WO2017221870A1 - 毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造方法 - Google Patents

毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造方法 Download PDF

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公栄 豊島
美帆 小川
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株式会社オーガンテクノロジーズ
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    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing artificial skin, and an artificial skin produced by the method.
  • the skin composed of epidermis, dermis tissue and subcutaneous tissue is a huge organ that covers the entire surface of the body and separates the body from the outside world.
  • a variety of ectodermal organs such as hair follicles, sebaceous glands, and sweat glands are distributed in the skin, and these are structurally and functionally linked to constitute the ectodermal system (skin organ system).
  • the integumental system protects the body surface from various external infringement by extending hair, regulates the environment of the body surface by excretion of sebum and sweat, excretes waste products, and also other organs such as the circulatory system and nervous system By cooperating with the system, it carries various physiological functions such as body temperature regulation and sensory reception.
  • artificial skins that have been proposed so far include only skin layers and dermis layers and no skin appendages, or skin appendage-like structures (such as hair follicle-like structures). Even so, it did not reproduce normal skin structure and function. Artificial skin that does not have a functional skin appendage has a limit in its use as a substitute for laboratory animals because there is no skin barrier function due to sebum and the like.
  • Patent Document 1 a collagen matrix layer containing contractile cells (for example, fibroblasts) and a collagen matrix layer containing cells (for example, dermal papilla cells) constituting tissue appendages are layered and cultured. , Indicating that hair follicle-like structures can occur in the culture.
  • Patent Document 1 merely shows that a structure resembling a hair follicle on the outer shape is generated, and artificial skin that reproduces the normal structure and function of the skin appendages is shown. Absent.
  • An object of the present invention is to provide artificial skin having hair follicles, sebaceous glands, and pores.
  • a method for producing artificial skin having hair follicles, sebaceous glands, and pores includes the following steps (A): preparing an artificial skin having a dermis layer and an epidermis layer, or an artificial skin having only a dermis layer; and (B): Transplanting the isolated hair follicle into the artificial skin prepared in step (A); Where, where The isolated hair follicle has a sebaceous gland, The isolated hair follicle is transplanted to the artificial skin so that the surface of the dermis layer of the artificial skin matches the position of the pores of the isolated hair follicle. It is related with the method characterized by this.
  • step (A) artificial skin having only a dermis layer is used
  • step (B) the following step (C): forming an epidermis layer on the dermis layer of the artificial skin; It is characterized by including.
  • the dermis layer of the artificial skin in the step (A) is formed by gelling a mixed solution containing fibroblasts, collagen, and a culture solution.
  • the method of the present invention in one embodiment, in the dermis layer of the artificial skin in the step (A), after a mixture liquid containing fibroblasts, collagen, and a culture solution is gelled, a mixture solution containing collagen and a culture solution is further added to form a gel. It is formed by repeating at least once.
  • the epidermis layer of “artificial skin having a dermis layer and an epidermis layer” in the step (A) is formed by applying a mixed solution containing keratinocytes and a culture solution to the surface of the dermis layer and culturing them. It is what was made.
  • the step (C) is a step of forming the epidermis layer by applying a mixed solution containing keratinocytes and a culture solution to the surface of the dermis layer of the artificial skin and culturing them. It is characterized by.
  • the method of the present invention comprises the step (A), (A): A step of preparing artificial skin having a dermis layer, an epidermis layer, and an adipose tissue layer.
  • the method of the present invention is the hair isolated in the following step (A ′): step (B) after the step (A) and before the step (B). Implanting preadipocytes at the site of artificial skin where the sac is implanted; It is characterized by including.
  • the method of the present invention is characterized in that the isolated hair follicle is a hair follicle isolated from animal skin.
  • the method of the present invention is characterized in that the isolated hair follicle is a hair follicle isolated from human skin.
  • the method of the present invention is characterized in that the isolated hair follicle is an artificially induced regenerated hair follicle.
  • the regenerated hair follicle is a first cell aggregate substantially composed of mesenchymal cells and a second substantially composed of epithelial cells. It is a regenerated hair follicle produced by culturing the cell aggregate in close contact with the cell aggregate.
  • the method of the present invention is characterized in that at least one of the mesenchymal cells and the epithelial cells is obtained by inducing undifferentiated cells.
  • the method of the present invention is characterized in that at least one of the mesenchymal cells and the epithelial cells is a unified cell derived from an animal hair follicle.
  • the present invention relates to an artificial skin having hair follicles and sebaceous glands, and further having pores.
  • a dermis layer consisting of a gel containing fibroblasts, collagen, and culture medium
  • An epidermis layer formed on the surface of the dermis layer and consisting essentially of keratinocytes, and Hair follicles having sebaceous glands, The hair follicle penetrates the epidermis layer and is buried in the dermis layer, The pore portion of the hair follicle is connected to the epidermis layer, Related to artificial skin.
  • the artificial skin of the present invention is characterized in that it further has an adipose tissue layer below the dermis layer.
  • the artificial skin of the present invention is characterized in that the hair follicle is covered with fat precursor cells in the dermis layer.
  • the present invention is characterized in that in one embodiment, the artificial skin is produced by the artificial skin production method of the present invention described above.
  • an artificial skin having functional hair follicles, sebaceous glands and pores and reproducing the barrier function of normal skin can be produced.
  • an artificial skin that is useful for evaluating the efficacy and safety of pharmaceuticals and cosmetics (especially, evaluating the efficacy and safety of pharmaceuticals and cosmetics related to hair).
  • FIG. 1 is a schematic view of artificial skin having hair follicles and sebaceous glands, which are produced by the method of the present invention, and these and the epidermis layer connected via pores.
  • FIG. 1A is a three-dimensional schematic diagram of artificial skin incorporating a skin appendage organ such as a hair follicle.
  • FIG. 1B is a schematic view of a cross section including a hair follicle of a portion indicated by a square in FIG. 1A.
  • the hair follicle of the artificial skin and the opening of the sebaceous gland are continuous with the keratinized epidermis layer of the artificial skin, and hair is erupted from the surface, and sebum secretion is performed to the body surface.
  • FIG. 1 is a schematic view of artificial skin having hair follicles and sebaceous glands, which are produced by the method of the present invention, and these and the epidermis layer connected via pores.
  • FIG. 1A is a three-
  • FIG. 2 is a diagram showing two embodiments of the method for producing artificial skin of the present invention.
  • the method of the present invention can be classified into two types, a method of forming the epidermis after the incorporation of the hair follicle and a method of incorporating the hair follicle after the formation of the epidermis layer, depending on the keratinized skin layer formation of the artificial skin and the incorporation time of the hair follicle including the sebaceous gland. Separated.
  • FIG. 3 shows the result of transplanting an isolated hair follicle into artificial skin having only the dermis layer, forming an epidermis layer, and culturing according to one embodiment of the method of the present invention.
  • FIG. 3 shows the result of transplanting an isolated hair follicle into artificial skin having only the dermis layer, forming an epidermis layer, and culturing according to one embodiment of the method of the present invention.
  • FIG. 3A shows that the formation of artificial skin having only a dermis layer (cell-containing collagen gel) is Day 0, adult mouse cheek beard hair follicle is incorporated into Day 1 in the artificial dermis layer, and cultured keratinocytes are layered on the artificial dermis on the same day. It is the photograph at the time of seeding and forming an epidermis layer and observing to Day8.
  • FIG. 3B shows a histological image of artificial skin when a mouse cheek beard hair follicle is used as a hair follicle to be transplanted in the procedure of FIG. 3A.
  • 3C is a top-bottom photograph showing a tissue image observed by preparing continuous sections from artificial skin after incorporating hair follicles of mouse hair and culturing for 7 days in the procedure of FIG. 3A.
  • the photo on the left is a weakly magnified image, and magnified images of the area indicated by the squares are shown on the top and bottom of the photo, respectively.
  • the hair follicles incorporated into the artificial skin and the keratinized skin layer of the artificial skin are connected via the pores at the arrow portion of the enlarged image.
  • the hair bulb shown by the arrowhead in the HE image of the hair bulb at the lower right of the photograph is histologically sound.
  • FIG. 4 shows the results of transplanting and culturing isolated hair follicles on artificial skin having a dermis layer and an epidermis layer according to an embodiment of the method of the present invention.
  • FIG. 4A shows a case in which the formation of artificial skin (cell-containing collagen gel) having a dermis layer and an epidermis layer is Day 0, and a hair follicle (hair follicle of a mouse cheek beard) is transplanted to Day 4, and observation is performed up to Day 10 It is a photograph of.
  • FIG. 4B shows a tissue image (H & E staining) of the artificial skin after hair follicle transplantation.
  • FIG. 5 shows the result of observing the hair shaft grown from the hair follicle incorporated into the artificial skin over time and measuring the hair shaft length by image analysis.
  • FIG. 5A is an observation result of hair shaft growth in the case where an epidermis layer is formed after transplanting a hair follicle of an adult mouse cheek beard into artificial skin. A plurality of hair follicles incorporated into the artificial skin was identified, and each hair shaft growth was followed over time.
  • FIG. 5B is an observation result of hair shaft growth in the case where an epidermis layer is formed after transplanting adult mouse hair follicles into artificial skin. Similar to the time-lapse observation of the mouse cheek beard, the hair follicles incorporated into the artificial skin were identified, and the hair shaft length of the hair follicles (red arrows) that had grown hair was measured.
  • FIG. 5C is an observation result of hair shaft growth in the case where an epidermis layer is formed after transplanting human hair follicles into artificial skin. The hair shaft length was measured and plotted in the same manner as the mouse hair follicle.
  • FIG. 6 shows the results of observation of hair shaft growth after transplanting hair follicles into artificial skin having a dermis layer and an epidermis layer. Take a stereomicrograph of the hair shaft before transplanting the hair follicles, measure the length of the club hair and the growing hair shaft from the top end of the hair bulb, and 3, 6, 12 days after transplanting to the artificial skin The hair shaft and the hair follicle were extracted from the artificial skin, and the hair shaft growth amount was measured by photographing with a stereomicroscope in the same manner. The length of the growing hair was measured and plotted with the club hair length as an internal standard.
  • FIG. 7 shows changes over time in organ culture of mouse cheek beard hair follicles.
  • FIG. 8 shows a comparison of an artificial skin model with only the epidermis and dermis and an artificial skin model with an epidermis, dermis and adipose tissue layer.
  • FIG. 8a shows the flow of this experiment. A hair follicle from which the collagen sheath of the variable region was removed by collecting the growing mouse cheek beard was prepared.
  • FIG. 8b shows a histological image on day 3 of organ culture.
  • FIG. 9 shows the result of producing the artificial skin of the present invention using the artificially produced regenerated hair follicle.
  • FIG. 9a shows the flow of this experiment. The upper part of FIG.
  • FIG. 9b shows the result of “epidermis + dermis model”, the middle part of “epidermis + dermis + adipose tissue model”, and the lower part of “epidermis + dermis + REC derived adipose precursor cell model”.
  • An enlarged view of the square range shown in the weak enlarged view in the left column of FIG. 9b is shown in the right column. In both models, it was shown that the epithelial tissue of the transplanted hair follicle was connected to the artificial skin epidermis layer.
  • the present invention relates to artificial skin having hair follicles, sebaceous glands, and pores, and a method for producing the same.
  • the artificial skin produced by the method of the present invention has a hair follicle having sebaceous glands, the hair follicle penetrates the epidermis layer and is buried in the dermis layer, and the pore portion of the hair follicle is the epidermis layer. It is connected with.
  • a hair follicle means a skin appendage that produces hair having a structure such as a hair papilla, hair matrix, hair sheath, hair fiber, hair bulge, napped muscle, sebaceous gland, hair follicle funnel (so-called pores), etc. .
  • the “hair follicle” is not limited to those containing all these structures, and at least a part of these structures is maintained and a structure having a function of producing hair is maintained. Including widely.
  • artificial skin means an artificial skin-like structure having at least a dermis layer, and preferably further having an epidermis layer.
  • dermis layer means a structure mainly composed of collagen and fibroblasts
  • skin layer means a structure mainly composed of keratinocytes.
  • the artificial skin (artificial skin before transplanting the isolated hair follicle) used in the present invention may be prepared before transplanting the hair follicle, or a commercially available artificial skin having an epidermis layer and a dermis layer may be used. Good.
  • the method for producing artificial skin (artificial skin before transplanting an isolated hair follicle) used in the present invention is not limited.
  • a mixed solution containing fibroblasts, collagen, and a culture solution can be prepared by gelling.
  • Preferably, after gelling the mixed solution containing fibroblasts, collagen, and the culture solution, further adding the mixed solution containing collagen and the culture solution, and repeating the gelation at least once or more A dermal layer may be formed.
  • the origin of the fibroblast used for preparation of the dermis layer of artificial skin is not limited,
  • the fibroblast derived from a human, a monkey, a pig, a cow, a horse, a dog, a cat, a mouse, a rat can be used.
  • the fibroblasts used for producing the dermis layer of artificial skin may be derived from any part of the living body, for example, neonatal, fetal, adult buttocks, scalp, palm, sole, foreskin-derived fibroblasts. Cells can be used.
  • the epidermis layer of the artificial skin of the present invention can be formed by applying a mixed solution containing keratinocytes and a culture solution to the surface of the dermis layer prepared by the above method, for example, and culturing them. it can.
  • the origin of the keratinocytes used for the production of the epidermis layer of artificial skin is not limited. For example, keratinocytes derived from humans, monkeys, pigs, cows, horses, dogs, cats, mice, and rats can be used.
  • the keratinocytes used for producing the epidermis layer of the artificial skin may be derived from any part of the living body, for example, the horn, scalp, palm, sole, foreskin derived from the neonate, fetus or adult. Cells can be used.
  • the artificial skin of the present invention may further have an adipose tissue layer below the dermis layer.
  • the “adipose tissue layer” in the present invention is not particularly limited as long as it is a structure containing a fat cell and having a composition capable of culturing the cell.
  • it may be a collagen gel containing a fat tissue.
  • the hair follicle penetrates the epidermis layer and is embedded in the dermis layer, but the hair follicle may be configured to be covered with fat precursor cells in the dermis layer.
  • the method for producing the artificial skin having such a configuration is not limited.For example, before transplanting the hair follicle into the artificial skin composed of the epidermis layer and the dermis layer, fat precursor cells are implanted in the transplantation site of the hair follicle, and then By transplanting the hair follicle, the desired configuration can be obtained.
  • the hair follicle can be transplanted into artificial skin composed of an epidermis layer and a dermis layer to obtain a desired configuration.
  • the origin of the adipose precursor cells used in the present invention is not particularly limited, and may be a commercially available adipose precursor cell, or a preadipocyte derived from a commercially available or mesenchymal stem cell isolated from a living body by a known method. It may also be a preadipocyte isolated directly from a living tissue.
  • the isolated hair follicle used in the present invention may be an isolated hair follicle collected from the skin of an animal.
  • the type of animal from which hair follicles are collected is not limited, and for example, isolated hair follicles derived from humans, monkeys, pigs, cows, horses, dogs, cats, mice, and rats can be used.
  • the method for trimming hair follicles collected from animal skin is not limited.
  • the isolated hair follicle used in the present invention is isolated from the collected skin so as not to damage the sebaceous glands. Can be obtained.
  • an artificially induced hair follicle can also be used as an isolated hair follicle used in the present invention.
  • the method for producing artificially induced hair follicles is not limited, and for example, hair follicles artificially induced using the methods described in WO2012 / 108069 and WO2012 / 115079 can be used.
  • a first cell aggregate substantially composed of mesenchymal cells and a second cell aggregate substantially composed of epithelial cells are brought into close contact and cultured inside the support.
  • the hair follicle derived from the regenerated hair follicle primordium produced by doing so can be used in the present invention.
  • At least one of the mesenchymal cells and the epithelial cells is a mesenchyme obtained by inducing undifferentiated cells (for example, iPS cells, ES cells, various tissue stem cells, various progenitor cells). It may be a lineage cell or an epithelial cell.
  • at least one of the mesenchymal cells and the epithelial cells may be a mesenchymal cell or an epithelial cell obtained from a single cell derived from an animal hair follicle.
  • the regenerated hair follicle primordium obtained by the above method may be transplanted into the skin of a living body, collected again after the hair follicle has grown to some extent, and used in the present invention.
  • hair follicles artificially induced using the method described in WO2016 / 039279 can be used in the present invention. Specifically, after stimulating an embryoid body derived from a pluripotent stem cell with a physiologically active substance capable of activating the Wnt pathway, the embryoid body is bound to a scaffold material, and the conjugate is transplanted into an animal body. To do. Then, since a teratoma frequently including skin appendages such as hair follicles and sebaceous glands is formed at the transplant site, hair follicles collected from the teratoma can be used in the present invention.
  • the isolated hair follicle is so arranged that the surface of the dermis layer of the artificial skin substantially coincides with the position of the pore portion of the isolated hair follicle.
  • Transplant into artificial skin By this step, after transplantation of the hair follicle, the pore part of the hair follicle and the epidermal layer of the artificial skin are connected, and the hair follicle and sebaceous gland become functional as skin appendages.
  • the pore part of the hair follicle and the skin layer of the artificial skin are “connected” (or the pore part of the hair follicle and the skin layer of the artificial skin are “continuous”).
  • the epidermal layer of the artificial skin are at least partly linked histologically.
  • Example 1 Production of artificial skin with hair follicles, sebaceous glands, and pores
  • FIG. 1 A schematic diagram of an artificial skin produced by the method of the present invention is shown in FIG. Moreover, the procedure of two embodiment of the manufacturing method of the artificial skin of this invention implemented in the present Example was shown in FIG.
  • mice were purchased from Shimizu Experimental Materials (Tokyo, Japan). Mouse management and manipulation was in accordance with NIH laboratory animal guidelines. All experiments were conducted with the approval of the animal experiment committee of RIKEN.
  • human materials are subject to the “Helsinki Declaration” (revised in 1975 in Tokyo) and have been approved and approved by the Research Ethics Review Committee at RIKEN and the medical institutions that provide them.
  • informed consent was obtained from donors and collected by joint research medical institutions.
  • the human material used in this study refers to the scalp tissue provided by a medical institution in Japan, the hair follicle separated from the tissue, and the surrounding tissue. Purchased cultured human-derived cells are not included.
  • HDFn Cell culture Normal human newborn foreskin fibroblasts
  • HEKn normal human newborn foreskin epidermal keratinocytes
  • the collagen solution was stored in ice until it was dispensed into the cell culture insert.
  • the cell culture insert in which an artificial dermis layer was formed by gelation of the cell-containing collagen solution was placed on a 12-well culture plate filled with DMEM10 medium containing 10 ng / ml FGF2 (Wako Pure Chemical Industries) and cultured overnight. The following culture conditions were all 37 ° C., 5% CO 2 and 100% humidity.
  • the mixture was allowed to stand for 30 minutes at 37 ° C., 5% CO 2, 100% humidity, and gelled, and the outer peripheral gap was supplemented with cell-free collagen gel, so that the medium components of the 12-well plate were placed in the cell culture insert. Prevented inflow.
  • the same treatment was performed once a day for 3 days after gel formation. Macrographs of the fibroblast-containing collagen gel were taken at each treatment, and it was measured that the contraction rapidly progressed until the third day and then reached a nearly steady state. It was confirmed that it was made to function.
  • An artificial skin was prepared by incorporating a hair follicle into the fibroblast-containing collagen gel prepared by the above methods (1) to (4) and then overlaying the epidermis layer.
  • the specific method is as follows. First, on the first day after the formation of the fibroblast-containing collagen gel, an incision for hair follicle incorporation was made on the collagen gel. Using an ophthalmic micro knife (straight knife Straight 22.5 °, Manny), a slit about 1.2 times the width of a hair follicle was formed on the gel surface. The slit depth was set to a depth that did not damage the bottom filter surface of the cell culture insert, and an inclination angle of about 30 degrees. A hair follicle of a cheek beard, a hair follicle of the trunk back skin, or a human hair follicle (both isolated hair follicles) was inserted into the slit from the surface side.
  • the epidermis layer is formed on the surface of the fibroblast-containing collagen gel by the same method as described in “3. Production of artificial skin by incorporating hair follicles after formation of the dermis layer and epidermis layer”, and air culture is performed. went.
  • the hair follicles to be incorporated into the artificial skin are in the growth stage VI among the hairs of the cheeks of the B57 / B6 mice aged 5-7 days and the back skin of the trunk and human hair follicles, and the hair type can be specified from the body surface What grew the hair shaft was used.
  • mouse cheek beards, dorsal skin body hair, and human scalp hair follicles in which club hair remains have been previously described (Toyoshima et al. (NATURE COMUNICATIONS
  • the body hair was cut and separated from the skin so as to be horizontal to the hair follicle so as to include the skin epidermis layer, dermis layer and subcutaneous fat layer as a hair group consisting of 10-15 complete hair follicles.
  • Human hair follicles were separated to form a hair group consisting of one hair follicle or two hair follicles, and the dermal tissue and skin epidermis layer above the hair follicles were trimmed in the same manner as the beard.
  • An artificial skin was prepared by forming an epidermis layer on the surface of the fibroblast-containing collagen gel prepared by the methods (1) to (4) described above, and then incorporating a hair follicle.
  • HEKn cells grown to 60% -80% confluent were single-celled by trypsin digestion and suspended in HuMedia-KG2 medium to 2 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • a cell suspension of 500 ⁇ l per well was seeded on the fibroblast-containing collagen gel prepared in (4) and cultured to form a keratinized epidermis layer on the fibroblast-containing collagen gel.
  • Overlaid HEKn cells were cultured in HuMedia-KG2 medium or DMEM10 medium until the 4th day after seeding, and the whole medium was changed under the same medium conditions as those in the double layer seeding on days 1, 2 and 3 after HEKn cell seeding. .
  • the above-described operation was performed after the collagen gel was replenished with the contraction of the fibroblast-containing collagen gel.
  • the amount of DMEM10 medium containing 10 ng / ml FGF2 in Well was adjusted to be the same as the liquid level of HuMedia-KG2 medium in the cell culture insert.
  • the culture in the cell culture insert was removed to start air culture, which is a culture condition in which the epidermis layer is directly exposed to atmospheric oxygen partial pressure conditions.
  • hair follicles were incorporated into the fibroblast-containing collagen gel in which the epidermis layer was formed.
  • HEKn cells were layered on a collagen gel containing HDFn cells, and hair follicles were incorporated on the third day, and air culture was started on the fourth day.
  • an isolated mouse cheek beard prepared by the method described in “2. Production of artificial skin by forming epidermis after incorporation of hair follicle into dermis layer” was used. The hair follicle incorporation into the artificial skin penetrates both the epidermis layer and the cell-containing collagen gel layer in the same manner as described in “2. Production of artificial skin by forming the epidermis after incorporation of the hair follicle into the dermis layer”.
  • a slit was formed.
  • an incision in the epidermis layer was formed by moving the ophthalmic micro scalpel shallowly in the horizontal direction, and then an incision was made in the dermis layer.
  • the ectodermal organs such as interepithelial hair follicles and sweat glands function as a skin organ system (outer skin system) by connecting to the skin epidermis layer through pores and openings of conduits. That is, in order for the sebaceous glands incorporated into the artificial skin together with the hair follicle to become functional, it is important that the pores of the incorporated hair follicle and the epidermal layer of the artificial skin are continuous.
  • the medium was removed, and the formalin fixative (SuperFix, KURABO) was placed in the cell culture insert and in the plate Well, respectively, and fixed in tissue by 1 ml and 2 ml respectively. Tissue fixation is performed for 6-12 hours in a room temperature environment. After fixation, the tissue is transferred to PBS (-) at room temperature, and becomes perpendicular to the epidermal layer including the midline, pores, and hair growth direction of the artificial hair follicle-embedded artificial skin. The split surface was cut out to produce a paraffin-wrapped block.
  • a continuous section having a thickness of 10 ⁇ m was prepared in accordance with a conventional method, followed by H & E staining, and the continuous position of the hair follicle and the epidermis layer and the hair bulb portion connected thereto were traced.
  • the outer follicular root sheath and the skin layer of the artificial skin are formed in the upper pore region of the hair follicle incorporated into the artificial skin. It was shown to be linked.
  • the hair follicle in the artificial skin produced by the method of the present invention is connected to the artificial skin epidermis layer through the pores and has a functional skin appendage.
  • the artificial skin obtained by the method of the present invention has a functional skin appendage.
  • Example 2 Production of artificial skin further having an adipose tissue layer
  • Production of 6-well format artificial skin was performed according to the following procedure.
  • HDFn normal human newborn foreskin fibroblasts
  • HEKn normal human newborn foreskin epidermal keratinocytes
  • a 10-fold concentration DMEM, 1M NaHCO 3 , and 1M HEPES buffer were prepared as additives for neutralizing the acidic collagen solution to obtain a cell survival environment, and refrigerated at 4 ° C. as stock. 400 ⁇ l each of HDFn cells dispersed in a neutral collagen solution is dispensed into a 6-well cell culture insert (0.4 ⁇ m / high-density pore) and allowed to stand at 37 ° C., 5% CO 2 , 100% humidity for 30 minutes. And an artificial dermis layer having a thickness of 1.0 to 1.5 mm was formed.
  • Collagen solution preparation and cell dispersion were carried out on ice so that the surface of the fibroblast-containing collagen gel was horizontal with the filter surface of the cell culture insert top and the gelation proceeded uniformly.
  • the collagen solution was stored in ice until it was dispensed into the cell culture insert.
  • the cell culture insert in which the artificial dermis layer was formed by gelation of the cell-containing collagen solution was placed on a 6-well culture plate filled with DMEM10 medium containing 10 ng / ml FGF2 (Wako Pure Chemical Industries) and continued to culture until the formation of the epidermis layer. .
  • the following culture conditions were all 37 ° C., 5% CO 2 and 100% humidity.
  • ⁇ Formation of skin layer> An epidermis layer was formed on the surface of the fibroblast-containing collagen gel produced by the above method to produce an artificial skin.
  • the specific method is as follows. HEKn cells grown to 60% -80% confluent were single-celled by trypsin digestion and suspended in HuMedia-KG2 medium to 3.7 ⁇ 10 6 cells / ml. A cell suspension of 1 ml per well is overlaid on the fibroblast-containing collagen gel prepared in (4) of Example 1 and cultured to form a keratinized epidermis layer on the fibroblast-containing collagen gel. Formed.
  • Overlaid HEKn cells were cultured in HuMedia-KG2 medium or DMEM10 medium until the 4th day after seeding, and the whole medium was changed under the same medium conditions as those in the double layer seeding on days 1, 2 and 3 after HEKn cell seeding. .
  • the above-described operation was performed after the collagen gel was replenished with the contraction of the fibroblast-containing collagen gel.
  • the amount of DMEM10 medium containing 10 ng / ml FGF2 in Well was adjusted to be the same as the liquid level of HuMedia-KG2 medium in the cell culture insert.
  • Air culture (37 ° C., 5% CO 2 , 12.5%), which is a culture condition in which the epidermal layer is exposed to low oxygen partial pressure conditions by removing the medium in the cell culture insert on the fourth day after HEKn cell overlaying O 2 , 100% humidity conditions).
  • the above-mentioned artificial skin subjected to air culture for 2 days was layered on a subcutaneous fat-containing collagen gel (adipose tissue layer) described later, and then used for incorporation of hair follicles.
  • a subcutaneous fat-containing collagen gel asdipose tissue layer
  • subcutaneous fat-containing collagen gel (adipose tissue layer) Skin tissue obtained by trimming unnecessary portions such as connective tissue from the back skin tissue of a mouse was cut into a ribbon shape, and then adipose tissue was collected using tweezers. Disperse the minced adipose tissue in a collagen neutral solution prepared by the method described in Example 1, (4), and leave it at 37 ° C., 5% CO 2 , 100% humidity for 30 minutes. The gelled gel was further cut into 3 mm squares, placed in a collagen gel neutral solution, and gelled by the same method as described above as a subcutaneous fat layer. As a control, a collagen gel containing no adipose tissue was also prepared.
  • An intact hair follicle containing the collagen sheath (upper row in FIG. 7) and a hair follicle from which the collagen sheath in the variable region was removed (lower row in FIG. 7) were prepared by collecting mouse whisker from the growing phase.
  • the hair follicles of each condition were adhered to the bottom of a 6 cm plastic culture dish with a thin layer collagen gel, and immersion culture was performed in DMEM / F12 (1: 1) containing 10% FBS in a 5% CO2 environment for 3 days. I went to my eyes.
  • the patient was observed daily with a stereomicroscope.
  • the arrow indicates the tip of the hair shaft, and the arrowhead indicates the position of the hair bulb.
  • the right column shows an enlarged image of the hair bulb part on the third day of culture.
  • the point gland shows the mesenchymal tissue boundary of the outermost layer of the hair follicle.
  • the hair bulb part moves to the upper part of the hair follicle to form a structure called secondary hair bud in the structural change of the hair follicle from the growth stage through the regression stage to the resting stage. For this reason, the increase in the position of the hair bulb and the shift of the mesenchymal tissue boundary of the hair follicle indicate that they are in a regression phase or a resting phase.
  • the mouse cheek beard hair follicle is in vivo in a state of being wrapped in a collagen sheath, and if the hair follicle in the growth phase is cultured in vitro with the collagen sheath attached, the hair shaft is elongated and the growth phase is maintained. It is known (for example, Biochemical and Biophysical Research Communications 367 (2008) 299-304). On the other hand, it is well known in the field of hair transplantation that hair follicles used for single hair follicle transplantation and the like enter a resting phase after a regression phase.
  • FIG. 8b shows a tissue image of the transplanted hair follicle on day 3 of organ culture.
  • the hair follicle incorporated in the artificial skin having no adipose tissue layer (FIG. 8b left) was a linear hair follicle mesenchymal image (arrow) indicating the regression phase, whereas the artificial skin having the adipose tissue layer
  • the dotted line on the right of the photograph shows the boundary between the dermis (Der) and adipose tissue (Adp).
  • adipose tissue has an effect of promoting hair follicle growth. That is, it was shown that the artificial skin of the present invention can evaluate hair follicle growth by the interaction between the hair follicle and the subcutaneous fat tissue.
  • Example 3 Manufacture of artificial skin using regenerated hair follicle primordium
  • Preadipocytes are commercially available from REC (rapidly expanding cell, purchased from Bay Bioscience), which is a commercially available mesenchymal stem cell (Mabuchi Y. et al., Stem Cell Reports, 1). , 152-165, 2013).
  • REC is thawed rapidly in a 37 ° C. water bath, washed with Adipogenic Maintenance Medium (Lonza), seeded in a culture plastic dish filled with the same medium at a cell density of 21,000 cells / cm 2 , and cultured for 3 days Went.
  • Adipogenic Maintenance Medium Licosine
  • the cells were collected according to a conventional method using a solution obtained by adding 0.25% Trypsin-1 mM EDTA (Invitrogen) to D-PBS ( ⁇ ) (Nacalai Tesque). Expression of the preadipocyte marker PPAR ⁇ gene in the obtained cells was confirmed and used as a REC-derived preadipocyte.
  • the regenerated hair follicle primordium was transferred onto a cell culture insert, and organ culture was performed for 7 days while adjusting the partial pressure of gas in a multi-gas chamber using DMEM / F12 (1: 1) medium containing 10% FBS. After 7 days, hair follicle development was determined under a stereomicroscope (FIG. 9a center left). This was divided
  • Epidermis + dermis model (artificial skin before hair follicle incorporation in Example 1) 2.
  • Epidermis + dermis + adipose tissue model (artificial skin before hair follicle incorporation in Example 2) 3.
  • Epidermis + dermis + REC model artificial skin in which fat precursor cells derived from REC are incorporated into a transplant hole into which a hair follicle is transplanted in 1 artificial skin
  • a 25G injection needle is used to form a graft hole that extends to the lower layer of the artificial skin, so that the artificial skin surface and the depth at which the pores of the divided hair follicles coincide with each other.
  • a micropipette is used to inject 0.2 ⁇ l of REC-derived preadipocyte conglomerate from which the culture solution has been removed into the transplantation hole, and then the hair follicles in the same manner as described above. Incorporated.
  • FIG. 9b Histological analysis of the transplanted hair follicle
  • the upper part of FIG. 9b shows the result of “epidermis + dermis model”, the middle part of “epidermis + dermis + adipose tissue model”, and the lower part of “epidermis + dermis + REC derived adipose precursor cell model”.
  • An enlarged view of the square range shown in the weak enlarged view in the left column of FIG. 9b is shown in the right column. In both models, it was shown that the epithelial tissue of the transplanted hair follicle was connected to the artificial skin epidermis layer.
  • Example 4 Effect of adipose tissue and adipose precursor cells on hair shaft growth of hair follicles in artificial skin
  • a hair follicle from which the collagen sheath of the variable region was removed was obtained by collecting the mouse cheek beard at the growing stage.
  • the hair follicle is modeled on the “epidermis + dermis model (without adipose tissue)”, “epidermis + dermis + adipose tissue model” or “epidermis + dermis + REC derived adipose precursor cell (induction period 2 days or 7 days) model of Example 3. Incorporated into the artificial skin ", organ culture was performed for 3 days.
  • Organ culture conditions were carried out by semi-gas phase culture under DMEM / F12 (1: 1) containing 10% FBS, 5% CO2, and O2 atmospheric partial pressure. Hair shaft growth on the 3rd day of culture is macroscopically photographed using a stereomicroscope (Stemi2000, Zeiss), and changes in hair shaft length are measured using image analysis software (AxioVision, Zeiss and Image J, NIH). did. In addition, hair follicles and hair shaft lengths before transplantation and hair follicles with hair follicle-embedded artificial skin were collected over time, and the hair follicles and hair shaft lengths were similarly measured by image analysis to quantitatively evaluate hair shaft growth. The function was evaluated.
  • the results are shown in FIG.
  • the “epidermis + dermis + adipose tissue model” or “epidermis + dermis + REC derived adipose precursor cell model” shows the effect of hair stem growth, especially REC-derived progenitor cells with an induction period of 7 days. It showed the highest hair follicle growth effect.
  • the hair follicles in the artificial skin produced by the method of the present invention behaved similarly to the hair follicles in living skin.
  • the artificial skin produced by the method of the present invention reproduces the structure and function closer to the living body skin than conventional artificial skin.
  • the artificial skin of the present invention it has been shown that not only skin appendages such as hair follicles but also fat and similar cells can be introduced. Therefore, it can be said that the artificial skin of the present invention is extremely useful in, for example, the evaluation of the efficacy and safety of pharmaceuticals and cosmetics on the skin.

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Abstract

【課題】　本発明は、毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚を提供することを課題とした。 【解決手段】　毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造方法であって、前記製造方法は、下記の各ステップ； （Ａ）：真皮層および表皮層を有する人工皮膚、または、真皮層のみを有する人工皮膚を準備するステップ；および、 （Ｂ）：ステップ（Ａ）で準備した人工皮膚に、単離された毛包を移植するステップ； を含み、ここで、前記単離された毛包は、皮脂腺を有するものであり、前記単離された毛包は、前記人工皮膚の前記真皮層の表面と、前記単離された毛包の毛穴部の位置とが一致するように、前記人工皮膚に移植される、 ことを特徴とする、方法を提供する。

Description

毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造方法
　本発明は、人工皮膚の製造方法、および、当該方法により製造される人工皮膚に関する。
　近年、欧州を中心として、動物愛護の観点から動物実験を廃止し、医薬品や化粧品の薬効評価や安全性評価を動物実験代替法で行うための技術開発が進められている。また、近年、生体より取り出した細胞を人為的に増殖させるための細胞培養技術の開発の進展により、様々な臓器や組織の生理的機能を保持しつつ生体外培養することが可能となってきている。その結果、ヒト由来培養細胞を用いた各種の試験評価法が開発され、これらの代替評価法を用いて、医薬品候補物質が人体に対してどのような影響を与えるか、またどのような投与量により所望の効果や有害作用を及ぼすかを調べることも可能となってきている。さらに、培養細胞、細胞足場材料および培養液を組み合わせることによる人工皮膚の製造方法の開発が進められ、Ｈ．Ｇｒｅｅｎ博士により、天然の皮膚と同等の機能と構造を持つ三次元培養皮膚が発明されたことを契機として、皮膚科学分野は動物実験代替法の開発における草分けとなっている。これまでにも、皮膚に対する医薬品や化粧品の薬効評価や安全性評価を、実験動物を用いずに行うための、人工皮膚の開発と製品化、および、人工皮膚を用いた動物実験代替法が提案されている（例えば、特許文献１）。
　表皮と真皮組織および皮下組織より構成される皮膚は、体の表面をくまなく覆い、体内と外界を隔てている巨大な器官である。皮膚には、毛包、皮脂腺、および汗腺といった多様な外胚葉性器官が分布し、これらが構造的かつ機能的に連携することにより外皮系（皮膚器官系）を構成している。外皮系は毛を伸ばすことにより様々な外的侵害から体表を防御し、皮脂や汗の分泌により体表の環境調節や老廃物の排泄を行い、さらに循環器系や神経系といった他の器官系とも連携することにより、体温調節や感覚受容といった多彩な生理的機能を担っている。皮膚付属器により皮膚表面に分泌される種々の水溶性および脂溶性成分は、強固な角化重層上皮である表皮層の物質透過性や水分含有量を変化させることから、アレルギー性疾患や加齢にともなう審美的変化との関連が示唆されている。
　しかし、これまで提案されている人工皮膚は、単純に表皮層と真皮層を含むのみで皮膚付属器官を有しないものや、皮膚付属器官様の構造（例えば毛包様の構造）を含むものであっても、正常な皮膚の構造および機能を再現するものではなかった。機能的な皮膚付属器官を有しない人工皮膚は、皮脂等による皮膚のバリア機能が存在しないため、実験動物の代替物としての使用には限界がある。
　例えば、特許文献１では、収縮剤細胞（例えば線維芽細胞）を含むコラーゲンマトリックス層と、組織付属器官を構成する細胞（例えば毛乳頭細胞）を含むコラーゲンマトリックス層とを重層させて培養することにより、培養物内に毛包様の構造物が発生し得ることを示している。しかし、特許文献１においては、単に、外形上毛包に似た構造物が発生したことが示されているに過ぎず、皮膚付属器官の正常な構造および機能を再現した人工皮膚は示されていない。
特開平１０－１３６９７７
　本発明は、毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚を提供することを課題とした。
　本発明者らは、動物の皮膚のバリア機能を再現し得る人工皮膚を製造するために鋭意研究を重ねた結果、機能的な皮膚付属器官を有する人工皮膚の製造に成功した。
　すなわち本発明は、一実施態様において、
　毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造方法であって、
前記製造方法は、下記の各ステップ
（Ａ）：真皮層および表皮層を有する人工皮膚、または、真皮層のみを有する人工皮膚を準備するステップ；および、
（Ｂ）：ステップ（Ａ）で準備した人工皮膚に、単離された毛包を移植するステップ；
を含み、ここで、
　前記単離された毛包は、皮脂腺を有するものであり、
　前記単離された毛包は、前記人工皮膚の前記真皮層の表面と、前記単離された毛包の毛穴部の位置とが一致するように、前記人工皮膚に移植される、
ことを特徴とする、方法に関する。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、
　前記ステップ（Ａ）において、真皮層のみを有する人工皮膚が使用され、
　前記ステップ（Ｂ）の後に、以下のステップ
（Ｃ）：前記人工皮膚の前記真皮層上に、表皮層を形成させるステップ；
を含むことを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、
　前記ステップ（Ａ）における人工皮膚の真皮層は、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化させることにより形成されたものである、ことを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、
　前記ステップ（Ａ）における人工皮膚の真皮層は、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化させた後、さらに、コラーゲンおよび培養液を含む混合液を添加し、ゲル化させることを少なくとも１回以上繰り返すことにより形成されたものである、ことを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、
　前記ステップ（Ａ）における「真皮層および表皮層を有する人工皮膚」の表皮層は、前記真皮層の表面に、角化細胞および培養液を含む混合液を適用し、これらを培養することにより形成されたものである、ことを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、
　前記ステップ（Ｃ）は、前記人工皮膚の前記真皮層の表面に、角化細胞および培養液を含む混合液を適用し、これらを培養することにより、前記表皮層を形成させるステップ、であることを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、前記ステップ（Ａ）が、
　（Ａ）：真皮層、表皮層、および、脂肪組織層を有する人工皮膚を準備するステップ、であることを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、前記ステップ（Ａ）の後、かつ、前記ステップ（Ｂ）の前に、以下のステップ
（Ａ’）：ステップ（Ｂ）において単離された毛包が移植される人工皮膚の部位に、脂肪前駆細胞を埋め込むステップ；
を含むことを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、前記単離された毛包が、動物の皮膚から単離された毛包であることを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、前記単離された毛包が、ヒトの皮膚から単離された毛包であることを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、前記単離された毛包が、人工的に誘導された再生毛包であることを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、前記再生毛包が、間葉系細胞から実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的に構成される第２の細胞集合体とを密着させて支持体内部で培養することにより製造される再生毛包であることを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかが、未分化細胞を誘導することにより得られたものであることを特徴とする。
　また、本発明の方法は、一実施態様において、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかが、動物の毛包由来の単一化された細胞であることを特徴とする。
　本発明は、他の実施形態において、毛包、皮脂腺を有する人工皮膚であって、さらに、毛穴を有することを特徴とする、人工皮膚に関する。
　また、本発明は、一実施形態において、
　線維芽細胞、コラーゲン、および培養液を含むゲルからなる真皮層、
　前記真皮層の表面に形成され、実質的に角化細胞からなる表皮層、および、
　皮脂腺を有する毛包、を含み、
　前記毛包は、前記表皮層を貫いて前記真皮層へ埋没しており、
　前記毛包の毛穴部が、前記表皮層と接続している、
人工皮膚に関する。
　また、本発明の人工皮膚は、一実施形態において、前記真皮層の下部に、さらに脂肪組織層を有することを特徴とする。
　また、本発明の人工皮膚は、一実施形態において、前記毛包が、前記真皮層中で脂肪前駆細胞に覆われていることを特徴とする。
　また、本発明は、一実施形態において、上記に述べた本発明の人工皮膚の製造方法によって製造される人工皮膚であることを特徴とする。
　上記に述べた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。
　本発明の方法によれば、機能的な毛包、皮脂腺および毛穴を備え、正常皮膚のバリア機能を再現した人工皮膚を製造することができる。これにより、医薬品や化粧品の薬効評価や安全性評価（特に、毛に関する医薬品や化粧品の薬効評価や安全性評価）に有用な人工皮膚を提供することができる。
図１は、本発明の方法によって製造される、毛包、皮脂腺を有し、これらと表皮層とが毛穴部を介して連結した人工皮膚の模式図である。図１Ａは毛包などの皮膚付属器官を組み込んだ人工皮膚の三次元的な模式図である。図１Ｂは図１Ａの四角で示した部分の毛包を含む断面の模式図を示す。人工皮膚の毛包および皮脂腺の開口部は、人工皮膚の角化表皮層と連続しており、その表面より毛を萌出し、体表面へと皮脂分泌が行われる。 図２は、本発明の人工皮膚の製造方法の２つの実施態様を示した図である。本発明の方法は、人工皮膚の角化表皮層形成および皮脂腺を含む毛包の組み込み時期により、毛包組み込み後に表皮形成を行う方法と、表皮層形成後に毛包を組み込む方法の二種に大別される。 図３は、本発明の方法の一実施態様により、真皮層のみを有する人工皮膚に単離された毛包を移植し、その後表皮層を形成させ、培養した結果を示す。図３Ａは、真皮層のみを有する人工皮膚（細胞含有コラーゲンゲル）の形成をＤａｙ０として、Ｄａｙ１に人工真皮層内に成体マウス頬ヒゲ毛包を組み込み、同日中に培養ケラチノサイトを人工真皮上に重層播種して表皮層の形成を実施し、Ｄａｙ８まで観察を行った際の写真である。図３Ｂは、図３Ａの手順において、移植する毛包としてマウス頬ヒゲの毛包を用いた場合の人工皮膚の組織像を示す。人工皮膚に組み込んだ毛包を含む組織の連続切片の弱拡大像を写真左上下に示し、左上および左下の四角にて示した部分の拡大写真をａ－ｃに示す。拡大写真の部位は弱拡大中のａ－ｃの記号にて示す。毛包の毛穴部の上皮と人工皮膚の角化表皮層が連続している部分をａの矢印にて示し、毛球部はｂの矢尻にて示す。図３Ｃは、図３Ａの手順において、マウス体毛の毛包を組み込み、７日間培養した後の人工皮膚より連続切片を作製して観察した組織像を上下写真として示す。写真左は弱拡大像であり、四角にて示した領域の拡大像を写真右の上下にそれぞれ示す。拡大像の矢印部において人工皮膚へ組み込まれた毛包と、人工皮膚の角化表皮層とが毛穴部を介して接続している。また、写真右下段の毛球部のＨＥ像に矢尻にて示す毛球部は組織学的に健全である。 図４は、本発明の方法の一実施態様により、真皮層および表皮層を有する人工皮膚に単離された毛包を移植し、培養した結果を示す。図４Ａは、真皮層および表皮層を有する人工皮膚（細胞含有コラーゲンゲル）の形成をＤａｙ０として、Ｄａｙ４に毛包（マウス頬ヒゲの毛包）の移植を実施し、Ｄａｙ１０まで観察を行った際の写真である。図４Ｂは、毛包移植後の人工皮膚の組織像（Ｈ＆Ｅ染色）を示す。矢印部において、移植した毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層とが接続しており、矢頭部において、毛母細胞と毛乳頭細胞が生存しており、毛球部は組織学的に健全であることが示されている。 図５は、人工皮膚へ組み込まれた毛包より成長した毛幹を経時的に観察して画像解析により毛幹長を計測した結果を示す。図５Ａは、成体マウス頬ヒゲの毛包を人工皮膚へ移植した後に表皮層を形成させた場合における毛幹成長の観察結果である。人工皮膚へ組み込んだ複数の毛包をそれぞれ識別してそれぞれの毛幹成長を経時的に追跡した。成長した毛幹を赤矢印にて示し、成長しなかった毛幹を白矢印にて示す。図５Ｂは、成体マウス体毛の毛包を人工皮膚へ移植した後に表皮層を形成させた場合における毛幹成長の観察結果である。マウス頬ヒゲにおける経時的観察と同様に、人工皮膚に組み込んだ毛包を識別して、毛成長した毛包（赤矢印）の毛幹長を計測した。図５Ｃは、ヒト頭髪の毛包を人工皮膚へ移植した後に表皮層を形成させた場合における毛幹成長の観察結果である。マウス毛包と同様に毛幹長を計測してプロットを行った。 図６は、真皮層および表皮層を有する人工皮膚へ毛包を移植した後の毛幹成長を観察した結果を示す。毛包の移植前に毛幹の実体顕微鏡写真を撮影し、毛球部最上端よりクラブヘアーと成長期毛幹の長さを計測し、人工皮膚への移植後３、６、１２日目に人工皮膚より毛幹と毛包を摘出して、同様に実体顕微鏡による撮影を行って毛幹成長量を計測した。クラブヘアーの長さを内部標準として成長期毛の伸長量を計測プロットした。 図７は、マウス頬ヒゲ毛包の器官培養における経時変化を示す。成長期のマウス頬ヒゲを採取してコラーゲン鞘を含むインタクト毛包（上段）および可変領域のコラーゲン鞘を除去した毛包（下段）を作製した。それぞれの条件の毛包を６ｃｍプラスチック培養皿の底面に薄層コラーゲンゲルにて接着し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）中にて５％ＣＯ２環境下において浸漬培養を３日目まで行った。培養開始時（Ｄａｙ　０）より毎日実体顕微鏡により経過観察を行った。矢印は毛幹先端を示し、矢尻は毛球部の位置を示す。右列には培養３日目の毛球部拡大像を示す。点腺は毛球部の間葉組織境界を示す。毛球部位置と毛球部の間葉組織境界のズレは退行期または休止期であることを示す。 図８は、表皮および真皮のみの人工皮膚モデルと、表皮、真皮および脂肪組織層を有する人工皮膚モデルの比較を示す。図８ａは、本実験の流れを示す。成長期のマウス頬ヒゲを採取して可変領域のコラーゲン鞘を除去した毛包を作製した。これを６ｗｅｌｌフォーマットとして作製した表皮＋真皮モデルまたは表皮＋真皮＋脂肪組織モデルの人工皮膚に組み込みこみ、３日間の器官培養を行った。器官培養条件は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、５％ＣＯ２環境下として、半気相培養により実施した。図８ｂは、器官培養３日目の組織像を示す。表皮＋真皮モデルに組み込まれた毛包（左図）は退行期を示す線状の毛包間葉像（矢印）であったのに対して、表皮＋真皮＋脂肪組織モデルに組み込まれた毛包（右図）は成長期毛球部であることが示された、写真右の点腺は真皮（Ｄｅｒ）と脂肪組織（Ａｄｐ）の境界を示す。 図９は、人工的に作製した再生毛包を用いて本発明の人工皮膚を作製した結果を示す。図９ａは本実験の流れを示す。図９ｂ上段は「表皮＋真皮モデル」、中段は「表皮＋真皮＋脂肪組織モデル」、下段は「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞モデル」の結果を示す。図９ｂ左列の弱拡大図中に示した四角の範囲を拡大したものを右列に示す。いずれのモデルにおいても、移植した毛包の上皮組織は人工皮膚表皮層と接続していることが示された。 図１０は、「表皮＋真皮モデル」、「表皮＋真皮＋脂肪組織モデル」、「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞モデル」のそれぞれにおいて、毛幹の成長を比較した結果を示す。
　本発明は、毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚およびその製造方法に関する。本発明の方法により製造される人工皮膚は、皮脂腺を有する毛包を有しており、前記毛包は表皮層を貫いて真皮層へ埋没しており、前記毛包の毛穴部が前記表皮層と接続していることを特徴とする。
　生体において、毛包は毛乳頭、毛母体、毛根鞘、毛線維、毛隆起、立毛筋、皮脂腺、毛包漏斗部（いわゆる毛穴）等の構造を有する、毛を産生する皮膚付属器官を意味する。しかし、本明細書において、「毛包」は、これらの全ての構造を含むものに限定されず、これらの構造の少なくとも一部を含み、毛を産生する機能を有する構造が維持されているものを広く含む。
　本願明細書において、「人工皮膚」とは、少なくとも真皮層を備える人工的な皮膚様の構造物をいい、好ましくはさらに表皮層を備えるものをいう。本発明において、「真皮層」は主としてコラーゲンや線維芽細胞から構成される構造物を意味し、「表皮層」は主として角化細胞（ケラチノサイト）から構成される構造物を意味する。本発明において用いる人工皮膚（単離された毛包を移植する前の人工皮膚）は、毛包の移植前に調製してもよく、表皮層と真皮層を備える市販の人工皮膚を用いてもよい。
　本発明において用いる人工皮膚（単離された毛包を移植する前の人工皮膚）の製造方法は限定されないが、真皮層については、例えば、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化することによって作製することができる。好ましくは、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化させた後、さらに、コラーゲンおよび培養液を含む混合液を添加し、ゲル化させることを少なくとも１回以上繰り返すことにより真皮層を形成させてよい。人工皮膚の真皮層の作製に用いる線維芽細胞の由来は限定されないが、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット由来の線維芽細胞を用いることができる。また、人工皮膚の真皮層の作製に用いる線維芽細胞は、生体のいずれの部位由来であってもよく、例えば、新生児、胎児、成人の臀部、頭皮、手の平、足裏、包皮由来の線維芽細胞を用いることができる。
　また、本発明の人工皮膚の表皮層は、例えば上記の方法により作製された真皮層の表面に、角化細胞および培養液を含む混合液を適用し、これらを培養することにより形成させることができる。人工皮膚の表皮層の作製に用いる角化細胞の由来は限定されないが、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット由来の角化細胞を用いることができる。また、人工皮膚の表皮層の作製に用いる角化細胞は、生体のいずれの部位由来であってもよく、例えば、新生児、胎児または成人の、臀部、頭皮、手の平、足裏、包皮由来の角化細胞を用いることができる。
　また、本発明の人工皮膚は、真皮層の下部に、さらに脂肪組織層を有していてよい。本発明における「脂肪組織層」は、脂肪細胞を含み、細胞の培養が可能な組成を有する構造物である限り特に限定されないが、例えば脂肪組織を含むコラーゲンゲルであってよい。
　また、本発明の人工皮膚においては、毛包が、表皮層を貫いて真皮層へ埋没しているが、前記毛包が、前記真皮層中で脂肪前駆細胞に覆われるように構成してよい。そのような構成を有する人工皮膚の作製方法は限定されないが、例えば、表皮層および真皮層からなる人工皮膚へ毛包を移植する前に、毛包の移植部位に脂肪前駆細胞を埋め込み、その後、毛包を移植することによって、所望の構成を得ることができる。また、例えば、移植用の毛包の周囲に脂肪前駆細胞を接着させた後に、表皮層および真皮層からなる人工皮膚へ毛包を移植することにより、所望の構成を得ることもできる。
　本発明において用いる脂肪前駆細胞の由来は特に限定されず、市販の脂肪前駆細胞であってもよく、市販の、あるいは生体から単離された間葉系幹細胞から公知の方法で誘導した脂肪前駆細胞であってもよく、生体の組織から直接単離された脂肪前駆細胞であってもよい。
　本発明において用いる単離された毛包は、動物の皮膚から採取された単離された毛包であってよい。この場合、毛包を採取する動物の種類は限定されず、例えばヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット由来の単離された毛包を用いることができる。動物の皮膚から採取された毛包のトリミング方法は限定されず、例えば、採取された皮膚から、皮脂腺を傷つけないように毛包を単離することで、本発明に用いる単離された毛包を得ることができる。
　また、本発明において用いる単離された毛包として、人工的に誘導された毛包を用いることもできる。人工的に誘導された毛包の製造方法は限定されず、例えばＷＯ２０１２／１０８０６９やＷＯ２０１２／１１５０７９に記載の方法を用いて人工的に誘導された毛包を用いることができる。具体的には、間葉系細胞から実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的に構成される第２の細胞集合体とを密着させて支持体内部で培養することにより製造される再生毛包原基由来の毛包を、本発明において用いることができる。この場合、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかは、未分化細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、各種の組織幹細胞、各種の前駆細胞）を誘導することによって得られる間葉系細胞または上皮系細胞であってよい。また、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかは、動物の毛包由来の単一化された細胞から得られる間葉系細胞または上皮系細胞であってよい。また、上記の方法によって得られた再生毛包原基を生体の皮膚へ移植し、毛包がある程度成長した後に再び採取し、本発明に用いてもよい。
　また、例えば、ＷＯ２０１６／０３９２７９に記載の方法を用いて人工的に誘導された毛包を本発明に用いることもできる。具体的には、Ｗｎｔ経路を活性化させ得る生理活性物質で多能性幹細胞由来の胚様体を刺激した後に、当該胚様体を足場材料と結合し、当該結合体を動物の生体へ移植する。すると、当該移植部位に、毛包や皮脂腺等の皮膚付属器官を高頻度に含むテラトーマが形成されるので、当該テラトーマから採取した毛包を本発明に用いることができる。
　本発明の人工皮膚の製造方法においては、単離された毛包を、人工皮膚の真皮層の表面と、前記単離された毛包の毛穴部の位置とが実質的に一致するように、人工皮膚に移植する。この工程により、毛包の移植後、毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層が接続され、毛包および皮脂腺が皮膚付属器官として機能的なものとなる。本発明において、毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層とが「接続する」（あるいは、毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層とが「連続する」）とは、毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層とが、少なくとも部分的に、組織学的に結合していることを意味する。
　本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
実施例１：毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造
　本発明の方法によって製造される人工皮膚の模式図を図１に示した。また、本実施例において実施した、本発明の人工皮膚の製造方法の２つの実施態様の手順を、図２に示した。
１．材料と方法
（１）実験動物
　Ｂ５７／Ｂ６マウスは清水実験材料（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて購入した。マウスの管理および操作はＮＩＨの実験動物指針に従った。全ての実験は理化学研究所の動物実験委員会の審査を受けその認可の上実施した。
（２）ヒト材料
　本研究においてヒト材料は、「ヘルシンキ宣言」（１９７５年東京改訂）の主旨に沿い、理化学研究所および提供医療機関における研究倫理審査委員会に諮り承認を得た上、「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針（平成２６年文部科学省・厚生労働省告示第３号）および関連規制に従い、提供者よりインフォームドコンセントを得た上で共同研究医療機関により採取提供を受け、理化学研究所多細胞システム形成研究センターの所定施設において使用した。本研究におけるヒト材料とは日本国内の医療機関より提供を受けた頭皮組織および、これより分離した毛包および周辺組織を指し、購入した培養ヒト由来細胞は含まれない。
（３）細胞培養
　正常ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＨＤＦｎ）と正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＨＥＫｎ）は第一継代後の凍結細胞としてクラボウより購入した。ＨＤＦｎとＨＥＫｎ細胞は３７℃の温浴にて急速に解凍したのち、１０％ウシ胎児血清と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ１０）にて洗浄し、ＨＤＦｎ細胞はＤＭＥＭ１０培地、ＨＥＫｎ細胞はＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地（クラボウ）を満たした培養プラスチックディッシュに２，５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度として播種し、これを第二継代細胞とした。継代培養は常法に従い、Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、０．２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ－１ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた溶液を用いて消化し、分散させたうえ、細胞密度を調整して各細胞に設定した培地条件にて継代した。正常ヒト細胞は第三継代まで継代培養して人工皮膚作製に供するか、または凍結ストックとし解凍後第四継代細胞として人工皮膚の作製に用いた。凍結ストックとする場合、両者とも６０－８０％コンフレントまで培養を継続し、人工皮膚の作製においては８０％以上のコンフレントとなった状態にて使用した。
（４）線維芽細胞含有コラーゲンゲルの作製
　（３）において継代培養したＨＤＦｎ細胞を、トリプシンＥＤＴＡ溶液により消化してシングルセル化した。次いで終濃度３．８ｍｇ／ｍｌコラーゲン（Ｉ－ＡＣ　５ｍｇ／ｍＬ、ＫＯＫＥＮ）、１ｘＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）、１０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３（和光純薬）、１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４となるように滴定調整、和光純薬）、５％ウシ胎児血清を含むコラーゲン中性溶液を作製し、氷温条件にて穏やかに攪拌しながら遠心分離によりペレット化したＨＤＦｎ細胞を分散させた。コラーゲン酸性溶液を中和して細胞生存環境とするための添加剤として、１０倍濃度ＤＭＥＭ、１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒを作製し、ストックとして４℃冷蔵保管した。コラーゲン中性溶液に分散したＨＤＦｎ細胞を１２ｗｅｌｌ用セルカルチャーインサート（０．４μｍ／高密度ポア）に４００μｌずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下に３０分間静置してゲル化させ、厚さ３－４ｍｍの人工真皮層を形成させた。線維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面がセルカルチャーインサート天部のフィルター面と水平となるように、また一様にゲル化を進行させるために、コラーゲン液調製および細胞分散は氷上にて行い、調整したコラーゲン液はセルカルチャーインサートへの分注時まで氷中に埋没させて保存した。細胞含有コラーゲン溶液のゲル化より人工真皮層を形成したセルカルチャーインサートは、１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２（和光純薬）を含むＤＭＥＭ１０培地を満たした１２ｗｅｌｌ培養プレートに設置して一晩培養した。以下の培養条件は全て３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件とした。
　ヒト線維芽細胞含有コラーゲンゲルを一晩培養した後に、マイクロフィブリル形成によりゲル収縮したことを目視により確認した。その後、新しいセルカルチャーインサートに１００μｌの終濃度３．８ｍｇ／ｍｌのウシ由来天然型コラーゲン１酸性溶液（Ｉ－ＡＣ　５ｍｇ／ｍＬ、ＫＯＫＥＮ）、１ＸＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）、１０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３（和光純薬）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）、５％ウシ胎児血清を含むコラーゲン溶液を入れ、収縮したゲルをピンセットにより移した。その後、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下に３０分間静置してゲル化させ、外周の間隙を細胞不含コラーゲンゲルにより補充することにより１２ｗｅｌｌプレートの培地成分がセルカルチャーインサート内に流入することを防止した。同様の処理をゲル形成後３日間に渡り一日一回の割合で実施した。各処理時に線維芽細胞含有コラーゲンゲルのマクロ写真を撮影し、３日目まで急速に収縮が進行し、その後ほぼ定常状態となることを計測し、線維芽細胞含有コラーゲンゲルが生理的に適切に機能するよう作製されたことを確認した。
２．真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行うことによる人工皮膚の作製（図３）
　上記の（１）～（４）の方法によって作製した線維芽細胞含有コラーゲンゲルに毛包を組み込み、その後表皮層を重層することによって人工皮膚を作成した。
　具体的な方法は次のとおりである。まず、線維芽細胞含有コラーゲンゲルの形成後１日目に、当該コラーゲンゲルに対して毛包組み込み用の切開を行った。眼科用マイクロメス（ストレートナイフ　Ｓｔｒａｉｇｈｔ　２２．５°、マニー）を用いて、ゲル表面へ、毛包の約１．２倍幅のスリットを形成した。スリット深度はセルカルチャーインサートの底部フィルター面に損傷を与えない限界までの深度とし、約３０度の傾斜角とした。このスリット内に、頬ヒゲの毛包、躯幹背部皮膚の体毛の毛包、またはヒト頭髪の毛包（いずれも単離された毛包）を表面側より挿入した。挿入される毛包から伸びている毛幹のみをピンセットにより掴み、毛球部や毛穴部には触れないようにした。挿入の際に細胞不含コラーゲン中性液に毛包を浸してスリット内への組み込みを行った。毛包の毛穴部と線維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面とがほぼ一致するように、移植毛包の深度の調節を行った。
　その後、後述する「３．真皮層および表皮層形成後に毛包組み込みを行うことによる人工皮膚の作製」と同様の方法により、線維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面に表皮層を形成させ、エアカルチャーを行った。
　人工皮膚へ組み込む毛包は、生後５－７日齢のＢ５７／Ｂ６マウスの頬ヒゲと躯幹背部皮膚の体毛およびヒト頭髪毛包のうち成長期ＶＩ期にあり、体表面より毛種を特定可能な毛幹を成長させているものを用いた。またクラブヘアーが残存しているマウス頬ヒゲと背部皮膚体毛、およびヒト頭皮毛包を、それぞれ先行文献（Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．（ＮＡＴＵＲＥ　ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ｜３：７８４｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１７８４，２０１２），Ａｓａｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．（ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ　ＲＥＰＯＲＴＳ，２：４２４｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ００４２４，２０１２），Ｕｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（Ｈａｉｒ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　５ｔｈ　ｅｄｎ（２０１０）））に記載された毛包器官の皮膚内移植技術に基づいて、実体顕微鏡を用いて分離および加工を行った。マウス頬ヒゲは、コラーゲン鞘を保持し、皮脂腺と外毛根鞘の損傷しないよう、毛包狭部より上方に位置する真皮性組織およびコラーゲン鞘と皮膚表皮層をサージカルメスにより切除した。体毛は１０－１５本の完全毛包よりなる毛群として、皮膚表皮層・真皮層・皮下脂肪層を含むよう、毛包に対して水平となるように皮膚より切り分けて分離した。ヒト毛包は１毛包または２毛包よりなる毛群の状態となるように分離し、ヒゲと同様に毛包上部の真皮性組織および皮膚表皮層のトリミングを行った。
３．真皮層および表皮層形成後に毛包組み込みを行うことによる人工皮膚の作製（図４）
　上記の（１）～（４）の方法によって作製した線維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面に表皮層を形成させ、その後、毛包を組み込むことによって、人工皮膚を作製した。
　具体的な方法は次のとおりである。６０％－８０％コンフレントまで増殖させたＨＥＫｎ細胞を、トリプシン消化によりシングルセル化し、２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地にて懸濁させた。１ｗｅｌｌあたり５００μlの細胞懸濁液を、（４）で作成した線維芽細胞含有コラーゲンゲル上に重層播種し、培養することにより、線維芽細胞含有コラーゲンゲル上に角化表皮層を形成させた。重層したＨＥＫｎ細胞は播種後４日目までＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地またはＤＭＥＭ１０培地中にて培養し、ＨＥＫｎ細胞播種後１、２、３日目に重層播種時と同じ培地条件として全量培地交換を行った。上述の操作は線維芽細胞含有コラーゲンゲルの収縮にともなうコラーゲンゲルの補充後に行った。Ｗｅｌｌ内の１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２を含むＤＭＥＭ１０培地量は、セルカルチャーインサート内のＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地の液面と同じになるように調整した。ＨＥＫｎ細胞重層後４日目にセルカルチャーインサート内の培地を除去することにより、表皮層が直接大気の酸素分圧条件にさらされる培養条件であるエアカルチャーを開始した。
　次に、表皮層が形成された線維芽細胞含有コラーゲンゲルに対して、毛包の組み込みを行った。ＨＤＦｎ細胞含有コラーゲンゲルにＨＥＫｎ細胞を重層して３日目に毛包の組み込みを行い、４日目にエアカルチャーを開始した。本実施例においては、「２．真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行うことによる人工皮膚の作製」に記載の方法により準備した、単離されたマウス頬ヒゲを用いた。人工皮膚への毛包組み込みは「２．真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行うことによる人工皮膚の作製」に記載した方法と同様に、表皮層と細胞含有コラーゲンゲル層の両者を貫くスリットを形成して行った。スリット形成において重層化表皮層と細胞含有コラーゲンゲル層の剥離を防ぐために、まず眼科用マイクロメスを水平方向に浅く動かすことにより表皮層の切り込みを形成し、その後に真皮層に切り込みを入れた。
４．人工皮膚へ組み込んだ毛包の機能評価
４－１．上皮間接続
　毛包や汗腺などの外胚葉性器官は、毛穴や導管の開口部を介して、皮膚表皮層と連結することにより皮膚器官系（外皮系）として機能する。すなわち、毛包と共に人工皮膚に組み込んだ皮脂腺が機能的なものとなるためには、組み込んだ毛包の毛穴部と人工皮膚の表皮層とが連続していることが重要となる。
　毛包組み込み後４日目と７日目に培地を取り除き、ホルマリン固定液（ＳｕｐｅｒＦｉｘ、ＫＵＲＡＢＯ）をセルカルチャーインサート内とプレートＷｅｌｌ内にそれぞれ１ｍｌと２ｍｌずつ入れて組織固定を行った。室温環境において６時間－１２時間組織固定を行い、固定終了後に室温のＰＢＳ（－）中に移し、毛包組み込み型人工皮膚の正中と毛穴と毛成長方向を含む表皮層に対して垂直となる割面を切り出し、パラフィン包枚ブロックを作製した。その後通法に従い１０μｍ厚の連続切片を作製し、Ｈ＆Ｅ染色を行い、毛包と表皮層の連続位置およびそれに連なる毛球部を追跡した。
　図３Ｂおよび図３Ｃに示すとおり、真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行った人工皮膚において、人工皮膚に組み込んだ毛包の上部毛穴領域において毛包外毛根鞘と人工皮膚の表皮層が連結していることが示された。
　また、図４Ｂに示すとおり、真皮層および表皮層形成後に毛包組み込みを行った人工皮膚においても、人工皮膚に組み込んだ毛包の上部毛穴領域において毛包外毛根鞘と人工皮膚の表皮層は連結していることが示された。
　これらの結果より、本発明の方法によって作製される人工皮膚中の毛包は、毛穴を介して人工皮膚表皮層と連結しており、機能的な皮膚付属器官を有することが示された。
４－２．組織学的評価
　毛包組み込み後４日目と７日目のＨ＆Ｅ染色像を用いて、毛球部の毛母細胞および毛乳頭細胞の非生理的な変性や細胞死に伴う核形態や細胞質染色性の変化と、それぞれの組織に特有な細胞配置を組織学的に解析し、天然毛包の組織と比較した。
　人工皮膚に組み込まれた毛包の毛球部を構成する細胞が生存して毛幹形成を維持していることを組織学的に解析したところ、真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行った人工皮膚においても（図３Ｂ、図３Ｃ）、真皮層および表皮層形成後に毛包組み込みを行った人工皮膚においても（図４Ｂ）、毛球部の毛母および毛乳頭細胞は生存していることが示された。
４－３．毛幹成長
　実体顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ２０００、Ｚｅｉｓｓ）を用いて、毛包組み込み時（Ｄａｙ　０）よりＤａｙ３、４、７、１４まで経時的にマクロ写真撮影を行い、画像解析ソフトウェアー（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ、ＺｅｉｓｓおよびＩｍａｇｅ　Ｊ、ＮＩＨ）を用いて毛幹長の変化を計測した。また、移植前の毛包および毛幹長および、毛包組み込み型人工皮膚より経時的に毛包を採取して毛包および毛幹長を同様に画像解析により計測し、毛幹成長を定量的に機能評価した。
　その結果、真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行った人工皮膚において、人工皮膚に組み込んだ毛包から４日間にわたり毛幹が成長することが示された（図５Ａ－Ｃ）。さらに、真皮層および表皮層形成後に毛包組み込みを行った人工皮膚においても、毛幹成長が継続することが示された（図６）。
　これらの結果から、本発明の方法によって得られる人工皮膚は、機能的な皮膚付属器官を有していることが示された。
実施例２：脂肪組織層をさらに有する人工皮膚の製造
１．６－ｗｅｌｌフォーマット人工皮膚の作製
　６－ｗｅｌｌフォーマット人工皮膚の作製は、以下の手順で行った。
＜細胞培養＞
　正常ヒト新生児包皮線維芽細胞（ＨＤＦｎ）と正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＨＥＫｎ）は第一継代後の凍結細胞としてクラボウより購入した。ＨＤＦｎとＨＥＫｎ細胞は３７℃の温浴にて急速に解凍したのち、１０％ウシ胎児血清と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ１０）にて洗浄し、ＨＤＦｎ細胞はＤＭＥＭ１０培地、ＨＥＫｎ細胞はＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地（クラボウ）を満たした培養プラスチックディッシュに２，５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度として播種し、これを第二継代細胞とした。継代培養は常法に従い、Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、０．２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ－１ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた溶液を用いて消化し、分散させたうえ、細胞密度を調整して各細胞に設定した培地条件にて継代した。正常ヒト細胞は第二継代まで継代培養して人工皮膚作製に供するか、または凍結ストックとし解凍後第三継代細胞として人工皮膚の作製に用いた。凍結ストックとする場合、両者とも６０－８０％コンフレントまで培養を継続し、人工皮膚の作製においては８０％以上のコンフレントとなった状態にて使用した。
＜線維芽細胞含有コラーゲンゲルの作製＞
　継代培養したＨＤＦｎ細胞を、トリプシンＥＤＴＡ溶液により消化してシングルセル化した。次いで終濃度３．８ｍｇ／ｍｌコラーゲン（Ｉ－ＡＣ　５ｍｇ／ｍＬ、ＫＯＫＥＮ）、１ｘＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）、１０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３（和光純薬）、１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４となるように滴定調整、和光純薬）、５％ウシ胎児血清を含むコラーゲン中性溶液を作製し、氷温条件にて穏やかに攪拌しながら遠心分離によりペレット化したＨＤＦｎ細胞を分散させた。コラーゲン酸性溶液を中和して細胞生存環境とするための添加剤として、１０倍濃度ＤＭＥＭ、１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒを作製し、ストックとして４℃冷蔵保管した。コラーゲン中性溶液に分散したＨＤＦｎ細胞を６ｗｅｌｌ用セルカルチャーインサート（０．４μｍ／高密度ポア）に４００μｌずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下に３０分間静置してゲル化させ、厚さ１．０－１．５ｍｍの人工真皮層を形成させた。線維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面がセルカルチャーインサート天部のフィルター面と水平となるように、また一様にゲル化を進行させるために、コラーゲン液調製および細胞分散は氷上にて行い、調製したコラーゲン液はセルカルチャーインサートへの分注時まで氷中に埋没させて保存した。細胞含有コラーゲン溶液のゲル化より人工真皮層を形成したセルカルチャーインサートは、１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２（和光純薬）を含むＤＭＥＭ１０培地を満たした６ｗｅｌｌ培養プレートに設置して表皮層形成まで培養を継続した。以下の培養条件は全て３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件とした。
＜表皮層の形成＞
　上記の方法により作製した繊維芽細胞含有コラーゲンゲルの表面に表皮層を形成させ、人工皮膚を作製した。
　具体的な方法は次のとおりである。６０％－８０％コンフレントまで増殖させたＨＥＫｎ細胞を、トリプシン消化によりシングルセル化し、３．７ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地にて懸濁させた。１ｗｅｌｌあたり１ｍｌの細胞懸濁液を、実施例１の（４）で作成した線維芽細胞含有コラーゲンゲル上に重層播種し、培養することにより、線維芽細胞含有コラーゲンゲル上に角化表皮層を形成させた。重層したＨＥＫｎ細胞は播種後４日目までＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地またはＤＭＥＭ１０培地中にて培養し、ＨＥＫｎ細胞播種後１、２、３日目に重層播種時と同じ培地条件として全量培地交換を行った。上述の操作は線維芽細胞含有コラーゲンゲルの収縮にともなうコラーゲンゲルの補充後に行った。Ｗｅｌｌ内の１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２を含むＤＭＥＭ１０培地量は、セルカルチャーインサート内のＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地の液面と同じになるように調整した。ＨＥＫｎ細胞重層後４日目にセルカルチャーインサート内の培地を除去することにより、表皮層が低酸素分圧条件にさらされる培養条件であるエアカルチャー（３７℃、５％ＣＯ２、１２．５％Ｏ２、１００％湿度条件下）を開始した。
　エアカルチャーを２日間行った上記の人工皮膚を、後述する皮下脂肪含有コラーゲンゲル（脂肪組織層）の上に重層し、その後、毛包の組み込みに供した。
２．皮下脂肪含有コラーゲンゲル（脂肪組織層）の作製
　マウス背部皮膚組織より結合組織等の不要部位をトリミングした皮膚組織をリボン状に裁断したのち、ピンセットを用いて脂肪組織を採取した。細切した脂肪組織を、実施例１の（４）に記載の方法で調製したコラーゲン中性溶液内に分散し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度条件下に３０分間静置することによりゲル化させたものをさらに３ｍｍ角に切り、コラーゲンゲル中性溶液内に配置し、上記と同様の方法でゲル化させたものを皮下脂肪層とした。対照として脂肪組織を含まないコラーゲンゲルも作成した。
３．移植用毛包の準備（図７）
　本実施例に用いた毛包は、実施例１の「２．真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行うことによる人工皮膚の作製」に記載の方法により準備し、コラーゲン鞘を取り外したマウス頬ヒゲを用いた。
　成長期のマウス頬ヒゲを採取してコラーゲン鞘を含むインタクト毛包（図７上段）および可変領域のコラーゲン鞘を除去した毛包（図７下段）を作製した。それぞれの条件の毛包を６ｃｍプラスチック培養皿の底面に薄層コラーゲンゲルにて接着し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）中にて５％ＣＯ２環境下において浸漬培養を３日目まで行った。
　培養開始時（Ｄａｙ　０）より、毎日実体顕微鏡により経過観察を行った。矢印は毛幹先端を示し、矢尻は毛球部の位置を示す。右列には培養３日目の毛球部拡大像を示す。点腺は毛包最外層の間葉組織境界を示す。通常、成長期より退行期を経て休止期へ至る毛包の構造変化において、毛球部は毛包上部へと移動して二次毛芽と呼ばれる構造を形成することが知られている。そのため、毛球部位置の上昇と毛包の間葉組織境界のズレは退行期または休止期であることを示す。
　なお、マウス頬ヒゲ毛包はコラーゲン鞘に包まれた状態で生体内にあり、成長期の毛包をコラーゲン鞘付きの状態で生体外培養を行うと毛幹が伸長し、成長期を維持することが知られている（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　３６７　（２００８）　２９９－３０４）。一方で、単毛包移植術等に供する毛包は退行期を経て休止期に突入することが植毛医療現場ではよく知られている。これと同様に、コラーゲン鞘を取り外す等の外的処置により刺激された成長期のマウス頬ヒゲ毛包を生体外培養すると、毛球部位置と毛球部の間葉組織境界のズレを生じ、退行期または休止期に移行することが見いだされた（図７）。
４．皮下脂肪付人工皮膚の作製および毛包の組込み（図８ａ）
　脂肪組織層の上にエアカルチャー２日後の人工皮膚を配置したのち、毛包の組込みを行った。人工皮膚への毛包組み込みは、実施例１の「２．真皮層への毛包組み込み後に表皮形成を行うことによる人工皮膚の作製」に記載した方法と同様に、表皮層と脂肪組織層の両者を貫くスリットを形成し、上記のコラーゲン鞘を取り外した毛包を作製し、ピンセットを用いて組み込むことによって行った。毛包の組み込み後、３日間の器官培養を行った。器官培養条件は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、５％ＣＯ２環境下として、半気相培養により実施した。
５．脂肪組織層の有無による毛包成長の比較（図８ｂ）
　図８ｂは、器官培養３日目の移植毛包の組織像を示す。脂肪組織層を有しない人工皮膚に組み込まれた毛包（図８ｂ左）は退行期を示す線状の毛包間葉像（矢印）であったのに対して、脂肪組織層を有する人工皮膚に組み込まれた毛包（図８ｂ右）は成長期毛球部であることが示された。写真右の点腺は真皮（Ｄｅｒ）と脂肪組織（Ａｄｐ）の境界を示す。
　以上の結果から、脂肪組織は、毛包の成長を促進する効果があることが示された。すなわち、本発明の人工皮膚は、毛包と皮下脂肪組織の相互作用による毛包成長の評価が可能であることが示された。
実施例３：再生毛包原基を用いた人工皮膚の製造
１．ＲＥＣ細胞からの脂肪前駆細胞の誘導
　脂肪前駆細胞は、市販の間葉系幹細胞であるＲＥＣ（Ｒａｐｉｄｌｙ　Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　Ｃｅｌｌ、ベイバイオサイエンスより購入）より先行文献（Ｍａｂｕｃｈｉ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，１，１５２－１６５，２０１３）に従い誘導した。
　ＲＥＣは３７℃の温浴にて急速に解凍したのち、Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）にて洗浄し、同培地を満たした培養プラスチックディッシュに２１，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度として播種し、３日間培養を行った。次に脂肪細胞へ分化誘導するため、Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　Ｍｅｄｉｕｍを除去後、Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）に置換し、さらに２日間培養を行った。細胞の回収は常法に従い、Ｄ－ＰＢＳ（－）（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）に、０．２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ－１ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた溶液を用いて行った。得られた細胞における脂肪前駆細胞マーカーＰＰＡＲγ遺伝子の発現を確認し、ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞として用いた。
２．移植用の再生毛包の作製（図９ａ）
　Ｅ１８．５マウス背部皮膚より、酵素処理によりシングルセル化した皮膚上皮と間葉系細胞を調製し、これらを用いて再生毛包原基を作製した。再生毛包原基の作成は、ＷＯ２０１２／１０８０６９およびＷＯ２０１２／１１５０７９に記載の方法を用いて行った。
　再生毛包原基をセルカルチャーインサート上に移し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地を用いてマルチガスチャンバーによりガス分圧を調製しながら７日間器官培養を行った。７日後に毛包発生が実体顕微鏡下において求められた（図９ａ中央左）。これを毛群毎に分割し（図９ａ中央右）、人工皮膚への組み込みに供した。
３．再生毛包の人工皮膚への移植（図９ａ）
　準備した再生毛包を、以下の３種類の人工皮膚へ組み込み、３日間器官培養（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地、５％ＣＯ２環境）した後、組織学的解析を行った。
１．表皮＋真皮モデル（実施例１における、毛包組み込み前の人工皮膚）
２．表皮＋真皮＋脂肪組織モデル（実施例２における、毛包組み込み前の人工皮膚）
３．表皮＋真皮＋ＲＥＣモデル（１の人工皮膚において、毛包が移植される移植孔にＲＥＣより誘導された脂肪前駆細胞を組み込んだ人工皮膚）
　いずれの人工皮膚においても、２５Ｇ注射針を用いて、人工皮膚の下層まで進達する移植孔を形成し、人工皮膚表面と、分割した毛包の毛穴部となる位置とが一致する深度となるように組み込みを行った。
　「表皮＋真皮＋ＲＥＣモデル」においては、マイクロピペットを用いて、移植孔内に培養液を除去したＲＥＣ由来脂肪前駆細胞集塊０．２μｌを注入し、その後、上記と同様の方法にて毛包を組み込んだ。
４．移植した毛包の組織学的解析（図９ｂ）
　図９ｂ上段は「表皮＋真皮モデル」、中段は「表皮＋真皮＋脂肪組織モデル」、下段は「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞モデル」の結果を示す。図９ｂ左列の弱拡大図中に示した四角の範囲を拡大したものを右列に示す。いずれのモデルにおいても、移植した毛包の上皮組織は人工皮膚表皮層と接続していることが示された。
　「表皮＋真皮モデル」へ移植された再生毛包組織は毛包組織の分化傾向より外れており、上皮組織により包まれた間葉細胞（図９ｂ上段右矢印）は認められたものの上皮細胞の毛母細胞分化は見られなかった。
　「表皮＋真皮+脂肪組織モデル」では、移植された毛包中に、上皮により包み込まれた間葉細胞の集塊が多数認められたものの（図９ｂ中段右矢印）、間葉細胞周囲の上皮細胞には毛球部特有な分化傾向は低い結果となった。また両モデルとも上皮組織の伸長（＊アスタリスク）が見られたが、毛包上皮への分化傾向は組織学的には認められなかった。
　「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞モデル」に移植された毛包では、毛母への分化傾向が強い上皮により間葉細胞が取り込まれていた（図９ｂ下段白矢印）。さらに、移植された毛包の上皮中央には角化傾向が強い毛幹状の構造（ＨＳ）が認められた。毛包周囲にはＲＥＣ由来脂肪前駆細胞が分布していた（矢尻）。人工皮膚における構造として、Ｅｐｉは表皮層、Ｄｅｒは真皮層を示し、またＡｄｐは皮下脂肪組織を示す。
実施例４：人工皮膚内の毛包の毛幹成長に対する脂肪組織と脂肪前駆細胞の効果
　成長期のマウス頬ヒゲを採取して可変領域のコラーゲン鞘を除去した毛包を作製した。当該毛包を、実施例３の「表皮＋真皮モデル（脂肪組織なし）」、「表皮＋真皮＋脂肪組織モデル」または「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞（誘導期間２日あるいは７日）モデル」の人工皮膚に組み込み、３日間の器官培養を行った。
　器官培養条件は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、５％ＣＯ２、Ｏ２大気分圧環境下として、半気相培養により実施した。培養３日目の毛幹成長は実体顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ２０００、Ｚｅｉｓｓ）を用いて、マクロ写真撮影を行い、画像解析ソフトウェアー（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ、ＺｅｉｓｓおよびＩｍａｇｅ　Ｊ、ＮＩＨ）を用いて毛幹長の変化を計測した。また、移植前の毛包および毛幹長および、毛包組み込み型人工皮膚より経時的に毛包を採取して毛包および毛幹長を同様に画像解析により計測し、毛幹成長を定量的に機能評価した。
　結果を図１０に示す。「表皮＋真皮モデル」に対し、「表皮＋真皮＋脂肪組織モデル」あるいは「表皮＋真皮＋ＲＥＣ由来脂肪前駆細胞モデル」は、毛幹成長効果を示し、特に誘導期間７日間のＲＥＣ由来前駆細胞が最も高い毛包成長効果を示した。
　以上のとおり、本発明の方法によって製造された人工皮膚における毛包は、生体の皮膚における毛包と類似した挙動を示すことが示された。すなわち、本発明の方法によって製造された人工皮膚は、従来の人工皮膚よりも生体の皮膚に近い構造や機能が再現されていた。また、本発明における人工皮膚においては、毛包などの皮膚付属器のみならず、脂肪およびそれに類する細胞の導入も可能であることも示された。それゆえ、本発明の人工皮膚は、例えば、皮膚に対する医薬品や化粧品の薬効評価や安全性評価における有用性が極めて高いと言える。

 

Claims (19)

  1. 　毛包、皮脂腺、および毛穴を有する人工皮膚の製造方法であって、
    前記製造方法は、下記の各ステップ
    （Ａ）：真皮層および表皮層を有する人工皮膚、または、真皮層のみを有する人工皮膚を準備するステップ；および、
    （Ｂ）：ステップ（Ａ）で準備した人工皮膚に、単離された毛包を移植するステップ；
    を含み、ここで、
    　前記単離された毛包は、皮脂腺を有するものであり、
    　前記単離された毛包は、前記人工皮膚の前記真皮層の表面と、前記単離された毛包の毛穴部の位置とが一致するように、前記人工皮膚に移植される、
    ことを特徴とする、
    方法。
  2. 　請求項１に記載の方法であって、
    　前記ステップ（Ａ）において、真皮層のみを有する人工皮膚が使用され、
    　前記ステップ（Ｂ）の後に、以下のステップ
    （Ｃ）：前記人工皮膚の前記真皮層上に、表皮層を形成させるステップ；
    を含むことを特徴とする、
    方法。
  3. 　請求項１に記載の方法であって、
    　前記ステップ（Ａ）における人工皮膚の真皮層は、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化させることにより形成されたものである、
    ことを特徴とする、
    方法。
  4. 　請求項１に記載の方法であって、
    　前記ステップ（Ａ）における人工皮膚の真皮層は、線維芽細胞、コラーゲン、および、培養液を含む混合液をゲル化させた後、さらに、コラーゲンおよび培養液を含む混合液を添加し、ゲル化させることを少なくとも１回以上繰り返すことにより形成されたものである、
    ことを特徴とする、
    方法。
  5. 　請求項１に記載の方法であって、
    　前記ステップ（Ａ）における「真皮層および表皮層を有する人工皮膚」の表皮層は、前記真皮層の表面に、角化細胞および培養液を含む混合液を適用し、これらを培養することにより形成されたものである、
    ことを特徴とする、
    方法。
  6. 　請求項２に記載の方法であって、
    　前記ステップ（Ｃ）は、前記人工皮膚の前記真皮層の表面に、角化細胞および培養液を含む混合液を適用し、これらを培養することにより、表皮層を形成させるステップ、
    であることを特徴とする、
    方法。
  7. 　請求項１に記載の方法であって、前記ステップ（Ａ）が、
    　（Ａ）：真皮層、表皮層、および、脂肪組織層を有する人工皮膚を準備するステップ、であることを特徴とする、
    方法。
  8. 　請求項１に記載の方法であって、前記ステップ（Ａ）の後、かつ、前記ステップ（Ｂ）の前に、以下のステップ
    （Ａ’）：ステップ（Ｂ）において単離された毛包が移植される人工皮膚の部位に、脂肪前駆細胞を埋め込むステップ；
    を含むことを特徴とする、
    方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の方法であって、前記単離された毛包は、動物の皮膚から単離された毛包であることを特徴とする、
    方法。
  10. 　請求項９に記載の方法であって、前記動物がヒトであることを特徴とする、
    方法。
  11. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の方法であって、前記単離された毛包は、人工的に誘導された再生毛包であることを特徴とする、
    方法。
  12. 　請求項１１に記載の方法であって、前記再生毛包は、
    　間葉系細胞から実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的に構成される第２の細胞集合体とを密着させて支持体内部で培養することにより製造される再生毛包であることを特徴とする、
    方法。
  13. 　請求項１２に記載の方法であって、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかが、未分化細胞を誘導することにより得られたものであることを特徴とする、
    方法。
  14. 　請求項１２に記載の方法であって、前記間葉系細胞または前記上皮系細胞の少なくともいずれかが、動物の毛包由来の単一化された細胞であることを特徴とする、
    方法。
  15. 　毛包、皮脂腺を有する人工皮膚であって、
    　さらに、毛穴を有することを特徴とする、
    人工皮膚。
  16. 　請求項１５に記載の人工皮膚であって、
    　線維芽細胞、コラーゲン、および培養液を含むゲルからなる真皮層、
    　前記真皮層の表面に形成され、実質的に角化細胞からなる表皮層、および、
    　皮脂腺を有する毛包、を含み、
    　前記毛包は、前記表皮層を貫いて前記真皮層へ埋没しており、
    　前記毛包の毛穴部が、前記表皮層と接続している、
    人工皮膚。
  17. 　請求項１６に記載の人工皮膚であって、
    　前記真皮層の下部に、さらに脂肪組織層を有することを特徴とする、
    人工皮膚。
  18. 　請求項１６に記載の人工皮膚であって、
    　前記毛包が、前記真皮層中で脂肪前駆細胞に覆われていることを特徴とする、
    人工皮膚。
  19. 　請求項１５～１７のいずれか１項に記載の人工皮膚であって、
    　前記人工皮膚は、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法によって作製されることを特徴とする、
    人工皮膚。

     
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