JP6855377B2 - 改変内皮細胞を含む生体適合性インプラント - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、2014年12月19日に出願された米国仮特許出願第62/094,915号の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に援用される。

参照による援用
参照による援用が許される管轄区域のために、本明細書において引用する各文書の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

発明の背景
生体適合性インプラントは、例えば人体内の損傷組織または欠陥組織の修復または置換を含むさまざまな応用に使用されてきた。一部のそのようなインプラントは、宿主対象の体内に外科的に埋植されたときに対象の細胞の定着が起こって対象の組織と一体化する生体適合性足場材料を含む。酸素および栄養の十分な供給を確保するために、そのようなインプラントは一般に、外科的埋植後に内皮細胞を帯びた状態にならなければならず、そしてその内皮細胞は、対象の既存の脈管構造と接続する機能的血管を形成しなければならない。したがって、そのような埋植された足場に内皮細胞が浸潤して、機能的血管を形成する程度および速度は、そのようなインプラントの最終的な成功の重要な決定要素である。インビトロで−すなわち外科的埋植に先だって−予め形成された血管を含有する三次元的生体適合性足場を生産することができれば、そのようなインプラントがインビボで宿主対象の組織と一体化する速度および効率を著しく増加させることができるであろう。しかし、そのようなインプラントを作成しようとするこれまでの試みは正否相半ばしている。例えばコラーゲンゲルまたはマトリゲル（Matrigel）を使ってインビトロで血管形成を誘発しようとするこれまでのいくつかの試みは、血管発芽も、極性化内皮細胞に取り囲まれた開通した管腔を有する血管の形成も、もたらすことができていない（そのようなこれまでのいくつかの試みに関する議論については、Nakatsu et al. (2003)「Angiogenic sprouting and capillary lumen formation modeled by human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) in fibrin gels: the role of fibroblasts and angiopoietin-1」Microvascular Research, Vol. 66, pp. 102-112を参照されたい）。他の試みでは、細胞外マトリックスコンポーネントでコーティングされたビーズ上で内皮細胞単層を培養した後、そのビーズをフィブリンゲルに包埋することが行われた。そのような方法は、それらのゲルの上で皮膚線維芽細胞を成長させた場合にのみ、開通した管腔を持つ血管の形成をもたらすことがわかった。そのような線維芽細胞共培養がない場合、内皮細胞は、最初は短くて細いひも状の構造を形成するが、それはその後、血管を形成することなく崩壊することがわかった。Nakatsu et al. (2003)参照。これらの知見と一致して、内皮細胞管腔形成には線維芽細胞が必要であると報告されている。Newman et al. (2011)「The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation」Molecular Biology of the Cell, Vol. 22, pp. 3791-3800参照。

発明の概要
本発明は、一部には、アデノウイルスE4ORF1タンパク質を発現する改変内皮細胞が、インビトロで、開通した管腔を有する血管を三次元的生体適合性足場の内部に形成することができるという驚くべき発見に基づいている。E4ORF1+内皮細胞が、そのような細胞と液状マトリゲルとのマウス側腹部への同時注入後に、インビボにおいて、マトリゲルプラグ内で新生血管を形成できること、およびE4ORF1+内皮細胞がマトリゲル被覆培養プレート上で新血管原性のチューブを形成できることは、以前に示されたものの（米国特許第8,465,732号参照）、本出願人の知る限り、三次元的足場内で開いた管腔を有する本物の血管を形成するそのような細胞の能力は、今まで立証されたことがなかった。本明細書に記載するとおり、驚いたことに、真のE4ORF1+血管は、インビトロで、ほんの数日の期間内に、線維芽細胞などの他の細胞タイプの非存在下でさえ、三次元的生体適合性足場材料内で、開いた管腔を有する管を形成できること、そしてその管含有インプラントは、最大6週間という長期間にわたって、インビトロで培養し、維持できることが、ここに見いだされた。興味深いことに、これらのインプラント中の血管は生体適合性足場の境界を越えて伸びることで、足場材料を取り囲む培養培地中に自由に浮かんでいるように見える突き出した血管を作出しうることもわかった。これらの発見を踏まえて、本発明は、対象への外科的埋植に適した一定の新しい改良されたインプラント、ならびにそのようなインプラントの作製および使用方法を提供する。

したがって、一実施形態において、本発明は、（a）生体適合性足場材料と（b）生体適合性足場材料内に配置された血管とを含み、前記血管がE4ORF1+改変内皮細胞を含む、対象への外科的埋植に適したインプラントを提供する。

別の一実施形態において、本発明は、対象への外科的埋植に適したインプラントを調製する方法であって、生体適合性足場材料と接触している改変E4ORF1+内皮細胞の集団を、生体適合性足場材料内に血管が形成されるまでインビトロで培養することによって、E4ORF1+血管を含むインプラントを形成させることを含む方法を提供する。

本発明のインプラントおよび方法に使用される生体適合性足場材料は、典型的には、三次元構造を有し、その三次元構造内に管が配置されうるようになっている。一部のそのような実施形態において、本発明のインプラントは、接続された血管のネットワークを含有し、これは毛細管を含みうる。一部のそのような実施形態において、血管は開いた/開通した管腔を有する。一部のそのような実施形態では、血管のうちの1つ以上が、生体適合性足場材料の境界を越えて突き出しうる。

一部の実施形態では、本発明のインプラントおよび方法において使用されるE4ORF1+改変内皮細胞が、ETV2ポリペプチドも発現する（すなわち、それらはE4ORF1+ETV2+内皮細胞である）。別のそのような実施形態では、E4ORF1+改変内皮細胞が組換えETSファミリー転写因子も発現する（すなわち、それらはE4ORF1+ETS+である）。

一部の実施形態において、改変E4ORF1+内皮細胞は、胎児細胞もしくは出生後細胞、または成人細胞でありうる。一部の実施形態では、本発明のインプラントおよび方法において使用される改変E4ORF1+内皮細胞が、哺乳動物内皮細胞である。一部の実施形態において、改変E4ORF1+内皮細胞はヒト内皮細胞である。一部の実施形態において、改変E4ORF1+内皮細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）に由来する。

一部の実施形態では、本発明のインプラントおよび方法において使用される改変E4ORF1+内皮細胞が、器官特異的内皮細胞である。例えば一部の実施形態において、改変内皮細胞は、造血系特異的内皮細胞、または神経系特異的内皮細胞、または心臓特異的内皮細胞、または肺特異的内皮細胞、または肝臓特異的内皮細胞、または腎臓特異的内皮細胞、または筋特異的内皮細胞、または軟骨特異的内皮細胞、または腱特異的内皮細胞、または脂肪組織特異的内皮細胞でありうる。一部のそのような実施形態では、使用される器官特異的内皮細胞が、インプラントが設置される器官または組織に由来する。

一部の実施形態では、本発明のインプラントおよび方法において使用される改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象の内皮細胞に由来する。すなわち、それらは自家内皮細胞である。別の実施形態では、改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象と同じ種のドナーの内皮細胞に由来する。すなわち、それらは同種異系内皮細胞である。一部のそのような実施形態において、同種異系ドナーは、インプラントの外科的埋植が行われる対象と組織適合（または部分適合）している。例えば一部の実施形態において、ドナーは、インプラントの外科的埋植が行われる対象と同じMHC型（またはHLA型）を有する。他の一部の実施形態において、ドナーは、インプラントの外科的埋植が行われる対象のものと部分的に適合するMHC型（またはHLA型）を有する。さらに別の実施形態において、ドナーは、インプラントの外科的埋植が行われる対象のものとは異なるMHC型（またはHLA型）を有する。

一部の実施形態では、本発明のインプラントおよび方法において使用される生体適合性足場材料が、改変内皮細胞に加えて、1つ以上の追加細胞タイプを含有する。一部のそのような実施形態において、追加細胞タイプは遺伝子修飾細胞でありうる。別のそのような実施形態において、追加細胞タイプはナイーブ（すなわち遺伝子修飾されていないもの）でありうる。一部のそのような実施形態において、追加細胞タイプは、胎児細胞もしくは出生後細胞、または成人細胞でありうる。一部の実施形態において、そのような追加細胞タイプは幹細胞または前駆細胞でありうる。別の実施形態において、そのような追加細胞タイプは分化細胞でありうる。一部の実施形態において、そのような幹細胞または前駆細胞は、造血幹細胞、骨幹細胞、筋幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、間葉系幹細胞、腸幹細胞、または精原幹細胞でありうる。一部の実施形態において、分化細胞は、分化した造血細胞、骨細胞、筋細胞、神経系細胞、周皮細胞、毛包細胞、脂肪細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、腸細胞、または精巣細胞でありうる。

一部の実施形態では、本発明のインプラントおよび方法において使用される生体適合性足場材料が、インプラント内で、4℃において固形である。一部の実施形態において、生体適合性足場材料は21℃において固形である。一部の実施形態において、生体適合性足場材料は、コラーゲンまたはフィブリンなどの1つ以上の細胞外マトリックス分子を含む。一部の実施形態において、インプラント内の生体適合性足場材料は、脱細胞化ブタ組織などの脱細胞化動物組織を含む。一部の実施形態において、インプラント内の生体適合性足場材料はマトリゲルではない。一部の実施形態において、インプラント内の生体適合性足場材料はヒアルロン酸を含まない。

一部の実施形態において、本発明のインプラントは血清を含まない。一部の実施形態において、本発明のインプラントは外因性成長因子を含まない。一部の実施形態において、本発明のインプラントは外因性血管新生因子を含まない。一部の実施形態において、本発明のインプラントは外因性VEGFを含まない。一部の実施形態において、本発明のインプラントは外因性FGFを含まない。

一部の実施形態において、本発明のインプラントは線維芽細胞を含まない。一部の実施形態において、本発明のインプラントは線維芽細胞由来の血管新生因子を含まない。一部の実施形態において、本発明のインプラントは線維芽細胞由来の細胞外マトリックスコンポーネントを含まない。

一部の実施形態において、本発明のインプラントはマイクロキャリアビーズを含まない。一部の実施形態において、本発明のインプラントは、細胞外マトリックス分子でコーティングされたマイクロキャリアビーズを含まない。

一部の実施形態において、本発明は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、本明細書に記載のインプラントを対象に埋植することを含む方法を提供する。一部のそのような方法において、対象は組織欠陥を有し、インプラントは対象の組織欠陥の部位に外科的に埋植される。一部のそのような方法において、改変E4ORF1+内皮細胞は器官特異的内皮細胞であり、インプラントはその器官特異的内皮細胞が由来する器官に外科的に埋植される。一部のそのような方法において、対象は哺乳動物対象である。一部のそのような方法において、対象はヒト対象である。一部のそのような方法において、改変E4ORF1+内皮細胞は対象自身の内皮細胞に由来する。すなわち、それらは自家内皮細胞である。別のそのような方法において、インプラント中の改変E4ORF1+内皮細胞は、同種異系ドナーの内皮細胞、例えば対象と同じMHC型またはHLA型を有する同種異系ドナー、または対象のMHC型もしくはHLA型に対して部分的適合を有する同種異系ドナーの内皮細胞に由来する。

本発明のこれらの実施形態および他の実施形態を、本明細書の附属実施例、特許請求の範囲、および図面セクションにおいて、さらに説明する。加えて、本明細書に記載する実施形態の一定の変更態様および組合せが本発明の範囲に包含されること、そして過度の試行錯誤なしに実行されうることは、当業者には明白になるであろう。

図１Ａおよび１Ｂ。実施例1で述べるようにE4ORF1および緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する改変内皮細胞を播種して、インビトロで維持した、インプラントの蛍光顕微鏡像。各像の下部にある白いバーは400ミクロンを表す。内皮細胞におけるGFP発現による緑色蛍光は、これらの白黒画像では白色に見えている。図1Aと図1Bのどちらにも開いた管腔を持つ血管構造を見ることができる。図1Bでは、血管が足場材料の境界を越えて突き出しているのがわかる。

図２Ａおよび２Ｂ。外科的埋植の48時間後にマウスの腹部から取り出した後の2つのインプラントの写真。図2Aの「試験」インプラントは、実施例1および2で述べるように、外科的埋植前に、E4ORF1+改変内皮細胞が播種され、培養下で維持されていた。図2Aの丸で囲んだ領域には、インプラント内の脈管化および血液を見ることができる。図2Bの「対照」インプラントは、外科的埋植前に内皮細胞が播種されておらず、こちらは検出可能な脈管化も血流も示さなかった。

図３。外科的埋植の4週間後にマウスの腹部から取り出した後の2つのインプラントの写真。右側に示す「試験」インプラントは、実施例で述べるように、外科的埋植前に、E4ORF1+改変内皮細胞が播種され、培養下で維持されていた。右側の「試験」インプラントには、この白黒画像ではインプラント縁部に暗い/黒い領域のように見える著しい脈管化および血液内容物を見ることができる。左側の「対照」インプラントは、埋植前に内皮細胞が播種されていなかった。

図４Ａ〜Ｄ。マウスの腹部に外科的に埋植されて埋植の2週間後に取り出されたインプラントの組織学的検査用切片の顕微鏡写真。図4Aおよび図4Bの「試験」インプラントには、実施例で述べるように、E4ORF1+改変内皮細胞が播種されていた。図4Cおよび図4Dの「対照」インプラントは、埋植前に内皮細胞が播種されていなかった。図4Aおよび図4Bの「試験」インプラントは、図4Cおよび図4Dのインプラントと比較して増加した細胞充実性を呈した。

詳細な説明
この特許情報開示の「発明の概要」、「図面」、「図面の簡単な説明」、「実施例」および「特許請求の範囲」セクションには、本発明の主要実施形態の一部を記載する。この「詳細な説明」セクションは、本発明の組成物および方法に関する一定の追加説明を提供するものであり、この特許情報開示の他のすべてのセクションと併せて読まれることが意図されている。さらにまた、当業者には明白になるであろうが、この特許情報開示の全体を通して記載するさまざまな実施形態は、多種多様に組み合わせることができ、またそのように意図されている。本明細書に記載する具体的実施形態のそのような組み合わせは本発明の範囲に包含されるものとする。

以下に一定の定義を掲載する。他の用語は、この特許情報開示のどこか他の箇所で定義されるか、それらが使用される文脈から明らかな意味を有するか、当技術分野におけるそれぞれの通常の意味にしたがって使用される。

定義
本明細書において使用する用語「約」および「およそ」は、数値に関連して使用される場合には、言明した値の±20％以内を意味する。

本明細書において使用する用語「培養」は、さまざまな種類の培地上または培地中での細胞の増殖を指す。「共培養」は、さまざまな種類の培地上または培地中での2つ以上の相異なるタイプの細胞の増殖を指し、例えば一部の実施形態では、内皮細胞と幹細胞または前駆細胞とが共培養されうる。

本明細書において使用する用語「有効量」は、本明細書に記載するアウトカムの1つ以上に対して、検出可能な効果を達成するのに十分な、本明細書に記載する指定された作用物質または細胞集団（例えばE4ORF1ポリペプチド、E4ORF1ポリペプチドをコードする核酸分子、またはE4ORF1+改変内皮細胞の集団）の量を指す。例えば内皮細胞におけるE4ORF1の発現の場合であれば、内皮細胞に導入/送達される（例えばベクター中の）核酸分子の有効量は、任意の適切な対照（例えばE4ORF1^-内皮細胞）のそれと比較して、内皮細胞の生存または増殖に検出可能な増加をもたらす量でありうる。E4ORF1をコードする核酸分子の導入の場合であれば、（例えばベクター中の）核酸分子の有効量は、任意の適切な対照（例えばE4ORF1^-内皮細胞）のそれと比較して、内皮細胞の生存または増殖に検出可能な増加をもたらす量でありうる。対象へのE4ORF1⁺内皮細胞の投与を伴う方法の場合であれば、有効量は、任意の適切な対照（例えばE4ORF1^-内皮細胞）のそれと比較して、1つ以上の望ましい生物学的指標または治療的指標の検出可能な改善（例えば内皮/脈管再生の改善、血管新生の改善、インプラントの生存または生着の改善など）をもたらす量でありうる。どの個別例においても、適当な「有効量」は、例えば用量増加試験などの、当技術分野において知られる標準的技法を使って経験的に決定することができ、予定の用途、予定の送達/投与様式、所望の送達/投与頻度などといった因子を考慮して決定することができる。さらにまた、インプラントにおける血管の形成を評価するために、および/またはインビボでの組織へのインプラントの一体化を評価するために、例えばこの特許情報開示の実施例セクションに記載するようなアッセイを使って、「有効量」を決定することもできる。

「改変」という用語は、本明細書において細胞に関連して使用される場合、具陳した表現型（例えばE4ORF1⁺またはETV2⁺または組換えETS転写因子の発現）をもたらすために、または具陳した核酸分子またはポリペプチドを発現させるために、人間によって改変された細胞を指す。「改変細胞」という用語は、自然に存在する細胞を包含することは意図しておらず、その代わりに、例えば組換え核酸分子を含む細胞、あるいは他の形で、例えば本来であればその細胞が発現しないポリペプチドを発現するように、またはあるポリペプチドを非改変内皮細胞に観察されるレベルより有意に高いレベルで発現するように、人工的に（例えば以下に定義する遺伝子修飾によって）変更が加えられた細胞を包含することを意図している。

「遺伝子修飾」または「遺伝子修飾型」または「遺伝子修飾された」とは、細胞の正常なヌクレオチド配列の、または細胞の正常なヌクレオチド配列に対する、任意の付加、欠失または破壊を指す。例えば一部の実施形態において、記載の内皮細胞は、それがアデノウイルスE4ORF1ポリペプチドをコードする核酸分子および/または本明細書に記載する他の具体的ポリペプチド（例えばETV2ポリペプチドなどのETS転写因子ポリペプチド）のいずれかをコードする核酸分子を含有するように、遺伝子修飾されている。同様に、一部の実施形態において、本明細書に記載する内皮細胞または本明細書に記載する他の細胞タイプのいずれか（幹細胞もしくは前駆細胞、または神経系細胞、筋細胞、周皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、単球、好中球、リンパ球、T細胞、B細胞、または毛包幹細胞など）も、所望どおりに、1つ以上の他の遺伝子修飾を含みうる。「遺伝子修飾」という用語は、遺伝子送達媒体の使用を包含し、形質導入（ウイルスが媒介するインビボまたはインビトロでのレシピエントへの核酸の導入）、トランスフェクション（単離された核酸の細胞による取り込み）、リポソーム媒介導入、および当技術分野において周知の他の手段を含むが、それらに限定されるわけではない。

「ナイーブ」または「野生型」という用語は、本明細書において細胞に関連して使用される場合、遺伝子修飾（この用語は上に定義されている）されていない細胞または「改変」細胞（この用語は上に定義されている）ではない細胞を指す。例えば、対象から得られた、そして人間によって遺伝子修飾されていない、内皮細胞または他の細胞タイプは、「ナイーブ」細胞または「野生型」細胞と見なされる。

本明細書において使用する語句「単離されたインプラント」は、対象の体内にあるのではなく、エクスビボ／インビトロにある、インプラントを指す。例えば、培養培地中のインビトロのインプラントは、「単離されたインプラント」と見なされる。典型的には、「単離された」インプラントは、インビボではなくインビトロで作出されたものであり、埋植もインビボでのインキュベーションもまだなされていないものである。したがって、典型的には、単離されたインプラントとは、インビトロで作出されたインプラントであって、外科的埋植に適しているが、対象への外科的埋植はまだ行われていないインプラントを指す。「インプラント」に言及する本発明の実施形態はすべて、典型的には、「単離されたインプラント」を伴う。

本明細書において使用する用語「組換え」は、分子生物学および遺伝子工学の方法（分子クローニングなど）を使って人間によって（機械によるものを含む）作成される、そして本来は自然界に存在しないであろうヌクレオチド配列を含む、核酸分子を指す。したがって組換え核酸分子は、自然界に存在する核酸分子、例えばある生物のゲノム中に存在する核酸分子とは区別されるべきである。したがって、介在するイントロン配列（例えば対応するゲノムDNA配列中に見いだされるであろうもの）を何も含まない、mRNA配列の相補的DNAコピー（すなわち「cDNA」コピー）を含む核酸分子は、組換え核酸分子と見なされるであろう。例えば、組換えE4ORF1核酸分子は、自然に存在するアデノウイルスゲノムにおいて当該コード配列に通常は付随していないプロモーターおよび/または他の遺伝要素に作動的に連結されたE4ORF1コード配列を含むかもしれない。同様に、組換えETV2核酸分子は、ETV2 cDNA配列（すなわち自然界では生物のゲノム中に存在しない配列）を含むかもしれないし、そして/または生物のゲノムにおいて当該コード配列に通常は付随していないプロモーターおよび/または他の遺伝要素に作動的に連結されたETV2コード配列を含んでもよい。

「対象」および「患者」という用語は本明細書では可換的に使用され、表示がある場合を除き、ヒトおよび非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタ、および他の哺乳動物種を指す。

細胞集団に関連して本明細書において使用する「実質的に純粋」という語句は、細胞集団全体を構成する細胞のうちの少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約75〜80％、より好ましくは少なくとも約85〜90％、最も好ましくは少なくとも約95％が、指定された一タイプ（例えば1つ以上の指定された細胞マーカーの発現、形態学的特徴、または機能的特徴によって決定されるもの）、または2つ以上の異なる細胞タイプを一緒に使用する実施形態では指定された（複数の）タイプである、細胞の集団を指す。したがって「実質的に純粋な細胞集団」とは、指定された1タイプまたは複数タイプではない細胞の含有率が約50％未満、好ましくは約20〜25％未満、より好ましくは約10〜15％未満、最も好ましくは約5％未満である細胞の集団を指す。

核酸分子およびポリペプチド
アデノウイルス初期4（E4）領域は少なくとも6つのオープンリーディングフレーム（E4ORF）を含有している。E4領域全体は、血管新生を調節し、内皮細胞の生存を促進することが、以前に示されている（Zhang et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(12):11760-66参照）。E4領域全体の中で、内皮細胞におけるこれらの生物学的効果を担っているのがE4ORF1配列であることも、以前に示されている。米国特許第8,465,732号参照。Seandel et al. (2008)「Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene」PNAS, 105(49):19288-93も参照されたい。本明細書に記載する本発明の実施形態のうちのいくつかは、E4ORF1+である改変内皮細胞、すなわちE4ORF1ポリペプチドを発現する改変内皮細胞を伴う。同様に、本明細書に記載する本発明の実施形態のうちのいくつかは、ETV2+またはETS+である改変内皮細胞を伴う。そのような細胞は、それぞれETV2ポリペプチドまたはETSファミリー転写因子ポリペプチドを含有し、発現する。これらのポリペプチド（E4ORF1、ETV2、ETS）のすべてを本明細書ではまとめて「本発明のポリペプチド」という。

「本発明のポリペプチド」は核酸分子によってコードされる。したがって一部の実施形態において、本発明は、アデノウイルスE4ORF1ポリペプチドをコードする核酸分子、ETS転写因子ポリペプチドをコードする核酸分子、および/またはETV2転写因子ポリペプチドをコードする核酸分子を伴う。そのような核酸分子を本明細書ではまとめて「本発明の核酸分子」という。

本発明のポリペプチドおよび本発明の核酸分子は、本明細書において指定するまたは当技術分野において知られるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有するか、そのようなアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の変異体（variant）、誘導体、突然変異体（mutant）、またはフラグメントであるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有しうる。ただし、そのような変異体、誘導体、突然変異体、またはフラグメントは、本明細書に記載する機能的特性のうちの1つ以上、または本明細書に記載する用途に要求される特性のうちの1つ以上を有するか、本明細書に記載する特性または用途（これには、インビトロで内皮細胞の生存を促進する能力、およびインビトロでインプラント内に血管を形成する内皮細胞の能力が含まれるが、それらに限定されるわけではない）のうちの1つ以上を妨害または阻止しないものとし、またはそのような要件を満たすポリペプチドをコードするものとする。

ETV2ポリペプチドなどのETS転写因子ポリペプチドを伴う実施形態において、本ポリペプチドは、任意の哺乳動物ETS転写因子ポリペプチド、例えばヒト、非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、またはブタのポリペプチドでありうる。一部の好ましい実施形態において、本ポリペプチドはヒトポリペプチドでありうる。そのようなポリペプチドのアミノ酸配列、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸配列は、当技術分野において周知であり、Genbankデータベースなどの公的に利用可能な周知のデータベースにおいて入手することができる。

アデノウイルスE4ORF1ポリペプチドを伴う実施形態において、使用されるポリペプチド配列は、ヒトアデノウイルスタイプ2、3、5、7、9、11、12、14、34、35、46、50、または52など、任意の適切なアデノウイルスタイプまたはアデノウイルス株に由来しうる。一部の好ましい実施形態において、使用されるポリペプチド配列はヒトアデノウイルスタイプ5に由来する。そのようなアデノウイルスポリペプチドのアミノ酸配列、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸配列は、当技術分野において周知であり、Genbankデータベースなどの公的に利用可能な周知のデータベースにおいて入手することができる。例えば、適切な配列には以下の配列が含まれる:ヒトアデノウイルス9（Genbankアクセッション番号CAI05991）、ヒトアデノウイルス7（Genbankアクセッション番号AAR89977）、ヒトアデノウイルス46（Genbankアクセッション番号AAX70946）、ヒトアデノウイルス52（Genbankアクセッション番号ABK35065）、ヒトアデノウイルス34（Genbankアクセッション番号AAW33508）、ヒトアデノウイルス14（Genbankアクセッション番号AAW33146）、ヒトアデノウイルス50（Genbankアクセッション番号AAW33554）、ヒトアデノウイルス2（Genbankアクセッション番号AP_000196）、ヒトアデノウイルス12（Genbankアクセッション番号AP_000141）、ヒトアデノウイルス35（Genbankアクセッション番号AP_000607）、ヒトアデノウイルス7（Genbankアクセッション番号AP_000570）、ヒトアデノウイルス1（Genbankアクセッション番号AP_000533）、ヒトアデノウイルス11（Genbankアクセッション番号AP_000474）、ヒトアデノウイルス3（Genbankアクセッション番号ABB17792）、およびヒトアデノウイルスタイプ5（Genbankアクセッション番号D12587）。

一部の実施形態において、本発明のポリペプチドおよび核酸分子は、本明細書に具体的に説明するものまたは当技術分野において知られているもの（例えばGenbankデータベースなどの公的配列データベースにあるもの）と同じアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドおよび核酸分子は、そのような配列の変異体、誘導体、突然変異体、またはフラグメント、例えばそのような配列に対して85％を上回る配列同一性を有する変異体、誘導体、突然変異体、またはフラグメントである、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有しうる。一部の実施形態において、変異体、誘導体、突然変異体、またはフラグメントは、既知配列に対して約85％の同一性、または既知配列に対して約88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、既知ヌクレオチド配列と比較して長さが約50ヌクレオチド、または約45ヌクレオチド、または約40ヌクレオチド、または約35ヌクレオチド、または約30ヌクレオチド、または約28ヌクレオチド、26ヌクレオチド、24ヌクレオチド、22ヌクレオチド、20ヌクレオチド、18ヌクレオチド、16ヌクレオチド、14ヌクレオチド、12ヌクレオチド、10ヌクレオチド、9ヌクレオチド、8ヌクレオチド、7ヌクレオチド、6ヌクレオチド、5ヌクレオチド、4ヌクレオチド、3ヌクレオチド、2ヌクレオチド、または1ヌクレオチド分相違する、既知ヌクレオチド配列の変異体、誘導体、突然変異体、またはフラグメントが使用される。一部の実施形態では、既知アミノ酸配列と比較して長さが約50アミノ酸、または約45アミノ酸、または約40アミノ酸、または約35アミノ酸、または約30アミノ酸、または約28アミノ酸、26アミノ酸、24アミノ酸、22アミノ酸、20アミノ酸、18アミノ酸、16アミノ酸、14アミノ酸、12アミノ酸、10アミノ酸、9アミノ酸、8アミノ酸、7アミノ酸、6アミノ酸、5アミノ酸、4アミノ酸、3アミノ酸、2アミノ酸、または1アミノ酸分相違する既知アミノ配列の変異体、誘導体、突然変異体、またはフラグメントが使用される。

E4ORF1核酸配列またはE4ORF1アミノ酸配列が使用される実施形態の場合、一部の実施形態において、そのような配列は、アデノウイルスE4領域に由来する他の配列を伴わずに、例えばE4領域全体のヌクレオチド配列を背景とすることなく、またはE4領域がコードする他のポリペプチドを伴わずに、使用される。しかし、他の一部の実施形態では、そのような配列を、E4領域に由来する1つ以上の他の核酸配列またはアミノ酸配列、例えばE4ORF2、E4ORF3、E4ORF4、もしくはE4ORF5配列、またはそれらの変異体、突然変異体、もしくはフラグメントと一緒に使用してもよい。例えば、E4ORF1配列は、他の配列、遺伝子、またはコード領域（例えばプロモーター、マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子など）を含有するコンストラクト（ウイルスベクターなど）に入れて使用することができるが、一定の実施形態において、E4ORF1配列は、E4領域全体を含有しないコンストラクト、またはE4領域からの他のORF、例えばE4ORF2、E4ORF3、E4ORF4、および/またはE4ORF5を含有しないコンストラクトに入れて使用される。

本発明の核酸分子は、所望の用途に応じてさまざまな他の核酸配列、遺伝子、またはコード領域、例えば抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子もしくは発現タグ（例えばGFPをコードするヌクレオチド配列など）、または望ましいかもしれない他の任意のヌクレオチド配列もしくは遺伝子を含有するコンストラクトに入れて、使用することができる。本発明のポリペプチドは単独で発現させるか、融合タンパク質の一部として発現させることができる。

一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、発現を可能にするために1つ以上のプロモーターの制御を受けることができる。所望の細胞タイプにおいて核酸配列の発現を駆動することができるプロモーターはどれでも使用することができる。適切なプロモーターの例には、CMV、SV40、RSV、HIV-Ltr、およびMMLプロモーターがあるが、それらに限定されるわけではない。プロモーターは、アデノウイルスゲノム由来のプロモーター、またはその変異体であることもできる。例えばE4ORF1が使用される場合、プロモーターは、アデノウイルス中で対応遺伝子の発現を駆動するために使用されているプロモーターであることができる。

一部の実施形態では、核酸配列の発現を希望どおりにオン/オフすることができるように、本発明の核酸分子を誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。例えばテトラサイクリン誘導発現系、またはホルモン誘導発現系などといった、任意の適切な誘導発現系を使用することができる。例えば、本発明の核酸分子が必要な間はそれらを発現させ、次に所望のアウトカムが達成されたら、例えば内皮細胞が十分に成長または増殖したら、オフにすることができる。発現をオン/オフできることは、インビボ応用にとって、とりわけ有用であるだろう。

本発明の核酸分子は、自然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含みうる。例えば、一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、細胞内で安定であって細胞内で直接的にタンパク質の発現/生産を指示するために使用することができる合成修飾RNAなどのRNAを含むことができる。別の実施形態において、本発明の核酸分子はDNAを含むことができる。DNAが使用される実施形態において、DNA配列は、細胞内での発現を可能にする（および/または容易にし、強化し、もしくは調節する）ために、1つ以上の適切なプロモーターおよび/または調節要素に作動的に連結することができ、1つ以上の適切なベクターまたはコンストラクト中に存在しうる。本発明の核酸分子は、同じ核酸コンストラクトに入れて内皮細胞に導入するか、別々の核酸コンストラクトに入れて導入することができる。

本発明の核酸分子は、当技術分野において知られる任意の適切なシステムを使って、例えば限定するわけではないがトランスフェクション技法およびウイルス媒介形質導入技法などを使って、内皮細胞に導入することができる。本発明に従って使用することができるトランスフェクション法には、リポソーム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、およびマイクロパーティクルボンバードメントがあるが、それらに限定されるわけではない。使用することができるウイルス媒介形質導入法には、レンチウイルス媒介形質導入、アデノウイルス媒介形質導入、レトロウイルス媒介形質導入、アデノ随伴ウイルス媒介形質導入、およびヘルペスウイルス媒介形質導入があるが、それらに限定されるわけではない。

本発明は、本発明の核酸分子を含有する発現ベクターなどのベクターも提供する。例えば、一実施形態において、本発明は、ETS転写因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とE4ORF1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む発現ベクターを提供する。一部のそのような実施形態において、ETS転写因子はETV2である。一部のそのような実施形態において、発現ベクターはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、ETS転写因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とE4ORF1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、別々のプロモーターの制御を受ける。一部の実施形態において、ETS転写因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とE4ORF1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は同じプロモーターの制御を受け、例えばETS配列とE4ORF1配列との間に配列内リボソーム進入部位配列（IRES）を持つ。

一部の実施形態では、ペプチドミメティックを使用しうる。ペプチドミメティックは、ポリペプチドを模倣するように設計された小さなタンパク質様の鎖である。そのような分子は、本発明のポリペプチドのいずれか（例えばETV2ポリペプチドまたはE4ORF1ポリペプチド）を模倣するように設計することができるだろう。ペプチドを修飾してペプチドミメティックを作出する方法または他の形でペプチドミメティックを設計する方法は、当技術分野では種々知られており、それらを使って、本発明のポリペプチドの一つのペプチドミメティックを作出することができる。

本発明のポリペプチドおよび核酸分子の取り扱い、操作、および発現は、分子生物学および細胞生物学の従来の技法を使って行いうる。そのような技法は当技術分野では周知である。例えば、ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列の取り扱い、操作、および発現に使用するための適切な技法に関する指針について、Sambrook, Fritsch and Maniatis編「Molecular Cloning A Laboratory Manual」2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989、「Methods of Enzymology」シリーズ（Academic Press, Inc.）、または他の任意の標準的テキストの教示内容を参照することができる。E4ORF1配列の取り扱いまたは発現に関連するさらなる側面は米国特許第8,465,732号に記載されており、その内容は参照により本明細書に援用される。

改変内皮細胞
一部の実施形態において、本発明は「改変内皮細胞」を提供する。

一部の実施形態において、改変内皮細胞はE4ORF1+改変内皮細胞である。一部の実施形態において、改変内皮細胞はE4ORF1+ETV2+改変内皮細胞である。一部の実施形態において、改変内皮細胞はE4ORF1+ETS+改変内皮細胞である。

別の実施形態において、改変内皮細胞は1つ以上のマーカーを発現する。事実、E4ORF1+改変内皮細胞を伴う本明細書に記載の実施形態のすべてにおいて、以下のマーカーの1つ以上を発現するように、または非改変内皮細胞と比較して（例えばナイーブ内皮細胞と比較して、または当該改変は加えられていないが、他の点では同等に処理された内皮細胞と比較して）、以下のマーカーの1つ以上の発現レベルが上昇するように、例えば以下のマーカーの1つ以上を2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、または50倍高いレベルで発現するように、（例えば核酸分子のトランスフェクションまたは形質導入によって、またはタンパク質もしくは化学的作用物質などの他の任意の作用物質による処理によって）改変された内皮細胞を、E4ORF1+細胞の代替物として使用できることに留意すべきである。マーカーは、インテグリンアルファ11、マトリリン2、TIMPメタロペプチダーゼ阻害因子3、デルタ様（Delta-like）4、エラスチン、スムーセリン様（Smoothelin-like）2、シンデカン1、カルポニン3酸性、プロテインC（凝固因子VaおよびVIIIaの不活化因子）、成長分化因子3、ギャップジャンクションタンパク質アルファ4 37kDa、トロンボスポンジンタイプ1モチーフ18を持つADAMメタロペプチダーゼ、インターロイキン33、レプチン受容体、スルファターゼ1、エフリン-A1、ジペプチジルペプチダーゼ4、コラーゲン,タイプVIII,アルファ1、ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド2、軟骨酸性タンパク質1、システイニルロイコトリエン受容体2、線維芽細胞成長因子2（塩基性）、ラミニンベータ3、CD82分子、インスリン受容体、エフリン-B1、ケモカイン（C-Cモチーフ）受容体様1、ギャップジャンクションタンパク質,アルファ4,37kDa、およびフィビュリン2である。上に列挙したマーカーおよびそれらに対応する遺伝子記号を下記の表1にも示す。
表1：改変E4ORF1+内皮細胞においてアップレギュレートされるマーカー

^*RNA-Seqによって決定した、第12継代（P12）非E4ORF1発現HUVECと比較した（P12）E4ORF1発現HUVECにおける増加倍率。

一部のそのような実施形態において、改変内皮細胞は、上記マーカーのうちの2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、もしくは28個、または29個すべてを発現するか、それらの発現レベルが上昇している。一部のそのような実施形態において、改変内皮細胞は、エラスチンを発現するか、エラスチンの発現レベルが上昇している。一部のそのような実施形態において、改変内皮細胞は、エラスチン、プロテインC、軟骨酸性タンパク質1、およびフィビュリン2を発現するか、それらの発現レベルが上昇している。一部のそのような実施形態において、改変内皮細胞は、エラスチン、プロテインC、軟骨酸性タンパク質1、フィビュリン2、マトリリン2、スムーセリン様2、成長分化因子3、インターロイキン33、レプチン受容体およびシステイニルロイコトリエン受容体2を発現するか、それらの発現レベルが上昇している。

改変内皮細胞は、当技術分野において知られる任意の適切な内皮細胞供給源に由来することができる。一部の実施形態において、内皮細胞は初代内皮細胞である。一部の実施形態において、改変内皮細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞もしくは非ヒト霊長類細胞、またはウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタ、もしくは他の哺乳動物の細胞である。一部の実施形態において、内皮細胞は初代ヒト内皮細胞である。一部の実施形態において、内皮細胞は臍帯静脈内皮細胞（UVEC）、例えばヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）である。一部の実施形態において、内皮細胞はナイーブ内皮細胞である。一部の実施形態において、内皮細胞は遺伝子修飾された内皮細胞である。一部の実施形態において、改変内皮細胞は幹細胞または前駆細胞に由来することができる。例えば、一部の実施形態において、改変内皮細胞は、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）または胚性幹細胞（ES細胞）などの多能性幹細胞に由来することができる。一部の実施形態において、改変内皮細胞は内皮前駆細胞に由来することができる。一部の実施形態において、改変内皮細胞は、ダイレクトリプログラミング法、または分化細胞を分化度が低下した細胞タイプ（例えば多能性細胞タイプまたは複能性細胞タイプ）にリプログラミングしてから、次にその分化度が低下した細胞を内皮細胞へと分化させる方法などといった、リプログラミング法を使用することで、分化非内皮細胞タイプから誘導することができる。一部の実施形態において、改変内皮細胞は器官特異的内皮細胞である。例えば、一部の実施形態において、改変内皮細胞は、造血系特異的内皮細胞、または神経系特異的内皮細胞、または心臓特異的内皮細胞、または肺特異的内皮細胞、または肝臓特異的内皮細胞、または腎臓特異的内皮細胞、または筋特異的内皮細胞、または軟骨特異的内皮細胞、または脂肪組織特異的内皮細胞でありうる。一部のそのような実施形態において、使用される器官特異的内皮細胞は、インプラントが設置される器官または組織に由来する。例えば、一部の実施形態において、インプラントが肺組織に埋植されるか、肺欠陥を処置するために使用されるのであれば、使用される内皮細胞は肺特異的内皮細胞でありうる。同様に、インプラントが肝臓組織に埋植されるか、肝臓欠陥を処置するために使用されるのであれば、使用される内皮細胞は肝臓特異的内皮細胞でありうる。使用することができる他の適切な内皮細胞には、以前に、米国特許第8,465,732号においてE4ORF1発現に適していると記載されているものがあり、その内容は参照により本明細書に援用される。

一部の実施形態において、改変内皮細胞は、本明細書に記載する具体的分子またはマーカー（例えばE4ORF1）のいずれかの発現に加えて、それらとは別に、1つ以上の遺伝子修飾を含むように遺伝子修飾されている。例えば、そのような細胞は、内皮細胞を冒す疾患または障害に関与することが知られているか、内皮細胞を冒す疾患または障害に関与すると疑われる遺伝子の修正版を含むか、内皮細胞において提供されることまたは改変内皮細胞を使って投与もしくは送達されることが望まれうる他の任意の遺伝子、例えば治療上有用な遺伝子を含みうる。

本発明の改変内皮細胞はさまざまな形態で存在することまたは提供されることができる。例えば、一部の実施形態において、改変内皮細胞は、細胞集団を、例えば単離された細胞集団を含みうる。一部の実施形態において、改変内皮細胞は、例えばインプラントに添加するためのまたはインプラントに含めるための、インビトロの細胞集団を含みうる。一部の実施形態において、改変内皮細胞は、実質的に純粋な細胞集団を含みうる。同様に、一部の実施形態において、本発明の単離されたインプラントは、実質的に純粋な内皮細胞集団を含みうる。例えば、一部の実施形態では、細胞集団全体を構成する細胞のうちの少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約75〜80％、より好ましくは少なくとも約85〜90％、最も好ましくは少なくとも約95％が、本発明の改変内皮細胞であるだろう。一部の実施形態において、改変内皮細胞は、改変細胞と1つ以上の追加コンポーネントとを含有する組成物の形態で提供されうる。例えば、一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載する改変内皮細胞の集団を、例えば生理食塩溶液、細胞懸濁培地などの担体溶液と一緒に含む組成物を提供しうる。一部の実施形態において、そのような組成物は、ヒト対象などの対象への投与に適した改変内皮細胞の集団と担体溶液とを含む治療用組成物でありうる。所望であれば、他の治療上許容されうる作用物質も含めることができる。当業者は、使用目的に応じて治療用組成物に含めるための適切な作用物質を、容易に選択することができる。

一部の実施形態において、本発明の改変内皮細胞は、複製することができないように、使用（例えば治療的使用）に先だって、有糸分裂が不活化されている。これは、例えばマイトマイシンCなどの化学的作用物質を使用することによって、または改変内皮細胞を照射することによって、達成されうる。

生体適合性足場
一定の実施形態において、本発明に従って使用される生体適合性足場は、生体適合性であり、細胞による浸潤を受けることができ（例えば多孔性構造を含み）、かつ生体対象への外科的埋植に適する任意の材料であるか、そのような材料を含むか、本質的にそのような材料からなるか、またはそのような材料からなることができる。そのような足場の例には、脱細胞化動物組織（例えば脱細胞化ブタ組織、例：Bard, Inc.から入手可能なXenMatrix）またはコラーゲン、ラミニン、および/もしくはフィブリンなどの1つ以上の細胞外マトリックス（「ECM」）コンポーネントを含むもの、またはそれらからなるもの、または本質的にそれらからなるものがあるが、それらに限定されるわけではない。一部の実施形態において、生体適合性足場は、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％のコラーゲンを含む。一部の実施形態において、生体適合性足場は、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％のラミニンを含む。一部の実施形態において、生体適合性足場は、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％のフィブリンを含む。一部の実施形態において、生体適合性足場は、4℃および/または室温（21℃前後）において固形であるか、またはその両方であるものである。一部の実施形態において、生体適合性足場はヒアルロン酸を含まない。一部の実施形態において、生体適合性足場は、約5％、4％、3％、2％、1％、または0.5％を上回るヒアルロン酸を含まない。一部の実施形態において、生体適合性足場はマトリゲルを含まない。一部の実施形態において、生体適合性足場材料は、それが埋植される組織の場所に応じて、例えばその生物機械的特性または他の任意の生物学的特性に基づいて選択されうる。

インプラント
本明細書に記載するインプラントは、生体適合性足場材料と改変内皮細胞とを含む。一部の実施形態において、生体適合性足場は三次元構造を有し、改変内皮細胞はインプラント内で血管を形成する。

一部の実施形態において、インプラントは内皮細胞に加えて他の細胞タイプも含みうる。一部の実施形態において、そのような追加細胞タイプは、幹細胞または前駆細胞、例えば胚性幹（ES）細胞、誘導多能性幹細胞（iPSC）、造血幹細胞、骨幹細胞、筋幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、間葉系幹細胞、腸幹細胞、精原幹細胞などでありうる。一部の実施形態において、そのような追加細胞タイプは、分化細胞、例えば造血細胞、骨細胞、筋細胞、神経系細胞、上皮細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、腸細胞、精巣細胞などでありうる。一部の実施形態において、そのような追加細胞タイプは遺伝子修飾された細胞でありうる。一部の実施形態において、そのような追加細胞タイプはナイーブ（すなわち遺伝子修飾されていない）細胞でありうる。本発明の改変内皮細胞と共に提供または使用されうる細胞の他の例は、米国特許第8,465,732号に掲載されており、その内容は参照により本明細書に援用される。

一部の実施形態において、インプラントは、インプラントの使用目的に応じて、任意の適切なサイズおよび/または形状を有しうる。例えば、インプラントが特定組織欠陥の置換用または修復用である場合、インプラントがその組織欠陥への挿入に適したサイズおよび形状を有するように、インプラントを構成することができる。

インプラントの培養方法および作製方法
細胞を培養する方法は当技術分野において周知であり、任意の適切な細胞培養法を使用することができる。例えば、本発明の改変内皮細胞、またはそのような細胞を含有するインプラントは、他の内皮細胞の培養に有用であることが知られている方法、または例えば米国特許第8,465,732号（この文献の内容は参照により本明細書に援用される）に記載されているようにE4ORF1+内皮細胞の培養に有用であることが知られている方法を使って、培養することができる。一部の実施形態において、本発明の改変内皮細胞、またはそのような細胞を含有するインプラントは、血清の非存在下、または外因性成長因子の非存在下、または血清と外因性成長因子との両方の非存在下、または外因性血管新生因子の非存在下で培養することができる。

本発明の改変内皮細胞は凍結保存することもできる。細胞培養および細胞凍結保存のための方法は、R. Ian Freshney著「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」第4版（2000）（「Freshney」）（この文献の内容は参照により本明細書に援用される）に記載の方法など、当業者には種々知られている。

本発明のインプラントは、当技術分野において知られる任意の適切な方法によって作製することができる。例えば、一実施形態において、本発明は、本明細書に記載するインプラントを調製するための方法であって、インビトロで生体適合性足場を改変内皮細胞の集団と接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態において、最初の接触工程は生体適合性足場材料を改変内皮細胞の培養物に入れること、または改変内皮細胞の培養物の上に置くことを含みうる。一部の実施形態において、最初の接触工程は、改変内皮細胞を生体適合性足場材料の上に置くこと、または生体適合性足場材料に入れることを含みうる。最初の接触工程中は、そしてその後は、改変内皮細胞、生体適合性足場、および結果として得られるインプラントを、内皮細胞の培養物にとって適切であることが知られている培養条件下に、例えば本明細書に記載する培養条件下に、維持することができる。生体適合性足場は、改変内皮細胞の集団と共に、所望に応じて、内皮細胞が生体適合性足場に浸潤するのに十分な時間、または内皮細胞が生体内適合性足場内で血管を形成するのに十分な時間、インキュベートしうる。例えば、一部の実施形態において、生体適合性足場は、インプラントの使用に先だって、例えば対象への埋植にインプラントを使用する前に、改変内皮細胞の集団と共に、約1日（24時間）、2日（48時間）、3日、4日、5日、6日、もしくは7日（1週間）、または約2週間、3週間、4週間、5週間、もしくは6週間、またはそれ以上にわたってインキュベートすることができる。

処置の対象および方法
一部の実施形態において、本発明のインプラントを埋植しうる対象は、組織欠陥の処置を助けるためにインプラントを使用することが望まれうる任意の動物種の対象である。一部の実施形態において、対象は哺乳動物、例えば霊長類（ヒトおよびサルなど）、齧歯類（マウス、ラットおよびウサギなど）、ヒツジ類（ヒツジおよびヤギなど）、ウシ類（乳牛など）、ブタ類、ウマ類、ネコ類およびイヌ類からなる群より選択される哺乳動物である。一部の実施形態において、対象はヒトである。

本発明のインプラントは、組織欠陥の処置を必要とする対象において組織欠陥を処置するために使用することができる。そのような対象は「組織欠陥」を有しうる。本明細書において使用する用語「組織欠陥」は、さまざまなタイプの状態、およびさまざまなタイプの組織損傷、組織傷害、または組織機能障害を包含するものとし、外傷、加齢、変性疾患、遺伝性障害、感染性疾患、自己免疫疾患、またはがんが引き起こすものを含むが、それらに限定されるわけではない。ここに提供する処置の方法は、対象における組織欠陥の置換、再建、再生、修復、または補充を提供しうるか、またはそれらの達成を目的としうる。例えば、一実施形態において、本明細書に記載するインプラントは、対象における糖尿病の（例えば欠陥インスリン分泌組織の置換または補充による）処置またはニューロパシーの処置に使用することができる。別の一実施形態において、本明細書に記載するインプラントは、例えば損傷した神経（例えばミエリン鞘が損傷している神経、ミエリン鞘に欠陥がある神経、またはミエリン鞘がない神経）の近傍にインプラントを設置することによって、ニューロパシーの処置に使用することができ、その場合、そのようなインプラントは神経（そのミエリン鞘を含む）の修復を容易にしうる。

本発明のインプラントは、インプラントの外科的埋植を必要とする対象に、当技術分野において知られる標準的な外科方法または外科技法を使って、外科的に埋植することができる。例えば、本発明のインプラントは、必要に応じて、組織欠陥部位または組織欠陥部位の近くに外科的に埋植することができる。

一部の実施形態において、本発明のインプラントは、そのインプラントが埋植される対象と同じ対象に由来する改変内皮細胞、すなわち自家細胞を含有する。別の実施形態において、本発明のインプラントは、同種異系ドナー対象に由来する改変内皮細胞を含有する。一部のそのような実施形態において、同種異系ドナーは、インプラントが設置される予定の対象との組織適合を有する（例えばHLA適合またはMHC適合である）。一部のそのような実施形態において、同種異系ドナーは、インプラントが設置される予定の対象とは不適合または部分適合である（例えばHLA部分不適合またはMHC部分不適合）。改変内皮細胞が同種異系ドナーに由来する実施形態では、「外来」内皮細胞の拒絶のリスクを低減するために、1つ以上の免疫抑制剤で対象を処置する必要がありうる。

キット
本発明は、本明細書に記載するインプラントを作製するためのキットおよび本明細書に記載するさまざまな方法を実行するためのキットも提供する。そのようなキットは、本明細書に記載するコンポーネントのいずれか、例えば限定するわけではないが、ヌクレオチド配列（例えばE4ORF1をコードするもの）、改変内皮細胞（例えばE4ORF1+内皮細胞）、ナイーブ内皮細胞、改変内皮細胞またはそこで発現するタンパク質もしくは核酸分子を検出するための手段または組成物（例えば核酸プローブ、抗体など）、改変内皮細胞の培養に役立つ、または改変内皮細胞を含有するインプラントを維持もしくは培養するのに役立つ培地もしくは組成物、生体適合性足場材料、またはそれらの任意の組み合わせを含有しうる。そのようなキットはすべて、場合によっては、使用説明書、コンテナ、培養容器などを含みうる。キットにはラベルが付随していてもよく、ラベルには、キットの内容物の使用に関する指示または他の情報を提供する電子可読フォームまたはコンピュータ可読フォーム（例えばディスク、光学ディスク、メモリーチップ、またはテープ）でありうる、任意の書込材料または記録材料を含めることができる。

以下の非限定的実施例では、本発明の一定の側面が、さらに記載されうる。

実施例1:改変内皮細胞を含有するインプラントのインビトロ培養
アデノウイルスE4ORF1タンパク質および緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する改変E4ORF1+ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、実施例3で述べるように培養した。改変E4ORF1+HUVECを標準的条件下で24穴プレートにプレーティングし、コンフルエントに到達させた。脱細胞化ブタコラーゲンマトリックスを使用した（XenMatrix（商標）外科グラフト、Bard Davol, Inc.、ロードアイランド州ウォリック）。マトリックス材料を剪刀で小断片に切断するか、6mm皮膚パンチを使用することによって、コラーゲンマトリックスを調製した。2つの代替的方法を使ってコラーゲンマトリックスに改変HUVECを播種した。第1の方法では、24穴プレートの表面で培養されている改変HUVECの単層の上にコラーゲンマトリックスを直接乗せた。第2の方法では、24穴プレートのウェルにコラーゲンマトリックスを入れ、そのコラーゲンマトリックスの上に、それぞれの培養容器から収穫した改変HUVECを乗せた。どちらの条件でも、改変HUVECは24時間以内にコラーゲンマトリックス中に成長することが観察され、試験したどの時点でもコラーゲンマトリックス内で生存可能状態を保っていた（最長6週間）。血管は、改変内皮細胞の播種から48時間以内に目に見えるようになり、試験したどの時点でも存在していた（最長6週間）。改変E4ORF1+HUVECは開いた管腔を持つ血管構造を形成し、それがコラーゲンマトリックス全体に観察されると共に（図1A参照）、マトリックスの境界から周囲の培地中に突き出してもいた（図1B参照）。

実施例2:改変内皮細胞を含有するコラーゲンマトリックスのインビボ埋植
コラーゲンマトリックスに実施例1で述べたように改変HUVECを播種した。細胞を、改変HUVECの播種後8日〜6週間、インビトロで培養してから、マウスに埋植した（ヒト内皮細胞に対するいかなる拒絶反応も最小限に抑えるために免疫不全マウスを使用した）。マウスを麻酔し、外科手術の準備をした。腹部の皮膚に8mmの切開を施した。インプラントが占めることになる空間を作出するために腹筋と皮膚の間に鉗子を挿入した。各動物に1つの「対照」インプラント（培地には浸漬したが内皮細胞は播種していないコラーゲンマトリックス材料を含むもの）と1つの「試験」インプラント（改変HUVECを含むもの）とを与えた。埋植後48時間〜4週間の時点でインプラントを収穫した。インプラントを取り出すときに、試験インプラントは対照インプラントよりはるかに強く周囲のマウス組織に付着していることがわかった。48時間時点において、試験インプラントは既に部分的に吻合していることが、移植片に浸透する血液の存在によって証明されたのに対し（図2A）、対照インプラントはそうではなかった（図2B）。移植片を取り出す際に、試験マトリックスも目に見えて周囲の組織に付着していたが、内皮細胞なしのマトリックスは付着を示さなかった。図3は、埋植後4週間の時点で、試験インプラントに見られる脈管化の程度が、対照と比較してはるかに強いことを例証している。インプラントを薄切し、組織学的検査に付した。試験インプラントは対照インプラントより高い細胞充実度を呈するように見えた。図4を参照されたい。

実施例3:E4ORF1+改変内皮細胞およびE4ORF1+改変内皮細胞を含有するインプラントの培養
コラーゲンマトリックス上で内皮細胞を培養するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、既知の疾病を持たない同意ドナーから入手し、アデノウイルスE4ORF1を形質導入することで、E4ORF1+HUVECを生成させた。この改変HUVECを、当技術分野において標準的な方法を使って、付着細胞として成長させた。この標準には、100％コンフルエント時に細胞を分割すること、37℃における培養、組織培養処理されたプレート、フラスコ、またはウェルでの拡大、ならびに内皮細胞サプリメント（50μg/ml）、ウシ胎児血清（FBS、最終濃度:20％）、抗生物質-抗真菌物質溶液、HEPES緩衝液（10mM）、ヘパリン（50μg/ml）、およびグルタマックス（Glutamax）を補足した培地199と規定される培地の使用が含まれる。細胞が増殖するにつれて、より大きなフラスコへの植え継ぎ時か、培地が培養2日間を越えたときに、培地を交換した。

マトリックスが水和されている場合にのみ、内皮細胞をマトリックスと接触させた。E4ORF1+内皮細胞をコラーゲンマトリックスと共に培養する際は、数種類の培養方法を使用した。ある方法では、鋭い刃を持つ器具（カミソリの刃、メス、または剪刀など)で固形コラーゲンマトリックスを25mm²片に切断した。別の一方法では、固形コラーゲンマトリックスを皮膚パンチで円形の小片に切断した。別の一方法では、E4ORF1+内皮細胞（EC）がコンフルエントな単層をなし、その上にマトリックスを置いて、十分な培地でマトリックスを覆った。ECはマトリックス中に移動した。ある培養方法では、マトリックスをウェルに入れ、そのマトリックスを十分な培地で覆った。E4ORF1+ECを培地に懸濁した状態でマトリックス含有ウェルに加えた。ECはマトリックスに付着し、接触媒介成長阻害が起こるまでマトリックス上で成長した。長期間インキュベーションの場合は、脈管構造の破壊を防止するために、マトリックスと直接接触しないように注意して、培地を2〜3日ごとに交換した。E4ORF1+ECによるコラーゲンマトリックスへの侵入は、それぞれの方法において24時間以内に認められ、播種した細胞の数と移植片のサイズに依存して、数日間、侵入し続けた。過成長（多層、球状または塊状に成長したE4ORF1+ECと定義される）は検知されず、細胞がコンフルエントで成長停止することと一致した。血管の外観を有する管腔含有構造が48時間時点で認められ、それが数週間、持続した（図1B）。

ヒトE4ORF1+ECに対する免疫応答を展開することができない免疫不全NOD scidガンマ（NSG）マウスにこれらのマトリックスを外科的に埋植することによって、インビボ実験を行った。麻酔下のマウスを清拭し、剃毛し、固定した。小さな8mm切開を皮膚に施した。鈍端型鉗子を閉じた状態で挿入し、皮膚と筋の間への挿入後にそれを開くことで、空洞を作出した。これを反対方向に繰り返した。次に、対照マトリックスおよび試験マトリックスをこれらの空洞に入れた。

Claims (81)

1. （a）三次元的生体適合性足場材料と（b）三次元的生体適合性足場材料内に配置された開通した管腔を有する血管とを含み、前記血管がE4ORF1+改変内皮細胞を含む、対象への外科的埋植に適した単離されたインプラントであって、線維芽細胞および線維芽細胞由来の血管新生因子を含まない、単離されたインプラント。
2. 接続された血管のネットワークを含む、請求項1に記載の単離されたインプラント。
3. 血管が毛細管を含む、請求項1に記載の単離されたインプラント。
4. 血管が開いた管腔を有する、請求項1に記載の単離されたインプラント。
5. 血管の1つ以上が生体適合性足場材料の境界を越えて突き出す、請求項1に記載の単離されたインプラント
6. E4ORF1+改変内皮細胞がE4ORF1+ETV2+である、請求項1に記載の単離されたインプラント。
7. 改変内皮細胞が組換えETSファミリー転写因子を発現する、請求項1に記載の単離されたインプラント。
8. 改変E4ORF1+内皮細胞が哺乳動物の内皮細胞である、請求項1に記載の単離されたインプラント。
9. 改変E4ORF1+内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項1に記載の単離されたインプラント。
10. 改変E4ORF1+内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）に由来する、請求項1に記載のインプラント。
11. 改変E4ORF1+内皮細胞が器官特異的内皮細胞である、請求項1に記載の単離されたインプラント。
12. 改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象の内皮細胞に由来する、請求項1に記載の単離されたインプラント。
13. 改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象と同じMHC型またはHLA型を有する同種異系ドナーの内皮細胞に由来する、請求項1に記載の単離されたインプラント。
14. 改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象に対して部分的MHC型適合または部分的HLA型適合を有する同種異系ドナーの内皮細胞に由来する、請求項1に記載の単離されたインプラント。
15. 改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象と比較してMHC型またはHLA型に相違を有する同種異系ドナーの内皮細胞に由来する、請求項1に記載の単離されたインプラント。
16. 生体適合性足場材料内に配置された幹細胞または前駆細胞をさらに含む、請求項1に記載の単離されたインプラント。
17. 幹細胞または前駆細胞が、造血幹細胞、骨幹細胞、筋幹細胞、神経幹細胞、毛包幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、間葉系幹細胞、腸幹細胞、および精原幹細胞からなる群より選択される、請求項16に記載の単離されたインプラント。
18. 生体適合性足場材料内に配置された1つ以上の追加細胞タイプをさらに含む、請求項1に記載の単離されたインプラント。
19. 追加細胞タイプが、造血細胞、骨細胞、筋細胞、神経系細胞、周皮細胞、毛包細胞、脂肪細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、皮膚細胞、腸細胞、および精巣細胞からなる群より選択される、請求項18に記載の単離されたインプラント。
20. 生体適合性足場材料が4℃において固形である、請求項1に記載の単離されたインプラント。
21. 生体適合性足場材料が21℃において固形である、請求項1に記載の単離されたインプラント。
22. 生体適合性足場材料が1つ以上の細胞外マトリックス分子を含む、請求項1に記載の単離されたインプラント。
23. 生体適合性足場材料がコラーゲンを含む、請求項1に記載の単離されたインプラント。
24. 生体適合性足場材料がフィブリンを含む、請求項1に記載の単離されたインプラント。
25. 生体適合性足場材料がラミニンを含む、請求項1に記載の単離されたインプラント。
26. 生体適合性足場材料が脱細胞化動物組織を含む、請求項1に記載の単離されたインプラント。
27. 生体適合性足場材料が脱細胞化ブタ組織を含む、請求項1に記載の単離されたインプラント。
28. 生体適合性足場材料がマトリゲル（Matrigel）ではない、請求項1に記載の単離されたインプラント。
29. 生体適合性足場材料がヒアルロン酸を含まない、請求項1に記載の単離されたインプラント。
30. 血清を含まない、請求項1に記載の単離されたインプラント。
31. マイクロキャリアビーズを含まない、請求項1に記載の単離されたインプラント。
32. 細胞外マトリックス分子でコーティングされたマイクロキャリアビーズを含まない、請求項1に記載の単離されたインプラント。
33. 対象への外科的埋植に適したインプラントを調製する方法であって、三次元的生体適合性足場材料と接触している改変E4ORF1+内皮細胞の集団を、三次元的生体適合性足場材料内に血管が形成されるまでインビトロで培養することによって、E4ORF1+血管を含むインプラントを形成させることを含む方法であって、培養が線維芽細胞および線維芽細胞由来の血管新生因子の非存在下で行われる、方法。
34. 接続された血管のネットワークが形成されるまで培養が行われる、請求項33に記載の方法。
35. 1つ以上の血管が生体適合性足場材料の境界を越えて突き出すまで培養が行われる、請求項33に記載の方法。
36. 培養が少なくとも24時間は行われる、請求項33に記載の方法。
37. 培養が少なくとも48時間は行われる、請求項33に記載の方法。
38. 培養が少なくとも3日は行われる、請求項33に記載の方法。
39. 培養が少なくとも4日は行われる、請求項33に記載の方法。
40. 培養が少なくとも5日は行われる、請求項33に記載の方法。
41. 培養が少なくとも1週間は行われる、請求項33に記載の方法。
42. 改変E4ORF1+内皮細胞がE4ORF1+ETV2+である、請求項33に記載の方法。
43. 改変E4ORF1+内皮細胞が組換えETSファミリー転写因子を発現する、請求項33に記載の方法。
44. 改変E4ORF1+内皮細胞が器官特異的内皮細胞である、請求項33に記載の方法。
45. 改変E4ORF1+内皮細胞が哺乳動物の内皮細胞である、請求項33に記載の方法。
46. 改変E4ORF1+内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項33に記載の方法。
47. 改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象の内皮細胞に由来する、請求項33に記載の方法。
48. 改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象と同じMHC型またはHLA型を有する同種異系ドナーの内皮細胞に由来する、請求項33に記載の方法。
49. 改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象に対して部分的MHC型適合または部分的HLA型適合を有する同種異系ドナーの内皮細胞に由来する、請求項33に記載の方法。
50. 改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象と比較してMHC型またはHLA型に相違を有する同種異系ドナーの内皮細胞に由来する、請求項33に記載の方法。
51. 改変E4ORF1+内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）に由来する、請求項33に記載の方法。
52. 血管が毛細管を含む、請求項33に記載の方法。
53. 血管が管腔を有する、請求項33に記載の方法。
54. 生体適合性足場材料がその中に配置された幹細胞または前駆細胞を含む、請求項33に記載の方法。
55. 幹細胞または前駆細胞が、造血幹細胞、骨幹細胞、筋幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、皮膚幹細胞、毛包幹細胞、間葉系幹細胞、腸幹細胞、および精原幹細胞からなる群より選択される、請求項54に記載の方法。
56. 生体適合性足場材料がその中に配置された1つ以上の追加細胞タイプを含む、請求項33に記載の方法。
57. 追加細胞タイプが、造血細胞、骨細胞、筋細胞、神経系細胞、周皮細胞、毛包、脂肪細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、皮膚細胞、腸細胞、および精巣細胞からなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
58. 生体適合性足場材料が4℃において固形である、請求項33に記載の方法。
59. 生体適合性足場材料が21℃において固形である、請求項33に記載の方法。
60. 生体適合性足場材料がマトリゲルではない、請求項33に記載の方法。
61. 生体適合性足場材料がヒアルロン酸を含まない、請求項33に記載の方法。
62. 生体適合性足場材料が1つ以上の細胞外マトリックス分子を含む、請求項33に記載の方法。
63. 生体適合性足場材料がコラーゲンを含む、請求項33に記載の方法。
64. 生体適合性足場材料が脱細胞化動物組織を含む、請求項33に記載の方法。
65. 生体適合性足場材料が脱細胞化ブタ組織を含む、請求項33に記載の方法。
66. 培養が血清の非存在下で行われる、請求項33に記載の方法。
67. 培養が外因性成長因子の非存在下で行われる、請求項33に記載の方法。
68. 培養が外因性血管新生因子の非存在下で行われる、請求項33に記載の方法。
69. 培養が外因性VEGFの非存在下で行われる、請求項33に記載の方法。
70. 培養が外因性FGFの非存在下で行われる、請求項33に記載の方法。
71. 培養がマイクロキャリアビーズの非存在下で行われる、請求項33に記載の方法。
72. 培養が、細胞外マトリックス分子でコーティングされたマイクロキャリアビーズの非存在下で行われる、請求項33に記載の方法。
73. 処置を必要とする対象を処置する方法に使用するための、請求項1〜32のいずれか一項に記載のインプラントであって、該方法が、インプラントを対象に埋植することを含むものである、インプラント。
74. 対象が組織欠陥を有し、インプラントは、対象の前記組織欠陥の部位に外科的に埋植される、請求項73に記載のインプラント。
75. 改変E4ORF1+内皮細胞が器官特異的内皮細胞であり、インプラントは、前記器官特異的内皮細胞が由来する器官に外科的に埋植される、請求項73に記載のインプラント。
76. 対象が哺乳動物対象である、請求項73に記載のインプラント。
77. 対象がヒト対象である、請求項73に記載のインプラント。
78. インプラント中の改変E4ORF1+内皮細胞が対象自身の内皮細胞に由来する、請求項73に記載のインプラント。
79. インプラント中の改変E4ORF1+内皮細胞が、対象と同じMHC型またはHLA型を有する同種異系ドナーの内皮細胞に由来する、請求項73に記載のインプラント。
80. インプラント中の改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象に対して部分的MHC型または部分的HLA型適合を有する同種異系ドナーの内皮細胞に由来する、請求項73に記載のインプラント。
81. インプラント中の改変E4ORF1+内皮細胞が、インプラントの外科的埋植が行われる対象と比較してMHC型またはHLA型に相違を有する同種異系ドナーの内皮細胞に由来する、請求項73に記載のインプラント。

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