CN117625514A - 一种人工毛囊及其体外构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人工毛囊及其体外构建方法和应用，所述人工毛囊是由真皮乳头细胞与毛囊干细胞混合后通过体外培养得到。所述体外构建方法是将真皮乳头细胞DPCs与毛囊干细胞HFSCs按照0.1:1至10:1的数量比例进行混合，重悬在Matrigel中，加入类器官诱导培养基OIM1或OIM2中培养7‑9天。本发明可以在体外构建尺寸可控、具有完整结构和功能的人工毛囊器官，主要应用于体外毛囊相关药物的开发或者体内毛囊移植，后者可作为在体内再生毛发的细胞（器官）制剂。
Description
技术领域
本发明属于干细胞与再生医学领域，主要涉及干细胞的获取与毛囊类器官体外诱导技术，细分领域属于细胞生物学与发育生物学。
背景技术
脱发是一种常见的皮肤疾病，也是世界性难题。脱发的原因很多，但其生物学本质都是病人毛囊的周期性生长被阻断，无法顺利从休止期进入下一个生长期，最终导致毛囊坏死和脱发。目前，对脱发的治疗主要采用药物治疗和自体毛囊移植两种方法。
当前以非那雄胺和米诺地尔为代表的治疗脱发药物并非针对脱发的特效药，而且副作用明显。针对毛囊的药物开发的动物模型一般以小鼠模型为主，鼠与人的差异性导致当前毛囊药物开发失败率高。若能在体外构建人毛囊的替代物，将为体外毛囊药物研发提供更优的药物开发模型，有助于开发对人类早期脱发、白发真正有效和安全的药物。
自体毛囊移植只是改变毛囊的位置，从头皮的一个区域(如枕部)迁移至脱发区域，并不改变毛囊的数量，远不能满足严重脱发患者的需求。随着干细胞和再生医学的发展，旨在再生毛囊的细胞疗法成为传统自体毛囊移植的可能替代方法。
真皮乳头细胞(Dermal papilla cells,DPCs)是由皮肤间质衍生的活性专门成纤维样细胞簇，毛囊干细胞(Hair follicle stem cells,HFSCs)是位于毛囊颈部膨大端的一群驻留的上皮样干细胞，两者对于毛囊的发生发展及周期性生长起着关键作用。
经检索，中国发明专利CN201580034253.3公开了用于预防脱发和促进毛发生长的组合物、其制造方法及其用途，所述组合物含有小尺寸干细胞(特别是直径为8μm以下的小的干细胞)或其培养基作为活性成分；并且所述组合物的用途为通过直径为8μm以下的小尺寸干细胞保持毛发生长促进功能的用途，所述毛发生长促进功能显著地增高了休止期的毛囊干细胞的活化。现有技术中一般有采用将两群干细胞混合后直接移植到体内诱导毛发再生的策略，可以观察到毛发的新生，但缺点是新生毛发的效率很低，新生毛囊的尺寸大小不一，毛发方向不可控，并且伴随明显的炎性反应。<硕士>·医药卫生科技·基础医学；2020.01南方医科大学李哲昊公开了小鼠毛囊干细胞与毛乳头细胞体外培养重建小鼠类毛囊器官的基本方法，并探究了胚胎期(E14.5)的表皮细胞和出生6天(P6)的表皮细胞对构建类毛囊器官的影响，但是此研究并未探究此技术是否也适用于基于成年小鼠或者成年人的毛囊类器官构建。所以，亟需开发更普适的在体外构建毛囊类器官或称人工毛囊的新策略。
发明内容
本发明旨在攻克现有技术的不足，发明了一种类器官技术，在体外诱导真皮乳头细胞DPCs和毛囊干细胞HFSCs混合物自组装为人工毛囊，其具有诱导毛发新生的能力。本发明可以在体外构建大小可控、具有完整结构和功能的人工毛囊器官，主要应用于体外毛囊相关的药物开发或者体内毛囊移植，后者可在体内再生毛发。
本发明的技术方案是：
本发明的技术方案之一：
一种人工毛囊，由真皮乳头细胞与毛囊干细胞按照真皮乳头细胞:毛囊干细胞
＝0.1:1-10:1的数量比例进行混合，混合后通过体外培养得到，所述真皮乳头细胞与毛囊干细胞均选取P10代以内的细胞，所述真皮乳头细胞与毛囊干细胞来源于动物的真皮细胞或表皮细胞。
优选的，由真皮乳头细胞与毛囊干细胞按照真皮乳头细胞:毛囊干细胞＝0.1:1-5:1的数量比例进行混合。
本发明的技术方案之二：
一种人工毛囊的体外构建方法，包括以下步骤：
由真皮乳头细胞与毛囊干细胞按照一定的比例混合后通过体外培养得到，具体人工毛囊的体外构建方法，包括以下步骤：
(1)分别得到真皮乳头细胞和毛囊干细胞，选取P10代以内的细胞；
(2)对分离后的单细胞悬液用荧光染料标记的流式抗体进行标记，流式分选DPCs与HFSCs；
(3)将DPCs与HFSCs按比例进行混合，重悬在Matrigel中，加入类器官诱导培养基培养7-9天；所述混合是真皮乳头细胞与毛囊干细胞按照0.1:1至10:1的数量比例进行混合；
所述类器官诱导培养基的成分和终浓度为：R-Spondin 1 100-200ng/mL；Wnt-3a10-100ng/mL；Noggin 5-50ng/mL；A83-015-100nM；SB202190 1-5μM；Y-276321-50μM；EGF1-500ng/mL；bFGF 0.1-100ng/mL；Hydrocortisone 0.5-1μg/mL；Nicotinamide 2-10mM；B27 supplement 0.5％-5％；N20.5％-5％；GlutaMax 100x 0.5％-5％；Hepes 1-10mM；Penicillin/Streptomycin 0.8％-1.2％；Primocin 10-100μg/mL；
或者所述培养基的成分和终浓度为：R-Spondin 1 0.1-1μg/mL；Wnt-3a 10-100ng/mL；BMP4 1-25ng/mL；Y-27632 1-50μM；EGF 1-500ng/mL；bFGF 0.1-100ng/mL；Hydrocortisone 0.3-0.5μg/mL；Nicotinamide 8-12mM；B27 supplement0.5％-5％；N20.5％-5％；GlutaMax 0.5％-5％；Hepes 1-10mM；
Penicillin/Streptomycin 0.8％-1.2％；Primocin 10-100μg/mL；
其中溶剂为AdvancedDMEM/F12；百分含量:如1％表明的是体积百分含量。
优选的，所述混合是真皮乳头细胞与毛囊干细胞按照0.1:1至5:1的数量比例进行混合。
优选的，所述类器官诱导培养基的成分和终浓度为：
R-Spondin 1200ng/mL；Wnt-3a 100ng/mL；Noggin 25ng/mL；A83-0150 nM；SB2021902μM；Y-27632 10μM；EGF 200ng/mL；bFGF 10ng/mL；Hydrocortisone 0.5μg/mL；Nicotinamide 10mM；B27 supplement 2％；N21％；GlutaMax 100x 1％；
Hepes 5mM；Penicillin/Streptomycin 1％；Primocin 50μg/mL；
或者所述类器官诱导培养基的成分和终浓度为：
R-Spondin 1 1μg/mL；Wnt-3a 100ng/mL；BMP4 25ng/mL；Y-27632 10μM；EGF50ng/mL；bFGF 5ng/mL；Hydrocortisone 0.5μg/mL；Nicotinamide 10mM；B27 supplement0.5％-5％；N2 1％；GlutaMax 1％；Hepes 10mM；
Penicillin/Streptomycin 1％；Primocin 100μg/mL。
本发明的技术方案之三：本发明提供了上述人工毛囊或者上述方法所构建的人工毛囊在制备体外毛囊相关的药物中的应用。
本发明的技术方案之四：本发明提供了上述人工毛囊或者上述方法所构建的人工毛囊在制备促进体内再生毛发制剂中的应用。
本发明的技术方案之五：
本发明提供了一种培养基，成分和终浓度为：R-Spondin 1 100-200ng/mL；Wnt-3a10-100ng/mL；Noggin 5-50ng/mL；A83-015-100nM；SB202190 1-5μM；Y-276321-50μM；EGF1-500ng/mL；bFGF 0.1-100ng/mL；Hydrocortisone 0.5-1μg/mL；Nicotinamide 2-10mM；B27 supplement 0.5％-5％；N20.5％-5％；GlutaMax 100x 0.5％-5％；Hepes 1-10mM；Penicillin/Streptomycin 0.8％-1.2％；Primocin 10-100μg/mL；
或者所述培养基的成分和终浓度为：R-Spondin 1 0.1-1μg/mL；Wnt-3a 10-100ng/mL；BMP4 1-25ng/mL；Y-27632 1-50μM；EGF 1-500ng/mL；bFGF 0.1-100ng/mL；Hydrocortisone 0.3-0.5μg/mL；Nicotinamide 8-12mM；B27 supplement0.5％-5％；N20.5％-5％；GlutaMax 0.5％-5％；Hepes 1-10mM；
Penicillin/Streptomycin 0.8％-1.2％；Primocin 10-100μg/mL；
其中溶剂为AdvancedDMEM/F12；百分含量:如1％表明的是体积百分含量。
本发明还提供了所述培养基在人工毛囊体外构建中的应用。
与现有技术相比，本发明的优势是：
1、通过本发明的毛囊类器官技术，1个毛囊可以变成20-30个人工毛囊，即是原来的20-30倍。如图4A以及图4B所示，来源于1个初始毛囊的细胞经过本发明的步骤处理后，优化条件下可以形成20-30个人工毛囊球体。此技术可解决当前传统毛囊移植技术无法扩增毛囊的技术和医学瓶颈。
2、本发明的方法体外构建的人工毛囊与初始原生毛囊具有极高的形态相似性，并且用消化液消化后皆保留不被胰蛋白酶和胶原酶消化的角质化毛发/毛干组织(图5)。
3、本发明对体外构建的人工毛囊(HF001)和初始原生毛囊(HF002)两者具有高度相似度(图6)。
4、本发明对体外构建的人工毛囊，移植人工毛囊组的小鼠皮肤出现完整的新生毛囊结构，并且没有明显的炎性反应(图7)。
总之，本发明披露了一种体外构建人工毛囊的新方法。基于此方法构建的人工毛囊一方面可用体外药物开发，筛选出针对人白发获脱发的高效药物；另一方面可用于体内移植，实现毛发再生。
以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述。
附图说明
图1是小鼠触须原生毛囊的获取过程图，其中(A)原生毛囊来源于新生7-9日龄小鼠；(B)体式显微镜下(4x)小鼠触须组织的整体结构；(C)体式显微镜下观察手术拔取的单个毛囊。
图2是毛囊DPCs与HFSCs的分选和标记过程图，其中(A)毛囊DPCs与HFSCs的解剖位置，以及流式和荧光标记的流程图；(B)利用流式分选首先获得intergrinα6与intergrinβ1双阳性的细胞群，再从中分选出CD34与Sca-1双阳性的细胞，得到HFSCs；(C)左图为空白对照,右图染色CD133与SOX-2,分选双阳性细胞，得到DPCs。
图3是分别用带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白标记的慢病毒感染DPCs和HFSCs后，将两群标有不同荧光标记的细胞混合在Matrigel后的明场(A)与荧光(B)的图片。
图4是不同诱导体系下体外毛囊类器官的形成状态比较图，其中(A)Matrigel/OIM1培养体系；(B)Matrigel/OIM2培养体系；(C)Matrigel/OIM3+OMM体系；(D)Matrigel/OIM4+OMM体系，图4A与图4B体系形成的毛囊类器官数量上较图4C与图4D体系有具有明显优势，但图4A中有过多的间质细胞贴壁，不利于后期毛囊类器官的扩展与成熟。统计发现：不同类器官诱导培养基体系下产生人工毛囊微器官效率、尺寸、一致性以及诱导毛发再生能力等方面具有较大差异。特别是OIM3与OIM4几乎没有诱导毛发再生的能力，而OIM1的体外诱导效率最高，不过一致性与诱导毛发再生能力不及OIM2(表7)。因此，在后续实施例中皆选定Matrigel/OIM2作为体外类器官构建的培养体系。
图5是体外构建的人工毛囊与初始原生毛囊具有极高的形态相似性，并且用消化液消化后皆保留不被胰蛋白酶和胶原酶消化的角质化毛发/毛干组织的图片。
图6是对体外构建的人工毛囊(HF001)和初始原生毛囊(HF002)进行单细胞测序并分析结果图，结果表明两者具有高度相似度。图6A显示毛囊组织单细胞测序解析细胞分群,主要包含毛囊细胞、血管细胞、成纤维样细胞、免疫细胞、黑色素细胞、肌细胞以及其他细胞等；图6B显示对比毛囊类器官(HF001-2)与原始毛囊组织(HF002)单细胞测序发现毛囊类器官包含毛囊细胞与成纤维样细胞等构成毛囊结构的核心细胞群，表明毛囊类器官与原始毛囊组织具有组织一致性。
图7是将人工毛囊植入小鼠后的实验结果图，其中注射新生小鼠原生毛囊单细胞悬液(图7A)或植入体外构建的人工毛囊(图7B)入裸鼠皮下，29天后发现人工毛囊移植组的裸鼠长出了毛发(图7C)；两组裸鼠皮下组织的光镜对比图(图7D)以及组织H&E染色对比图(图7E)证明移植人工毛囊组的小鼠皮肤出现完整的新生毛囊结构，并且没有明显的炎性反应。
图8是将不分选的真皮与表皮细胞混合后，利用Matrigel/OIM2培养体系诱导形成毛囊类器官，光镜下显示形成了成类似毛发的结构图，其中图8A是40倍镜下的结构照片；图8B是100倍镜下的结构照片。
图9是注射新生小鼠原生毛囊单细胞悬液(图9A)或植入体外构建的人工毛囊(图9B)入裸鼠皮下，H&E染色图片对比证明移植人工毛囊组的小鼠皮肤出现完整的新生毛囊结构。
图10是用新生24小时龄的小鼠背部组织分离的ESCs与DCs按照1至1的比例混合后，利用Matrigel/OIM2培养体系诱导形成毛囊类器官，光镜下显示形成类似毛发的结构图，其中图10A是40倍镜下的结构照片；图10B是100倍镜下的结构照片。
具体实施方式
实施例1：
一种人工毛囊的体外构建方法，包括以下步骤：
(1)脱颈处死7-9日龄新生小鼠，手术取出小鼠嘴巴两端的触须组织；
(2)体式显微镜下，用无菌镊子小心镊取完整的毛囊结构；
(3)1100rpm，5min水平离心；吸弃上清，加入2mL预热消化液充分混匀后放37℃水浴锅中消化45mins，每隔15mins剧烈摇晃一次；
(4)观察细胞消化完毕后(不使用DNase I处理)加入适量终止液，终止消化；
(7)悬液过70μm滤膜，收集滤过的细胞悬液；
(8)1000rpm，5min离心；吸弃上清，加入2mL清洗液重悬，充分混匀后计数；
对分离后的单细胞悬液用荧光染料标记的流式抗体进行标记，流式分选DPCs与HFSCs；DPCs与HFSCs按照1:1的比例(数量比例)进行混合，重悬在Matrigel中(表1)，加入不同的类器官诱导液或者时序性组合(见表2-6)培养7-9天。所述Matrigel为现有技术产品。
消化培养基质Matrigel水凝胶，获取人工毛囊并移植入小鼠皮下。
实验过程和实验结果见图1-7和附图说明以及表7，实施例1的结果证明本发明体外构建的人工毛囊与初始原生毛囊具有极高的形态相似性的图片，并且用消化液消化后皆保留不被胰蛋白酶和胶原酶消化的角质化毛发/毛干组织(图5)。对体外构建的人工毛囊(HF001)和初始原生毛囊(HF002)进行单细胞测序分析的图(图6)，结果表明两者具有高度相似度。注射新生小鼠原生毛囊单细胞悬液图7A或植入体外构建的人工毛囊图7B入裸鼠皮下，29天后发现人工毛囊移植组的裸鼠长出了毛发图7C；两组裸鼠皮下组织的光镜对比图图7D以及组织H&E染色对比图图7E证明移植人工毛囊组的小鼠皮肤出现完整的新生毛囊结构，并且没有明显的炎性反应。
表1：人工毛囊不同诱导体系的构建
表2：类器官诱导培养基1(organoid induction medium 1,OIM1)
表3：类器官诱导培养基2(organoid induction medium 1,OIM2)
表4：类器官诱导培养基3(organoid induction medium 3,OIM3)
| 组分名称 | 终浓度 | 组分名称 | 终浓度 |
| bFGF | 4ng/mL | Primocin | 1‰ |
| BMP4 | 2.5ng/mL | Y-27632 | 10μM |
| SB431542 | 10μM |
表5：类器官诱导培养基4(organoid induction medium 4,OIM4)
| 组分名称 | 终浓度 |
| bFGF | 50ng/mL |
| LDN | 200ng/mL |
| Y-27632 | 10μM |
表6：类器官成熟培养基(organoid maturation medium,OMM)
表7：不同类器官诱导培养基体系下产生人工毛囊微器官的效率、尺寸、一致性以及诱导毛发再生能力对比
| 培养基体系 | 效率(产出比) | 尺寸(直径) | 一致性 | 诱导毛发再生能力 |
| OIM1 | 30倍 | 250微米 | 80％ | 65％ |
| OIM2 | 27倍 | 200微米直径 | 87％ | 80％ |
| OIM3 | 5倍 | 55微米直径 | 50％ | 无 |
| OIM4 | 3倍 | 20微米直径 | 30％ | 无 |
备注：效率是指：诱导1个初始毛囊形成的人工毛囊微器官的平均数量。
表8：本发明实施例中用到的原材料都是现有产品；附表备注其作用以及生产公司
实施例2：
一种人工毛囊的体外构建方法，包括以下步骤：
脱颈处死7-9日龄新生小鼠，手术取出小鼠嘴巴两端的触须组织；
体式显微镜下，用无菌镊子小心镊取完整的毛囊结构；
1100rpm，5min水平离心；
吸弃上清，加入2mL预热消化液充分混匀后放37℃水浴锅中消化45mins，每隔15mins剧烈摇晃一次；
观察细胞消化完毕后(不使用DNase I处理)加入适量终止液，终止消化；
悬液过70μm滤膜，收集滤过的细胞悬液；
1000rpm，5min离心；
吸弃上清，加入2mL清洗液重悬，充分混匀后计数；
取5*104细胞(不分选的真皮与表皮细胞混合)重悬在Matrigel中，加入Matrigel/OIM2培养体系(表3)下培养7-9天。
消化培养基质Matrigel水凝胶，获取人工毛囊并移植入小鼠皮下；结果见图8与图9，图8显示将不分选的真皮与表皮细胞混合后，利用Matrigel/OIM2培养体系诱导形成毛囊类器官，光镜下显示形成了成类似毛发的结构，图9是注射新生小鼠原生毛囊单细胞悬液(图9A)或植入体外构建的人工毛囊(图9B)入裸鼠皮下，H&E染色图片对比证明移植人工毛囊组的小鼠皮肤出现完整的新生毛囊结构。
实施例3：
一种人工毛囊的体外构建方法，包括以下步骤：
酒精浸没处死24小时内日龄新生小鼠，用无菌生理盐水清洗标本3次；
在生物安全柜内，用无菌镊子配合无菌手术剪刀小心镊取小鼠的整个背部皮肤组织；
将背部皮肤铺展在6厘米的培养皿中，加入10％中性蛋白酶浸没组织，4℃放置过夜；
用镊子小心分离表皮与真皮组织，并分别用手术剪刀剪碎，各加入3mL预热消化液充分混匀后放37℃水浴锅中消化45mins，每隔15mins剧烈摇晃一次；
观察细胞消化完毕后加入适量终止液，终止消化；
悬液分别过70μm滤膜，收集滤过的细胞悬液；
1000rpm，5min离心；
吸弃上清，加入2mL清洗液重悬，充分混匀后计数；
表皮组织分离后的单细胞悬液包含大量ESCs(Epithelial Stem Cells,表皮干细胞；HFSCs属于ESCs的一种)；真皮组织分离后的单细胞悬液包含大量DCs(Dermal Cells,真皮细胞；DPCs属于DCs的一种)；
ESCs:DCs按照1至1的比例(细胞数量比例)进行混合，重悬在Matrigel中，加入Matrigel/OIM2培养体系(表3)下培养7-9天，结果详见图10，图10是用新生24小时龄的小鼠背部组织分离的ESCs与DCs按照1至1的比例混合后，利用Matrigel/OIM2培养体系诱导形成毛囊类器官，光镜下显示形成类似毛发的结构。
以上所述为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种人工毛囊，其特征是，由真皮乳头细胞与毛囊干细胞按照真皮乳头细胞:毛囊干细胞=0.1:1-10:1的数量比例进行混合后通过体外诱导培养获得，所述真皮乳头细胞与毛囊干细胞均选取P10代以内的细胞，所述真皮乳头细胞与毛囊干细胞来源于动物的真皮细胞或表皮细胞。
2.根据权利要求1所述人工毛囊，其特征是，由真皮乳头细胞与毛囊干细胞按照真皮乳头细胞:毛囊干细胞=0.1:1-5:1的数量比例进行混合。
3.一种人工毛囊的体外构建方法，包括以下步骤：
1)分别得到真皮乳头细胞和毛囊干细胞，选取P10代以内的细胞；
2)对分离后的单细胞悬液用流式抗体进行标记，流式分选DPCs与HFSCs；
3)将DPCs与HFSCs按比例进行混合，重悬在Matrigel中，加入类器官诱导培养基培养7-9天；所述混合是真皮乳头细胞与毛囊干细胞按照0.1:1至10:1的数量比例进行混合；
所述类器官诱导培养基的成分和终浓度为：R-Spondin 1 100-200 ng/mL；Wnt-3a 10-100 ng/mL；Noggin 5-50 ng/mL；A83-01 5-100nM；SB202190 1-5 µM；Y-27632 1-50 µM；EGF 1-500 ng/mL；bFGF 0.1-100 ng/mL；Hydrocortisone 0.5 -1µg/mL；Nicotinamide 2-10 mM；B27 supplement 0.5%-5%；N2 0.5%-5%；GlutaMax 100x 0.5%-5%；Hepes 1-10 mM；Penicillin/Streptomycin 0.8%-1.2%；Primocin 10-100 µg/mL；
或者所述培养基的成分和终浓度为：R-Spondin 1 0.1-1 µg/mL；Wnt-3a 10-100 ng/mL； BMP4 1-25 ng/mL；Y-27632 1-50 µM； EGF 1-500 ng/mL； bFGF 0.1-100 ng/mL；Hydrocortisone 0.3-0.5 µg/mL；Nicotinamide 8-12 mM；B27 supplement 0.5%-5%； N20.5%-5%； GlutaMax 0.5%-5%； Hepes 1-10 mM；Penicillin/Streptomycin 0.8%-1.2%；Primocin 10-100 µg/mL；
其中溶剂为Advanced DMEM/F12；百分含量表示体积百分比。
4.根据权利要求3所述人工毛囊，其特征是，所述混合是由真皮乳头细胞与毛囊干细胞按照真皮乳头细胞：毛囊干细胞=0.1:1-5:1的数量比例进行混合。
5.根据权利要求3或4所述人工毛囊，其特征是，所述类器官诱导培养基的成分和终浓度为：
R-Spondin 1 200 ng/mL； Wnt-3a 100 ng/mL； Noggin 25 ng/mL；A83-01 50 nM；SB202190 2 µM；Y-27632 10 µM；EGF 200 ng/mL； bFGF 10 ng/mL； Hydrocortisone 0.5µg/mL；Nicotinamide 10 mM； B27 supplement 2%； N2 1%； GlutaMax 100x 1%； Hepes 5mM； Penicillin/Streptomycin 1%；Primocin 50 µg/mL；
或者所述类器官诱导培养基的成分和终浓度为：
R-Spondin 1 1 µg/mL； Wnt-3a 100 ng/mL； BMP4 25 ng/mL； Y-27632 10 µM； EGF50ng/mL； bFGF 5 ng/mL； Hydrocortisone 0.5 µg/mL； Nicotinamide 10 mM； B27supplement 0.5%-5%；N2 1%；GlutaMax 1%； Hepes 10 mM；
Penicillin/Streptomycin 1%； Primocin 100 µg/mL。
6.权利要求1或2所述人工毛囊或权利要求3-5中任意一项方法所构建的人工毛囊在制备体外毛囊相关的药物中的应用。
7.权利要求1或2所述人工毛囊或权利要求3-5中任意一项方法所构建的人工毛囊在制备促进体内再生毛发制剂中的应用。
8.一种培养基，其特征是，成分和终浓度为：R-Spondin 1 100-200 ng/mL；Wnt-3a 10-100 ng/mL；Noggin 5-50 ng/mL；A83-01 5-100nM；SB202190 1-5 µM；Y-27632 1-50 µM；EGF 1-500 ng/mL；bFGF 0.1-100 ng/mL；Hydrocortisone 0.5 -1µg/mL；Nicotinamide 2-10 mM；B27 supplement 0.5%-5%；N2 0.5%-5%；GlutaMax 100x 0.5%-5%；Hepes 1-10 mM；Penicillin/Streptomycin 0.8%-1.2%；Primocin 10-100 µg/mL；
或者所述培养基的成分和终浓度为：R-Spondin 1 0.1-1 µg/mL；Wnt-3a 10-100 ng/mL； BMP4 1-25 ng/mL；Y-27632 1-50 µM； EGF 1-500 ng/mL； bFGF 0.1-100 ng/mL；Hydrocortisone 0.3-0.5 µg/mL；Nicotinamide 8-12 mM；B27 supplement 0.5%-5%； N20.5%-5%； GlutaMax 0.5%-5%； Hepes 1-10 mM；Penicillin/Streptomycin 0.8%-1.2%；Primocin 10-100 µg/mL；
其中溶剂为Advanced DMEM/F12；百分含量为体积百分含量。
9.权利要求8所述培养基在人工毛囊体外构建中的应用。
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