JP2005525088A - 再構成乳頭を有する皮膚/毛髪等価物 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)適当な再構成真皮(偽真皮;PD)または偽真皮調剤を供給する工程、
(b)培養乳頭細胞、好ましくは真皮乳頭細胞(毛乳頭細胞)を含む再構成乳頭(偽乳頭;PP)を、適当なマトリックス、とりわけゲルマトリックス中に供給するか、または培養乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞(毛乳頭細胞)を含むそのような再構成乳頭(偽乳頭;PP)の対応する前駆体を、マトリックス、とりわけゲルマトリックスを形成することができる適当なマトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地MFMPP中に、インサイチューで、とりわけ再構成真皮(偽真皮;PD)中で供給する工程、
(c)工程(b)で供給された再構成乳頭(PP)またはそれらの前駆体を、工程(a)で供給された偽真皮(PD)また偽真皮調剤中に導入または挿入する工程、
(d)任意に、再構成表皮(偽表皮;PE)または再構成周皮(偽周皮;PI)を偽真皮(PD)に適用する工程
を含む、皮膚/毛髪等価物、とりわけ再構成真皮(偽真皮;PD)中に再構成乳頭(偽乳頭;PP)を有する皮膚/毛髪モデルの製造方法に関する。
そうして供給または発生させた偽真皮(PD)に、適当な栄養培地、とりわけ最小必須培地MEM、および任意に他の成分を、所望により適用することができる。
キャリヤは、多孔質および無孔質の両方であり得、孔を有さないか、または少しの若しくは多くの孔を有し得る。多孔質表面が好ましく、それにより乳頭細胞は、自然な三次元凝集体を良好に模倣することができる。膨潤性キャリヤ物質(例えば多糖類またはポリペプチドをベースとするもの)または非膨潤性キャリヤ物質(例えばポリマー)も、使用することができる。
キャリヤは、無機および/または有機物質からなることができ、これらは、その表面で変性されていても良く、未変性でも良い。
ガラス、シリコーンまたはポリマーマトリックス、例えばポリスチレンなどが適当である。多糖類、例えばデキストラン、またはポリペプチド、例えばゼラチンのマトリックスが特に適当である。架橋ポリマー、例えば架橋ゼラチン(特に高架橋ゼラチン、例えば Cultisphere(商標), Percell)または架橋デキストランも、特に適している。
次いで乳頭細胞で被覆されたキャリヤから形成された偽乳頭を、調製した偽真皮または偽真皮調剤に埋め込むことができる。
1つの実施態様において、偽乳頭(PP)を適応させるために適当な空洞を、まず、好ましくは既に収縮した偽真皮(PD)中に、とりわけパンチングまたはプリッキングにより形成し、次いで培養乳頭細胞を含有し、その寸法が偽真皮中に形成された空洞に対応するように造形される偽乳頭が、それらの空洞に(例えば移植により)導入または挿入される。偽真皮(PD)のパンチングまたは偽真皮(PD)のプリッキングを、例えばパンチ(例えば直径0.5〜4mm、好ましくは約2mm)、ボタンカニューレまたは通常のカニューレで行うことができる。
適当なキャリヤ上で成長し、個々の偽乳頭を表す乳頭細胞の注入において、好ましくは100〜100,000個の偽乳頭が、偽真皮1cm3あたりに導入される。
偽乳頭(PP)の偽真皮(PD)中への導入または挿入を、規則的な間隔で行うことができる。
モデルを製造するために偽真皮(PD)が、まずコラーゲンマトリックス中の表皮線維芽細胞から調製される。次いで「穴」を、偽真皮(PD)中に一定の角度(例えば30〜90°)であけることができ、次いで任意に基底膜タンパク質(例えばラミニン、コラーゲン IV など)または例えば Matrigel(商標)、基底膜タンパク質の混合物、または Matrigel とコラーゲン(とりわけ I 型コラーゲン)との混合物で裏打ちすることができる。次いで再構成乳頭(偽乳頭;PP)が、「穴」に挿入される。これらの再構成乳頭を、毛包乳頭から培養された真皮乳頭細胞と、ゲル、例えば Matrigel(商標) 若しくはコラーゲン(特に I 型コラーゲン)またはこれらの混合物とを混合し、少ない継代数で該混合物をゲル化させることにより得ることができる。ゲル化の後、偽乳頭(PP)を、ゲルから打ち抜き、偽真皮(PD)に挿入することができる。しかしながらゲル化を、インサイチューで偽真皮への導入後に行うこともできる。しかしながら代わりに、Matrigel(商標) 中に埋め込まれた真皮乳頭細胞を、あらかじめ「穴」があけられていない偽真皮(PD)に直接注入することもでき、または Matrigel(商標) 中に埋め込まれた真皮乳頭細胞が、プリッキングチャネルを介して偽真皮(PD)に導入される。
最後に毛包メラノサイトおよび/または毛包ケラチノサイト(ORSおよび/またはマトリックスケラチノサイト)の細胞層を、偽真皮(PD)に適用することができる。
毛髪の形態形成の最早段階(形態形成段階 I〜III)を思い出させるもの、例えば周皮を含む小胞様または小胞状構造が、次いで(5)で、三次元毛髪/皮膚モデルに形づくられる。
本発明の皮膚/毛髪等価物は、特に、毛髪の形態形成の最早段階、即ち、形態形成段階 I 〜III) を思い出させるものを含む小胞様または小胞状構造を有し、特に三次元的に形成され、場合により空間的に分画された再構成乳頭(偽乳頭;PP)を有する皮膚/毛髪モデルであり、皮膚/毛髪等価物は、再構成真皮(偽真皮;PD)を含み、この中に偽乳頭(PP)が導入または挿入され、偽乳頭(PP)は、培養乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞(毛乳頭細胞)を適当なキャリヤ上および/または適当なマトリックス、とりわけゲルマトリックス中に含み、再構成表皮(偽表皮;PE)または偽周皮(PI)は、任意に真皮に適用される。
本発明は、本発明の皮膚/毛髪等価物を含む系、とりわけ試験系(例えばスクリーニング系)にも関する。加えて、さらなる詳細のために、本発明の方法、本発明の皮膚/毛髪等価物、および本発明の使用についての先の所見を参照することができ、従ってこれは、本発明の系にもあてはまる。
本発明の皮膚/毛髪等価物は、単離された毛包よりも標準化可能な再構成モデルである。それは、毛包の需要を減少させ、そして単層系よりもインビボ状況に近い。さらにそれは、動物試験に代わるものである。
本発明の再構成モデルは、複雑な三次元構造モデルであり、これは、その構造およびその組織組成においてインビボでの毛包を擬態し、その結果、活性物質(化粧品、薬剤など)の有効性および適合性に対して提供される情報について高度の関連性がある。
以下の実施例は、決して本発明を限定するものではなく、本発明を説明することが意図される。
単細胞培養物の調製
真皮線維芽細胞
真皮線維芽細胞をヒト包皮から単離する。該包皮の表皮および真皮を、サーモリシン(0.5mg/nl HEPES緩衝剤)で相互から酵素的に分離する。線維芽細胞を抽出するために真皮を、コラゲナーゼH(0.2U/ml、Boehringer Mannheim、マンハイム、ドイツ)で消化させる(37℃で3〜4時間)。インキュベーション段階後に、細胞を希釈するために溶液を慎重に混合し、細胞ふるいを通して濾過し、細胞を遠心分離する。培養を、ダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)中で Glutamax I (L-アラニル-L-グルタミン) およびピルビン酸ナトリウム、10%のウシ胎児血清(FCS)(Gibco BRL、カールスルーエ、ドイツ)で強化された4,500mgL-1のグルコースおよびピリドキシン(Gibco BRL、カールスルーエ、ドイツ)、25μg mL-1のゲンタマイシン(Sigma、タウフクリッヒェン(Taufkirchen)、ドイツ)および100UI mL-1のペニシリンG (Sigma) [1] で行う。
真皮線維芽細胞をヒト包皮から単離する。該包皮の表皮および真皮を、サーモリシン(0.5mg/nl HEPES緩衝剤)で相互から酵素的に分離する。ケラチノサイトを抽出するために表皮を、トリプシン (Gibco BRL、カールスルーエ、ドイツ) で消化させる(37℃で20分)。インキュベーション段階後に、細胞を希釈するために溶液を慎重に混合し、細胞ふるいを通して濾過し、細胞を遠心分離する。培養を、ウシ新生児血清 (NCF、fetal clone II、Hyclone)、表皮成長因子 (EGF)(Sigma)、インシュリン (Sigma)、ヒドロコルチゾン (Sigma)、トリヨード-L-サイロニン (Sigma)、アデニン (Sigma)、コレラトキシン (Sigma) 並びに抗生物質で強化された DMEM Glutamax I および Ham's F 12 (Sigma)(3:1)の混合物 [1] 中で、フィーダー層(増殖を阻害するために60グレイで照射した真皮線維芽細胞)上で行う。
ORSケラチノサイトを、後頭部から抜いたヒトの毛髪から単離する。ケラチノサイトを抽出するために、毛根の残りをまずメスで取り除き、小胞をトリプシン (プロテアーゼ、Gibco BRL、カールスルーエ、ドイツ) で消化させる(37℃で40分)。インキュベーション段階後に、細胞を希釈するために溶液を慎重に混合し、細胞ふるいを通して濾過し、細胞を遠心分離する。培養を、ウシ新生児血清 (NCF、fetal clone II、Hyclone)、表皮成長因子 (EGF)(Sigma)、インシュリン (Sigma)、ヒドロコルチゾン (Sigma)、トリヨード-L-サイロニン (Sigma)、アデニン (Sigma)、コレラトキシン (Sigma) および抗生物質で強化された DMEM Glutamax I および Ham's F 12 (Sigma)(3:1)の混合物 [1] 中で、フィーダー層(増殖を阻害するために60グレイで照射した真皮線維芽細胞)上で行う。
ORSメラノサイトを、Tobin らの方法により単離する [3]。
真皮乳頭細胞を、頭皮(側頭または後頭領域)から無傷毛包で単離する。この目的のために上真皮を取り出し、真皮乳頭と一緒の小胞を、時計工ピンセットを使用して真皮から引き抜く。真皮乳頭のさらなる単離を、ステレオ拡大鏡の下で行う。次いで真皮乳頭を、I 型コラーゲンで被覆した培養瓶にマイクロキャピラリーにより移す。培養を、20%のウシ胎児血清(FCS)(Gibco BRL、カールスルーエ、ドイツ)および抗生物質で強化されたグルタミン含有 RPMI 1640 培地 (Sigma) 中またはウシ胎児血清10%含有チャング培地中のいずれかで行う。
毛髪モデルを確立するために、まず偽真皮(PD)を発生させる。この目的のために、第4継代の真皮線維芽細胞を、ラットの尾の腱からの I 型コラーゲンと混合し、マルチウェルプレート中で播種する。この目的は、細胞数、培養時間、層の厚さ、真皮等価物(偽真皮;PD)の寸法を最適化することである。製造を、以下の実験計画にあわせて行う:1部のHBSS緩衝剤(Gibco BRL)を、8部のコラーゲン溶液 (Becton Dickinson) と混合し、1Mの水酸化ナトリウムで中和する。必要量の細胞を、1部のウシ胎児血清(FCS、Gibco BRL)中に添加する。得られた混合物(偽真皮調剤)を、細胞培養皿に注ぎ、インキュベーション室内で37℃で1時間インキュベートする。コラーゲンの重合後にモデルを、10%のFCSおよびペニシリン/ストレプトマイシンで補足されたDMEMで被覆する。培地を、1週間あたり3回、7日間にわたって変更する。
真皮乳頭細胞の単層培養を最適化するために2つの異なる培地を、一次培養物を調製するために使用する。
1. ペニシリン/ストレプトマイシンを有するFCS20%含有 RPMI 1640 (Sigma)
2. FCS10%含有チャング培地 (Irvine Scientific)
一方で一次培養物(P0)を、示した培地中で調製し、他方で培養を続けるために使用する培地が、細胞の増殖、形態および配列に対する効果を有するかどうかを測定するために試験を行う。
Matrigel(商標)(Becton Dickinson) を、偽真皮(PD)中に置かれた真皮乳頭細胞のための環境培地として使用することができる [4,5]。Matrigel(商標) は、マウスの Engelbreth-Holm-Swarm 腫瘍から得られ、主としてラミニン、IV 型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ナイドジェン(とりわけエンタクチン)、およびまたTGF-β、FGF、およびEHS腫瘍の他の成長因子を含有する。DPCの増殖に対する Matrigel(商標) の影響を研究するために、DPの一次培養を、Matrigel(商標) で被覆した細胞培養瓶内で行い、成長を観察する。比較のためにDPを、同時に、I 型コラーゲンで被覆した細胞培養瓶内で成長させる。
注入チャネルを調製するために、ボタンカニューレ、通常のカニューレおよび2mmのパンチを使用する。チャネルを際立たせるために、1%のアガロース溶液中10%のベルリンブルーの溶液を調製し、ボタンカニューレおよび通常のカニューレを使用して真皮等価物中に注入する。パンチを使用する場合、生検パンチで調製したチャネルを、直ちにまたは24時間後のいずれかに、ボタンカニューレを使用して充填する。チャネルを、ステレオ拡大鏡により調製する。凍結切片を調製するため、および組織検査のために、24時間後にモデルを深冷凍結する。
まず第2継代の真皮乳頭細胞を、250,000細胞/mlの濃度でラットの尾の腱からの I 型コラーゲンと混合し、マルチウェルプレート中で播種した。細胞数を、偽真皮(PD)の製造に従い選択した。
製造を、以下の実験計画にあわせて行った:1部のHBSS緩衝剤(Gibco BRL)を、8部のコラーゲン溶液 (Becton Dickinson) と混合し、1Mの水酸化ナトリウムで中和した。必要量の細胞を、1部のウシ胎児血清(FCS、Gibco BRL)中に添加した。得られた混合物(偽真皮調剤)を、細胞培養皿に注ぎ、インキュベーション室内で37℃で1時間インキュベートした。コラーゲンの重合後にモデルを、10%のFCSで補足されたチャング培地で被覆した。培地を、1週間あたり3回、8日間にわたって変更した。
非常に高い細胞密度を確立するために細胞を、まず必要な細胞濃度で Matrigel(商標) と混合し、次いで冷却遠心機(5分、1,000rpm、T=1℃)で遠心分離した。次いで過剰の Matrigel(商標) を除去し、後に残った細胞ペレットをピペットで取り出し、偽真皮(PD)または偽真皮調剤中に直接注入した。こうして製造したモデルを、組織学的および免疫組織化学的な評価に付した。
マイクロキャリヤの使用は、真皮乳頭細胞を再現性のある予定の三次元構造に培養することを可能にし、これは毛包における生理的配列を有効に擬態する。原則として適当なマイクロキャリヤは、その上で真皮乳頭細胞を培養し得るあらゆる種類の三次元キャリヤである。以下のキャリヤ物質を試験した:
再構成毛包モデルをさらに開発するために偽真皮を、5日の培養後に Snapwell Inserts (Corning Costar) に移し、まず表皮ケラチノサイト(500,000細胞/モデル)で被覆した。ケラチノサイト培地(ウシ新生児血清 (NCF、fetal clone II、Hyclone)、表皮成長因子 (EGF)(Sigma)、インシュリン (Sigma)、ヒドロコルチゾン (Sigma)、トリヨード-L-サイロニン (Sigma)、アデニン (Sigma)、コレラトキシン (Sigma)、アスコルビル-2-ホスフェート (Sigma) および抗生物質で強化された DMEM Glutamax I および Ham's F 12 (Sigma)(3:1) 中における1週間の液中培養後、モデルを気/液界面に移し、インシュリン (Sigma)、ヒドロコルチゾン (Sigma)、アスコルビル-2-ホスフェート (Sigma)、ウシ血清アルブミン (Sigma) および抗生物質で強化された DMEM Glutamax I および Ham's F 12 (Sigma)(3:1) 中でさらに2週間培養した。
別の実験において表皮ケラチノサイトを、毛包からのORSケラチノサイトにより置き換え、これを800,000細胞/モデルで播種した。培養(液中)を、ケラチノサイト培地で7日間行った。
以下のパラメーターは、偽真皮(PD)を製造するための最適な条件を表すことが分かった:2.5×105細胞/mlゲル調剤(偽真皮調剤)は、7日間、12ウェルプレート中で培養される。播種時の層の厚みは10mmである。7日後にモデルは完全に収縮し、残りの層の厚みは3.3mmであり、これは、約67%の収縮に相当する。
DPC一次培養物の調製における細胞増殖は、RPMI培地中よりもチャング培地中において良好であることが分かった。培養を続けたとき、細胞成長において2つの培地の間に違いはなかった。両方の培地を使用する場合、細胞は、一次培養および第1継代の両方において、典型的にクラスターに配列される。
ボタンカニューレを注入チャネルを調製するために使用してもよい。なぜなら充分に大きなチャネルを、そのようなカニューレにより偽真皮(PD)を貫通することなく、調製することができるからである。パンチを使用することもでき、その場合にチャネルを、細胞/Matrigel(商標) 混合物で充填することができ、またはDPCを有する Matrigel(商標) のパンチを、存在するチャネル中に置くことができる。
ケラチノサイト培地中における偽真皮のORSケラチノサイトでの被覆(付録を参照)は偽真皮の形成を導くのに対して、表皮ケラチノサイト(NHEK)およびケラチノサイトでの気/液界面培地における被覆は、表皮の形成を導く。
[1] K. Schlotmann ら, Cosmetic Efficacy Claims In Vitro Using a 3D Human Skin Model, Int. J. Cosmet. Sci. 23, 第310-319頁 (2001年)
[2] R. Warren ら, Improved Method for the Isolation and Cultivation of Human Scalp Dermal Papilla Cells, J. Invest. Dermatol. 98, 第693-699頁 (1992年)
[3] D.J. Tobin ら, Isolation and Long-Term Culture of Human Hair-Follicle Melanocytes, J. Invest. Dermatol. 104, 第86-89頁 (1995年)
[4] A. Limat ら, Outer root sheath cells organize into epidermoid cyst-like spheroids when cultured in Matrigel(商標). Cell Tissue Res. 275, 第169-176頁 (1994年)
[5] EP 0 218 065 A2
Claims (38)
- 以下の工程:
(a)再構成真皮(偽真皮;PD)または偽真皮調剤を供給する工程、
(b)培養乳頭細胞、好ましくは真皮乳頭細胞(毛乳頭細胞)を含む再構成乳頭(偽乳頭;PP)を、適当なキャリヤ上および/または適当なマトリックス、とりわけゲルマトリックス中に供給するか、あるいは培養乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞を含むそのような再構成乳頭(偽乳頭;PP)の対応する前駆体を、マトリックス、とりわけゲルマトリックスを形成することができる適当なマトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地MFMPP中に、インサイチューで、とりわけ再構成真皮(偽真皮;PD)中で供給する工程、
(c)工程(b)で供給された再構成乳頭(PP)またはそれらの前駆体を、工程(a)で供給された偽真皮(PD)また偽真皮調剤中に導入または挿入する工程、
(d)任意に、再構成表皮(偽表皮;PE)または再構成周皮(偽周皮;PI)を偽真皮(PD)に適用する工程
を含む、皮膚/毛髪等価物、とりわけ再構成真皮(偽真皮;PD)中に再構成乳頭(偽乳頭;PP)を有する皮膚/毛髪モデルの製造方法。 - 偽真皮(PD)または偽真皮調剤が、培養収縮細胞を適当なマトリックス中に含み、該マトリックスが、コラーゲン、とりわけ I 型および/または III 型コラーゲン、および任意に他の成分をベースとするマトリックスであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 線維芽細胞、とりわけ真皮線維芽細胞を、偽真皮(PD)または偽真皮調剤のための収縮細胞として使用することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 真皮線維芽細胞をヒトまたは動物の皮膚から単離し、培養後に収縮細胞を得られた単層培養物から、とりわけ穏やかなトリプシン処理によって回収することにより、偽真皮(PD)または偽真皮調剤のための培養収縮細胞を得ることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 収縮細胞、とりわけ線維芽細胞、好ましくは真皮線維芽細胞を、適当な栄養培地中で、とりわけ最小必須培地MEMを栄養培地として使用して培養することを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 単層培養物から回収され、任意に適当な栄養培地中に存在する収縮細胞と、少なくとも1種のマトリックス形成剤MFPD、とりわけゲル形成剤を含有する偽真皮(PD)のためのマトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地MFMPDおよび任意に他の成分とを混合することにより、偽真皮調剤を得ることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 偽真皮調剤が、マトリックス、好ましくはゲルを形成し、とりわけ、もしあるなら栄養培地を放出して、偽真皮(PD)に収縮することを特徴とする請求項6に記載の方法。
- マトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地MFMPDが、少なくとも1種のコラーゲン、とりわけ I 型および/または III 型コラーゲン、および任意に他の成分、とりわけ真皮の細胞外マトリックスの成分、好ましくはマトリックスおよび/または硬タンパク質、例えばラミニンを、マトリックス形成剤MFPD、とりわけゲル形成剤として含むことを特徴とする請求項6または7に記載の方法。
- 適当な栄養培地、とりわけ最小必須培地MEM、および任意に他の成分を、偽真皮(PD)に適用することを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 偽乳頭(PP)が、培養乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞を、適当なマトリックス中に含み、該マトリックスが、特に、コラーゲン、とりわけ IV 型コラーゲンおよび任意に他の成分をベースとするマトリックスであることを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 真皮乳頭細胞をヒトまたは動物の皮膚の毛包から単離し、培養後に真皮乳頭細胞を、得られた単層培養物から、とりわけ穏やかなトリプシン処理によって回収することにより、培養真皮乳頭細胞を得ることを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 真皮乳頭細胞を、適当な栄養培地中で、とりわけ最小必須培地(MEM)、特にDMEMおよび/またはRPMI培地および/またはチャング(Chang)培地を栄養培地として、任意に他の成分、とりわけウシ胎児血清(FCS)、コラーゲン、とりわけ I 型コラーゲンなどと一緒に使用して培養することを特徴とする請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞を適当なキャリヤ上で成長させることにより、偽乳頭(PP)を得ることを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- キャリヤが、約50〜2,000μmの範囲、好ましくは100〜1,000μmの範囲、より好ましくは約100〜500μmの範囲の寸法を有することを特徴とする請求項13に記載の方法。
- キャリヤ物質を、好ましくは架橋されている、多糖類またはポリペプチド、とりわけゼラチンまたはデキストランから選択することを特徴とする請求項13または14に記載の方法。
- 単層培養物から回収され、任意に適当な栄養培地中に存在する乳頭細胞と、少なくとも1種のマトリックス形成剤MFPP、とりわけゲル形成剤を含有する偽乳頭(PP)のためのマトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地MFMPPおよび任意に他の成分とを混合し、得られた混合物が、マトリックス、好ましくはゲルを形成し、とりわけ、もしあるなら栄養培地を放出して収縮することにより、偽乳頭(PP)を得ることを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- マトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地MFMPPが、マトリックス形成剤MFPP、とりわけゲル形成剤として、少なくとも1種のコラーゲン、とりわけ IV 型コラーゲン、並びに任意に、マトリックスおよび/または硬タンパク質、とりわけラミニン、ゼラチン、キトサン、グルコサミン、グルコサミノグリカン(GAG)、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、硫酸化糖タンパク質、例えばナイドジェン(とりわけエンタクチン)、および成長因子、例えば組織成長因子-ベータ(TGF-β)、線維芽細胞成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および Engelbreth-Holm-Swarm 腫瘍(EHS腫瘍)および/またはヒト胎盤からの他の成長因子、および上記成分の混合物の群から特に選ばれる他の成分を含有することを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 収縮したマトリックス、とりわけゲルおよび/または偽乳頭(PP)を、インサイチューで、偽真皮(PD)または偽真皮調剤中で形成することを特徴とする請求項16または17に記載の方法。
- 偽乳頭(PP)を、マトリックス、とりわけゲルから形成し、偽乳頭(PP)の形成/造形を、工程(c)における偽乳頭(PP)またはそれらの前駆体の導入または挿入前またはその後のいずれかで行うことを特徴とする請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 偽真皮(PD)のためのマトリックス形成剤MFPDおよび/または偽乳頭(PP)のためのマトリックス形成剤MFPPが、加熱により、とりわけ20℃〜40℃の温度でゲル化し、とりわけ該方法において重合し、細胞の成長および分化を促進することができることを特徴とする請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 偽真皮(PD)のマトリックスおよび/または偽乳頭(PP)のマトリックスが、三次元構造を形成することを特徴とする請求項1〜20のいずれかに記載の方法。
- マトリックス、とりわけゲルの形成が、可逆または不可逆であることを特徴とする請求項1〜21のいずれかに記載の方法。
- 偽乳頭(PP)を適応させるために適当な空洞を偽真皮(PD)中に、とりわけパンチングまたはプリッキングにより形成し、次いで培養乳頭細胞を含有し、その寸法が偽真皮(PD)中に形成された空洞に対応する偽乳頭(PP)を、それらの空洞に導入、挿入または移植することにより、あるいは培養真皮乳頭細胞および少なくとも1種のマトリックス形成剤MFPPの混合物の形態の偽乳頭(PP)またはそのような偽乳頭(PP)の対応する前駆体を、導入または挿入し、次いで偽乳頭(PP)の前駆体が、インサイチューで偽真皮(PD)中で、とりわけゲル化によってマトリックスを形成することにより、工程(c)における偽乳頭(PP)の導入または挿入を行うことを特徴とする請求項1〜21のいずれかに記載の方法。
- パンチングまたはプリッキングを、とりわけ直径0.5〜4mm、好ましくは約2mmのパンチ、ボタンカニューレまたは通常のカニューレで行うことを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 偽乳頭(PP)またはそれらの前駆体の導入の前に空洞を、少なくとも1種のコラーゲン、とりわけ IV 型コラーゲンおよび/または他のマトリックスタンパク質、とりわけ基底膜タンパク質、例えばラミニンで裏打ちすることを特徴とする請求項23または24に記載の方法。
- 予備成形偽乳頭(PP)または偽乳頭(PP)の前駆体を、偽真皮(PD)中、またはとりわけ偽真皮調剤中に直接導入または挿入することを特徴とする請求項1〜23のいずれかに記載の方法。
- 工程(c)において偽乳頭(PP)またはそれらの前駆体を偽真皮(PD)中に導入または挿入する角度が、偽真皮(PD)面を基準に30°〜90°、とりわけ40°〜60°であることを特徴とする請求項1〜26のいずれかに記載の方法。
- 任意に工程(d)で行われる再構成表皮(偽表皮;PE)または再構成周皮(偽周皮;PI)の適用を、工程(c)における偽乳頭(PP)またはそれらの前駆体の導入または挿入の前またはその後に行うことを特徴とする請求項1〜27のいずれかに記載の方法。
- 偽表皮(PE)または偽周皮(PI)が、培養ケラチノサイト、とりわけ毛包ケラチノサイト(ORSおよび/またはマトリックスケラチノサイト)および/または表皮ケラチノサイト、および任意にメラノサイトさえ、とりわけ外毛根鞘メラノサイト(ORSメラノサイト)および/または表皮メラノサイト、および任意に他の成分を含有することを特徴とする請求項28に記載の方法。
- ケラチノサイトおよびメラノサイトを、個々に別の単層若しくは多層中、または一緒に単層若しくは多層としての混合物中で、偽真皮(PD)に適用することを特徴とする請求項28または29に記載の方法。
- 請求項1〜30のいずれかに記載の方法により得ることができる、毛髪/皮膚等価物、とりわけ偽真皮(PD)中に再構成乳頭(PP)を有する毛髪モデル。
- 製薬、医療または化粧品およびボディケア分野における、請求項31に記載の皮膚/毛髪等価物の使用。
- とりわけ適合性および/または有効性について薬剤または化粧品を発見、研究および/または試験するための、請求項32に記載の皮膚/毛髪等価物の使用。
- 毛包に関する、とりわけ毛髪の着色、毛髪の成長、毛髪の構造、毛髪の色などに関する有効性および/または適合性について薬剤または化粧品を発見、研究および/または試験するための、請求項33に記載の使用。
- 薬剤または化粧品の開発のための、請求項31に記載の皮膚/毛髪等価物の使用。
- 好ましくは自動スクリーニング法において、とりわけ薬剤または化粧品を発見、研究および/または試験するための、請求項31に記載の皮膚/毛髪等価物の使用。
- とりわけ薬剤または化粧品による毛包、毛髪の着色、毛髪の成長、毛髪の構造、毛髪の色などの影響をインビトロで評価するための、請求項31に記載の皮膚/毛髪等価物の使用。
- 請求項31に記載の皮膚/毛髪等価物を含む系、とりわけ試験系。
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