TWI811306B - 毛球部毛根鞘細胞(dscc)之鑑定方法、及用於使毛囊再生之組合物之評估方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以GREM2基因之表現水準為指標。又，本發明提供一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以GREM2基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。

Description

毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法、及用於使毛囊再生之組合物之評估方法
本發明係關於一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法。又，本發明係關於一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法。
毛髮由存在於皮膚之毛囊產生。毛囊係包圍毛髮之組織層，包括來自外胚葉之毛母(毛母細胞)、內毛根鞘、外毛根鞘、或來自中胚葉之真皮毛根鞘、毛乳頭等。包圍毛乳頭之毛母細胞受到毛乳頭所供給之營養或蛋白質之誘導而反覆進行分裂，從而角質化，藉此形成毛髮。
毛髮之發育產生問題而引發毛髮稀少、脫髮症。毛髮稀少、脫髮症有壯年性脫髮症、圓形禿、休止期脫髮症等，頻度最高的為壯年性脫髮症。壯年性脫髮症係於男性中主要受男性激素之影響而引起，故亦稱為男性型脫髮症。毛髮反覆經歷包括生長期、退行期及休止期之毛髮週期而進行生長和替換。男性型脫髮症係由於在該毛髮週期中生長期變短、細而短之毛髮之比率增加而引起之症狀。
目前，壯年性脫髮症之治療主要使用作為外用劑之敏樂定(minoxidil)或作為經口藥之非那雄胺(finasteride)。該等治療法之有效性或安全性均已得到確認，但未必對所有之壯年性脫髮症有效。
另外，作為壯年性脫髮症之治療，實施自體植毛術。自體植毛術係將從側頭部或後頭部採集之包含毛根之毛髮移植至自身脫髮部之術式。然而，由於該術式係將自己之毛髮移植於其他部位之術式，故並非增加毛髮總量。
近年來，開發了針對各種疾病之再生醫療技術，於毛髮再生領域亦研究開發了新技術。例如，揭示有毛囊中之位於毛囊再外層之真皮毛根鞘、尤其是位於毛球部之底部之毛球部毛根鞘細胞(dermal sheath cup cell：DSCC)具有較高之毛囊誘導能力，報告有於移植DSCC之實驗中確認生髮(非專利文獻1、2)。又，亦揭示有DSCC係於生髮中具有重要作用之毛乳頭(Dermal papilla：DP)細胞之前驅細胞，DSCC備受矚目(非專利文獻3)。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Jahoda CA,, et al., Induction of hair growth by implantation of cultured dermal papilla cells. Nature 1984; 311: 560-562.
[非專利文獻2]McElwee KJ,, et al., Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla. J. Invest. Dermatol. 2003; 121: 1267-1275.
[非專利文獻3]Rahmani W., et al., Hair follicle dermal stem cells regenerate the dermal sheath, repopulate the dermal papilla, and modulate hair type. Dev. Cell. 2014 Dec. 8; 31 (5): 543-58.
於毛髮再生之領域正在開發使用來自毛囊之細胞群之治療法，但具有毛囊誘導能力之毛球部毛根鞘細胞於目前階段只有於目視下採集毛球部周邊底部之細胞之方法，且不知曉特異之標記物。又，無法評估採集之細胞中除毛球部毛根鞘細胞以外之細胞混入多少。又，無法評估於活體外培養所採集之毛球部毛根鞘細胞後維持其性質之細胞殘存多少。
因此，本發明之目的在於調查清楚來自毛囊之細胞群、尤其是毛球部毛根鞘細胞中特異性表現之標記物基因，並且提供一種以該基因之表現水準為指標之鑑定毛球部毛根鞘細胞之方法。又，本發明之目的在於提供一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法。
本發明者經過銳意研究，結果發現了於毛球部毛根鞘細胞中表現之基因，從而完成本發明。即，本發明包含以下之發明。
[1]一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以GREM2基因之表現水準為指標。
[2]如[1]中記載之方法，其進而以選自由ASPN基因、MMP11基因、PTGER3基因、RBP4基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[3]如[1]或[2]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[4]如[3]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
[5]一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以GREM2基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
[6]如[5]中記載之方法，其進而以選自由ASPN基因、MMP11基因、PTGER3基因、RBP4基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、 CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[7]如[5]或[6]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[8]如[7]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
[9]一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以ASPN基因之表現水準為指標。
[10]如[9]中記載之方法，其進而以選自由GREM2基因、MMP11基因、PTGER3基因、RBP4基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[11]如[9]或[10]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[12]如[11]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
[13]一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以ASPN基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
[14]如[13]中記載之方法，其進而以選自由GREM2基因、MMP11基因、PTGER3基因、RBP4基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[15]如[13]或[14]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[16]如[15]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
[17]一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以MMP11基因之表現水準為指標。
[18]如[17]中記載之方法，其進而以選自由GREM2基因、ASPN基因、PTGER3基因、RBP4基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、 CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[19]如[17]或[18]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[20]如[19]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
[21]一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以MMP11基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
[22]如[21]中記載之方法，其進而以選自由GREM2基因、ASPN基因、PTGER3基因、RBP4基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[23]如[21]或[22]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[24]如[23]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以 上之來自毛囊之細胞群。
[25]一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以PTGER3基因之表現水準為指標。
[26]如[25]中記載之方法，其進而以選自由GREM2基因、ASPN基因、MMP11基因、RBP4基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[27]如[25]或[26]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[28]如[27]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
[29]一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以PTGER3基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
[30]如[29]中記載之方法，其進而以選自由GREM2基因、ASPN基因、MMP11基因、RBP4基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因 、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[31]如[29]或[30]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[32]如[31]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
[33]一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以RBP4基因之表現水準為指標。
[34]如[33]中記載之方法，其進而以選自由GREM2基因、ASPN基因、MMP11基因、PTGER3基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[35]如[33]或[34]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[36]如[35]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以 上之來自毛囊之細胞群。
[37]一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以RBP4基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
[38]如[37]中記載之方法，其進而以選自由GREM2基因、ASPN基因、MMP11基因、PTGER3基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[39]如[37]或[38]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[40]如[39]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
[41]一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以TLE4基因之表現水準為指標。
[42]如[41]中記載之方法，其進而以選自由GREM2基因、ASPN基因、MMP11基因、PTGER3基因、RBP4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因 、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[43]如[41]或[42]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[44]如[43]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
[45]一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以TLE4基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
[46]如[45]中記載之方法，其進而以選自由GREM2基因、ASPN基因、MMP11基因、PTGER3基因、RBP4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
[47]如[45]或[46]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
[48]如[47]中記載之方法，其中上述來自毛囊之細胞群為繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
根據本發明，能夠識別來自毛囊之細胞群中所含有之毛球部毛根鞘細胞，能夠評估含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之品質。又，即便於活體外培養經單離之毛球部毛根鞘細胞而使之增殖後，亦能夠評估毛球部毛根鞘細胞是否殘存，能夠選擇毛囊誘導能力較高之用於使毛囊再生之組合物。
圖1係表示毛囊(Hair follicle：HF)亞單位之圖。(a)為HF整體。(b)為切開之上部真皮毛根鞘(Upper Dermal Sheath：UDS)。(c)為切開之經翻轉之分離前之毛球部毛根鞘(Dermal Sheath Cup：DSC)及毛乳頭(Dermal Papilla：DP)。比例尺=200μm。
圖2係表示主成分分析後之微陣列結果之近似性之圖。自不同視點之三維視點。X軸為主成分(PC)1(32.34%之分散補充)；Y軸為PC2(22.83%之分散補充)；Z軸為PC3(20.43%之分散補充)。黑色符號：個人(ID)1；白色符號：ID2；斜線符號：ID3。三角形：DSC，四邊形：DP，圓形：UDS。
圖3係於毛球部毛根鞘(DSC)中不同表現之基因。針對3名個體，分別將正規化之DSC識別基因之表現水準與毛乳頭(DP)及上部真皮毛根鞘(UDS)進行比較。
圖4係表示利用定量PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)解析獲得之毛球部毛根鞘(DSC)及毛乳頭(DP)中之GREM2之表現水準之圖。表示將GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)之表現量設為100%時之相對值。
圖5係表示人體毛囊中之GREM2之表現之圖。表示原位(in situ)雜交之結果。(a)GREM2探針，(b)為(a)之放大圖，(c)無探針。紅：原位訊號，藍：利用Hechst33342進行之核染色。比例尺，(a)：100μm，(b)及(c)：50μm。
圖6係表示人體毛囊中之GREM2及GREM1之表現之圖。表示原位雜交之結果。(a)GREM2探針，(b)GREM1探針，(c)無探針。上段：僅原位訊號，中段：原位訊號及核，下段：DSC部分之放大圖。紅：原位訊號，藍：利用Hechst33342進行之核染色。比例尺：100μm。
圖7係表示DSC識別基因之調節控制及其細胞內局域之推定圖。
圖8係表示於毛球部毛根鞘(DSC)之培養前後DSC識別基因之表現量之變化之圖。自完整(intact)之DSC及於活體外培養約30天之DSC回收總RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)，並藉由定量PCR進行解析。表示以GAPDH之表現量進行正規化，且將完整之DSC之基因表現量設為100%時之培養後之DSC之相對基因表現量。
圖9(a)係藉由定量PCR對毛球部毛根鞘(DSC)、毛乳頭(DP)、上部真皮毛根鞘(UDS)經培養後第1繼代之各細胞中之GREM2之表現水準進行解析之圖。表示將DSC細胞中之相對於GAPDH之表現量的GREM2之表現量設為100%時之相對值之2次實驗之平均值。(b)表示於將DSC細胞之值設為1時，毛球部毛根鞘(DSC)、毛乳頭(DP)、上部真皮毛根鞘(UDS)經培 養後第1繼代之各細胞中之群落形成能力之比。
以下，對用以實施本發明之形態進行說明，但本發明之技術範圍並非僅限定於下述形態。
將毛髮之皮膚內部最深部之膨脹之部分稱作毛球部(hair bulb)，將位於毛球部中央部之包含間葉系細胞之部分稱為毛乳頭(dermal papilla)。毛細血管或神經伸入至毛乳頭，吸收來自食物之營養或氧，控制毛髮之產生或生長。於與毛乳頭相接處有毛母細胞(hair matrix cell)，毛髮係產生於該部位。即，毛母細胞自伸入至毛乳頭內之毛細血管吸取營養或氧，反覆進行分裂，藉此形成毛髮。
於本說明書中，「毛囊(Hair Follicle：HF)」係指包括作為上皮系細胞之毛母(毛母細胞)、內毛根鞘、外毛根鞘、或作為間葉系細胞之真皮毛根鞘、毛乳頭及黑色素細胞等之包圍毛髮之組織層。本發明中使用之組織或細胞可來自任一動物，但較佳為來自脊椎動物，更佳為來自哺乳動物，最佳為來自人。
於本說明書中，「真皮毛根鞘(Dermal Sheath：DS)」係含有包覆毛囊最外層之一層或數層真皮性細胞層(波形蛋白陽性)之組織，包含α平滑肌型肌動蛋白(α-SMA)陽性細胞。真皮毛根鞘於毛球部之最下端與毛乳頭相連。如下所述，於本說明書中，真皮毛根鞘包括毛球部毛根鞘與上部真 皮毛根層。
於本說明書中，「毛球部毛根鞘(dermal sheath cup：DSC)」係真皮毛根鞘之一部分，指位於毛球部之底部之組織(參照圖1)。「毛球部毛根鞘細胞(dermal sheath cup cell：DSCC)」係構成毛球部毛根鞘之細胞。已知毛球部毛根鞘細胞為毛乳頭細胞之前驅細胞，並已知藉由將毛球部毛根鞘細胞移植至皮膚而於移植部位誘導毛囊。即，若可於來自毛囊之細胞群或含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物中，選擇毛球部毛根鞘細胞之比率較高及/或其活性較高之來自毛囊之細胞群或組合物，則能夠提供毛囊誘導能力更高之來自毛囊之細胞群或含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物。
於本說明書中，「上部真皮毛根鞘(Upper Dermal Sheath：UDS)」係指真皮毛根鞘中除上述毛球部毛根鞘之部分以外之組織。
於本說明書中，「來自毛囊之細胞群」係指包含上述構成毛囊之細胞之細胞群。又，於本說明書中，「含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物」係除來自毛囊之細胞群以外亦包含例如活體能夠適應之物質者。活體能夠適應之物質例如可為水、生理鹽水、磷酸緩衝液、細胞培養用培養基、活體適應性水凝膠(殼聚糖凝膠、膠原蛋白凝膠、明膠、肽凝膠、層黏連蛋白凝膠及血纖維蛋白凝膠等)等，但並非限定於該等。
本發明者等人經過銳意研究，結果發現了於毛球部毛根鞘細胞 (DSCC)中特異性表現之基因。即，本發明中使用之用於識別毛球部毛根鞘細胞之基因或識別標記物包含以下表1：
Figure 108108263-A0305-02-0017-1
再者，本發明所使用之表1及表2(下述)中記載之基因之具體序列可自基因庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取。本發明所使用之基因之具體序列並非限定於根據表1及表2中記載之登錄號獲取之序列，例如亦包括與上述表1或表2特定之核苷酸序列具有70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同源性之序列、或者其等之剪切變異體等。又，該基因可來自任一動物，但較佳為來自脊椎動物，更佳為來自哺乳動物，最佳為來自人。
於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以GREM2基因之表現水準為指標。
又，於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以ASPN基因之表現水準為指標。
又，於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以MMP11基因之表現水準為指標。
又，於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以PTGER3基因之表現水準為指標。
又，於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以RBP4基因之表現水準為指標。
又，於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以TLE4基因之表現水準為指標。
於來自毛囊之細胞群中，藉由測定上述基因之表現水準，可鑑定來自毛囊之細胞群所含有之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)。又，於來自毛囊之 細胞群中，藉由測定上述基因之表現水準，可預測來自毛囊之細胞群所具有之毛囊誘導效果。
於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以GREM1基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
又，於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以ASPN基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
又，於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以MMP11基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
又，於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法 ，其特徵在於：以PTGER3基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
又，於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以RBP4基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
又，於一實施態樣中，本發明包含以下之態樣。
一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於：以TLE4基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
於含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物中，以上述基因之表現水準為指標，確定來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性，藉此可評估來自毛囊之細胞群所含有之毛球部毛根鞘細胞之相對之量或活性，結果可預測毛球部毛根鞘細胞之毛囊誘導效果。
於其他態樣中，本發明之上述任一方法進而可 以選自由GREM2基因、ASPN基因、MMP11基因、PTGER3基因、RBP4基因及TLE4基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。藉由將對毛球部毛根鞘細胞具有特異性之該等基因加以組合，能夠更加準確地評估來自毛囊之細胞群或含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物所含有之毛球部毛根鞘細胞。
進而，於其他態樣中，本發明除上述步驟以外，進而亦可以選自由以下表2所含有之基因(GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因)所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
Figure 108108263-A0305-02-0021-2
Figure 108108263-A0305-02-0022-3
於本說明書中，「基因之表現水準」係指可藉由對由任意基因轉錄之轉錄產物或以該轉錄產物為模板轉譯之轉譯產物進行檢測、測定而確定者。轉錄產物例如意指以基因之DNA為模板轉錄之RNA鏈、即利用RNA聚合酶合成之RNA鏈及轉錄後於細胞內經修飾之RNA鏈。作為轉錄產物所含有之RNA鏈，例如為信使RNA(mRNA)。該等RNA鏈亦包括轉錄後於細胞內經加工者。轉譯產物例如意指以由基因轉錄所得之轉錄產物為模板 進行轉譯之多肽鏈、即利用核糖體合成之多肽鏈、及由該多肽鏈經摺疊(folding)而形成之蛋白質。轉譯產物亦包括多肽鏈或蛋白質之片段。
基因之表現水準可藉由使用公知之方法進行測定。例如，為了測定基因之表現水準，於測定基因之轉錄產物之情形時，可藉由以目標基因之序列為參考而設計適當之探針，使用其等，採用定量PCR法(qPCR法)、原位雜交法、北方墨點法、DNA微陣列法等方法，藉此進行測定。
又，例如為了測定基因之表現水準，於測定基因之轉譯產物之情形時，可使用檢測由目標基因轉譯之蛋白質之抗體，例如藉由西方點墨法、流式細胞儀法(FACS法)、ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析)法等進行測定。
於一實施態樣中，基因之表現水準可藉由根據任意之管家基因之表現水準加以正規化(標準化)而進行比較。作為可用於比較之管家基因，例如可列舉：GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-肌動蛋白、β2-微球蛋白、HPRT 1(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1)等。藉由與本發明所使用之上述基因相同之方法，測定管家基因之表現水準，根據該管家基因之表現水準加以正規化(標準化)，藉此可於不同之樣品間進行比較。
於一實施態樣中，「以基因之表現水準為指標」可指於來自毛囊之細 胞群中，檢測表現規定水準以上(例如，陰性對照樣品之訊號以上)之基因之細胞之比率。藉此，能夠評估來自毛囊之細胞群中所含有之毛球部毛根鞘細胞之比率。
於一實施態樣中，「以基因之表現水準為指標」亦可指於來自毛囊之細胞群整體中，檢測任意基因之表現水準，與其他樣品之同一基因之表現水準進行比較。藉此，能夠評估作為來自毛囊之細胞群整體，毛球部毛根鞘細胞所表現之基因為高表現或低表現。
於一實施態樣中，「毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之活性」係於毛球部毛根鞘細胞表現之上述基因之表現水準。於不同之樣品間，比較上述基因之表現水準，藉此，可比較來自毛囊之細胞群所含有之毛球部毛根鞘細胞之相對活性。
於一實施態樣中，本發明可使用於活體外培養之來自毛囊之細胞群。藉此，可評估來自毛囊之細胞群所含有之毛球部毛根鞘細胞於培養前後其比率或其性質是否發生變化。又，於其他態樣中，本發明可使用繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。關於在活體外培養來自毛囊之細胞群並使之繼代之方法，採用公知之方法即可，並無限定。
[實施例]
以下，基於實施例進一步詳細地說明本發明，但該等毫不限定本發明。
<實施例1> 1.方法 1-1.毛囊亞單位之製備
自2例接受母斑細胞母斑切除及1例接受脂肪瘤切除之30~70歲之3名女性獲得包含毛囊(Hair Follicle：HF)之頭皮皮膚片。樣品係避開腫瘤病灶，自切除之皮膚之邊緣採集。以McElwee KJ.,et al.(參考文獻1)及Niiyama S.,et al.(參考文獻2)為參考，於實體顯微鏡下，自單離之完整之HF顯微解剖HF之間葉系亞單位(圖1)。簡言之，用鉗子固持HF之與毛球區域鄰接之部位，使用針將毛球橫向切斷而切開。使用鉗子與針將毛球之毛球部毛根鞘(Dermal Sheath Cup：DSC)翻轉，去除殘留之來自上皮之組織而使毛乳頭(Dermal papilla：DP)露出。將DP橫向切斷而自DSC分離。關於上部真皮毛根鞘(Upper Dermal Sheath：UDS)，一面使用另外之鉗子保持HF之近位端，一面使用鉗子自外毛根鞘剝離而使之單離。
1-2.總RNA之製備
將各亞單位混合，溶解於1ml之ISOGEN(Nippon Gene公司，富山，日本)，按照製造商之指示進行RNA提取。沈澱後，使用安捷倫2100生物分析儀(Agilent Bioanalyzer 2100)(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)根據核糖體RNA比(28S/18S)評估RNA之品質。將具有6.5~8.3之RNA完整性數值(RIN)之樣品用於微陣列分析。
1-3.微陣列分析
微陣列解析係按照製造商之指示(Agilent Technologies)實施。於寡核苷酸(dT)引子、AffinityScript多重溫度逆轉錄酶、T7 RNA聚合酶及經Cy3色素標記之CTP(cytidine triphosphate，三磷酸胞苷)之存在下，使用低輸入快速Amp標記套組(Low Input Quick Amp Labeling Kit)(Agilent Technologies)對10ng之全RNA進行活體內逆轉錄及其後之轉錄，轉化成螢光標記cRNA(complementary ribonucleic acid，互補核糖核酸)。將獲得之600ng之標記cRNA片段化，與Agilent SurePrint G3人類GE(Gene Expression，基因表現)8x60K微陣列(G4851A，Agilent Technologies)進行雜交，利用Agilent雙雷射微陣列掃描儀(G2565AA)進行掃描。使用特徵抽取軟體11.0.1.1版本(Agilent Technologies)測定訊號強度。為了進行統計分析，利用Genespring GX 13.0軟體(Agilent Technologies)對資料進行處理。微陣列資料係按照有關微陣列實驗之最小化資訊(MIAME)準則進行記載，寄存於基因表現綜合(GEO)資料庫(寄存編號GSE95219；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。
1-4.原位雜交
為了使細胞內之GREM2及GREM1之局域視覺化，使用石蠟包埋組織切片進行原位雜交。按照ViewRNA(商標)ISH Tissue 1-Plex Assay套組(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)之製造商手冊，基於高度特異分枝狀DNA訊號擴增技術，使用GREM2或GREM1特異性6型探針。使用堅牢紅(Fast Red)基質檢測出訊號，繼而觀察螢光。核之染色使用Hoechst33342(Thermo Fischer Scientific Inc.)實施。
1-5.定量PCR(qPCR)
使用NucleoSpin RNA XS(TAKARA BIO Inc.，滋賀，日本)，按照隨附之說明書，自各樣品提取總RNA，繼而使用CellAmp全轉錄組擴增套組(Whole Transcriptome Amplification Kit)(即時(Real Time))Ver.2(TAKARA BIO Inc.，滋賀，日本)製備cDNA(complementary Deoxyribonucleic Acid，互補去氧核糖核酸)。
qPCR係使用LightCycler(註冊商標)FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I及LightCycler(Roche Molecular Systems,Inc，Pleasanton)按照隨附之說明書實施。
2.結果 2-1. HF之各亞單位表示不同之基因分佈。
對單離之完整之HF亞單位(DSC、DP、UDS)之基因表現分佈進行解析(圖1)。對分別自3人之供體獲得之藉由顯微解剖所得之HF亞單位之總RNA進行微陣列解析，鑑定出HF亞單位特異之能夠識別之基因。對2個以上之個體排除了標記為資料不可靠、或標記為與背景相等之微陣列探針。結果，將25342個探針作為分析對象。為了自完整之HF亞單位鑑定特異且能夠識別之基因，至少對1種HF成分進而選擇訊號強度為50以上之18905探針進行解析。
首先，實施主成分分析(PCA)，對總微陣列資料集之關係性進行解析。根據圖2可知，來自同一個體之3個HF亞單位之位置沿著PC1維密切地 相關。另一方面，來自不同個體之同一亞單位之位置沿著PC3維較弱地相關。考慮到該等個體內之差異，於各個體內進行比較。DSC對DP、DSC對UDS及UDS對DP進行比較，將臨界值設為1.5倍。即便於個體內亦實質上存在差異，但利用PCA清楚發現，於3名個體間，不僅DSC且DP及UDS分佈亦有類似點。
2-2. DSC及DP識別基因之提取
將所有3名共同之表現亢進或表現抑制之基因之數量示於表3。
Figure 108108263-A0305-02-0028-4
結果，於DSC對DP中，鑑定出63個表現亢進之基因。該等之中，除去於UDS中亦表現亢進之基因及5個不具特徵之探針，獲得32個基因作為DSC識別基因(表4)。
Figure 108108263-A0305-02-0028-5
Figure 108108263-A0305-02-0029-8
2-3. DSC識別基因之特徵賦予
上述DSC識別基因清單中包含以前報告之於真皮毛根鞘(DS)中表現之平滑肌肌動蛋白α2(α平滑肌肌動蛋白)、前列腺素E受體3及基質金屬肽酶11(參考文獻3~5)。於該清單中亦包含7種細胞外基質成分：核心蛋白聚糖、纖蛋白2、含捲曲螺旋域蛋白80、肌腱蛋白XB、asporin、透明質酸蛋白聚糖連結蛋白1、及基質金屬肽酶11，該等類別於基因本體解析中明顯占大多數。與DP相比較，多數DSC識別基因不僅於DSC且於UDS中亦高表現(圖3)。其等之中，6種基因：asporin、DAN家族BMP拮抗劑gremlin 2(GREM2)、基質金屬肽酶11、前列腺素E受體3、視黃醇結合蛋白4、及斷裂4轉導蛋白樣增強子(TLE4)於DSC中更高地特異性表現，相對於UDS，至少1.5倍表現亢進(表5)。
Figure 108108263-A0305-02-0030-9
2-4. GREM2為完整之DSC識別基因。
於與DP及UDS兩者進行比較之情形時，6種DSC特異性基因實質上於DSC中表現亢進。因此，於完整之DP及DSC組織中實施針對該等基因中之GREM2之定量PCR。結果，確認到於與DP進行比較之情形時，於 DSC中約10倍以上明顯特異性表現亢進(圖4)。為了進一步確認組織中之GREM2基因之特異性表現，進行原位雜交。結果可於毛囊之毛球中之DSC區域確認到GREM2之表現，表明GREM2係特異性表現於完整之毛囊中DSC(圖5)。又，亦針對作為同一GREM家族之GREM1同樣地進行原位雜交，確認到於HF中之表現(圖6)。
2-5.經由電腦模擬(in silico)解析之DSC識別基因之上游調節因子之鑑定
評估表現變化之上游調節因子之分析之結果與已報告之文獻一致，TGF-b1(Transforming Growth Factor Beta 1，轉移生長因子β1)被鑑定為DSC識別之9個基因之推定調節因子(圖7)。5個基因與Wnt路徑相關，其一之TLE4為Wnt路徑中熟知之作為核成分之Groucho家族成員。作為2種BMP信號拮抗劑之GREM1及GREM2亦又於DSC中表現亢進。圖7表示DSC識別因子之推定之調節網路及細胞內局域，提示TGF-b1調節DSC之特徵性細胞外基質成分。
<實施例2>
使用Amnio Max培養基(Thermofisher)，於37℃、5% CO2下於活體外培養利用與實施例1相同之方法所單離之DSC約30天。自培養前之完整之DSC及培養後之DSC回收總RNA，與上述1-5.同樣地實施qPCR。以GAPDH之表現量進行正規化、且將完整之DSC之基因表現量設為100%時之培養後之DSC之基因表現量如圖8所示。
<實施例3>
GREM2為培養之DSC細胞之識別基因，與細胞之群落形成活性相關。
使用Amnio Max培養基(Thermofisher)，於37℃、5% CO2下於活體外培養利用與實施例1相同之方法所單離之DSC、DP、UDS，自第1繼代之各細胞回收總RNA，與上述1-5.同樣地實施qPCR。
圖9(a)表示將DSC細胞中之相對於GAPDH之表現量的GREM2之表現量設為100%時之相對值。結果，確認到於DSC細胞中GREM2之表現亢進。
藉由如下方法對培養之細胞之群落形成能力進行評估：於10cm培養皿播種1000個細胞，利用Amnio Max培養基進行培養，計數12天後形成之群落數。結果，確認到DSC細胞具有較高之群落形成活性(圖9(b))。
<參考文獻>
1. McElwee KJ, Kissling S, Wenzel E, Huth A, Hoffmann R. Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla. J Invest Dermatol 2003; 121: 1267 - 1275.
2. Niiyama S, Happle R, Hoffmann R. The feasibility of quantitative analysis of androgen metabolism by use of single dermal papillae from human hair follicles. Exp Dermatol 2001; 10: 124 - 127.
3. Jahoda CA, Reynolds AJ, Chaponnier C, Forester JC, Gabbiani G. Smooth muscle alpha-actin is a marker for hair follicle dermis in vivo and in vitro. J Cell Sci 1991; 99: 627 - 636.
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5. Colombe L, Michelet JF, Bernard BA. Prostanoid receptors in anagen human hair follicles. Exp Dermatol 2008; 17: 63 - 72.

Claims (8)

  1. 一種來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之鑑定方法，其特徵在於以GREM2基因之表現水準為指標。
  2. 如請求項1之方法，其進而以選自由ASPN基因、MMP11基因、PTGER3基因、RBP4基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
  3. 如請求項1或2之方法，其中上述來自毛囊之細胞群係於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
  4. 如請求項3之方法，其中上述來自毛囊之細胞群係繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
  5. 一種含有來自毛囊之細胞群之用於使毛囊再生之組合物之評估方法，其特徵在於： 以GREM2基因之表現水準為指標，確定上述來自毛囊之細胞群中之毛球部毛根鞘細胞(DSCC)之比率及/或活性。
  6. 如請求項5之方法，其進而以選自由ASPN基因、MMP11基因、PTGER3基因、RBP4基因、TLE4基因、GREM1基因、DCN基因、PDGFRL基因、ACKR1基因、HAPLN1基因、DCD基因、SCGB1D2基因、ACTA2基因、PLIN4基因、DOK6基因、ENPP4基因、IL15基因、CCDC80基因、TNXB基因、FBLN2基因、DLEC1基因、LRRC17基因、ZNF791基因、CNIH3基因、PRR15L基因、DCAF4基因、GYLTL1B基因、LOC142937基因、BPIFC基因、ANO2基因、IFI44L基因及PCSK7基因所組成之群中之一種以上之基因之表現水準為指標。
  7. 如請求項5或6之方法，其中上述來自毛囊之細胞群係於活體外培養之來自毛囊之細胞群。
  8. 如請求項7之方法，其中上述來自毛囊之細胞群係繼代1次以上之來自毛囊之細胞群。
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