KR100953849B1

KR100953849B1 - 기질 세포로부터 수득된 착색시킬 수 있는 표피 등가물,제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR100953849B1
Application number: KR1020070070779A
Authority: KR
Inventors: 칼리 바카르; 다니엘 아셀리노
Original assignee: 로레알
Priority date: 2006-07-13
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2010-04-20
Also published as: CN101385871B; US20080097607A1; JP6549182B2; FR2903702A1; FR2903702B1; EP1878790A1; KR20100068339A; KR20080007183A; ES2644762T3; US10039791B2; EP1878790B1; KR101673165B1; CN101385871A; JP6366215B2; CA2596599C; JP2017158586A; CA2596599A1; JP2008029342A

Abstract

본 발명은 기질 세포의 분화로부터 유래되는 세포를 포함하는, 착색시킬 수 있는 표피 등가물의 제조, 및 수득되는 표피 등가물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 착색시킬 수 있고 임의로 모낭을 포함하는, 상기 표피 등가물을 포함하는 인공 피부, 그의 제조 방법, 및 국소 미용, 약학 또는 피부학적 제품의 효과를 평가하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 인공 피부는 또한 포유류, 특히 3-도 화상을 입은 피해자와 같은 인간에게 이식되고자 하는 이식편의 제조에 사용될 수 있다.

표피 등가물

Description

기질 세포로부터 수득된 착색시킬 수 있는 표피 등가물, 제조 방법 및 용도 {EPIDERMIS EQUIVALENT CAPABLE OF PIGMENTING, OBTAINED FROM MATRIX CELLS, METHOD OF PREPARATION AND USE}

본 발명은 기질 세포의 분화로부터 유래된 세포를 포함하는, 착색시킬 수 있는 표피 등가물, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 착색시킬 수 있고 임의로 모낭을 포함하고, 상기 표피 등가물을 포함하는 인공 피부, 그의 제조 방법 및 국소적 미용, 약학 또는 피부학적 제품의 효과를 평가하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 인공 피부는 또한 포유류, 더욱 특히 3-도 화상을 입은 피해자와 같은 인간 환자에 이식되고자 하는 이식물의 제조에 사용될 수 있다.

한편으로는 기계 분야 및 생리학적 분야 둘 다에서의 피부의 역할을 더 잘 이해하는데 필요한 연구를 수행하는 것을 가능하게 하고, 다른 한편으로는 미용 및/또는 약학적 활성제의 활성 또는 대안적으로는 국소 성분의 부작용의 예고성 테스트를 구축하는 것을 가능하게 하는 인공 피부 모델을 개발하기 위한 노력이 수년간 이루어져 왔다.

따라서, 다소 인간 피부에 유사한 모델을 개발하는 것이 가능해졌다. 예를 들어, 하기 문서에서 언급된 모델들을 언급할 수 있다 : EP　0　285　471, EP　0　285　474, EP　0　418　035, WO-A-90/02796, WO-A-91/16010, EP　0　197　090, EP　0　020　753, FR　2　665　175, FR　2　689　904.

일반적으로, 상기 문서에서 언급된 인공 피부 모델은 진피 유두 섬유아세포 및/또는 상피근초 (외모근초 또는 ORS 라고도 함) 로부터 제거된 세포로부터 제조되는데, 이는 상기 세포를 수득하기가 용이하기 때문이다. 실제로, 상기 세포는 머리 가닥을 잡아당길 때 제거되고, 지지체, 종종 진피 등가물 상에 침착되고 적합한 배양 배지 내에서 배양되는 경우 표피를 생성할 수 있다.

케라틴세포는 ORS 로부터 유래되고, 상기 표피 모델에 존재할 수 있는 소수의 멜라닌세포는 많지 않고 만족할 만한 착색된 피부 모델을 수득하는 것을 가능하게 하지 않는다 (Lenoir　MC, Bernard　BA, Pautrat　G, Darmon　M, Shroot　B). 인간 모낭의 외모근초 세포는 시험관 내에서 완전히 분화된 표피를 재생시킬 수 있다 ([Dev Biol. 1988 Dec; 130(2): 610-20] 및 [Limat　A, Breitkreutz　D, Hunziker　T, Boillat　C, Wiesmann　U, Klein　E, Noser　F, Fusenig　NE. Restoration of the epidermal phenotype by follicular outer root sheath cells in recombinant culture with dermal fibroblasts. Exp Cell Res. 1991 June; 194(2): 218-27]).

착색된 피부 모델을 얻기 위해서는, 케라틴세포 배양물에 시판의 표피 멜라닌세포를 첨가하는 것이 알려져 있다 (FR　2　665　175). 그러나, 상기 모델로 수득된 착색의 성질은 천연 착색을 만족할만하게 재생하지 않는다.

모구에 위치하고, 진피 유두 주위에서 소세포 군집을 형성하는 기질 세포는 주로, 배아층을 구성하고 빨리 증식 및 분화하는 케라틴세포의 전구체로 이루어져 있고, 모간을 형성하고, 따라서 모발 주기에서 중요한 역할을 한다. 모발성장기의 시작부터 그의 종결까지, 상기 기질 세포는 퇴행기까지 증식하고, 그런 다음 휴지기 동안에 사라질 것이다 (Ebling　FJ. The biology of hair. Dermatol Clin. 1987 Jul; 5(3): 467-81. Review; Saitoh　M, Uzuka　M, Sakamoto　M. Human hair cycle. J Invest Dermatol. 1970 Jan; 54(1): 65-81). 매트릭스는 또한 모발의 착색을 책임지는 소낭성 멜라닌세포를 포함한다.

상기 기질 세포의 증식 및 분화는 진피 유두에 의해 조절된다 (Botchkarev　VA, Kishimoto　J. Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling. J Invest Dermatol Symp Proc. 2003 Jun; 8(1): 46-55. Review).

놀랍게도, 출원인은, 인공 진피 상에서 기질 세포를 배양하는 것이 특히 케라틴세포 및 멜라닌세포를 포함하는 완전한 표피를 초래할 수 있다고 서술하였다.

기질에 존재하는 소낭성 멜라닌세포가 정상적으로는 모발을 염색하려는 것일지라도, 상기 세포는 또한 표피 환경에서 성장할 수 있으며, 또한 본 발명의 방법에 따라 시험관 내에서, 또한 이식 후 생체 내에서 생성된 표피의 착색에 기능적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 출원인은 오로지 모발 세포인 기질 세포로부터 착색시킬 수 있는 피부 모델을 제조하기 위한 신규 방법을 개발하였다.

상기 방법은 모든 표피 세포 유형을 제공하는 단일 조직인 기질의 사용에 의해 완전한 표피를 포함하는 피부 모델을 수득하는 것을 가능하게 한다는 점에서 유리한 것으로 밝혀져 있으며 ; 더욱이, 상기 세포는 그것들이 증식할 수 있게 하는 거의 분화되지 않은 상태에서 서로 경합가능하고, 생체 표피의 특징을 나타내는 표피 조직을 형성한다.

이러한 표피 등가물 제조 방법은 주어진 세포 유형으로 조직을 채우도록 계획된 전처리를 필요로 하지 않는다.

기질 세포는 모발이 성장기, 퇴행기 또는 휴지기 중 어떤 기에 있는지와는 상관없이 사용될 수 있다.

마지막으로, 상기 방법은 ORS (그 중 일부는 약 33000 개 세포의 접종을 필요로 함) 의 케라틴세포를 사용하는 문헌에서 이미 상술된 기술과 비교해, 극소수의 세포를 필요로 하고 (약 1000 개의 세포가 주입됨), 기질 세포의 콜로니화 동역학은 높으며, 그로 인해 인공 표피의 제조가 가속화된다.

극복해야 할 한가지 난점은 상기 질의 기질 세포를 충분한 양으로 수득하는 것에 있다.

정상적인 조건 하에서, 머리 가닥이 떨어지거나 또는 잡아 당겨진 후에, 진피 유두-기질 세포 구획은 두피의 진피에 남아 있다. 이 구획은 새로운 모발 주기의 발달을 개시할 것이고, 새로운 소낭을 제공할 것이다. 따라서, 머리 가닥을 잡아당겨서는 상기 기질 세포를 수득할 수 없고, 따라서, 두피의 생검을 수행 하고, 그런 다음 현미해부에 의해 상기 세포를 단리하는 것이 필요할 것이다.

단리하는 어려움 외에도, 기질 세포는 또한 적어도 하기 이유로 인해 배양하기가 어렵다 :

a) 세포 수가 특히 적음 ;

b) 상기 세포는 쉽게 분해되며, 따라서, 현미해부 동안에 그것들을 단리하는 것이 어려움 ;

c) 상기 세포는 플라스틱 지지체에 부착되지 않음 ;

d) 상기 세포는, 그것들이 작은 콜로니를 형성하고 표피 등가물의 제조에 필요한 충분한 양으로 1 차 배양을 형성하지 않는 경향이 있기 때문에, 증식시키기가 어려움.

일부 저자들은 유두의 섬유아세포와의 공동-배양으로서 상기 세포를 배양하는 것을 제안하였다. 상기 방법의 단점은, 수득된 배양물이 균질하지 않고, 기질 세포가 공동-배양에 사용된 유두 진피 섬유아세포로 오염된다는 것이다 (Reynolds　AJ, Lawrence　CM, Jahoda　CA Human hair follicle germinative epidermal cell culture. J Invest Dermatol. 1993 Oct; 101(4): 634-8).

Luo 등은 플라스틱 지지체 상에서 기질 세포를 현미해부하고 배양하는 기술을 제안하였다 (Luo 등 : Method for culturing hair follicle epithelial matrix cells ; Reg. number: H1610; Nov. 5, 1996). 그러나, 상기 현미해부 기술은 매우 낮은 수율의 기질 세포를 초래하고, 상기 세포의 배양은 단지 완전한 피부를 위한 모델로서 작용할 수 없는 단일층의 미분화된 세포를 수득할 수 있게 할 뿐이 다.

본 출원인은 기질 세포를 단리하였고, 진피 등가물 상에서 상기 세포를 배양하는 방법을 개발하였으며, 상기 세포는 빨리 증식하고 분화하여, 완전한 표피를 형성한다.

바람직하게는, 기질 조직은 세포의 양 및 본질을 보존하는 새로운 현미해부 기술에 의해 단리되고 ; 그것들은 서로 분리되지 않는다. 상기 현미해부는 진피 등가물 지지체 상에서 기질 세포 모두를 단리하고 보존할 수 있게 한다.

상기 현미해부 기술을 사용하여, 기질 세포는 진피 등가물에 더욱 용이하게 부착하고, 균일하게 증식하고, 분화한다. 수득된 표피 등가물은 추가로 멜라닌세포와 같은 케라틴세포 이외의 세포 유형을 포함할 수 있다.

착색시킬 수 있는 표피를 제조하는 공지된 기술은, 시험관 내에서 예비배양한 후에 멜라닌세포가 첨가되는 ORS 의 케라틴세포를 사용하는데 ; 그러나, 상기 예비배양의 결과는, 세포 분화가 표피 맥락 외부에서 발생하고, 멜라닌세포가 생체 내에서 관찰된 멜라닌세포에 상당하는 수지상 양을 발달시키지 않는다는 것이다. 그의 후속하는 표피 모델로의 도입은 케라틴세포의 기저층에서 멜라닌세포의 균질한 분포, 또는 일반적으로 이극성 (2 개의 수지상을 가짐) 인 멜라닌세포의 최적의 기능성을 보장하지 않으며, 따라서 멜라닌 입자의 케라틴세포로의 이전 능력이 낮다.

따라서, 본 발명의 첫번째 주제에 따르면, 본 발명은 착색된 표피 등가물의 제조를 위한 기질 세포의 용도에 관한 것이다.

표현 "기질 세포" 는 모구에 위치하는 세포를 의미하는 것으로 이해되고, 그것들은 모유두세포 주변에서 소세포 군집을 형성한다 (Ebling　FJ. The biology of hair. Dermatol Clin. 1987 Jul; 5(3): 467-81. Review; Saitoh　M, Uzuka　M, Sakamoto　M. Human hair cycle. J Invest Dermatol. 1970 Jan; 54(1): 65-81). 상기 세포의 샘플을 수합하고, 증폭시키고, 조직 뱅크 내에 저장할 것이다.

기질 조직의 본질을 보존하기 위해, 상기 세포를 하기 방법에 따라 수합하는 것이 가능할 것이다 : 모낭을 2% 항생제 및 필수 아미노산이 보충된 최소 배양 배지를 포함하는 페트리 디쉬에 놓음. 모구의 표피를 진피 유두 및 결합성 초 (connective sheath) 로부터 분리하고, 그런 다음, 모구 부위를 진피 유두의 정점 (apex) 에서 자름. 다음, 수득된 절편을 멸균 고리 내에 있는 진피 등가물 상에 놓고, 그런 다음 기질 세포를 하기 및 실시예 I 에서 표피 제조 방법에서 상세히 기술된 배지 내에서 배양함.

기질 세포는 착색시킬 수 있는 표피의 제조에 필요한 모든 세포를 제공하고 ; 따라서, 표피 등가물의 제조를 위한 기질 세포의 용도는 임의의 기타 유형의 세포를 필요로 하지 않고, 임의의 외인성 세포의 공급을 배제한 채 수행될 수 있다.

두번째 주제에 따르면, 본 발명은 기질 세포를 진피부 등가물 상에서 배양하는 한 가지 이상의 단계를 포함하는 표피 등가물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따라 수득되는 - 표피 모델로서 지칭되기도 하는 - "표피 등가물" 은 생체 내에서 표피의 특징, 즉, 진피 등가물과 접촉되는 기저 세포와 함 께 케라틴세포를 적어도 포함하는 각질 중층 다층 상피의 특징을 재생하는 완전한 조직으로서, 그의 상부 중층은 조직학적으로 정상적인 과립층 (stratum granulosum) 및 각질층 (stratum corneum) 을 재생하는 말단 분화를 지시한다. 이러한 표피 등가물은 또한 기능적인 멜라닌세포를 포함하는데, 즉, 멜라노솜 (멜라닌 과립) 을 케라틴세포로 이전시킬 수 있으며 ; 상기 표피의 조직학적 관찰은 기저층의 수준에서 멜라닌세포의 구성을 보여주고, 따라서 피부의 정상적인 구조를 정확하게 재생한다.

상기 표피 모델의 한 특징은, 수많은 수지상 (3 개 이상) 을 함유하고 기저 케라틴세포를 균일하게 둘러싸는 많은 수의 멜라닌 세포이고 ; 상기 특징은 표피 모델의 횡단면의 관찰 동안에 매우 분명하게 나타난다 (특히, 기저층의 케라틴세포가 멜라닌세포에 상응하는 두껍고 어두운 층에 의해 둘러싸여 있는 것을 볼 수 있는 도 3 을 참조).

상기 특징은, 특히 당 기술분야의 방법과 관련해 본 발명의 방법에 따라 수득되는 표피 모델을 구별할 수 있게 한다. 실제로, 통상의 방법 (멜라닌세포의 후속 첨가) 에 따라 제조된 표피는 기저 케라틴세포 사이에 위치하고, 2 개의 수지상을 가진 소수의 멜라닌세포를 함유한다.

바람직하게는, 진피 등가물은 또한 랑게스한스 세포 및/또는 메켈 세포를 포함한다.

더욱이, 상기 표피는 균일하게 착색시킬 수 있다.

실제로, 본 발명에 따른 표피 모델은 케라틴세포의 상부 극 및 각질층에서 규칙적으로 위치하는 멜라닌 과립으로 균질하게 착색되는 것으로 보인다. 상기 분포는 선행 표피 모델과 비교해 유리하고, 그 부분에서는 표피에 불규칙적으로 분포한 멜라닌 과립이 더 소수이다.

더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 방법은 하기를 포함하는 것을 특징으로 한다 :

a -　배양 배지에 침지된 지지체 상에 놓여 있는 진피 등가물 상에 기질 세포를 접종함 ;

b -　상기 진피 등가물의 표면에서 기질 세포를 증식시킴 ;

c -　생성 동안에 표피 등가물의 상부 표면을 배양 배지가 덮지 않도록 상기 지지체를 들어올림.

특히, 지지체는 지지체 망일 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 "진피 등가물" 또는 진피 지지체는 선행 기술분야에서 기술된 것들 중 임의일 수 있다 (특히 FR　2　665 175 에 기술된 것들). 예로써, 지지체로서 이전에 탈-표피화된 진피인 수축 콜라겐/섬유아세포 격자 (Prunieras 등, Ann. Chir. Plast., 1979, 24, No.　4, 357-362), 합성 반투과성 막으로 이루어진 군으로부터 선택되는 불활성 지지체 (특히 FR　2　833　271 에 기술된 것들), Millipore 상표의 필터와 같은 합성 막, 콜라겐-기재 피하 구성물, 또는 세포 생존성 및 부착과 상용적인 임의의 기타 공기-노출성 지지체를 언급할 수 있다.

바람직하게는, 진피 등가물은 생체 내에서 관찰되는 것에 상당하는 분화 상태에 있는, 진피 섬유아세포가 분포된 콜라겐 격자로 이루어질 것이다.

이러한 유형의 진피 등가물은 예를 들어 EP　0　418　035, WO　00/29553 또는 EP　0　285　471 에서 기술된 바와 같은 다양한 방법에 따라 제조될 수 있다.

이 방법은 하기 배양 단계를 포함할 수 있다 :

a)　동물 또는 인간 조직 절편을 접종한 영양 배지 상에서 생성된 단일층 배양물로부터 수합된 수축 세포와,

b)　진피의 세포외 기질의 성분이 보충된 영양 배지, 상기 혼합물은 수축하는 젤을 형성하고, 영양 배지를 배출하고, 피부 등가물을 형성함.

수축 세포로서 섬유아세포를 사용할 수 있으며 ; 건강한 인간 공여자로부터 수득되고, 조절된 트립신처리에 의해 단층 배양물로부터 수합된 진피 섬유아세포를 유리하게는 수축 세포로서 사용할 수 있다. 하기 설명되는 바와 같이, 수축 세포의 선택은 기질 세포의 분화를 결정할 것이며 ; 따라서, 수축 세포는 목적하는 표피 등가물의 질에 따라 선택될 것이다.

진피 등가물의 섬유아세포가 케라틴세포 분화 프로그램을 지휘할 수 있기 때문에, 기질 세포는 진피 등가물에 의해 생성되는 세포 내용물에 따라 피부 또는 모발을 형성할 수 있는 만능 세포의 저장기를 구성한다.

따라서, 기질 세포가 주로 존재하는 진피 등가물이 모낭간 피부 섬유아세포를 함유한다면, 섬유아세포 및 매트릭스의 케라틴세포 사이의 상호작용으로 인해, 매트릭스의 케라틴세포가 모낭간 표피 등가물을 형성할 것이다.

피부 섬유아세포는 유두 또는 망상 섬유아세포 또는 그 둘의 조합일 수 있다.

착색시킬 수 있는 표피 모델의 제조를 위해, 모낭간 섬유아세포를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 제조 방법을 수행하는 것은 진피 등가물 - 또는 진피 기질 - 에 기질 세포를 접종하는 것으로 이루어진다.

전체 기질은 진피 등가물 상에 침착된다. 침착된 기질의 수는 진피 등가물의 표면적에 따라 다르다. 예를 들어, 진피 등가물이 60　mm 디쉬에서 제조되는 경우, 그것들은 수축 후에, 약 2　cm² 의 표면적을 가지고, 약 10 개의 기질로 접종된다.

상기 기질의 표면에서 기질 세포를 증식시킬 수 있도록 하는 조건이 유지되며, 상기 기질 세포 배양의 개발은 상기 기질 표면과 접촉되는 하나 이상의 최소 영양 배지, 바람직하게는 실시예 I 에서 기술된 바와 같은 3F 배지를 사용하여 촉진된다.

유리하게는, 기질 (substrate) 에 기질 세포를 접종한 후, 기질 세포를 덮는 상기 영양 배지 중에서 침지된 이식된 기질을 바람직하게는 5 내지 6 일 동안 유지시킨다.

다음, 진피 등가물을 공기와 접촉되게 놔두는데 ; 이를 위해, 용기의 바닥에 대해 들어 올려진 지지체 망 상에 진피 등가물을 놓고, 영양 배지 수준을 조정하여, 지지체 망이 겨우 덮여지나 영양 배지가 생성되는 피부 등가물의 상부 표면을 덮지 못하게 한다.

한 변형에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 추가로 표피 등가물의 착색을 유도하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 이는 UV 선으로의 자극일 수 있다.

그렇게 해서 형성된 본 발명에 따른 피부 등가물은 잘 분화되고, 잘 조직화된다. 또한 전반적으로 균질하게 된다.

또한 하기 인공 피부로서도 지칭되는 표현 "피부 등가물" 은 진피 등가물 상에 놓인 표피 등가물 조합물을 의미하는 것으로 이해된다.

그렇게 해서 제조된 진피 등가물은 하나 이상의 케라틴세포 및 멜라닌세포를 포함한다.

표피 등가물은 또한 랑게르한스 세포 및/또는 메켈 세포를 포함할 수 있고 ; 이러한 세포는 특히 기질 세포의 접종 동안에 지지체에 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 한 변형에 따르면, 진피 유두 섬유아세포 및/또는 결합성 초 섬유아세포 및/또는 전체 진피 유두를 포함하는 진피 등가물을 사용하여 하나 이상의 모낭을 재구성할 수 있는 피부 등가물을 제조하는 것이 가능하다.

진피 등가물에 유두 섬유아세포 또는 결합성 초 섬유아세포와 같은 모발 섬유아세포 또는 전체 유두 또는 결합성 초 또는 결합성 초 분획이 포함되도록 선택한다면 (Reynolds　AJ, Lawrence　CM, Jahoda　CA Human hair follicle germinative epidermal cell culture. J Invest Dermatol. 1993 Oct; 101(4): 634-8), 상기 섬유아세포 및 기질 세포 사이의 상호작용 때문에, 케라틴세포는 체모 또는 두발 (모간) 의 형태를 재생할 것이다.

본 발명의 또다른 주제는 착색시킬 수 있는 표피 등가물에 관한 것으로서, 상기 등가물은 기질 세포의 증식 및 분화로부터 유래되는 세포로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기 모델은 그의 조직학적 특징으로 인해 규명될 수 있으며 : 기저 케라틴세포를 둘러싼 3 개 이상의 수지상을 포함하는 작은 멜라닌세포를 포함한다.

상기 등가물은 더욱 구체적으로는 본 발명의 방법에 따라 제조되는 표피 등가물이고, 표피 등가물은 균일하고 균질하게 착색시킬 수 있고, 시험관 내 및 이식 후 생체 내 둘 다에서 건강한 피부의 착색을 재생시킬 수 있는 특징을 가지고 있다.

피부 또는 표피 모델의 착색 (멜라닌세포에 의한 멜라닌의 합성) 은 임의의 공지된 방법, 특히 소위 폰타나 메이슨 염색 (Fontana Masson staining) 에 의해 정량화될 수 있다.

예로써, 제한 없이, 착색은 하기에 의해 관찰 및/또는 정량화될 수 있다 :

- 컴퓨터-보조 영상 분석에 의해 수많은 염색된 수직 단면에서 멜라닌 과립의 수를 측정함 ;

- 생화학적 기술에 의해 배양 균질물의 멜라닌 함량을 측정함 ;

- 생화학적 기술에 의해 배양물 중에 함유된 표피 타이로시네이즈 (tyrosinase) 활성을 측정함 ;

- 간접 면역형광 또는 전자 현미경 기술에 의해, DOPA 로 염색시킴으로써 배양물 중에 존재하는 멜라닌세포의 수 및 그의 위치를 측정함 ;

- 다양한 색소 및 그의 물리화학적 상태 사이의 가변성 평형상태를 고려하는 색도 측정에 의한 색상의 기계적 분석 ;

- 수득된 착색의 강도를 정확하게 평가할 수 있게 하는 임의의 기타 기술.

본 출원인은 또한, 이식 후에 표피 등가물이 유리하게는 착색 능력을 가지고 있음을 말할 수 있었다. 더욱이, 수득된 착색은 균질하고, 균일하고, 원래의 피부색과 동일하다.

그의 또다른 주제에 따르면, 본 발명은 기질 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 표피 등가물의 제조용 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 추가로 지지체 상에 놓인 진피 등가물, 및 기질 세포의 증식 및 분화에 적합한 영양 배지로 이루어진 장비를 포함할 수 있다.

그의 또다른 주제에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득되는 표피 등가물을 포함하는, 피부의 미용 또는 치료성 화합물을 평가하기 위한 키트에 관한 것이다.

피부 등가물의 제조를 위해 선택되는 다양한 방법과는 상관없이, 표피 및/또는 피부 등가물은 동물 실험, 예를 들어 활성제의 방출, 그의 피부 침투 및/또는 흡수 및/또는 생물학적 이용가능성의 연구, 미용, 약학 또는 피부학적 활성제 및/또는 성분의 내성, 상용성 및 효능의 연구를 필요로 하는 모든 테스트에 대한 대체 테스트로서 유용한 3-차원 모델이다.

본 발명에 따른 표피 및/또는 피부 등가물은 또한 신규 활성제를 규명하기 위한 미용, 약학 또는 피부학적 제품의 자동화된 스크리닝 방법에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 피부 등가물은 또한 피부 착색 및 두발 및/또는 체모의 성장 기작의 생리학적 연구를 가능하게 한다.

본 발명에 따른 표피 등가물이 피부의 천연 착색을 재생하기 때문에, 탈색 활성제, 착색 활성제 및 선스크린을 시험하는 것이 특히 유리하다.

본 출원은 특히, 제품이 "검버섯" 또는 주근깨를 밝게 할 수 있거나 또는 더욱 일반적으로 피부빛을 밝게 할 수 있는 것으로 생각되는 경우, 광노화 또는 노화에 특히 유용한 것으로 판명될 수 있다.

모낭을 포함하는 표피 등가물은 특히 체모 또는 모발의 성장 역동학을 수행하는 것을 가능하게 할 것이며, 따라서 모발 성장을 촉진시키는 활성제, 모발 손실과 싸울 수 있는 활성제 또는 체모의 성장을 느리게 하는 활성제에 대한 연구에 이르는, 모발 주기 및 상기 주기에 영향을 미칠 수 있는 요소에 대한 연구와 같이, 생체 내 맥락에서 가능한 한 완전한 수많은 살아 있는 모발을 필요로 하는 임의의 연구를 가능하게 할 것이다.

활성 멜라닌세포의 존재로 인해, 상기 모델은 또한 특히 멜라닌 생성의 유도 또는 억제에 인한 두발 및/또는 체모의 색상에 영향을 줄 수 있는 활성제를 연구할 수 있게 한다.

마지막으로, 상기 모델은 또한 체모 및/또는 두발의 구조를 변경시키고자 하는 활성제의 효과를 연구할 수 있게 한다.

신규 활성제를 규명하기 위해 제품을 스크리닝하는 방법은 하기 단계를 포함한다 : 단계 (a) 상기 테스트 제품을 본 발명에 따른 표피 등가물과 접촉되도록 함, 그런 다음, 단계 (b) 표피 등가물 상에서의 상기 제품의 효과를 판독함.

본 발명에 따른 스크리닝 방법 중 하나의 변형에 따르면, 완전한 피부 모델이 사용될 것이다.

바람직하게는, 단계 (a) 를 수행하기 위해서는, 테스트 제품을 국소적으로 적용, 예를 들어 통상의 국소 제제 내에서 제형화하거나 또는 배양 배지에 도입될 것이다.

원하는 효과에 따라, 단계 (b) 는, 완벽할 필요는 없이, 테스트 제품 (대조군) 과 접촉된 적이 없는 본 발명에 따른 표피 등가물과 비교하고/거나, 또는 임의로 멜라닌의 표지 및 정량화에 의해 표피 등가물의 착색 또는 탈색의 강도의 변화 (예를 들어, 폰타나 메이슨 방법에 따른 착색), 모간의 성장의 가속화 또는 감소, 임의로 모발 케라틴의 생성에 있어서의 효과를 관찰하는 것으로 이루어질 수 있다.

단계 (b) 는 또한 구조 단백질, 특히 진피 기질의 거대분자 및 표피 분화 단백질과 같은 표피 및/또는 진피 마커를 분석함으로써 수행될 수 있다.

테스트 제품과 접촉되는 표피 또는 피부 등가물 상에서 측정되는 요소는 동일한 조건 하에서 배양되나, 테스트 제품을 받지는 않을 대조군 표피 또는 피부 등가물 상에서 측정된 것과 비교될 것이다.

표피 또는 피부 모델이 면역계 세포인 랑게르한스 세포를 포함하는 경우, 스크리닝 테스트는 또한 자극 또는 알레르기 반응을 유도할 수 있는 제품을 규명하기 위한 것일 수 있다.

그를 위해, 스크리닝 방법의 단계 (b) 에서 관찰된 요소는 하기로부터 선택될 것이다 :

- 세포독성 ;

- 염증 매개체의 방출 ;

- 조직학 또는 락테이트 탈수소효소 (케라틴세포 막 본질에 대한 마커) 의 방출에 의해 드러난 세포 손상 (Roguet 등 J Tox In vitro 6: 303 (1992) 및 Ponec　M in In vitro Toxicology. Eds Rougier, Maibach and Golberg p. 107, 1994) ;

- 피부 지질, 특히 세라미드 및 인지질의 합성 및 조성의 변경 (JID 86, 598 (1986)) ;

- 표피 세포 분화에 대한 마커로서 표피 세포의 계층화 (M　Prunieras & R　Roguet Toxicologie cellulaire In vitro methodes & applications Eds M　Adolphe, A　Guillouzo and F　Marano eds INSERM 1995 p. 191-236) (DUFFY　PA, FLINT　OP : In vitro dermal irritancy test. In CK　Atterwill and CE　Steele (Eds) : In vitro methods in Toxicology Cambridge Univ. Press Cambridge 1987, pp. 279-297) (Use of skin cell culture for In vitro assessment of corrosion and cutaneous irritancy, Roguet, Cell Biology and Toxicology, 1999 : 15, 63-75).

표피 등가물은 또한 화상, 상처 치유 결핍, 피부 궤양, 건선, 백반, 모발 색소 결핍증과 같은 색소 장애와 같은 피부 장애를 가진 환자에 이식되고자 하는 이식물의 제조를 위해 사용될 것이다.

본 출원은 또한 이식에 의한 보정이 관찰될 수 있는 심각한 색소 이상, 예를 들어 선천성 또는 후천성 저색소증 또는 과색소증 (Na　GY, Seo　SK, Choi　SK. Single hair grafting for the treatment of vitiligo. J Am Acad Dermatol. 1998 Apr; 38(4): 580-4) 을 초래하는 임의의 병리상태 ; 사고 원인, 예를 들어 신체 또는 얼굴의 넓은 영역에 걸쳐서 화상을 입은 피부 (예를 들어 : 3-도 화상을 입은 피해자) ; 수술 원인, 예를 들어 모반 또는 문신 치료를 위한 절제술을 받은 피부 (Kumagai 등, Ann Plast Surg. 39: 483-488, 1997) (Kumagai 등, An Plast Surg . 33: 385-391, 1994) 에 관한 것일 것이다.

본 출원은 또한 기질의 변성과 관련된 장애에 관한 것이다.

본 발명에 따른 피부 등가물은 또한, 모기질의 현미해부에 의한 추출 후에 두피 절편으로부터 제조되는 경우 자가이식편을 생성하는 것을 가능하게 하며, 생체 내에서 균일하게 착색된 표피가 빨리 형성되게 할 수 있다. 이러한 자가이식편은 궤양뿐만 아니라 심각한 화상에 관여할 수 있다 (Limat　A, French　LE, Blal　L, Saurat　JH, Hunziker　T, Salomon　D. Organotypic cultures of autologous hair follicle keratinocytes for the treatment of recurrent leg ulcers. J Am Acad Dermatol. 2003 Feb; 48(2): 207-14).

이러한 특정한 경우에, 인공 피부는 또한 백반으로 고생하는 환자에서 복수의 미세자가이식편을 생성할 수 있게 하여, 멜라닌세포를 거의 함유하지 않는 ORS 세포를 사용하는 현존하는 것보다 더 양호한 조건 하에서 색상화가 부족한 부분에서의 재착색을 가능하게 한다.

모든 이러한 적용을 위해서, 본 발명에 따른 피부 등가물은 자연적으로 착색되는 이점을 갖고 있다. 따라서, 이식된 피부 영역은 더욱 풍취가 있고, 햇빛에 노출되는 동안에 정상적인 생리학적 거동을 재생한다.

실시예 I - 착색된 피부 모델의 제조

Asselineau　D, Bernard　B, Bailly　C, Darmon　M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67　kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp Cell Res. 1985 Aug; 159(2): 536-9.

Asselineau　D, Bernard　BA, Darmon　M. Three-dimensional culture of human keratinocytes on a dermal equivalent A model system to study epidermal morphogenesis and differentiation in vitro. Models dermatol, vol. 3, pp.　1-7 (Karger, Basel 1987)

I-A-피부 등가물의 제조

섬유아세포를 해동시키고, 섬유아세포용 배지 (MEM + 10% FCS (소 태아 혈청) 에서 배양하고, 트립신처리하였다.

격자 생성을 위해, 세포를 해동 후 12 내지 13 일째에 풍부하게 되었을 때 사용하고, MEM Hepes 10% FCS 중 2 x 10⁶　세포/ml 의 세포 현탁액을 수득하도록 제조하였다.

배양 배지의 제조

MEM 1.76X

MEM 10X 17.6　ml

NaHCO3 7.5% 5.1　ml

1.76　mM L-글루타민 0.88　ml

0.88　mM 나트륨 피루베이트 0.88　ml

0.88 X 비-필수 아미노산 0.88　ml

8.8　U/8.8　㎍/ml (0.088%) 페니실린 스트렙토마이신 0.088　ml

0.04 X (0.04%) 항진균 항생제 0.044　ml

멸균 초-순수 75　ml

MEM Hepes 10% FCS

MEM 25　mM Hepes 50　ml

2　mM L-글루타민 0.5　ml

1　mM 나트륨 피루베이트 0.5　ml

1 X 비-필수 아미노산 0.5　ml

20　U/20　㎍/ml (0.2%) 페니실린 스트렙토마이신 0.1　ml

0.1 X (0.1%) 항진균 항생제 0.05　ml

10% FCS 5　ml

NaOH 0.1N

10　ml NaOH 1N

90 ml 멸균 초-순수

상기 용액을 0.22 ㎛ GV Durapore 막이 있는 Millipore 필터에 통과시켰다.

아세트산 1/1000

0.5　ml 빙초산 100%

499.5　ml 멸균 초-순수

격자 제조

Gattefosse 콜라겐의 사용

3.22　ml MEM 1.76 X

0.63　ml FCS

0.35　ml NAOH 0.1N

0.2　ml MEM Hepes 10% FCS

부피 = 4.4　ml

상기 용액에 세포 현탁액 0.5　ml 을 첨가하였다.

그런 다음, 냉 콜라겐을 필요한 부피만큼 서서히 도입하였다.

Erlenmeyer 플라스크의 내용물을 세균성 디쉬 Falcon Ø 60　mm 로 비웠다.

인큐베이터 (37℃ - 5% CO₂) 에 약 1 시간 30 분 내지 2 시간 동안 디쉬를 놔두었다.

수축이 일어나도록 3 일 동안 놔두었다.

다음, 기질 세포를 접종하였다.

I-B-기질 세포의 현미해부 및 배양 (접종) (도 1)

피부 생검으로부터, 모낭의 현미해부를 수행하고, 그것들을 배양 배지를 함유하는 페트리 디쉬에 놓았다. 표피를 진피 유두 구 및 결합성 초로부터 분리하고, 구 영역을 진피 유두의 정점에서 자르고 ; 다음, 이 절편을 바늘을 이용해 약한 압력을 가함으로써 멸균 고리 내에 있는 진피 등가물 상에 놓았다. 결합성 초와 기질 세포의 분리는 단백용해성 효소의 사용 없이 더욱 쉽게 일어나고, 따라서 진피 부분을 제거하고, 기질 세포를 1 주일 동안 3F 배양 배지로 배양하였다.

I-C-인공 피부의 제조

침지된 배양 7 일 후, 피부를 에머션 (emersion) 에 두었다.

그러나, 케라틴세포가 격자를 떠나는지 현미경 하에 관찰하면서 체크하였다.

Falcon 세균성 디쉬에, 에머션 망을 두었다.

7.5　ml MEM 10% FCS + 3 F 를 첨가하여, 버블이 생기는 것을 피하였다.

멸균 외과용 메스를 사용해 에머션된 피부 주변의 접착제를 잘라내었다.

구부러진 한 쌍의 핀셋 및 세포 리프터를 사용해 망 위로 피부를 옮겼다.

디쉬를 37℃ - 5% CO₂의 인큐베이터 안에 두었다.

배지 (7.5　ml MEM 10% FCS + 3 F) 를 수요일 및 금요일에 바꿔 주었다.

에머션 7 일 후에, 피부를 사용하게 준비하였다.

사용된 배양 배지 : MEM 10% FCS + 3 F

MEM 500　ml

2　mM L-글루타민 5　ml

1　mM 나트륨 피루베이트 5　ml

1 X 비-필수 아미노산 5　ml

20　U/20　㎍/ml (0.2%) 페니실린 스트렙토마이신 1　ml

0.1 X (0.1%) 항진균 항생제 0.5　ml

10　ng/ml EGF 10　㎍/ml 의 스톡 용액 0.5 ml

10^-10 M 콜레라 독소 10^-5 M 스톡 용액 5　ml

0.4　㎍/ml 하이드로코르티손 0.5　mg/ml 스톡 용액 0.4 ml

10% FCS 50　ml

도 2 및 도 3 은 본 발명의 방법에 따른 인공 피부의 횡단면을 나타낸 것이다.

그의 관찰은, 생체 내에서 표피를 재생하는 각질층으로 덮힌 층화 표피를 보여준다. 또한, 도 3 의 표피는 멜라닌을 포함하는 것을 볼 수 있다.

실시예 II -모낭을 포함하는 피부 모델의 제조

실시예 I 에서 기술된 프로토콜을 위한 실험 조건을 단계 I-A- 에서 소낭성 섬유아세포를 사용하여 재생할 것이다.

도 1 은 기질 세포의 현미해부 및 배양에 관한 것이고, 도 2 는 이식 후에 기질 세포를 사용하여 수득된 인공 피부의 조직학적 측면을 나타낸 것이고, 도 3 은 이식 후에 기질 세포를 사용하여 수득된 인공 피부에서 폰타나 메이슨 표지에 의한 멜라닌의 존재를 나타낸 것이다.

Claims

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하기를 포함하는 표피 등가물 제조 방법 :

a -　배양 배지 중에 침지된 지지체 상에 놓인 진피 등가물 상에 기질 세포를 접종함 ;

b -　상기 진피 등가물의 표면에서 기질 세포를 증식시킴 ;

c -　배양 배지가 제조 동안에 표피 등가물의 상부면을 덮지 않도록 상기 지지체를 들어올림.
제 3 항에 있어서, 단계 (a) 의 진피 등가물이 진피 섬유아세포가 분포되는 콜라겐 격자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 섬유아세포가 모낭간 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b 가 5 내지 6 일 동안 영양 배지 중에 침지된 진피 등가물과 기질 세포가 접촉되도록 유지하는 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 영양 배지가 3F 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 착색-유도 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는, 3 개 이상의 수지상이 있는 멜라닌세포를 포함하는 표피 등가물.
기질 세포의 증식 및 분화로부터 유래되는 세포로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 3 개 이상의 수지상이 있는 멜라닌세포를 포함하는 표피 등가물.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 적어도 케라틴세포 및 멜라닌세포를 포함하는 표피 등가물.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 랑게르한스 세포 및/또는 메켈 세포를 추가로 포함하는 표피 등가물.
제 9 항 또는 제 10 항에 따른 표피 등가물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 등가물.
하기를 포함하는, 기능성 모낭을 포함하는 피부 등가물의 제조 방법 :

a -　배양 배지 중에 침지된 지지체 상에 놓이고 진피 유두 섬유아세포를 포함하는 진피 등가물 상에 기질 세포를 접종함 ;

b -　상기 진피 등가물의 표면에서 기질 세포를 증식시킴 ;

c -　배양 배지가 제조 동안에 표피 등가물의 상부면을 덮지 않도록 상기 지지체를 들어올림.
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피부 등가물을 위한 배양 배지 내에 제 9 항 또는 제 10 항에 따른 표피 등가물을 포함하는 화합물 평가 키트.
화합물의 피부 방출, 침투, 흡수, 생물학적 이용가능성, 내성, 상용성, 효능, 또는 이들의 조합을 테스트하기 위한, 제 13 항에 따른 피부 등가물의 사용 방법.
제 17 항에 있어서, 미용, 약학 또는 피부학적 화합물의 자동화된 스크리닝 방법에서의 사용 방법.
제 17 항에 있어서, 피부 착색을 조정하는 화합물을 규명하기 위한 사용 방법.
제 17 항에 있어서, 체모 및/또는 두발의 성장을 조정하는 화합물을 규명하기 위한 사용 방법.
제 17 항에 있어서, 피부 자극 또는 알레르기 반응을 유도할 수 있는 화합물을 규명하기 위한 사용 방법.
하기 단계를 포함하는, 신규 활성제를 규명하기 위해 제품을 스크리닝하는 방법 :

상기 테스트 제품을 제 9 항 또는 제 10 항에 따른 표피 등가물과 접촉시키기 위한 단계 (a), 및

다음으로, 표피 등가물 상에서 상기 제품의 효과를 판독하기 위한 단계 (b).
화상, 상처 치유 결핍, 피부 궤양, 건선, 백반, 선천성 또는 후천성 저색소증 또는 과색소증과 같은 색소 장애, 또는 수술 원인으로 인한 색소 장애로부터 선택되는 피부 장애를 치료하고자 하는 이식편의 제조를 위한, 제 9 항 또는 제 10 항에 따른 표피 등가물의 사용 방법.
피부 등가물을 위한 배양 배지 내에 제 13 항에 따른 피부 등가물을 포함하는 화합물 평가 키트.