集団の毛髪再生能を評価する方法 | |
| Kimelberg et al. | Acutely isolated astrocytes as models to probe astrocyte functions | |
| US8334136B2 (en) | Method for promoting hair growth or hair regeneration by maintaining or increasing expression of cell-adhesion factor | |
| Chen et al. | Multiomic characterization and drug testing establish circulating tumor cells as an ex vivo tool for personalized medicine | |
| AU2022340811A1 (en) | Assessment of melanoma therapy response | |
| Min et al. | Multiple human adipocyte subtypes and mechanisms of their development | |
| JP2021507714A (ja) | ヒト真皮線維芽細胞の単離方法 | |
| Jabart et al. | Single-cell protein expression of hiPSC-derived cardiomyocytes using Single-Cell Westerns | |
| Murrow et al. | Changes in epithelial proportions and transcriptional state underlie major premenopausal breast cancer risks | |
| Marohn et al. | Defining epidermal stem cell fate infidelity and immunogenicity in Hidradenitis suppurativa at the single-cell resolution |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23766573 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |