WO2020066818A1 - 毛包上皮性幹細胞の生体外増殖方法 - Google Patents

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fgf
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epithelial
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杏祐 浅川
真 武尾
公栄 豊島
美帆 小川
悠 森
恭介 岸本
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株式会社オーガンテクノロジーズ
京セラ株式会社
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a culture medium for efficiently growing epithelial cells that can be used for producing a regenerated hair follicle primordium, and a method for using the same.
  • Non-Patent Document 1 In order to realize hair regenerative medicine, it is necessary to obtain epithelial stem cells and mesenchymal stem cells having the ability to induce hair follicles, which are necessary for reconstituting the hair follicle primordium, and to grow them in vitro.
  • mesenchymal stem cells it is known that hair papilla cells, which can be obtained from hair papilla, have hair follicle inducing ability and can be obtained by in vitro culture. (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 3 CD34-positive integrin ⁇ 6-positive stem cells obtained by three-dimensional culture of mouse hair follicle-derived cells (Non-Patent Document 4), but its organ regeneration ability has not been sufficiently demonstrated.
  • an object of the present invention is to provide a means for efficiently growing epithelial cells that can be used for producing a regenerated hair follicle primordium.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, by culturing cells derived from epithelial tissue using a cell culture medium containing a combination of specific additives, the regenerated follicle primordium
  • the present inventors have found that the present invention can be used for the production of E. coli, that is, it is possible to proliferate a mass of epithelial cells capable of inducing hair follicles in large quantities, and have completed the present invention.
  • a culture medium for growing epithelial cells that can be used for production of regenerated hair follicle primordium, comprising a basal medium and at least the following (1) to (3): (1) at least one bone morphogenetic protein (BMP) inhibitor; A culture medium comprising at least one of (2) at least one fibroblast growth factor; and (3) sonic hedgehog (SHH) or an SHH agonist.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • SHH sonic hedgehog
  • the culture medium according to [1] The BMP inhibitor is selected from the group consisting of Noggin, Dorsomorphin, Chordin, Follistatin, and Ectodin. Culture medium.
  • the culture medium according to any one of [1] to [3],
  • the fibroblast growth factor comprises FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, and FGF-10. Selected from a group, Culture medium.
  • the SHH agonist is selected from SAG or Purmorphamine; Culture medium.
  • the culture medium according to [6] The receptor tyrosine kinase ligand is selected from the group consisting of EGF, TGF ⁇ , amphiregulin, and heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF); Culture medium.
  • the culture medium according to [8] The TGF ⁇ receptor / ALK5 inhibitor is selected from the group consisting of SB431542, KY03-I, IWR-1-endo, and A83-01, Culture medium.
  • [11] A method for expanding epithelial cells for use in producing a regenerated hair follicle primordium, Culturing cells derived from epithelial tissue in the culture medium according to any one of [1] to [10], Method.
  • the cells derived from the epithelial tissue are cells obtained by converting the collected epithelial tissue into a single cell, Method.
  • the epithelial tissue is a hair follicle bulge region epithelial tissue, Method.
  • a culture medium for efficiently growing epithelial cells that can be used for producing a regenerated hair follicle primordium, and a method for efficiently growing the epithelial cells using the culture medium. Is done.
  • FIG. 1 shows a culture image of mouse hair follicle epithelial cells cultured for 6 days in each of NFSE medium, NFFS medium and NFFS + Wnt + Notch medium.
  • FIG. 2 shows the results of measurement of colony formation rate (A), growth rate (B), and spheroid size (C) in mouse hair follicle epithelial cells cultured in NFSE medium, NFFS medium, and NFFS + Wnt + Notch medium for 5 days. Is shown.
  • FIG. 3 shows the results of marker analysis of mouse cultured hair follicle epithelial cells cultured in NFSE medium, NFFS medium and NFFS + Wnt + Notch medium.
  • FIG. 1 shows a culture image of mouse hair follicle epithelial cells cultured for 6 days in each of NFSE medium, NFFS medium and NFFS + Wnt + Notch medium.
  • FIG. 2 shows the results of measurement of colony formation rate (A), growth rate (B), and
  • FIG. 4 shows the evaluation of organ inducing ability using the intradermal transplantation method (A) of regenerated hair follicle primordium reconstructed from mouse hair follicle epithelial cells cultured in NFSE medium, NFFS medium and NFFS + Wnt + Notch medium. Representative hair growth examples (B) and quantification results (C) are shown.
  • GT indicates a guide thread
  • E indicates an epithelial cell aggregate
  • DP indicates a dermal papilla cell aggregate.
  • FIG. 5 shows culture images of human cultured hair follicle epithelial cells cultured in NFFS medium on day 10 and day 20 of culture and the number of cells obtained per hair follicle.
  • FIG. 6 shows the results of stem cell marker analysis on mouse cultured hair follicle epithelial cells (day 6 of culture) and human cultured hair follicle epithelial cells (day 20 of culture) cultured in NFSE medium or NFFS medium.
  • FIG. 7 shows an experimental method (A) for evaluating the organ inducing ability of human cultured hair follicle epithelial cells cultured in NFFS medium and the results of histochemical analysis (B).
  • the present invention relates in one aspect to a culture medium for growing epithelial cells that can be used for the production of regenerated hair follicle primordia (hereinafter, also referred to as the culture medium of the present invention).
  • the hair follicle primordium is the tissue from which the hair follicle is derived and is composed of epithelial cells and mesenchymal cells.
  • the hair follicle primordium is formed by the thickening of a part of the epidermis during the fetal period and the aggregation of the facing mesenchymal cells.
  • “regenerated hair follicle primordium” refers to a hair follicle primordium artificially derived or regenerated from epithelial cells and mesenchymal cells.
  • hair follicle primordium means that when used for production of regenerated hair follicle primordium together with appropriate mesenchymal cells, it has at least a hair-growth ability It means that regenerated hair follicle primordium can be induced. That is, in the present invention, it is not intended to simply proliferate cells derived from epithelial tissue (for example, hair follicle) or to proliferate epithelial cells that induce only the regenerated follicle primordium without hair growth ability.
  • epithelial tissue for example, hair follicle
  • "can be used for the production of regenerated hair follicle primordium” has a hair growth ability when used for the production of regenerated hair follicle primordium, and This means that a regenerated hair follicle primordium having a high survival rate in a living body can be produced.
  • "high engraftment rate to the living body” means at least 30%, preferably at least 40%, more preferably at least 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 70%. It may mean 80%, more preferably at least 90%, or more preferably at least 95%.
  • the culture medium of the present invention comprises a basal medium and at least the following (1) to (3): (1) at least one bone morphogenetic protein (BMP) inhibitor; (2) at least one fibroblast growth factor; and (3) at least one of sonic hedgehog (SHH) or SHH agonist.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • SHH sonic hedgehog
  • Basic medium refers to a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like essential for culturing cells, particularly mammalian cells (eg, humans).
  • a medium used for culturing animal cells can be used, and the minimum essential medium such as, but not limited to, an Eagle medium is used.
  • MEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • MEM- ⁇ Minimum Essential Medium ⁇
  • Ham's ⁇ F-12 and F-10 Medium DMEM / F12 Medium, Williams Medium E, RPMI-1640 Medium, MCDB Medium 199 medium, Fisher medium, Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM), McCoy's modified medium, DEF-CS medium, CnT-PR medium, Advanced @ DMEM medium, Advanced @ MEM medium, Advanced @ DMEM / F12 medium, or a mixed medium of these. Can be mentioned.
  • the BMP inhibitor that can be used in the culture medium of the present invention is not particularly limited as long as it can prevent or inhibit the binding of a BMP molecule to a BMP receptor.
  • the BMP transcription activity is measured using a method known to those skilled in the art (Zilberg et al., BMC Cell Biol, 8:41, 2007). Can be determined by
  • BMP inhibitors that can be used in the culture medium of the present invention include, but are not limited to, for example, Noggin, Dorsomorphin, Chordin, Follistatin, And Ectodin.
  • one type of BMP inhibitor may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the concentration of the BMP inhibitor contained in the culture medium of the present invention ranges from 0.1 ng / mL to 1000 ng / mL, preferably from 0.3 ng / mL to 300 ng / mL, more preferably from 1 ng / mL to 100 ng / mL. can do.
  • the fibroblast growth factor (2) that can be used in the culture medium of the present invention is not limited thereto, but for example, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF -5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, and FGF-10.
  • one type of fibroblast growth factor may be used alone, or a plurality of types may be used in combination.
  • at least two fibroblast growth factors are used in combination as fibroblast growth factors.
  • At least FGF-7 is used as the fibroblast growth factor.
  • the concentration of fibroblast growth factor contained in the culture medium of the present invention is from 0.1 ng / mL to 1000 ng / mL, preferably from 0.3 ng / mL to 300 ng / mL, more preferably from 1 ng / mL to 100 ng / mL. Range.
  • the SHH agonist that can be used in the culture medium of the present invention is not particularly limited as long as it can enhance SHH-mediated signal transduction. Whether a certain molecule or compound has SHH agonist activity can be determined using a method as suggested in, for example, JP-A-2009-213442. Examples of the SHH agonist that can be used in the culture medium of the present invention include, but are not limited to, SAG and Purmorphamine.
  • the concentration of SHH or SHH agonist contained in the culture medium of the present invention ranges from 0.1 ng / mL to 1000 ng / mL, preferably from 0.3 ng / mL to 300 ng / mL, more preferably from 1 ng / mL to 100 ng / mL. It can be.
  • the culture medium of the present invention in one embodiment, further comprises (4) at least one receptor tyrosine kinase ligand. It is preferable that the culture medium of the present invention further contains a receptor tyrosine kinase ligand, since the engraftment rate when the produced regenerated follicle primordium is transplanted into a living body can be significantly improved.
  • Receptor tyrosine kinase ligands that can be used in the culture medium of the present invention include, but are not limited to, EGF, TGF ⁇ , amphiregulin, and heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF ).
  • the concentration of the receptor tyrosine kinase ligand contained in the culture medium of the present invention is from 0.1 ng / mL to 1000 ng / mL, preferably from 0.3 ng / mL to 300 ng / mL, more preferably from 1 ng / mL to 100 ng / mL. Range.
  • the culture medium of the present invention further comprises (5) at least one TGF ⁇ receptor / ALK5 inhibitor.
  • the TGF ⁇ receptor / ALK5 inhibitor that can be used in the culture medium of the present invention is not particularly limited as long as it can inhibit the interaction between TGF ⁇ receptor and ALK5, and TGF ⁇ receptor inhibitor or ALK5 inhibitor And the like.
  • Examples of the TGF ⁇ receptor / ALK5 inhibitor that can be used in the culture medium of the present invention include, but are not limited to, SB431542, A83-01, ALK5 Inhibitor, D4476, LY364947, SB525334, and SD208. Can be mentioned.
  • the concentration of the TGF ⁇ receptor / ALK5 inhibitor contained in the culture medium of the present invention is from 0.001 ng / mL to 1000 ng / mL, preferably from 0.01 ng / mL to 100 ng / mL, more preferably from 0.1 ng / mL to It can be in the range of 10 ng / mL.
  • the culture medium of the present invention may be any of the above (1) to (3), and optionally (4) and (5), as well as other cells for optimizing a cell culture medium, particularly a cell culture medium for epithelial cells. It may contain components. Other components for optimizing such cell culture media include, but are not limited to, serum substitutes such as Glutamax TM , B27 supplement (GIBCO), N2 supplement (GIBCO), and Y. Rock inhibitor such as -27632.
  • the culture medium of the present invention preferably does not contain other additives that promote proliferation or differentiation induction other than the above (1) to (5).
  • Such other additives include, but are not limited to, Wnt or Wnt agonists, Notch or Notch agonists and the like. Whether a molecule or compound has Wnt activity can be determined, for example, by the method of Korinek et al. , ⁇ Science ⁇ 275 ⁇ 1784-1787, 1997, and can be determined by measuring Wnt transcriptional activity. Whether a molecule or compound has Notch activity can be determined, for example, by Hsieh et al. , Mol @ Cell. ⁇ Biol. It can be determined by measuring Notch transcriptional activity using the methods described in $ 16, $ 952-959, 1996.
  • the culture medium of the invention consists essentially of a basal medium, a combination of the following additives, and other components for optimizing the cell culture medium, Or no other additives that promote differentiation induction: Noggin, EGF, FGF-7, FGF-10, SAG.
  • the culture medium of the present invention consists essentially of a basal medium, a combination of the following additives, and other components for optimizing the cell culture medium: Without other additives that promote proliferation or differentiation induction: Noggin, FGF-7, FGF-10, SAG.
  • substantially composed means the same result as “only composed” with respect to the production of regenerated hair follicle primordium having epithelial cell proliferation or hair follicle inducing ability. It means that the content of other additives is acceptable as long as it can be obtained.
  • the present invention relates to a method for growing epithelial cells for use in producing a regenerated hair follicle primordium (hereinafter, also referred to as the method of the present invention).
  • the method of the present invention comprises the step of culturing cells derived from epithelial tissue in the culture medium of the present invention.
  • cells derived from epithelial tissue can typically be prepared from hair follicles, for example, bulge regions (eg, outer root sheath cells of the bulge region), hair matrix, or iPS cells or Hair follicle epithelium derived from ES cells can be used.
  • Epithelial tissues that can be used in the methods of the present invention include mammalian primates (eg, humans, monkeys, etc.), ungulates (eg, pigs, cows, horses, etc.), small mammal rodents (eg, mice, Rat, rabbit, etc.) as well as various animals such as dogs and cats.
  • the epithelial tissue may be collected under the same conditions as those used for collecting the tissue as it is, and may be removed under aseptic conditions and stored in an appropriate storage solution.
  • Preparation of cells derived from epithelial tissue from hair follicles is performed, for example, by first separating hair follicles isolated from surrounding tissues into epithelial tissue and mesenchymal tissue according to the shape. At that time, an enzyme may be used for easy separation. Examples of the enzyme include known enzymes such as dispase, collagenase, and trypsin, and those skilled in the art can appropriately use a preferable enzyme.
  • cells derived from other than hair follicles may be used as cells derived from epithelial tissue.
  • Cells derived from other than follicles include, but are not limited to, epithelial cells of skin or oral mucosa or gingiva, preferably differentiated, e.g., keratinized, such as skin or mucosa, Or immature epithelial progenitor cells that can be differentiated into parakeratotic epithelial cells, such as non-keratinized epithelial cells or stem cells thereof.
  • epithelial cells or primary culture cells thereof are used as epithelial cells is described in JP-A-2008-29756, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • ES cells derived from the inner cell mass of any animal can be used.
  • ES cells derived from human, mouse, rat, dog, cat, rabbit, cow, horse, sheep, goat, pig, or monkey inner cell mass can be used.
  • IPS cells induced Pluripotent Stem cells
  • ES cells somatic cells
  • iPS cells induced Pluripotent Stem cells
  • iPS cells derived from humans, mice, rats, dogs, cats, rabbits, cows, horses, sheep, goats, pigs, or monkeys can be used as the source of iPS cells.
  • somatic cells from which iPS cells can be used in the present invention are not particularly limited, and iPS cells derived from cells derived from any tissue can be used.
  • the method for inducing iPS cells that can be used in the present invention is not particularly limited, and any method can be used as long as iPS cells can be induced from somatic cells. be able to.
  • single celling refers to a process of separating a plurality of cells (typically, tissues or organs) that are bonded or adhered to each other into individual cells.
  • Such a single cell-forming treatment may be performed by a method known to those skilled in the art, and is not limited thereto.
  • the treatment can be performed by enzymatic treatment.
  • the enzymes that can be used for the enzyme treatment and the conditions for using them are known to those skilled in the art. For example, enzymes such as dispase, collagenase, and trypsin can be used.
  • Single celling is preferable from the viewpoint of promoting efficient growth of desired epithelial cells.
  • the cells derived from epithelial tissue are cells derived from bulge region epithelium.
  • Such cells can be prepared by collecting tissue from the bulge region epithelium (for example, the outermost layer of the outer root sheath) and subjecting it to a single cell treatment.
  • the culture of epithelial tissue-derived cells in the culture medium of the present invention can employ conditions generally used for culturing animal cells, for example, in an incubator at a temperature of about 37 ° C. and a 5% CO 2 concentration. Can be applied. In addition, an antibiotic such as streptomycin may be appropriately added.
  • an extracellular matrix known to those skilled in the art may be used as appropriate.
  • Matrigel TM (Corning), Type IV Collagen (Invitrogen), atelocollagen (Koken), Type I Collagen, Type III Collagen and the like are used. can do.
  • the population of epithelial cells grown by the above method is an epithelial cell population having hair follicle inducing ability, and may be used as it is for the production of regenerated hair follicle primordium, or if necessary, Specific epithelial cell populations may be further isolated using negative and positive selection techniques based on surface markers. Negative and positive selection techniques based on surface markers are also known to those of skill in the art, and any antibody-based technique can be used, including, for example, fluorescence activated cell sorting (FACS) and timed bead separation.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • Example 1 Culture method of mouse hair follicle epithelial cells
  • Hair follicles were collected from 7-8 week old C57BL / 6 mice (CLEA Japan) and C57BL / 6 6-TgN (act-EGFP) mice did.
  • skin containing body hair primordia was collected from C57BL / 6 6-TgN (act-EGFP) mice (SLC) having a fetal age of 18.0 to 18.5 days.
  • the regenerated hair follicle primordia produced by the following experimental method were transplanted into 6 to 8 week old Balb / c nu / nu mice (SLC).
  • the separated bulge region epithelial tissue was subjected to an enzyme treatment with 0.05% Trypsin (Invitrogen, Carlsbad, US) for 1 hour in an incubator, and the cells were singulated through a 35 ⁇ m pore cell strainer. Culture of the unified cells was performed using ADVANCED DMEM / F-12 (ThermoFisher) as a basal medium, Matrigel (Corning) as a scaffold material, and B27 supplement (GIBCO), N2 supplement (GIBCO), Rockin as additives.
  • FIG. 1 shows a culture image
  • FIG. 2 shows the results of measurement of the colony formation rate, spheroid size, and multiplication factor on the 5th day of culture. Except for the conditions using the NFFSE medium, smaller colonies were formed.
  • the gel containing the cultured hair follicle epithelial cells subjected to the three-dimensional culture was collected, subjected to Collagenase I (Worthington) digestion, Trypsin (GIBCO) digestion and DNase @ Type I (Worthington) digestion, and suspended in a medium.
  • Collagenase I Worthington
  • GEBCO Trypsin
  • DNase @ Type I Worthington
  • RNARNA extraction from cultured hair follicle epithelial cells was performed using RNeasy Plus Micro Kit (QUIAGEN), and cDNA was synthesized from the obtained RNA using SuperScript VILO Master Mix (Invitrogen).
  • the real-time PCR is performed using the above cDNA as a template, a TaqMan Fast Advanced Master Mix (applied biosystem) and a mixture of Taqman primer for various markers in a Quant Studio 12K Flex (reaction at 95 ° C. 95 ° C. at 95 ° C. at 95 ° C. at 95 ° C. in Quant Studio at 12 ° C.). For 20 seconds at 60 ° C.) (x ⁇ 40 cycles), the expression level of the marker gene was analyzed.
  • FIG. 3 shows the results of analyzing the expression of stem cell markers and differentiation markers of hair follicle epithelial cells cultured using NFFFSE medium, NFFS medium or NFFS + Wnt + Notch medium.
  • the expression of the secondary hair germ marker (Lgr5, P-cadherin) and the hair bulb marker (Lef1) are high, and the sebaceous gland markers (Blimp1, c-myc, PPAR- ⁇ ) in the NFFS + Wnt + Notch medium.
  • Strong induction of epidermal markers (CK1, Loricrin) was observed, and stem cell markers such as CD34 and CD49f were maintained in the NFFSE medium.
  • Regenerated hair follicle primordium was prepared according to the organ primordium method (Japanese Patent No. 59362671). That is, the obtained mouse hair follicle epithelial cells and cultured dermal papilla cells were separately transferred to 1.5 ml microtubes (Eppendorf) coated with silicone grease (Dow Corning Toray), and collected as a precipitate by centrifugation. The supernatant of the culture solution after centrifugation was completely removed using GERoader Tip 0.5-20 ⁇ l (Eppendorf). Next, 30 ml of Cellmatrix type I-A (Nita Gelatin, Osaka, Japan) was dropped on a Petri dish coated with silicone grease to prepare a collagen gel drop.
  • I-A Cellmatrix type I-A
  • a nylon thread having a total length of 5 mm (Matsuda Medical Industries) is inserted into the structure of the cell aggregate (particularly between the epithelial cells and mesenchymal cells).
  • the contact surface between the cell fraction of the cultured dermal papilla cells and the epithelial cell fraction is inserted without any damage under a stereoscopic microscope without breaking the contact surface) and then allowed to stand at 37 ° C. for 5 minutes.
  • the gel follicle primordium having a guide was prepared by solidifying the gel drop to further strengthen the bond between epithelial cells and mesenchymal cells.
  • the hair follicle primordium after 8 to 16 hours of culture was transplanted intradermally into mice according to conventional methods. That is, a nude mouse was anesthetized according to a standard method, and after disinfecting the back with isodine, the nude mouse was placed in a natural lying position. Puncture was performed using a V-Lance micro scalpel (Alcon, Japan) to form a graft wound from the skin epidermis layer to the lower layer of the dermis layer. The implant was set to a depth of about 400 ⁇ m in the vertical direction from the body surface, and about 1 mm in the horizontal direction. The regenerated hair follicle primordium into which the nylon thread guide was inserted was sharpened with sharp tweezers No.
  • Example 2 Culture of human follicle-derived hair follicle epithelial cells 1) Recovery of hair follicle bulge epithelial cells from human scalp tissue The extracted human scalp tissue was treated with povidone-iodine (Meiji Seika Pharma Co., Ltd.), PBS (Nacalai Tesque), Washing was performed in the order of a tissue recovery solution (10% bovine serum, 50 ⁇ g / mL gentamicin, DMEM containing 1% HEPES). Using a scalpel, the hair follicles were cut into strips so as to be arranged in a line, and then each fragment was further divided vertically at the interface between the dermis layer and the subcutaneous fat layer.
  • the dermis layer (upper tissue) containing bulge epithelial cells was collected in a culture dish, and the upper tissue was minced to include a single pore.
  • a mixture of 1000 U / mL Dispase (Wako Pure Chemical Industries) and collagenase (Worthington) was added to the single hair follicle-formed tissue, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 10 to 20 minutes. After washing with 2 mL of the tissue recovery solution, 2 mL of the tissue recovery solution and 1 ⁇ L of DNase I (Worthington) were added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1-2 minutes.
  • the hair follicle was pulled out using forceps, and the lower part cut at the lower part of the sebaceous gland was collected in a centrifuge tube. The lower part was washed twice with PBS by centrifugation. 100 ⁇ L of 2.5% trypsin (SAFC Bioscience) and 4.9 mL of PBS were mixed and added. After incubation at 37 ° C. for 15 minutes, 5 mL of a tissue recovery solution and 5 ⁇ L of DNaseI were added and mixed gently. The obtained cell suspension was passed through a cell strainer having a diameter of 40 ⁇ m, and 2 mL of a tissue recovery solution was added twice from above the strainer. The cell suspension was centrifuged at 590 g at 4 ° C.
  • the cell suspension was dispensed into a 1.5 mL Eppendorf tube so that the cell suspension became 6 ⁇ 10 4 cells / tube.
  • the tube was centrifuged at 310 g at 4 ° C. for 3 minutes to remove the supernatant, and 600 ⁇ L / tube of a 1% atelocollagen solution (Koken) was added and mixed. After removing air bubbles by centrifugation, the cell suspension was seeded in a 6-well plate at 90 ⁇ L / well.
  • human NF FSE medium having the following composition or NFFS medium without EGF from the NFFSE medium was added at 3 mL / well, and culture was started in the CO 2 incubator: ADVANCED DMEM / F-12 (ThermoFisher), 1M HEPES, Glutamax (Thermo Fisher Scientific), N2 supplement (Thermo Fisher Scientific), B27 supplementary Chemicals (10%), B27 supplementary (30%). ), 100 ⁇ g / mL FGF-7 (Millipore), 100 ⁇ g / mL FGF-10 (sum Junyaku), 20ng / mL EGF (Peprotech) and 500 ⁇ g / mL SAG (Millipore).
  • a 0.125% trypsin / 10 ⁇ g / mL DNase I solution was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 15 minutes.
  • 10 mL of a medium for human epithelial cells was added, and the mixture was centrifuged at 590 g at 4 ° C. for 3 minutes, and the supernatant was removed.
  • the cells were loosened by tapping, and a medium for human epithelial cells containing 5 ⁇ L DNase I was added.
  • the obtained cell suspension was passed through a cell strainer having a diameter of 40 ⁇ m, and centrifuged at 590 g at 4 ° C. for 3 minutes.
  • a medium for human epithelial cells was added to obtain a cell suspension.
  • the cell suspension was dispensed into a 1.5 mL Eppendorf tube so that the cell suspension became 6 ⁇ 10 4 cells / tube.
  • the tube was centrifuged at 310 g for 3 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant, and 600 ⁇ L / tube of a 1% atelocollagen solution was added and mixed. After removing air bubbles by centrifugation, the cell suspension was seeded in a 6-well plate at 90 ⁇ L / well.
  • FIG. 5 shows the culture images on the 10th and 20th days of culture and the number of cells obtained per hair follicle.
  • the results are shown in FIG.
  • the cultured hair follicle epithelial cells were confirmed to be a cell population containing CD34 + CD49f + (FIG. 6).
  • organ inducing ability of human hair follicle epithelial cells In order to evaluate the organ inducing ability of cultured human hair follicle epithelial cells, mouse fetal skin mesenchymal tissue known to have organ inducing ability was used. The regenerated hair follicle primordium was reconstituted by the organ primordium method, and analyzed using the developmental potential by in vitro culture as an index.
  • Skin mesenchymal cells were prepared from mouse embryos according to the conventional method. That is, dorsal skin was collected from EGFP mouse fetuses having a fetal age of 18.0 to 18.5 days, and a method reported by Nakao et al. (Nakao K et al., Nat. Methods, 4 (3), 227-30, 2007) ) Was partially modified, and dispase treatment was performed for 1 hour at 4 ° C. under shaking conditions of 55 rpm to separate the epithelial layer and the dermal layer. The dermis layer was further treated twice with 100 units / ml of collagenase I (Worthington) at 37 ° C.
  • mouse fetal skin mesenchymal cells obtained human hair follicle epithelial cells and mouse fetal skin mesenchymal cells are separately transferred to 1.5 ml microtubes (Eppendorf) coated with silicone grease, collected as a precipitate by centrifugation, and cultured after centrifugation. The supernatant of the liquid was completely removed using 0.5 to 20 ⁇ l of GELoader Tip (Eppendorf).
  • Cellmatrix type IA (Nita gelatin, Osaka, Japan) was dropped on a Petri dish coated with silicone grease to prepare a collagen gel drop, and the cultured dermal papilla cells prepared as described above were treated with 0.1% of the above.
  • a -10 ⁇ l pipette tip (Quality Scientific plastics)
  • about 0.2 ⁇ l was injected to prepare a cell aggregate.
  • the epithelial cells prepared as described above were put in 0.2 ⁇ l using a 0.1-10 ⁇ l pipette tip (Quality Scientific plastics) so as to be in intimate contact with the aggregate of cultured dermal papilla cells.
  • the mixture was injected to a certain degree to produce a cell aggregate. Further, from the epithelial cell side of the cell aggregate of cultured hair papilla cells and epithelial cells, a nylon thread having a total length of 5 mm (Matsuda Medical Industries) is inserted into the structure of the cell aggregate (particularly between the epithelial cells and mesenchymal cells). A 6-well plate containing 1 ml of DMEM 10% FBS was added after confirming under a stereoscopic microscope that the contact surface between the cultured dermal papilla cell fraction and the epithelial cell fraction penetrated vertically without breaking the contact surface).
  • the collagen gel was transferred onto a 0.4 ml pore size Cell Culture Insert (Becton Dickinson) set in (Becton Dickinson) and the organ culture was performed for 7 days in a 37 ° C.-5% CO 2 incubator, and the regenerated hair follicles A primordium was prepared.
  • the regenerated hair follicle after culturing was removed from the gel, fixed with 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin using a tissue processor (Leica, ASP300S) and an embedding apparatus (Sakura, Tissue-Tek @ TEC), and then microtome.
  • a tissue processor Leica, ASP300S
  • an embedding apparatus Sakura, Tissue-Tek @ TEC
  • microtome was used to prepare a 5 ⁇ m section, and immunostaining was performed using an anti-human mitochondrial antibody (Millipore).
  • the stained sections were analyzed using a confocal laser microscope LSM-780 (Carl-Zeiss).
  • FIG. 7 shows the results.
  • human-derived cells were arranged so as to surround mouse-derived cells, and hair follicle cells surrounded hair matrix cells, indicating a hair follicle tissue-like structure. From the above results, it is considered that human cultured hair follicle epithelial cells formed hair follicle tissue by epithelial mesenchymal interaction with cells derived from mouse fetal skin mesenchymal tissue. It was shown to be inducible.

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Abstract

【課題】　再生毛包原基の製造に使用することが可能な上皮性細胞を効率よく増殖するための手段を提供すること。 【解決手段】　再生毛包原基の製造に使用することが可能な上皮性細胞を増殖するための培養培地であって、基礎培地と、少なくとも以下の（１）～（３）：（１）少なくとも１種のＢＭＰ阻害剤；（２）少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子；および（３）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）またはＳＨＨアゴニスト、の少なくとも１種とを含む培養培地、および前記培養培地を用いた、前記上皮性細胞を増殖する方法が提供される。

Description

毛包上皮性幹細胞の生体外増殖方法
　本発明は、再生毛包原基の製造に使用することが可能な上皮性細胞を効率よく増殖するための培養培地およびその使用方法に関する。
　毛髪再生医療の実現のためには、毛包原基を再構成するために必要となる毛包誘導能を有する上皮性幹細胞および間葉系幹細胞の取得、ならびにその生体外増殖が必要である。間葉系幹細胞については、毛乳頭より取得可能である毛乳頭細胞が、毛包誘導能を有していることが知られており、生体外での培養により取得可能であることが示されている（非特許文献１）。
　一方、上皮性幹細胞については、腸管上皮組織からのＬｇｒ５陽性幹細胞の培養技術が確立されており、培養後のＬｇｒ５陽性細胞から腸管絨毛を再生可能であることが示されている（非特許文献２）。
　毛包においては、バルジ領域に毛包誘導能を有する幹細胞の存在が示唆されており（非特許文献３）、生体外増殖については、マウス毛包由来細胞の三次元培養によるＣＤ３４陽性ｉｎｔｅｇｒｉｎα６陽性幹細胞の増殖方法の報告（非特許文献４）があるが、その器官再生能は十分に立証されていない。
Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ．１３，９７５－８２，２００７ Ｎａｔｕｒｅ．　４５９，　２６２－５，　２００９ Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．３１６，１４２２－８，２０１０ ＥＭＢＯ　Ｊ．　３６，　１５１－１６４，　２０１７
　現時点で、毛包誘導能を有する上皮性幹細胞を生体外培養により大量増殖できる技術は報告されていない。
　そこで本発明は、再生毛包原基の製造に使用することができる上皮性細胞を効率よく増殖するための手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、特定の添加剤の組み合わせを含む細胞培養培地を用いて上皮組織由来の細胞を培養することによって、再生毛包原基の製造に使用することができる、すなわち、毛包誘導能を有する上皮性細胞の集団を大量に増殖することが可能になることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下の特徴を包含する：
　［１］　再生毛包原基の製造に使用することが可能な上皮性細胞を増殖するための培養培地であって、基礎培地と、少なくとも以下の（１）～（３）：
　（１）少なくとも１種の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤；
　（２）少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子；および
　（３）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）またはＳＨＨアゴニスト、の少なくとも１種
とを含む
培養培地。
　［２］　［１］に記載の培養培地であって、
　前記ＢＭＰ阻害剤は、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、フォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、およびエクトディン（Ｅｃｔｏｄｉｎ）からなる群より選択される、
培養培地。
　［３］　［１］または［２］に記載の培養培地であって、
　少なくとも２種の線維芽細胞増殖因子を含む、
培養培地。
　［４］　［１］～［３］のいずれかに記載の培養培地であって、
　前記線維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９、およびＦＧＦ－１０からなる群より選択される、
培養培地。
　［５］　［１］～［４］のいずれかに記載の培養培地であって、
　前記ＳＨＨアゴニストは、ＳＡＧまたはプルモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎ）より選択される、
培養培地。
　［６］　［１］～［５］のいずれかに記載の培養培地であって、
　（４）少なくとも１種の受容体型チロシンキナーゼリガンド
をさらに含む、
培養培地。
　［７］　［６］に記載の培養培地であって、
　前記受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦα、アンフィレギュリン、およびヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）よりなる群から選択される、
培養培地。
　［８］　［１］～［７］のいずれかに記載の培養培地であって、
　（５）少なくとも１種のＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤
をさらに含む、
培養培地。
　［９］　［８］に記載の培養培地であって、
　前記ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＫＹ０３－Ｉ、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、およびＡ８３－０１からなる群より選択される、
培養培地。
　［１０］　［１］～［９］のいずれかに記載の培養培地であって、
　ＷｎｔもしくはＷｎｔアゴニスト、ＮｏｔｃｈもしくはＮｏｔｃｈアゴニストを含まない、
培養培地。
　［１１］　再生毛包原基の製造に使用するための上皮性細胞を増殖するための方法であって、
　上皮組織由来の細胞を、［１］～［１０］のいずれかに記載の培養培地中で培養する工程を含む、
方法。
　［１２］　［１１］に記載の方法であって、
　前記上皮組織由来の細胞は、採取した上皮組織を単一細胞化処理した細胞である、
方法。
　［１３］　［１１］または［１２］に記載の方法であって、
　前記上皮組織は、毛包バルジ領域の上皮組織である、
方法。
　［１４］　［１１］～［１３］のいずれかに記載の方法によって増殖された上皮性細胞集団。
　上記に挙げた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。
　本発明によれば、再生毛包原基の製造に使用することができる上皮性細胞を効率よく増殖するための培養培地、および前記上皮性細胞を前記培養培地により効率的に増殖する方法が提供される。
図１は、ＮＦＦＳＥ培地、ＮＦＦＳ培地およびＮＦＦＳ＋Ｗｎｔ＋Ｎｏｔｃｈ培地の各培地中で６日間培養したマウス毛包上皮性細胞の培養像を示す。 図２は、ＮＦＦＳＥ培地、ＮＦＦＳ培地およびＮＦＦＳ＋Ｗｎｔ＋Ｎｏｔｃｈ培地の各培地中で５日間培養したマウス毛包上皮性細胞におけるコロニー形成率（Ａ）、増殖倍率（Ｂ）、およびスフェロイドサイズ（Ｃ）の測定結果を示す。 図３は、ＮＦＦＳＥ培地、ＮＦＦＳ培地およびＮＦＦＳ＋Ｗｎｔ＋Ｎｏｔｃｈ培地の各培地中で培養したマウス培養毛包上皮性細胞のマーカー解析結果を示す。 図４は、ＮＦＦＳＥ培地、ＮＦＦＳ培地およびＮＦＦＳ＋Ｗｎｔ＋Ｎｏｔｃｈ培地の各培地中で培養したマウス毛包上皮性細胞より再構成した再生毛包原基の皮内移植法（Ａ）を用いた器官誘導能評価の代表的発毛例（Ｂ）および定量化の結果（Ｃ）を示す。図中、ＧＴはガイド糸、Ｅは上皮性細胞凝集塊、ＤＰは毛乳頭細胞凝集塊をそれぞれ示す。 図５は、ＮＦＦＳ培地中で培養したヒト培養毛包上皮性細胞の培養１０日目および２０日目の培養像と１毛包当たりの取得細胞数を示す。 図６は、ＮＦＦＳＥ培地またはＮＦＦＳ培地中で培養したマウス培養毛包上皮性細胞（培養６日目）およびヒト培養毛包上皮性細胞（培養２０日目）における幹細胞マーカー解析の結果を示す。 図７は、ＮＦＦＳ培地中で培養したヒト培養毛包上皮性細胞の器官誘導能評価の実験方法（Ａ）と組織化学的解析の結果（Ｂ）を示す。
　以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　本発明は、一態様において、再生毛包原基の製造に使用することが可能な上皮性細胞を増殖するための培養培地（以下、本発明の培養培地とも称する。）に関する。
　毛包原基は、毛包の由来となる組織であり、上皮性細胞および間葉系細胞から構成される。毛包原基は胎生期に表皮の一部が肥厚し、対面の間葉系細胞が凝集することにより形成される。
　本発明において、「再生毛包原基」とは、上皮性細胞および間葉系細胞から人工的に誘導または再生された毛包原基を指す。
　本発明において、「再生毛包原基の製造に使用することが可能な」とは、適切な間葉系細胞と共に再生毛包原基の製造に用いられた際に、少なくとも発毛能を有する再生毛包原基を誘導できることを意味する。すなわち、本発明において、上皮組織（例えば毛包）由来の細胞を単に増殖すること、または発毛能を有しない再生毛包原基のみを誘導する上皮性細胞の増殖は意図していない。
　本発明の別の実施形態において、「再生毛包原基の製造に使用することが可能な」は、再生毛包原基の製造に使用される際に、発毛能を有し、かつ、生体への生着率が高い再生毛包原基を製造し得ることを意味する。ここで、「生体への生着率が高い」は、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％を意味し得る。
　本発明の培養培地は、基礎培地と、少なくとも以下の（１）～（３）：
　（１）少なくとも１種の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤；
　（２）少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子；および
　（３）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）またはＳＨＨアゴニスト、の少なくとも１種
とを含むことを特徴とする。
　基本培地は、細胞、特に哺乳動物細胞（例えばヒト）の培養に必須の炭素源、窒素源および無機塩等を含有する培地を指す。本発明の培養培地に使用することができる基本培地として、一般的に、動物細胞の培養に用いられる培地を用いることができ、これに限定されるものではないが、イーグル培地などの最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ－α）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２およびＦ－１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地、ＤＥＦ－ＣＳ培地、ＣｎＴ－ＰＲ培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＭＥＭ培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、またはこれらの混合培地等を挙げることができる。
　本発明の培養培地に使用することができる（１）ＢＭＰ阻害剤は、ＢＭＰ受容体へのＢＭＰ分子の結合を阻止または阻害できるものであれば特に限定されない。ある分子または化合物がＢＭＰ阻害活性を有するか否かは、当業者に公知の方法（Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ.,　ＢＭＣ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ,　８：４１,　２００７.）を用いて、ＢＭＰの転写活性を測定することによって決定することができる。
　本発明の培養培地に使用することができるＢＭＰ阻害剤としては、これに限定されるものではないが、例えばノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、フォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、およびエクトディン（Ｅｃｔｏｄｉｎ）等を挙げることができる。本発明の培養培地において、ＢＭＰ阻害剤は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　本発明の培養培地に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲とすることができる。
　本発明の培養培地に使用することができる（２）線維芽細胞増殖因子としては、これに限定されるものではないが、例えばＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９、およびＦＧＦ－１０等を挙げることができる。本発明の培養培地において、線維芽細胞増殖因子は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。本発明の別の実施形態では、線維芽細胞増殖因子として、少なくとも２種の線維芽細胞増殖因子が組み合わせて使用される。
　本発明の一実施形態では、線維芽細胞増殖因子として、少なくともがＦＧＦ－７が使用される。
　本発明の培養培地に含まれる線維芽細胞増殖因子の濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲とすることができる。
　本発明の培養培地に使用することができる（３）ＳＨＨアゴニストは、ＳＨＨにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものであれば特に制限されない。ある分子または化合物がＳＨＨアゴニスト活性を有するか否かは、例えば特開２００９－２１３４４２号中に示唆されるような方法を用いて決定することができる。
　本発明の培養培地に使用することができるＳＨＨアゴニストとしては、これに限定されるものではないが、例えば、ＳＡＧまたはプルモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎ）等を挙げることができる。
　本発明の培養培地に含まれるＳＨＨまたはＳＨＨアゴニストの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲とすることができる。
　本発明の培養培地は、一実施形態において、（４）少なくとも１種の受容体型チロシンキナーゼリガンドをさらに含む。本発明の培養培地が受容体型チロシンキナーゼリガンドをさらに含むことは、製造される再生毛包原基を生体へ移植した際の生着率を顕著に改善できる点で好ましい。
　本発明の培養培地に使用することができる受容体型チロシンキナーゼリガンドとしては、これに限定されるものではないが、例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦα、アンフィレギュリン、およびヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）を挙げることができる。
　本発明の培養培地に含まれる受容体型チロシンキナーゼリガンドの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲とすることができる。
　本発明の培養培地は、一実施形態において、（５）少なくとも１種のＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤をさらに含む。本発明の培養培地に使用することができるＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤は、ＴＧＦβ受容体とＡＬＫ５との相互作用を阻害できるものであれば特に制限されず、ＴＧＦβ受容体阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤などを含み得る。
　本発明の培養培地に使用することができるＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤としては、これに限定されるものではないが、例えば、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１、ＡＬＫ５　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｄ４４７６、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ５２５３３４、ＳＤ２０８を挙げることができる。
　本発明の培養培地に含まれるＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤の濃度は、０．００１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲とすることができる。
　本発明の培養培地は、上記（１）～（３）、ならびに任意の（４）および（５）の他、細胞培養培地、特に上皮性細胞用の細胞培養培地を最適化するための他の成分を含んでもよい。そのような細胞培養培地を最適化するための他の成分としては、これに限定されるものではないが、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ、Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）などの血清代替物や、Ｙ－２７６３２などのＲｏｃｋ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ等を挙げることができる。
　本発明の培養培地は、好ましくは、上記（１）～（５）以外に、増殖、または分化誘導を促す他の添加剤を含まない。そのような他の添加剤として、これに限定されるものではないが、ＷｎｔもしくはＷｎｔアゴニスト、ＮｏｔｃｈもしくはＮｏｔｃｈアゴニスト等を挙げることができる。ある分子または化合物がＷｎｔ活性を有するか否かは、例えばＫｏｒｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７５　１７８４－１７８７，１９９７に記載される方法を用いて、Ｗｎｔ転写活性を測定することによって決定することができ、ある分子または化合物がＮｏｔｃｈ活性を有するか否かは、例えばＨｓｉｅｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６，　９５２－９５９，１９９６に記載される方法を用いて、Ｎｏｔｃｈ転写活性を測定することによって決定することができる。
　本発明の例示的な実施形態において、本発明の培養培地は、実質的に、基礎培地、以下の添加剤の組み合わせ、および細胞培養培地を最適化するための他の成分から構成され、増殖、または分化誘導を促すその他の添加剤を含まない：ノギン、ＥＧＦ、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－１０、ＳＡＧ。
　本発明の別の例示的な実施形態において、本発明の培養培地は、実質的に、基礎培地、以下の添加剤の組み合わせ、および細胞培養培地を最適化するための他の成分から構成され、増殖、または分化誘導を促すその他の添加剤を含まない：ノギン、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－１０、ＳＡＧ。
　なお、本発明において、「実質的に構成される」は、上皮性細胞の増殖または毛包誘導能を有する再生毛包原基の製造に関して、「のみから構成される」場合と同様の結果が得られる限りにおいて、その他の添加剤の含有が許容されることを意味する。
　本発明は、別の態様において、再生毛包原基の製造に使用するための上皮性細胞を増殖するための方法（以下、本発明の方法とも称する）に関する。
　本発明の方法は、上皮組織由来の細胞を、本発明の培養培地中で培養する工程を含むことを特徴とする。
　本発明において、上皮組織由来の細胞は、典型的には、毛包から調製することができ、例えば、バルジ領域（例えばバルジ領域の外毛根鞘最外層細胞）、毛母基部、またはｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞から誘導した毛包上皮などを用いることができる。
　本発明の方法に使用することができる上皮組織は、哺乳動物の霊長類（例えばヒト、サルなど）、有蹄類（例えばブタ、ウシ、ウマなど）、小型哺乳類のげっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）のほか、イヌ、ネコなど種々の動物などから採取することができる。上皮組織の採取は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。
　毛包からの上皮組織由来の細胞の調製は、例えば、まず周囲の組織から単離された毛包を、形状に従って、上皮組織および間葉組織に分離することによって行われる。その際、分離を容易に行うため酵素を用いてもよい。酵素としては、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン等、公知のものを挙げることができ、当業者は適宜好ましい酵素を使用することができる。
　また、上皮組織由来の細胞として、毛包以外に由来する細胞を使用してもよい。毛包以外に由来する細胞としては、これに限定されるものではないが、皮膚もしくは口腔内の粘膜または歯肉の上皮性細胞、好ましくは、皮膚または粘膜などの、分化した、例えば角化した、または錯角化した上皮性細胞に分化しうる未熟な上皮性前駆細胞、例えば非角化上皮性細胞またはその幹細胞等が挙げられる。具体的に、口腔内上皮性細胞またはその初代培養細胞を上皮性細胞として用いる例が特開２００８－２９７５６号公報に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
　本発明において用いることのできるＥＳ細胞の由来は特に限定されず、あらゆる動物の内部細胞塊由来のＥＳ細胞を用いることができる。例えば、ＥＳ細胞の由来として、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、またはサルの内部細胞塊由来のＥＳ細胞を用いることができる。
　「ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）」とは、一般的に、体細胞へ、例えば数種類の遺伝子および／または薬剤を導入することにより、ＥＳ細胞のように非常に多くの細胞に分化できる分化万能性と、分裂増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能を持たせた細胞をいう。ただし、本発明においては、上記の説明に限定されず、当業者が「ｉＰＳ細胞」であると認識する細胞を広く含む。
　本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の由来は特に限定されず、あらゆる動物由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。例えば、ｉＰＳ細胞の由来として、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、またはサル由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。また、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の由来となる体細胞も特に限定されず、あらゆる組織由来の細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を用いることができる。さらに、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の誘導方法も特に限定されず、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる方法であれば、どのような方法を用いて誘導されたｉＰＳ細胞でも用いることができる。
　上皮組織由来の細胞として、生体から採取した上皮組織由来の細胞を用いる場合には、培養に供する前に、単一細胞化処理を行うことが好ましい。本発明において、「単一細胞化」は、互いに結合または接着した状態にある複数の細胞（典型的には組織または器官）を、個々の細胞に分離する処理を指す。このような単一細胞化の処理は、当業者に公知の方法を用いてよく、これに限定されるものではないが、例えば酵素処理によって行うことができる。当該酵素処理に使用できる酵素およびその使用条件も当業者に公知であり、例えばディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシンなどの酵素を使用することができる。単一細胞化は、所望の上皮性細胞の効率的な増殖を促す観点から好ましい。
　本発明の好ましい実施形態において、上皮組織由来の細胞は、バルジ領域上皮由来の細胞である。このような細胞は、バルジ領域上皮（例えば外毛根鞘最外層）から組織を採取し、単一細胞化処理に供することによって調製することができる。
　本発明の培養培地中での上皮組織由来の細胞の培養は、動物細胞の培養に一般的に用いられる条件を採用することができ、例えば約３７℃の温度、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内での培養を適用することができる。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加してもよい。
　培養には、適宜、当業者に公知の細胞外マトリクスを用いてよく、例えば、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｔｙｐｅ　ＩＶ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アテロコラーゲン（高研）、Ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　Ｃｏｌｌａｇｅｎなどを使用することができる。
　上記の方法によって増殖される上皮性細胞の集団は、毛包誘導能を有する上皮性細胞集団であり、再生毛包原基の製造にそのまま使用してもよいし、または、必要に応じて、表面マーカーに基づくネガティブおよびポジティブ選択技術を用いて、特定の上皮性細胞集団をさらに単離してもよい。表面マーカーに基づくネガティブおよびポジティブ選択技術も、当業者に公知であり、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）および時期ビーズ分離を含む、任意の抗体に基づく技術を用いることができる。
　本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
［実施例１］マウス毛包上皮性細胞の培養方法
１）実験動物
　７－８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア）およびＣ５７ＢＬ／６　６－ＴｇＮ（ａｃｔ－ＥＧＦＰ）マウスより毛包を採取した。また、胎齢１８．０から１８．５日齢のＣ５７ＢＬ／６　６－ＴｇＮ（ａｃｔ－ＥＧＦＰ）マウス（ＳＬＣ）より、体毛原基を含む皮膚を採取した。また、下記実験手法により作製した再生毛包原基は６から８週齢のＢａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウス（ＳＬＣ）に移植した。
２）毛包上皮性細胞の調製
　Ｃ５７ＢＬ／６のＥＧＦＰマウスより摘出した頬髭組織より、２５Ｇ注射針を用いてコラーゲン鞘を取り除き、バルジ領域に細分化した。バルジ領域組織は終濃度４．８Ｕ／ｍｌのＤｉｓｐａｓｅ　ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｓｏｎ）および１００Ｕ／ｍｌのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）溶液にて３７℃で４分間反応させ、その後、２５Ｇ注射針を用いて外科的にバルジ領域上皮組織とバルジ周囲の間葉組織に分離した。分離したバルジ領域上皮組織は０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳ）でインキュベータにて１時間酵素処理を行い、３５μｍ　ｐｏｒｅセルストレーナーを通して単一化細胞とした。
　単一化細胞の培養は、ＡＤＶＡＮＣＥＤ　ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を基礎培地とし、足場材料としてＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用い、添加剤として、Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）、Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）、Ｒｏｃｋ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２、ＷＡＫＯ）、ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＦＧＦ－７（Ｒ＆Ｄ）、ＦＧＦ－１０（Ｒ＆Ｄ）、ＳＨＨ　ａｇｏｎｉｓｔ（ＳＡＧ、ｃａｙｍａｎ）、およびＢＭＰ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎｏｇｇｉｎ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ならびに１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を含む培地（ＮＦＦＳＥ培地）、ＮＦＦＳＥ培地よりＥＧＦを除いた培地（ＮＦＦＳ培地）、ならびにＮＦＦＳ培地にＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ）およびＮｏｔｃｈリガンド（Ｊａｇｇｅｄ２およびＤＬＬ１）（Ｒ＆Ｄ）を添加した培地（ＮＦＦＳ＋Ｗｎｔ＋Ｎｏｔｃｈ培地）に細胞を懸濁後、６ウェルプレート内で三次元培養を行うことにより実施した。培養像を図１に示し、培養５日時点でのコロニー形成率、スフェロイドサイズ、および増殖倍率の測定結果を図２に示す。ＮＦＦＳＥ培地を用いた条件以外では、より小さいコロニーが形成された。
　３次元培養を行った培養毛包上皮性細胞を含むゲルを回収し、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）消化、Ｔｒｙｐｓｉｎ（ＧＩＢＣＯ）消化とＤＮａｓｅ　ＴｙｐｅＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）消化を行い、培地に懸濁後、３５μｍセルストレーナーを通し、マウス培養毛包上皮性細胞とした。
３）マウス毛包由来培養毛包上皮性細胞の分化状態の解析
　毛包上皮性細胞の分化能評価に先立ち、培養後の毛包上皮性細胞の分化状態をリアルタイムＰＣＲ解析により実施した。
　培養毛包上皮性細胞からのＲＮＡ抽出はＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ）を用いて行い、得られたＲＮＡより、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲは、上記のｃＤＮＡをテンプレートとしＴａｑＭａｎＦａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）ならびに各種マーカーに対するＴａｑｍａｎ　ｐｒｉｍｅｒの混合液をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　１２Ｋ　Ｆｌｅｘ（ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）でＰＣＲ反応｛９５℃で２０秒、（９５℃で１秒、６０℃で２０秒）　ｘ　４０サイクル）を行い、マーカー遺伝子の発現量を解析した。
　ＮＦＦＳＥ培地、ＮＦＦＳ培地もしくはＮＦＦＳ＋Ｗｎｔ＋Ｎｏｔｃｈ培地を用いて培養された毛包上皮性細胞の幹細胞マーカーおよび分化マーカーの発現解析結果を図３に示す。ＮＦＦＳ培地で培養された細胞では、二次毛芽マーカー（Ｌｇｒ５、Ｐ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、毛球部マーカー（Ｌｅｆ１）の発現が高く、ＮＦＦＳ＋Ｗｎｔ＋Ｎｏｔｃｈ培地では皮脂腺マーカー（Ｂｌｉｍｐ１、ｃ－ｍｙｃ、ＰＰＡＲ－γ）、表皮マーカー（ＣＫ１、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ）の強い誘導が認められ、ＮＦＦＳＥ培地ではＣＤ３４、ＣＤ４９ｆなどの幹細胞マーカーが維持されていた。
４）マウス毛包上皮性細胞の器官誘導能評価
　培養毛包上皮性細胞の器官誘導能を評価するために器官原基法を用いて再生毛包原基を再構成し、動物移植による発毛能を指標に解析を行った。
　再生毛包原基は器官原基法（特許第５９３２６７１号）に従って作製した。すなわち、取得したマウス毛包上皮性細胞と培養毛乳頭細胞とを、シリコーングリース（東レ・ダウコーニング）を塗布した１．５ｍｌマイクロチューブ（エッペンドルフ）にそれぞれ別々に移し、遠心分離により沈殿として回収し、遠心後の培養液の上清をＧＥＬｏａｄｅｒ　Ｔｉｐ　０．５－２０μｌ（エッペンドルフ）を用いて完全に除去した。次に、シリコーングリースを塗布したペトリディッシュ上にＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ　ｔｙｐｅ　Ｉ－Ａ　（Ｎｉｔｔａ　ｇｅｌａｔｉｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を３０ｍｌ滴下してコラーゲンゲルドロップを作製し、上記にて調製した培養毛乳頭細胞を０．１－１０μｌのピペットチップ（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｐｌａｓｔｉｃｓ）を用いて、０．２μｌ程度注入し細胞凝集塊を作製した。続いて、同ゲルドロップ内へ、上記にて調製した上皮性細胞を０．１－１０μｌのピペットチップ（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｐｌａｓｔｉｃｓ）を用いて、培養毛乳頭細胞の凝集塊に密着させるように０．２μｌ程度注入し細胞凝集塊を作製した。さらに培養毛乳頭細胞と上皮性細胞との細胞凝集塊の上皮性細胞側より、全長５ｍｍのナイロン糸（松田医科工業）を、細胞凝集塊の構造（特に上皮性細胞と間葉系細胞との接触面）を壊さず培養毛乳頭細胞の細胞画分と上皮性細胞画分との接触面を垂直に貫くように実体顕微鏡下で確認のうえで挿入し、その後３７℃にて５分間静置し、ゲルドロップを固化させることにより、上皮性細胞と間葉性細胞の結合をより強固にすることでガイドを有する再生毛包原基を作製した。
　８から１６時間の培養後の毛包原基を、従来法に従いマウスの皮内に移植した。すなわち、ヌードマウスを定法に従って麻酔を行い、背部をイソジン消毒した後に自然横臥位をとらせた。Ｖランスマイクロメス（日本アルコン）を用いて穿刺し、皮膚表皮層から真皮層下層部に至る移植創を形成した。移植創は体表面より垂直方向に約４００μｍの深度までとし、水平方向は約１ｍｍ程度とした。ナイロン糸製ガイドを挿入した再生毛包原基を、移植創の体表側に上皮性細胞成分が向くように、先鋭ピンセットＮｏ．５（夏目製作所）を用いて挿入した。移植創上端部に再生毛包原基の上皮性細胞成分の上端部が露出するよう移植深度を調節し、ナイロン糸製ガイドが体表面に露出するように位置させた。ナイロン糸製ガイドを移植創に近接した皮膚表面にステリストリップ（スリーエム）で固定し、その後、ナースバンおよびサージカルテープ（スリーエム）で移植創を保護した。移植後５から７日で保護テープを除去し、ナイロン糸製ガイドを移植部位に残存させ、１日後に残存している場合は抜去した。移植物の生着を目視または蛍光実体顕微鏡で判定した後に経過観察を行った。経過観察は、麻酔下のマウスの移植部位を目視、蛍光実体顕微鏡、実体顕微鏡による観察・撮影を行い、再生毛包の発毛を評価した。
　その結果、ＮＦＦＳＥ培地ならびにＮＦＦＳ培地で培養した細胞からは発毛が確認されたが、ＮＦＦＳ＋Ｗｎｔ＋Ｎｏｔｃｈ培地で培養した細胞からは発毛が認められず、ＮＦＦＳＥもしくはＮＦＦＳ培地で器官誘導能を有する毛包上皮性細胞の培養が可能であることが示された（図４）。
［実施例２］ヒト毛包由来毛包上皮性細胞の培養
１）ヒト頭皮組織からの毛包バルジ上皮性細胞の回収
　摘出したヒト頭皮組織をポビドンヨード（明治製菓ファルマ）、ＰＢＳ（ナカライテスク）、組織回収液（１０％ウシ血清、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１％　ＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭ）の順番で洗浄した。メスを用いて毛包が１列に並ぶように短冊状に切断後、各断片について更に真皮層と皮下脂肪層の境界面で上下に分断した。バルジ上皮性細胞を含む真皮層（上部組織）を培養皿に回収し、単一毛穴を含むように上部組織を細切した。単毛包化した組織に対して１０００Ｕ／ｍＬ　Ｄｉｓｐａｓｅ（和光純薬）とコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を混合して添加し、３７℃で１０－２０分間インキュベートした。組織回収液２ｍＬで洗浄後、組織回収液２ｍＬとＤＮａｓｅＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）１　μＬを添加し、室温で１－２分静置した。ピンセットを用いて毛包を上方に引き抜き、皮脂腺下部で切断した下方部分を遠心チューブに集めた。下方部分を、遠心操作によりＰＢＳで２回洗浄した。２．５％トリプシン（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１００μＬとＰＢＳ４．９ｍＬを混合して添加し、３７℃で１５分間インキュベート後、組織回収液５ｍＬとＤＮａｓｅＩ　５μＬを添加し、穏やかに混合した。得られた細胞懸濁液を４０μｍ径のセルストレーナーに通し、ストレーナーの上から組織回収液２ｍＬを２回添加した。細胞懸濁液を５９０ｇ、４℃で３分間遠心して上清を除去し、組織回収液を１ｍＬ添加した。細胞濃度を測定後、６×１０４細胞／チューブになるように細胞懸濁液を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに分取した。チューブを３１０ｇ、４℃で３分間遠心して上清を除去し、６００μＬ／チューブの１％アテロコラーゲン溶液（高研）を加え、混合した。遠心により気泡を除去後、細胞懸濁液を６ウェルプレートに９０μＬ／ウェルずつ播種した。インキュベーター内で３０分程度ゲルを固化させた後、以下の組成を有するヒトＮＦＦＳＥ培地あるいはＮＦＦＳＥ培地からＥＧＦを除いたＮＦＦＳ培地を３ｍＬ／ウェルで添加し、ＣＯ２インキュベーターで培養を開始した：ＡＤＶＡＮＣＥＤ　ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍＭ　Ｙ－２７６３２（和光純薬）、２５０μｇ／ｍＬ　Ｎｏｇｇｉｎ（シグマ）、１００μｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１００μｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－１０（和光純薬）、２０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および５００μｇ／ｍＬ　ＳＡＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。
２）ヒト毛包バルジ上皮性細胞の継代
　細胞がコロニー形成しているゲルについて、セルスクレーパーでゲルを培養皿から剥離した。剥離したゲルを５０ｍＬチューブに回収し、ヒト上皮性細胞用培地（前掲）１０ｍＬを添加した。ピペッティングによりゲルを物理的に細断し、コラゲナーゼを添加した。ゲルが完全に溶解するまで３７℃で最長６０分インキュベートした。ＰＢＳを１０ｍＬ添加して５９０ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去することを３回繰り返した。タッピングでペレットをほぐした後、０．１２５％トリプシン／１０μｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅＩ溶液を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。ヒト上皮性細胞用培地を１０ｍＬ添加して５９０ｇ、４℃で３分間遠心し、上清を除去した。タッピングにより細胞をほぐし、５μＬ　ＤＮａｓｅＩ入りのヒト上皮性細胞用培地を添加した。得られた細胞懸濁液を４０μｍ径のセルストレーナーに通し、５９０ｇ、４℃で３分間遠心した。上清を除去後、ヒト上皮性細胞用培地を１ｍＬ添加して細胞懸濁液を得た。細胞濃度を測定後、６×１０４細胞／チューブになるように細胞懸濁液を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに分取した。チューブを３１０ｇ、４℃で３分間遠心して上清を除去し、６００μＬ／チューブの１％アテロコラーゲン溶液を加え、混合した。遠心により気泡を除去後、細胞懸濁液を６ウェルプレートに９０μＬ／ウェルずつ播種した。インキュベーター内で３０分程度ゲルを固化させた後、ヒト上皮性細胞用培地を３ｍＬ／ウェルで添加し、ＣＯ２インキュベーターでさらに培養を行った。培養１０日目および２０日目の培養像と、１毛包あたりの取得細胞数を図５に示す。
３）ヒト毛包由来培養毛包上皮性細胞の分化状態の解析
　ヒト由来培養毛包上皮性細胞の分化状態をフローサイトメトリー解析により評価した。
３－１）細胞内マーカー解析
　培養毛包上皮性細胞（培養２０日目）をＰＢＳ－０．２ｍＭＥＤＴＡ－０．０５％ＢＳＡに懸濁後、５９０ｇ、５分間、４℃で遠心し上清を除去し、細胞を４％ＰＦＡあるいは８０％ＭｅＯＨに再懸濁した。細胞懸濁液は４℃、１０分間インキュベートさせることにより細胞内タンパク質の固定を行った。固定後の細胞はＰＢＳ－０．２ｍＭＥＤＴＡ－０．０５％ＢＳＡで再懸濁したのち、１１００ｇ、５分間、４℃）を行う洗浄操作を２回繰り返したのち、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００に再懸濁し、４℃で１０分間インキュベートさせることにより、透過処理を行った。処理後の細胞は２回洗浄操作を行ったあと、ＰＥ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ３４抗体（ＢＤ）またはｅＦｌｏｕｒ６６０標識抗ヒトＣＤ４９ｆ抗体（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を含むＰＢＳ－０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ－０．０５％ＢＳＡ溶液に再懸濁し、４℃で１５分間インキュベートした。反応後の細胞は２回洗浄操作を行ったあと、フローサイトメーターで解析した。上記と同様の操作を、培養マウス頬髭組織由来細胞についても行った。
　結果を図６に示す。培養毛包上皮性細胞はＣＤ３４陽性ＣＤ４９ｆ陽性を含む細胞集団であることが確認された（図６）。
４）ヒト毛包上皮性細胞の器官誘導能評価
　ヒト培養毛包上皮性細胞の器官誘導能を評価するために、器官誘導能を有することが知られているマウス胎児皮膚間葉組織を用いて器官原基法により、再生毛包原基を再構成し、生体外培養による発生能を指標に解析を行った。
　従来法に従いマウス胎児から皮膚間葉系細胞を調製した。すなわち、胎齢１８．０から１８．５日齢のＥＧＦＰマウス胎児より背部皮膚を採取し、中尾等が報告した方法（Ｎａｋａｏ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　４（３），　２２７－３０，　２００７）を一部改変し、ディスパーゼ処理を１時間、４℃、５５ｒｐｍの震とう条件で行い、上皮層と真皮層を分離した。真皮層をさらに、３７℃で４０分間の１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）処理を２回行い、その後、単一細胞化処理を行い、マウス胎児皮膚間葉系細胞を取得した。取得したヒト毛包上皮性細胞とマウス胎児皮膚間葉系細胞とを、シリコーングリースを塗布した１．５ｍｌマイクロチューブ（エッペンドルフ）にそれぞれ別々に移し、遠心分離により沈殿として回収し、遠心後の培養液の上清をＧＥＬｏａｄｅｒ　Ｔｉｐ　０．５－２０μｌ（エッペンドルフ）を用いて完全に除去した。次に、シリコーングリースを塗布したペトリディッシュ上にＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ　ｔｙｐｅ　Ｉ－Ａ（Ｎｉｔｔａ　ｇｅｌａｔｉｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を３０μｌ滴下してコラーゲンゲルドロップを作製し、上記にて調製した培養毛乳頭細胞を０．１－１０μｌのピペットチップ（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｐｌａｓｔｉｃｓ）を用いて、０．２μｌ程度注入し細胞凝集塊を作製した。続いて、同ゲルドロップ内へ、上記にて調製した上皮性細胞を０．１－１０μｌのピペットチップ（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｐｌａｓｔｉｃｓ）を用いて、培養毛乳頭細胞の凝集塊に密着させるように０．２μｌ程度注入し細胞凝集塊を作製した。さらに培養毛乳頭細胞と上皮性細胞との細胞凝集塊の上皮性細胞側より、全長５ｍｍのナイロン糸（松田医科工業）を、細胞凝集塊の構造（特に上皮性細胞と間葉系細胞との接触面）を壊さず培養毛乳頭細胞の細胞画分と上皮性細胞画分との接触面を垂直に貫くように実体顕微鏡下で確認のうえで挿入し、ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳを１ｍｌ加えた６ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅ（ベクトン・ディッキンソン）にセットした０．４ｍｌ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅのＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔ（ベクトン・ディッキンソン）上にコラーゲンゲルごと移して３７℃－５％ＣＯ２インキュベーター内にて７日間器官培養を行い、再生毛包原基を作製した。
　培養後の再生毛包をゲルから取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、ティッシュプロセッサー（Ｌｅｉｃａ、ＡＳＰ３００Ｓ）と包埋装置（Ｓａｋｕｒａ、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ　ＴＥＣ）を用いてパラフィン包埋を行ったのち、ミクロトームを用いて５μｍ切片を作製し、抗ヒトミトコンドリア抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて免疫染色を行った。染色後の切片は、共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ－７８０（Ｃａｒｌ－Ｚｅｉｓｓ）を用いて解析した。結果を図７に示す。培養７日目には、マウス由来細胞を取り囲むようにヒト由来細胞が配置し、毛乳頭細胞を毛母細胞が取り囲む、毛包組織様構造を示していた。以上の結果から、ヒト培養毛包上皮性細胞は、マウス胎仔皮膚間葉組織由来細胞との上皮間葉相互作用により毛包組織を形成したと考えられ、ヒト培養毛包上皮性細胞は、器官誘導能を有することが示された。

Claims (14)

  1. 　再生毛包原基の製造に使用することが可能な上皮性細胞を増殖するための培養培地であって、基礎培地と、少なくとも以下の（１）～（３）：
    　（１）少なくとも１種の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤；
    　（２）少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子；および
    　（３）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）またはＳＨＨアゴニスト、の少なくとも１種
    とを含む
    培養培地。
  2. 　請求項１に記載の培養培地であって、
    　前記ＢＭＰ阻害剤は、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、フォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、およびエクトディン（Ｅｃｔｏｄｉｎ）からなる群より選択される、
    培養培地。
  3. 　請求項１または２に記載の培養培地であって、
    　少なくとも２種の線維芽細胞増殖因子を含む、
    培養培地。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の培養培地であって、
    　前記線維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９、およびＦＧＦ－１０からなる群より選択される、
    培養培地。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の培養培地であって、
    　前記ＳＨＨアゴニストは、ＳＡＧまたはプルモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎ）より選択される、
    培養培地。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の培養培地であって、
    　（４）少なくとも１種の受容体型チロシンキナーゼリガンド
    をさらに含む、
    培養培地。
  7. 　請求項６に記載の培養培地であって、
    　前記受容体型チロシンキナーゼリガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦα、アンフィレギュリン、およびヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子よりなる群から選択される、
    培養培地。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の培養培地であって、
    　（５）少なくとも１種のＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤
    をさらに含む、
    培養培地。
  9. 　請求項８に記載の培養培地であって、
    　前記ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＫＹ０３－Ｉ、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、およびＡ８３－０１からなる群より選択される、
    培養培地。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の培養培地であって、
    　ＷｎｔもしくはＷｎｔアゴニスト、ＮｏｔｃｈもしくはＮｏｔｃｈアゴニストを含まない、
    培養培地。
  11. 　再生毛包原基の製造に使用するための上皮性細胞を増殖するための方法であって、
    　上皮組織由来の細胞を、請求項１～１０のいずれか１項に記載の培養培地中で培養する工程を含む、
    方法。
  12. 　請求項１１に記載の方法であって、
    　前記上皮組織由来の細胞は、採取した上皮組織を単一細胞化処理した細胞である、
    方法。
  13. 　請求項１１または１２に記載の方法であって、
    　前記上皮組織は、毛包バルジ領域の上皮組織である、
    方法。
  14. 　請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法によって増殖された上皮性細胞集団。
     
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