JP5932671B2 - ガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法、当該方法によって製造される、ガイドを有する移植用再生器官原基を含む組成物、およびガイドを有する移植用再生器官原基の移植方法 - Google Patents
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Description
最近になり、上皮性付属器官である歯や唾液腺、皮膚付属器官である毛包において、器官原基を再生し、発生過程を再現することによって器官再生を目指した研究が進められている。これらの器官は生命の維持に直結するわけではないものの、器官喪失や機能不全に陥ることが知られている。このような例としては、う蝕や傷害、歯胚形成不全による歯の喪失や、高齢化に伴う唾液分泌障害、男性型脱毛症や毛包形成不全による毛髪の喪失などが挙げられる。このような、器官喪失や機能不全は、QOLに大きな影響を与えるため、器官再生による機能回復が大いに期待されている。なかでも歯の再生において、胎児性の歯胚由来の上皮系細胞と胎児性の歯胚由来の間葉系細胞を適切に三次元配置させた再生歯胚の移植や、生体内で異所的に再生した再生歯ユニットの移植や、歯と歯槽骨、歯根膜を有する機能的ユニットの移植により歯の生理機能をすべて有する機能的な歯の再生が示されている(例えば、特許文献1参照)。さらに、口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として利用した場合(例えば、特許文献2参照)、羊膜由来細胞を間葉系細胞として利用した場合(例えば、特許文献3参照)、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を間葉系細胞として利用した場合(例えば、特許文献4参照)にも、同様に特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯ユニットが得られることが示されている。
これらの研究成果から、再生器官原基、あるいは再生器官原基より再生した器官の移植による機能的な器官再生の実現可能性が示されたといえ、その他の上皮性付属器官についても、再生器官原基による器官置換的再生医療が望まれている。
皮膚付属器官である毛包は、個体の生涯にわたって成長と退行(毛周期)を繰り返し、成長期における毛球部の再生は、毛包器官発生期と同様な分子機構により誘導されることが知られている。また、このような毛周期における毛球部の再生は、間葉系細胞である毛乳頭細胞により誘導されると考えられている。そして、成長期において、毛包上皮幹細胞が間葉系細胞である毛乳頭細胞により分化誘導され毛球部が再生されると考えられている。また、バルジ領域および下方領域には、神経提由来幹細胞のニッチが存在することから、毛包は複数の幹細胞ニッチを保持し、幹細胞プールとして機能していると考えられている。毛包形成誘導能を保持した毛乳頭細胞については、その培養法が報告されている。毛包間葉系細胞の幹細胞ニッチについては未だに確定的な報告はされていないが、毛乳頭には軟骨細胞、血球系細胞、脂肪細胞に分化可能な細胞が含まれており、成体皮膚真皮組織からは毛包および皮膚の真皮を再生するSKIPs細胞を得ることができることから、毛包間葉系幹細胞の存在が示唆されている。これらのことより、他の器官では実現されていない成体由来細胞による完全な器官再生の可能性が示唆され、臨床応用可能な毛包再生技術の実用化が期待されている。
ここで、本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、ガイドを挿入する工程後、さらに数日、前記再生器官原基を培養する工程を含むことを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記第1の細胞集合体と前記第2の細胞集合体のうち、少なくともいずれか一方が、再生対象の器官由来であることを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記第1の細胞集合体および前記第2の細胞集合体が、ともに再生対象の器官由来であることを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記再生器官原基が、上皮性付属器官原基であることを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記再生器官原基が、再生毛包原基、再生汗腺原基、再生皮脂腺原基、再生唾液腺原基、再生乳腺原基、再生腎臓ネフロン原基、再生涙腺原基、および、再生内分泌腺原基からなる群より選択されるいずれか一つの器官原基であることを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記再生器官原基が再生毛包原基であり、前記上皮系細胞がバルジ領域上皮細胞または毛母基底部上皮細胞であることを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記再生器官原基が再生毛包原基であり、前記間葉系細胞が毛乳頭細胞または真皮毛根鞘細胞であることを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記再生器官原基が再生唾液腺原基であり、前記上皮系細胞が唾液腺由来の上皮系細胞であり、前記間葉系細胞が唾液腺由来の間葉系細胞であることを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記再生器官原基が再生涙腺原基であり、前記上皮系細胞が涙腺由来の上皮系細胞であり、前記間葉系細胞が涙腺由来の間葉系細胞であることを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記ガイドが、化学繊維であることを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記ガイドが、生体吸収性であることを特徴とする。
本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法の一実施態様においては、前記ガイドが、ナイロン糸であることを特徴とする。
また、本発明の別の態様によれば、ガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法により作製されたガイドを有する移植用再生器官原基を、対象の部位へ移植する工程を含む、移植用再生器官原基の移植方法に関する。
ここで、本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の移植方法の一実施態様においては、前記ガイドを移植部位より突出した状態で維持することにより、移植した再生器官原基の上皮系細胞側の部分と前記対象の上皮系細胞とがガイドに沿って伸長し、連結することを特徴とする。
また、本発明のガイドを有する移植用再生器官原基の移植方法の一実施態様においては、前記再生器官原基が、導管を有する器官の再生を目的とした器官原基であり、前記再生器官原基の移植時に、前記ガイドを前記対象部位に存在する導管内に挿入し、前記再生器官原基の上皮系細胞側の部分と前記導管とを連絡させることにより、前記再生器官原基の上皮系細胞側の部分がガイドに沿って伸長し、前記対象部位の導管と連結することを特徴とする。
また、ガイドに沿って再生器官原基の上皮系細胞とレシピエント側の上皮層(上皮系細胞)とが連結することにより、特に毛包形成の過程においては、再生器官原基由来の嚢胞形成を阻止することができる。また、唾液腺のように、導管を有する外分泌腺等においては、上皮系細胞がガイドに沿って伸長しているため、レシピエント側の導管との連結効率を向上させることができる。
さらに、本発明により作製される再生器官原基は、毛包、汗腺、唾液腺等を含む上皮性付属器官に対して適用可能であり、体表面にかぎらず口腔内や腸管、あるいは内分泌組織のような内腔に管腔構造を介して接続する器官の再生にも適用可能である。これらの器官および組織の再生においても、適用できることから、皮膚付属器官のみならず、広く器官および組織再生医療に応用可能な技術を提供する。
本発明に係る製造方法の第一の態様は、哺乳動物(例えば、ヒト)に移植するための移植用再生器官原基の製造方法であって、間葉系細胞と上皮系細胞とを器官培養することにより作製した培養中の再生器官原基へガイドを挿入する工程を含むことを特徴とする。
また、本明細書において、「上皮性付属器官」とは、外胚葉由来または内胚葉由来の上皮細胞と、中胚葉または神経提由来の間葉系細胞との相互関係により形成される器官であり、例えば、内胚葉性上皮由来の器官や、外胚葉性付属器官、内分泌腺、導管を介して他の上皮組織と接続する外分泌腺等の器官を意味し、より具体的には、例えば、毛包、汗腺、涙腺、皮脂腺等の表皮付属器官や、口腔内、腸管、もしくは内分泌組織のような内腔に管腔構造を介して接続する器官を意味する。
また、本明細書において、「外胚葉性付属器官」とは、「上皮性付属器官」のうち、外胚葉由来の器官であり、毛包、汗腺、涙腺、皮脂腺等の表皮付属器官等を意味する。
再生器官原基は、間葉系細胞から実質的に構成される第1の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的に構成される第2の細胞集合体とを密着させて支持体内部で培養する工程を含む方法によって作製することができる。
なお、本明細書において、上記のような方法により、例えば、毛包原基を作製した場合には、作製された毛包原基を「再生毛包原基」という。
ここで、細胞集合体とは、細胞が密着した状態をいい、組織であっても、ばらばらの細胞から調製された細胞凝集塊であってもよい。組織を用いれば、細胞配置や形状の正しい器官が得られやすいという利点があるが、入手できる量に制約がある場合もある。細胞凝集塊の調製には、培養細胞も用いることができるので、培養細胞を用いる場合には、細胞集合体を比較的入手しやすく、少なくともその点においては好ましい。
また、間葉系細胞及び上皮系細胞を採取する器官は、細胞の分化段階の幼若性と均質性の観点から、正常な成体内で再生する能力を保持しているものであることが好ましい。または、人為的な外科的操作や薬剤投与、遺伝子導入により再生可能となったものも使用することができる。
本発明で用いられる支持担体としては、例えば、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス(商品名)、メビオールゲル(商品名)、マトリゲル(商品名)、エラスチン、フィブリン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、乳酸/グリコール酸共重合体(PLGA)等を挙げることができる。中でも、適切な硬さや保持力を有するコラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス、メビオールゲル、マトリゲル、細胞外マトリクス混合物、エラスチン、フィブリン、ラミニンが好ましい。
例えば、支持担体は液状のものを用い、再生器官原基を配置した後に硬化させてもよい。例えば培養用のディッシュ上にコラーゲンゲルドロップを作製し、コラーゲンドロップ内に再生器官原基を配置した後、37℃のCO2インキュベータ内で培養することにより、コラーゲンをゲル化させることができる。
また、配置した後に、支持担体を固化する工程を設けることも好ましい。これにより、細胞がさらに凝集して、より高密度な状態とすることができる。例えば、コラーゲンゲルの場合、培養温度下で数分〜数十分間静置することによって固化することができる。このとき、細胞集合体内に細胞以外の成分が少なければ少ないほど、より高密度な状態が実現される。
培養期間は、長くすることによって、再生器官原基の形成をより進行させることができる。所望の状態を得るために、例えば、6日以上、30日以上、50日以上、100日以上、又は300日以上培養してもよく、培養の途中で、培地や培養条件を変更することもできる。
例えば、再生毛包原基を移植した際に、機能的な毛髪を得るためには、再生毛包原基を少なくとも1日培養することが好ましく、2日以上培養することがより好ましい。
再生唾液腺原基や再生涙腺原基を移植し、機能的な唾液腺や涙腺を得る際にも、再生唾液腺原基または再生涙腺原基を少なくとも1日培養することが好ましく、2日以上培養することがより好ましい。
支持担体を単独で培養する場合、培養条件は、一般的な動物細胞の培養に用いられる条件とすることができる。また、培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが知られている各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、FGF、BMP等を挙げることができる。
また、再生唾液腺原基のように、移植時にレシピエント側の導管へガイドを挿入する必要がある場合には、例えば、ガイドの直径を5μm〜60μmとすることが好ましく、20μm〜40μmとすることがより好ましい。また、ガイドの長さは、1mm〜6mmとすることが好ましく、2mm〜3mmとすることがより好ましい。さらに、導管へガイドを挿入しやすいように表面が滑らかであり、また、組織を傷つけない程度の固さを保持するガイドが好ましい。このようなガイドとしては、ブレードのようなマルチフィラメントよりも、モノフィラメントの素材が好ましい。
また、再生器官原基となる細胞塊へのガイドの挿入は、器官培養開始直後、すなわち、上皮系細胞と間葉系細胞との細胞集合体を培地内へ配置した後すぐに挿入することができる。また、再生毛包原基の上皮系細胞は器官培養により細胞接着により強度を増すことから、ガイドの素材強度(たとえばステンレス線などを用いたり)とガイドの先端を鋭利とする等により貫通力を増すことで、培養開始後1〜2日目に挿入することもできる。ガイド挿入のタイミングを、器官原基作成直後とすることにより、ナイロン糸などの生体に対する異物応答が低くフレキシブルな素材を用いることができる点で好ましい。
ガイドを挿入した移植用再生器官原基は、当業者に公知の方法で対象とする部位に移植することができる。例えば、再生毛包原基を移植する際には、シャピロ式植毛術やチョイ式植毛器を用いた植毛、空気圧を利用したインプランター等を使用し、移植することができる。シャピロ式植毛術とは、移植部位をマイクロメス等で移植創を作った後に、ピンセットを用いて移植する方法である。このような植毛術を適用する際には、本発明により提供される移植用再生器官原基がガイドを有しているため、ガイドを摘むことにより、再生毛包原基を直接触れることなく操作可能であり、簡便に操作することができる。
また、例えば、再生唾液腺原基の移植時のように、レシピエント側の導管へガイドを挿入する必要のある器官原基を移植する際には、レシピエント側の導管を長く保存しておくことで、移植後にガイドが抜けるのを防ぐことができ好ましい。また、栄養供給の向上の観点からも、移植部位を大静脈の近くにすることが好ましい。その際、レシピエント側の導管を長く保存しておくことで、移植部位を調節しやすくなる。
また、再生器官原基を移植後は、ガイドが抜けないように皮膚接合用のテープやバンド、縫合等により、ガイドと移植対象部位とを固定することもできる。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項(部材、ステップ、要素、数字など)が存在することを意図するものであり、それ以外の事項(部材、ステップ、要素、数字など)が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語(技術用語及び科学用語を含む。)は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
1. 材料と方法
(1)実験動物
7−8週齢のC57BL/6マウス(日本クレア)およびC57BL/6 6−TgN (act−EGFP)マウスより毛包を採取した。また、胎齢18.0−18.5日齢のC57BL/6 6−TgN (act−EGFP)マウス(SLC)より、体毛原基を含む皮膚を採取した。また、下記実験手法により作製した再生毛包原基は6−8週齢のBalb/c nu/nuマウス(SLC)に移植した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、東京理科大学動物実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
C57BL/6のEGFPマウスを頸椎脱臼により安楽死させた後に、毛球部を傷つけないように頬部皮膚全層および皮下組織を採取した。頬髭周囲の皮下組織を除去した後に、毛包を分離した。成長期I−IV期の頬髭毛包を選択し、25G注射針を用いてコラーゲン鞘を取り除き、毛包を露出させた。毛球部を分離し、毛乳頭を摘出した。摘出した毛包および毛乳頭は、10%牛胎児血清と1%ペニシリン・ストレプトマイシン溶液を含むDMEM培地(DMEM10)中で保存した。分離した毛乳頭は、3.5cm培養プラスチックディッシュ(日本ベクトン・ディッキンソン)に播種し、10ng/mlのFGF2(和光純薬)を含むDMEM10にて、5% CO2、37℃、湿度95%環境下にて初代培養を行った。初代培養毛乳頭細胞は4日目および8日目に培地交換し、9日間培養したのちに使用した。初代培養毛乳頭細胞は、PBS(−)で3回洗浄した後に、0.05%トリプシンを含む10 mM EDTA溶液(GIBCO)で剥離し、DMEM10でトリプシン中和し、十分洗浄した後に氷温下で使用時まで保存した。
摘出した頬髭組織より、25G注射針を用いてコラーゲン鞘を取り除き、バルジ領域に細分化した。バルジ領域組織は終濃度4.8U/mlのDispase II (Becton Dickson)及び100U/mlのCollagenase (Worthington, Lakewood, NJ)溶液にて37℃で4分間反応させ、その後、25G注射針を用いて外科的にバルジ領域上皮組織とバルジ周囲の間葉組織に分離した。分離したバルジ領域上皮組織は0.05% Trypsin (Invitrogen, Carlsbad, US)でインキュベータにて1時間酵素処理を行い、35μmporeセルストレイナーを通して単一化細胞とした。また、(2)で得た培養毛乳頭細胞は0.05% Trypsin (Invitrogen, Carlsbad, US)にて回収し、35μmpore セルストレイナーを通して単一化細胞とした。
再生毛包原基は器官原基法に従って作製した。以下に手順の詳細を記載する。取得したバルジ領域上皮組織由来の単一化バルジ領域細胞と培養毛乳頭細胞とを、シリコングリースを塗布した1.5mlマイクロチューブ (エッペンドルフ)にそれぞれ別々に移し、遠心分離により沈殿として回収し、遠心後の培養液の上清をGELoader Tip 0.5−20ml(エッペンドルフ)を用いて完全に除去した。次に、シリコングリース(東レ・ダウコーニング)を塗布したペトリディッシュ上にCellmatrix type I−A (Nitta gelatin, Osaka, Japan)を30ml滴下してコラーゲンゲルドロップを作製し、上記にて調製した培養毛乳頭細胞を0.1−10mlのピペットチップ (Quality Scientific plastics)を用いて、0.2ml程度注入し細胞凝集塊を作製した。続いて、同ゲルドロップ内へ、上記にて調製したバルジ領域上皮細胞を0.1−10mlのピペットチップ(Quality Scientific plastics)を用いて、培養毛乳頭細胞の凝集塊に密着させるように0.2ml程度注入し細胞凝集塊を作製した。さらに培養毛乳頭細胞とバルジ領域上皮細胞との細胞凝集塊のバルジ領域上皮細胞側より、全長5mmのナイロン糸(松田医科工業)を、細胞凝集塊の構造(特に上皮細胞と間葉系細胞との接触面)を壊さず培養毛乳頭細胞の細胞画分とバルジ領域上皮細胞画分との接触面を垂直に貫くように実体顕微鏡下で確認のうえで挿入し、その後37℃にて5分間静置し、ゲルドロップを固化させることにより、上皮系細胞と間葉系細胞の結合をより強固にすることでガイドを有する再生毛包原基を作製した。
胎齢18.0−18.5日齢のEGFPマウス胎児より背部皮膚を採取し、中尾等が報告した方法(Nakao Ket al., Nat. Methods, 4(3), 227−30, 2007)を一部改変し、ディスパーゼ処理を1時間、4℃、55 rpm震とう条件で行い、上皮層と真皮層を分離した。真皮層をさらに、37℃で40分間の100units/mlのコラゲナーゼI処理を2回行い、その後、単一化処理を行い、間葉系細胞を取得した。また、上皮層を37℃で40分間100units/mlのコラゲナーゼI処理を2回行って、混入している間葉系細胞を除去し、さらに100units/mlのコラゲナーゼIを含む0.25%トリプシン溶液で37℃、10分間処理し、その後、単一化処理を行い、上皮系細胞を取得した。
また培養毛乳頭細胞の代わりに胎児皮膚間葉細胞をコラーゲンゲルドロップ中に注入し、かつ、バルジ領域細胞の代わりに胎児皮膚上皮細胞をコラーゲンゲルドロップ中の胎児皮膚間葉細胞塊に密着するように注入することにより、(4)に記載の方法と同様の方法により、ガイドを有する胎児皮膚間葉細胞と胎児皮膚上皮細胞との細胞凝集塊を作製した。
胎児皮膚上皮細胞および間葉細胞より作製した再生毛包原基と、成体髭由来のバルジ領域上皮細胞および培養乳頭際細胞より作製した再生毛包原基とを、下記のようにして、ヌードマウスの皮内へ移植した。
ヌードマウスを定法に従ってペントバルビタール麻酔を行い、背部をイソジン消毒した後に自然横臥位をとらせた。Vランスマイクロメス(日本アルコン)を用いて穿刺し、皮膚表皮層から真皮層下層部に至る移植創を形成した。移植創は体表面より垂直方向に約400μmの深度までとし、水平方向は約1mm程度とした。ナイロン糸製ガイド(8−0ナイロン縫合糸相当、長さ約5mm)を挿入した再生毛包原基よりコラーゲンゲルを除去し、移植創の体表側に上皮系細胞成分が向くように、先鋭ピンセットNo.5(夏目製作所)を用いて挿入した。移植創上端部に再生毛包原基の上皮系細胞成分の上端部が露出するよう移植深度を調節し、ナイロン糸製ガイドが体表面に露出するように位置させた。ナイロン糸製ガイドを移植創に近接した皮膚表面にステリストリップ(スリーエム)で固定し、その後、ナースバンおよびサージカルテープ(スリーエム)で移植創を保護した。移植後5−7日で保護テープを除去し、ナイロン糸製ガイドを移植部位に残存させ、1日後に残存している場合は抜去した。移植物の生着を目視または蛍光実体顕微鏡で判定した後に経過観察を行った。
再生毛包原基の移植部位を目視および蛍光実体顕微鏡にて観察し、発毛を評価した。発毛後に、定期的な写真撮影にて毛成長と退行を評価した。採取した組織はマイルドホルム10N(和光純薬)で固定した後に、定法に従ってパラフィン包埋ブロックまたは凍結ブロックとした。連続切片を作製し、HE染色またはHoechstによる蛍光核染色を施し、組織学的解析を行った。
(1)再生毛包原基の皮内移植による発毛
皮内移植した再生毛包原基の移植位置を解析するために、胎齢18.5日齢のマウス皮膚細胞より再生毛包原基を作製し、ヌードマウス皮膚内に移植した。移植後に皮膚を摘出し、パラフィン切片を作製してHE染色を行った。その結果、移植位置は皮膚真皮層内であり、体表面よりの深度は平均393μmであった。移植直後、移植後3日目、および10日目の結果を図2に示す。図2に示すように、皮膚内に再生毛包原基を移植した際には、ガイドが体表面より突出した状態でガイドを固定していた(Day 0の上段の写真、矢印はガイドを示す)。また、移植時には、再生毛包原基とレシピエント上皮とは接続していなかった(図2中、Day 0の下段のHE染色した切片の写真)。移植後3日目までに再生毛包原基の上皮成分と、レシピエント皮膚表皮層はガイドを介して接続していた(図2中、Day 3の下段のHE染色した切片の写真、矢印は接続した部分を示す)。移植後10日までに毛包を再生し、平均14日で体表面より再生毛が発毛し(図2中、Day 10)、その発毛頻度は90%であった。
また、同様の移植深度となるように成体頬髭由来の再生毛包原基をヌードマウス背部へ移植した結果を図4に示す。図4Aは、再生毛包原基へガイドを挿入した写真を示し、Eは、バルジ領域上皮細胞由来の部分を示し、DPは、培養乳頭細胞由来の部分を示し、Gはガイドを示す。図4Bは、移植部位を蛍光実体顕微鏡で追跡した写真を示す。成体髭由来の再生毛包原基を移植したところ、移植後平均21日で再生毛が体表面より発毛した(図4C)。また、その発毛頻度は74%であった。
再生した毛包を採取し、組織分析を行った。結果を図5に示す。左の弱拡大顕微鏡像中の四角い枠の部分を拡大したものが、写真中央および右である。再生毛包はGFP蛍光により周辺のヌードマウス毛包と識別された(図5の左下の写真)。再生した毛包の上皮組織はレシピエント皮膚表皮層と連結し、連結部の表皮基底層はレシピエント由来細胞が優性であった。また、再生毛上部の拡大写真において、皮脂腺の再生が確認された(図5の中央の上下の写真において、矢印の部分)。皮脂腺は再生毛包原基由来とレシピエント細胞由来が混在していたが、再生毛包の皮脂腺より下方は移植した再生毛包原基由来であった。さらに、図5の右側の写真は毛球部を示すが、右下の写真において、毛乳頭(DP)部位におけるGFPの蛍光を確認できたことから、毛乳頭は移植した再生毛包原基由来であることが示された。このように、再生毛包は組織学的に正常な毛包構造を示し、また、成体頬髭由来の再生毛包は体毛より明らかに大型であった。
胎児体毛由来の再生毛は100%黒色毛であり、成体頬髭由来の再生毛は95.5%が白色毛であった。図6は、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡により観察した写真を示す。点線部内には髭様硬毛に特徴的な螺旋状の毛髄(M)が認められ(図6a)、かつ、正常な頬髭と同等なキューティクル構造を認めた(図6b)。このように、再生髭は天然毛と同等の毛髄と皮質を呈し、明らかな髭状を呈していた。
再生髭の毛幹成長と退行を追跡したところ、毛周期の進展に伴い退行し脱毛した毛穴部位より新たな毛幹が成長していた(図7)。また、その毛周期の期間は天然髭の毛周期と同等であり、有意差は認められなかった(図8)。この結果より、再生毛は毛周期を経てもレシピエント表皮層との連結を保持し、毛成長と退行を繰り返すことが明らかとなった。
(1)再生唾液腺原基の作製および器官培養
唾液腺の再生を目的として、器官原基法を用いた唾液腺原基の作製を行なった。
胎齢13.5〜14.5日のC57BL/6マウス胎仔から顎下腺原基を外科的に摘出した。摘出した顎下腺原基を終濃度50U/mlのDispase II(Becton Dickson)溶液にて、25℃で1.5分間反応させ、その後、25G注射針を用いて顎下腺上皮組織と顎下腺間葉組織に分離した。さらに、間葉組織は終濃度50U/mlのCollagenase(Worthington, Lakewood, NJ)溶液と終濃度0.25%のTrypsin(Invitrogen, Carlsbad, US)溶液で37℃温浴にて10分間酵素処理を行い、22μporeセルストレイナーを通して、完全に単一化された間葉系細胞を取得した。上皮組織は終濃度100U/mlのCollagenase(Worthington, Lakewood, NJ)溶液で37℃温浴にて15分間の酵素処理を2回行った後、終濃度0.25%のTrypsin(Invitrogen, Carlsbad, US)溶液で37℃温浴にて5分間酵素処理を行い、22μporeセルストレイナーを通して、完全に単一化された上皮系細胞を取得した。
得られた上皮系細胞と間葉系細胞とを用いて、器官原基法により、コラーゲンゲル中に再成唾液腺原基を作製した (図9)。以下に手順の詳細を記載する。取得した単一化上皮系細胞と単一化間葉系細胞とを、シリコングリースを塗布した1.5mlマイクロチューブ (エッペンドルフ)にそれぞれ別々に移し遠心分離にかけた。遠心分離後の培養液の上清をGELoader Tip 0.5−20ml(エッペンドルフ)を用いて完全に除去し、沈殿として単一化上皮系細胞および単一化間葉系細胞をそれぞれ回収した。次に、シリコングリース(東レ・ダウコーニング)を塗布したペトリディッシュ上にCellmatrix type I−A (Nitta gelatin, Osaka, Japan)を30μl滴下してコラーゲンゲルドロップを作製し、上記にて調製した単一化間葉系細胞を0.1−10mlのピペットチップ (Quality Scientific plastics)を用いて、0.3μl程度注入し細胞凝集塊を作製した。続いて、同ゲルドロップ内へ、上記にて調製した単一化上皮系細胞を0.1−10mlのピペットチップ(Quality Scientific plastics)を用いて、間葉系細胞の凝集塊に密着させるように0.2μl程度注入し、顎下腺原基由来の上皮系細胞と間葉系細胞との細胞凝集塊を作製した。
上記の結果より、器官原基法を用いることで再成唾液腺原基の作製が可能であることが示された。
なお、図9に示すように、胎齢13.5日のマウス胎児からは、発生段階に差がある顎下腺原基が得られたが(図9中の前記、中期、後期の写真参照)、いずれの発生段階における顎下腺原基からも、上記の方法により、上皮系細胞および間葉系細胞から再構築した再生唾液腺原基を作製することができた。
上記(1)方法で作製した再成唾液腺原基に対して、上皮系細胞側より、全長約3mmの生体吸収性糸(グンゼ社製)を、再生唾液腺原基の構造(特に上皮系細胞と間葉系細胞との接触面)を壊さず上皮系細胞部分と間葉系細胞部分との接触面を垂直に貫くように、実体顕微鏡下で確認のうえで挿入した。ガイド挿入後は、60時間器官培養を行なった。
外科的に、成体マウスの耳下腺の腺房部分を除去し、耳下腺へ連結していた導管部分を露出させた。次に、上記(2)の方法で作製した、2日間器官培養したガイドを有する再成唾液腺原基をコラーゲンゲルとともに、耳下腺導管部へ移植した。移植の際、導管の切断面と再成唾液腺原基の上皮組織とが近接するようにガイド糸の位置を調製し、レシピエント側の耳下腺導管にガイドを挿入した。また、移植した再成唾液腺原基が動かないように再生唾液腺原基を含むコラーゲンゲルと咬筋を8-0ナイロン縫合糸(ベアーメディック、千葉、日本)で縫合した(図12)。
このように、再生器官原基法により唾液腺を再構築することができた。また、顎下腺由来の再生唾液腺原基であっても、別の唾液腺である、耳下腺部位において、顎下腺を再構築すること可能であった。
顎下腺由来の再生唾液腺原基と成体マウスの耳下腺導管が結合し、唾液分泌経路が保持されていることを明らにすることを目的とし、再生唾液腺原基の移植後30日目において、外科的手法により、移植部位および耳下腺導管を露出させ、再生唾液腺原基の移植部位よりも口腔側の導管から再生唾液腺原基に向けてエバンスブルー溶液をマイクロインジェクションにより注入した。
また、唾液腺を全て除去した唾液腺欠損マウスと、唾液腺を全て除去した後にガイドを有する再生唾液腺原基を顎下腺部位に移植したマウス(移植マウス)との、体重および生存率の推移の比較したところ、唾液腺欠損マウスは、唾液腺摘出日より日を追うごとに体重が減少し続けたのに対して、移植マウスは、移植後約3、4日目から、次第に体重が回復し、約6日目には、ほぼ正常な体重まで回復した(図15)。また、唾液腺欠損マウスは、唾液腺摘出日より4日目以降において生存率が20%以下であったのに対して、移植マウスでは、移植日より4日目以降において約70%の生存率を示した(図15)。
(1)再生涙腺原基の作製および器官培養
涙腺の再生を目的として、器官原基法を用いて再生涙腺原基の作製を下記のように行なった。
胎齢16.5〜17.5日のC57BL/6マウス胎仔から涙腺原基を外科的に摘出した。摘出した涙腺原基を終濃度50U/mlのDispase II(Becton Dickson)溶液にて、25℃で1.5分間反応させ、その後、25G注射針を用いて涙腺上皮組織と涙腺間葉組織に分離した。さらに、間葉組織は終濃度50U/mlのCollagenase(Worthington, Lakewood, NJ)溶液と終濃度0.25%のTrypsin(Invitrogen, Carlsbad, US)溶液で37℃温浴にて10分間酵素処理を行い、22μporeセルストレイナーを通して、完全に単一化された間葉系細胞を取得した。上皮組織は終濃度100U/mlのCollagenase(Worthington, Lakewood, NJ)溶液で37℃温浴にて15分間の酵素処理を2回行った後、終濃度0.25%のTrypsin(Invitrogen, Carlsbad, US)溶液で37℃温浴にて5分間酵素処理を行い、22μporeセルストレイナーを通して、完全に単一化された上皮系細胞を取得した。
得られた上皮系細胞と間葉系細胞とを用いて、器官原基法により、コラーゲンゲル中に再成涙腺原基を作製した。以下に手順の詳細を記載する。取得した単一化上皮系細胞と単一化間葉系細胞とを、シリコングリースを塗布した1.5mlマイクロチューブ (エッペンドルフ)にそれぞれ別々に移し遠心分離にかけた。遠心分離後の培養液の上清をGELoader Tip 0.5−20ml(エッペンドルフ)を用いて完全に除去し、沈殿として単一化上皮系細胞および単一化間葉系細胞をそれぞれ回収した。次に、シリコングリース(東レ・ダウコーニング)を塗布したペトリディッシュ上にCellmatrix type I−A (Nitta gelatin, Osaka, Japan)を30μl滴下してコラーゲンゲルドロップを作製し、上記にて調製した単一化間葉系細胞を0.1−10mlのピペットチップ (Quality Scientific plastics)を用いて、0.3μl程度注入し細胞凝集塊を作製した。続いて、同ゲルドロップ内へ、上記にて調製した単一化上皮系細胞を0.1−10mlのピペットチップ(Quality Scientific plastics)を用いて、間葉系細胞の凝集塊に密着させるように0.2μl程度注入し、涙腺原基由来の上皮系細胞と間葉系細胞との細胞凝集塊を作製した(図16)。
上記(1)の方法で作製した再成涙腺原基に対して、上皮系細胞側より、全長約3mmの生体吸収性糸(グンゼ社製)を、再生唾液腺原基の構造(特に上皮系細胞と間葉系細胞との接触面)を壊さず上皮系細胞部分と間葉系細胞部分との接触面を垂直に貫くように、実体顕微鏡下で確認のうえで挿入した。ガイド挿入後は、2日間器官培養を行なった。
器官培養を行った後、成体マウスの涙腺の腺房部分を除去して導管部分を露出させ、再生唾液腺原基を移植する場合と同様の方法で、再生涙腺原基を涙腺導管部へ移植した。
以上の効果を提供することにより、本発明により作製される移植用再生器官原基は、医療産業分野において広く活用することが出来る、新たな器官置換的再生医療を提供することができる。
Claims (13)
- ガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法であって、
間葉系細胞から実質的に構成される第1の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的に構成される第2の細胞集合体とを密着させて支持体内部で培養することにより再生器官原基を調製する工程と、
前記第1の細胞集合体と前記第2の細胞集合体との接触面を壊さず、また、前記第1の細胞集合体と前記第2の細胞集合体とを貫くように、前記再生器官原基にガイドを挿入する工程と、
を含む、製造方法であって、
ここで、前記ガイドは、ポリマーより作られた繊維、金属繊維、炭素繊維、化学繊維、動物繊維、および、植物繊維からなる群より選択される、
方法。 - ガイドを挿入する工程後、さらに数日前記再生器官原基を培養する工程を含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記第1の細胞集合体と前記第2の細胞集合体のうち、少なくともいずれか一方が、再生対象の器官由来である、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記第1の細胞集合体および前記第2の細胞集合体が、ともに再生対象の器官由来である請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記再生器官原基が、上皮性付属器官原基である請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記再生器官原基が、再生毛包原基、再生汗腺原基、再生皮脂腺原基、再生唾液腺原基、再生乳腺原基、再生腎臓ネフロン原基、再生涙腺原基、および、再生内分泌腺原基からなる群より選択されるいずれか一つの器官原基である請求項1〜4に記載の製造方法。
- 前記再生器官原基が再生毛包原基であり、前記上皮系細胞がバルジ領域上皮細胞または毛母基底部上皮細胞である請求項6に記載の製造方法。
- 前記再生器官原基が再生毛包原基であり、前記間葉系細胞が毛乳頭細胞または真皮毛根鞘細胞である請求項6または7に記載の製造方法。
- 前記再生器官原基が再生唾液腺原基であり、前記上皮系細胞が唾液腺由来の上皮系細胞であり、前記間葉系細胞が唾液腺由来の間葉系細胞である請求項6に記載の製造方法。
- 前記再生器官原基が再生涙腺原基であり、前記上皮系細胞が涙腺由来の上皮系細胞であり、前記間葉系細胞が涙腺由来の間葉系細胞である請求項6に記載の製造方法。
- 前記ガイドが、化学繊維である請求項1〜10のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ガイドが、生体吸収性である請求項1〜11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ガイドが、ナイロン糸である請求項1〜10のいずれか一項に記載の製造方法。
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