FR3133198A1 - Modele de peau reconstituee - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un modèle de peau reconstituée comprenant 1) un substitut cutané et 2) une composante microbienne et une composante lipidique sur la surface dudit substitut cutané, ainsi qu’un procédé d’obtention du modèle de peau reconstituée. Le modèle de peau reconstituée peut notamment être utilisé dans une méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène ; une méthode d’évaluation de l’efficacité in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène ; ou une d'évaluation in vitro de la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique.
Description
Le domaine de l’invention concerne un nouveau modèle cutané intégrant une composante microbienne et un composant lipidique. Ce modèle est particulièrement adapté pour étudier et développer des nouveaux actifs/produits dans le domaine dermo-cosmétique. En effet, à ce modèle intégré, un stress physique ou chimique peut être ajouté pour reproduire des lésions ou des situations pathologiques, pouvant provoquer des déséquilibres du microbiote cutané.
La peau est bien plus qu’une enveloppe externe, elle est en effet un véritable organe nécessaire à la vie. Elle constitue un terrain d’échange entre notre environnement intérieur et l’environnement extérieur et est de ce fait exposée à de multiples agressions et variations auxquelles elle s’adapte en permanence. La peau assure donc, entre autres, une véritable fonction barrière, autrefois attribuée à sa seule structure et composition. La peau est composée de cellules regroupées entre elles pour former un tissu à la fois résistant et souple. Ces cellules sont réparties en trois couches : l’hypoderme, le derme et l’épiderme. L’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau. Il est constitué de tissu adipeux blanc qui permet de protéger l’organisme des chocs, de constituer une réserve énergétique et de thermoréguler le corps. Le derme est la couche comprise entre l’hypoderme et l’épiderme. Elle est la couche la plus épaisse de la peau. Le derme héberge les vaisseaux sanguins et lymphatiques, les nerfs, les glandes sudoripares qui produisent la sueur et les follicules pilo-sébacés. Il est majoritairement composé de macromolécules, de cellules fibroblastiques et de cellules du système immunitaire. L’épiderme est la surface la plus mince de la peau. Il est composé à 90 % de kératinocytes qui servent à synthétiser la kératine et permettent, grâce à leur différenciation, d’assurer une imperméabilité et une protection à la peau. L’épiderme est constitué de quatre principales couches : la couche basale (stratum basale), constituée de kératinocytes à larges noyaux, qui permettent d’assurer le renouvellement constant de l’épiderme ; la couche spineuse (stratum spinosum), composée de kératinocytes volumineux qui s’aplatissent progressivement en allant vers les couches supérieures ; la couche granuleuse (stratum granulosum), composé de kératinocytes aplatis qui permettent de transformer les kératinocytes en cornéocytes (cellules anucléées) et enfin la couche cornée (stratum corneum), couche supérieure composée des cornéocytes qui vont desquamer. L’épiderme n’est pas uniquement composé de cornéocytes mais aussi de lipides entre ces différentes cellules. Les lipides sont organisés sous forme de bicouches lipidiques. Les principales classes de ces lipides sont les céramides, le cholestérol et les acides gras libres. Ils assurent en partie la fonction barrière de la peau.
Le sébum est un film hydrolipidique produit par les glandes sébacées. Il est excrété à la surface de la peau où il va former une couche protectrice, mais aussi servir de substrat au microbiote cutané. Le sébum est majoritairement lipophile et anaérobie, et va donc permettre de conserver des espèces microbiennes lipophiles et anaérobies. Il va aussi protéger la peau en la graissant et en l’acidifiant pour réguler le pH cutané.
Le microbiote cutané joue également un rôle clé dans les fonctions protectrices de la peau. Il participe également à la régulation du pH de la peau. Le microbiote cutané, appelé également flore cutanée, se situe au niveau de l’épiderme. Il est constitué de micro-organismes comme des bactéries, des virus, des champignons et parasites. Le microbiote cutané évolue au fur et à mesure de l’avancée en âge, pour atteindre en moyenne 1 000 milliards de bactéries, et 1 000 espèces de virus, parasites et champignons. Pour les bactéries, les souches les plus connues et étudiées sontStaphylococcus a ureus,Staphylococcus e pidermidisetCutibacterium acnes. Certaines sont aérobies et vivent donc avec l’apport d’oxygène et d’autres sont anaérobies et vivent plus en profondeur dans lestratum corneumsans apport d’oxygène. Certaines de ces bactéries produisent des acides gras, d’autres des peptides antimicrobiens et même dans certains cas des acides aminés. La plupart de ces bactéries utilisent les lipides du sébum pour croitre et produire ces composés.
Le microbiote cutané varie de manière quantitative et qualitative d’une personne à l’autre. Des variables telles que l’âge, le sexe, le système immunitaire, le pH, la température ou encore l’humidité peuvent modifier la composition du microbiote de la peau. Par exemple, l’utilisation de produits cosmétiques ou pharmaceutiques créent des différences. Toutefois, deux catégories distinctes peuvent être identifiées au sein du microbiote cutané : la flore « résidente » et la flore « transitoire ».
Comme son nom l’indique, la flore cutanée résidente vit en totale symbiose avec la peau. On parle d’organismes commensaux. Elle est importante pour la défense contre les micro-organismes pathogènes, car la place qu’elle occupe sature l’espace et empêche la fixation d’organismes indésirables.
La flore transitoire ne s’établit pas de façon permanente à la surface de la peau, elle varie au cours de la journée, dépend des activités réalisées et des variations des conditions environnantes. Elle peut être présente quelques heures, ou quelques jours. Les micro-organismes qui la composent sont pour la plupart inoffensifs, dits saprophytes. Cette flore peut également être constituée de bactéries pathogènes opportunistes et entraîner des maladies, si les défenses de l’hôte faiblissent. Une des espèces transitoires les plus communes estS. aureus, mise en cause dans la dermatite atopique (DA).
Les micro-organismes présents sur la peau et composant la flore résidente ne sont pas opportunistes, ils remplissent des fonctions très utiles pour la protection de l’organisme. En effet, le microbiote cutané assure différents rôles dans le maintien de l’intégrité de notre peau. Il constitue une barrière en régulant l’homéostasie de la peau, en lui fournissant des nutriments ou bien encore en rentrant en compétition avec des pathogènes.S. epidermidissécrète par exemple des peptides antimicrobiens contreS. aureus.Corynebacterium striatumetC . acnesinhibent quant à eux l’expression de gènes de virulence de ce dernier (Sanford and Gallo, Seminars in Immunology, 25, pp370-7, 2013). La symbiose entre hôte et microorganismes est notamment indispensable à la bonne santé de la peau. Lorsque cet équilibre est rompu, on parle alors de dysbiose. Il a été montré dans de nombreuses études que les dysbioses sont corrélées à l’apparition de certaines pathologies cutanées inflammatoires, comme l’acné, la dermatite atopique ou l’eczéma. La compréhension des interactions entre le microbiote cutané et la peau constitue donc un enjeu dans l’élaboration de nouveaux traitements cosmétiques et pharmaceutiques.
Aujourd’hui, l’évaluation d’agents cosmétiques et pharmacologiques peut notamment être fait sur des modèles de peaux humaines reconstruites in vitro. Ces modèles contiennent une barrière épidermique différenciée et reflètent les conditions morphologiques d’une peau humainein vivo. Parmi les modèles de peau humaines reconstruites, Van Der Krieken et son équipe ont développé un modèle destratum corneumà partir de kératinocytes prélevés au talon de volontaires (Acta Derm Venereol. 2016 ; 96(7) : 873-879). Un microbiote est notamment ajouté aux kératinocytes en suspension. Cependant, la composition de ces modèles de peaux diffère encore beaucoup de la composition réelle de la peau humaine. En particulier, il ne comprend pas de lipides ayant un rôle protecteur pour la peau et le microbiote et qui sont sécrétés par les glandes sébacées. De plus, il ne comporte pas de kératinocytes viables. Ainsi, l’interaction entre micro-organismes et kératinocytes (sécrétion de cytokines, de peptides antimicrobiens, etc.) n’est pas observable.
Des modèles 3D d’épidermes reconstruites ayant un composé microbien ont également été utilisés pour étudier les interactions entre le microbiote et la peau (Rademacher et al., Experimental Dermatology, 27, pp489-494, 2018). Toutefois, la plupart de ces modèles comprend la colonisation d’une seule espèce de micro-organisme, tel queC. amycolatum ,et ne reflètent donc pas les conditions réelles de notre peau. La présence de lipides dans les modèles de peau sain n’est pas non plus décrite.
Par conséquent, il existe toujours un besoin de modèle permettant de reproduire les conditions les plus proches de la peau naturelle, de préférence pouvant être obtenu de façon aisée et à un coût réduit.
De façon avantageuse, les inventeurs ont mis au point un nouveau modèle de peau comprenant une composante microbienne et une composante lipidique qui permet avantageusement de se rapprocher de la véritable peau. De façon avantageuse, le coût associé à un tel modèle est notamment réduit comparé aux explants. Par ailleurs, ce modèle peut être utilisé avec différents stress afin de mimer des troubles de la peau. En effet, les inventeurs ont notamment observé que l’application d’un stress exogène sur le modèle de peau induisait des caractéristiques moléculaires et métaboliques semblables à celles observéesin vivochez les sujets ayant une peau exposée au soleil ou à des conditions inflammatoires. Le modèle peut avantageusement servir d’outil afin de cribler des actifs ou encore des formulations cosmétiques ou pharmacologiques d’intérêts.
Le premier objet de l’invention concerne donc un modèle de peau reconstituée comprenant :
- un substitut cutané, et
- une composante microbienne et une composante lipidique sur la surface dudit substitut cutané.
Un autre objet de l’invention porte sur un procédé d’obtention d’un modèle de peau reconstituée comprenant :
- Fourniture d’un substitut cutané,
- Application sur ledit substitut cutané, de façon concomitante ou séquentielle, d’une composante microbienne et d’une composante lipidique.
L’invention concerne également une méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes :
- L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention ;
- La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ;
- Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et
- Déterminer si ledit actif ou de ladite formulation cosmétique permet de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c).
L’invention concerne également une méthode d’évaluation de l’efficacitéin vitrod’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes :
- L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention ;
- La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ;
- Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et
- Évaluer l’efficacité dudit actif ou de ladite formulation cosmétique en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c).
L’invention concerne également une méthode d'évaluationin vitrode la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique, comprenant les étapes suivantes :
- L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention ;
- Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique dans le modèle de peau de l’étape a) ; et
- Évaluer si ledit actif ou formulation cosmétique est bien toléré par le modèle de peau.
L’invention concerne enfin un kit comprenant une composante microbienne et une composante lipidique destiné à être appliqué sur un substitut cutané, la composante microbienne comprenant au moins quatre genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genresCutibacterium , Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia , Finegoldia , Gemella , Veillonella , Kocuia , Corynebacterium, Methylobacterium ,etBrevibacterium.
Comme indiqué ci-dessus, l’invention porte sur un modèle de peau reconstituée comprenant :
- un substitut cutané, et
- une composante microbienne et une composante lipidique sur la surface dudit substitut cutané.
Par « substitut cutané » on entend une culture de cellules cutanées composée d’au moins une couche. Les substituts cutanés selon l’invention comprennent notamment les cultures de cellules cutanées en monocouche, les cultures de cellules cutanées en bicouche et les modèles tissulaires, dont les cultures d’épiderme reconstruit ou de peau reconstruite. En effet, comme il est souvent difficile de travailler sur des explants frais, il est particulièrement avantageux, dans le cadre de la présente invention, d’utiliser des cultures de cellules cutanées. Par « épiderme reconstruit », on entend un épiderme généré in vitro par des techniques classiques bien connues de la personne du métier (cf., par exemple, Limat et Hunziger.Cells Tissues Organs2002;172:79-85 ; Poumayet al., Arch Dermatol Res. 2004;296(5):203-11). Par « peau reconstruite » on entend une culture contenant au moins deux compartiments : un compartiment dermique, et un compartiment épidermique. De préférence, la composante épidermique de la peau reconstruite contient des kératinocytes. De préférence, la composante dermique contient des fibroblastes.
Avantageusement, les cellules cutanées comprennent des cellules normales, saines ou pathologiques pouvant entrainer des troubles cutanés, ou des cellules issues de lignées. Des cellules cutanées mises en culture peuvent notamment être obtenues à partir d’explant de tissu cutané. Par « explant » ou « explant de peau », on entend ici un prélèvement de cellules ou de tissu cutané, lequel peut être réalisé dans un but chirurgical ou pour effectuer des analyses. En particulier, un explant peut être obtenu lors d’une exérèse chirurgicale. Par « exérèse », on entend ici une intervention chirurgicale consistant à découper (exciser) une partie plus ou moins large ou profonde de la peau pour en traiter une anomalie ou une excroissance. On procède à une exérèse soit pour retirer une tumeur cancéreuse ou suspecte de l'être, soit pour traiter une anomalie bénigne de la peau qui est gênante, que ce soit pour des raisons fonctionnelles ou esthétiques. Une exérèse au sens de l’invention inclut par exemple les échantillons de peau obtenus après chirurgie plastique (plastie mammaire, abdominale, lifting, prélèvement préputial, otoplastie, c’est-à-dire recollement d’oreille, syndactylie ou doigt surnuméraire, etc.).
Un explant peut aussi être obtenu par biopsie. Par « biopsie », on entend ici un prélèvement de cellules ou tissu cutané réalisé à des fins d’analyse. Plusieurs types de procédures de biopsies sont connus et pratiqués dans le domaine. Les types les plus communs comprennent (1) la biopsie incisionnelle, dans laquelle seul un échantillon du tissu est prélevé, (2) la biopsie excisionnelle (ou biopsie chirurgicale) qui consiste en l’ablation totale d’une masse tumorale, réalisant ainsi un geste thérapeutique et diagnostique, et (3) la biopsie à l’aiguille, dans laquelle un échantillon de tissu est prélevé avec une aiguille, celle-ci pouvant être large ou fine. D’autres types de biopsie existent, comme par exemple le frottis ou le curettage, et sont aussi englobés dans la présente invention.
Alternativement, lesdites cellules cutanées peuvent être obtenues par différentiation de cellules souches (Guenouet al.,Lancet, 374(9703) : 1745-1753, 2009 ; Nissanet al.,Proc. Natl . Acad. Sci., 108(36) : 14861-14866, 2011 ; Kraehenbuehlet al.,Nature Methods, 8 : 731–736, 2011). Lesdites cellules souches ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines.
Les cellules cutanées selon l’invention, qu’elles proviennent d’une biopsie ou qu’elles soient obtenues par différentiation de cellules souches, comprennent au moins un type de cellules habituellement présentes dans l’hypoderme, le derme et/ou l’épiderme. Ces cellules comprennent ainsi, entre autres, des kératinocytes, des mélanocytes, des fibroblastes, des adipocytes, des cellules endothéliales, des mastocytes, des cellules de Langerhans et/ou des cellules de Merkel. De façon préférentielle, les cellules cutanées selon l’invention comprennent au moins des kératinocytes et/ou des fibroblastes. De façon plus préférentielle, les cellules cutanées selon l’invention comprennent des kératinocytes et/ou des fibroblastes.
De nombreuses méthodes de culture de cellules cutanées sont connues de la personne du métier. N’importe laquelle de ces méthodes peut être utilisée pour cultiver le substitut cutané de l’invention. Le substitut cutané est cultivé et/ou conservé dans des conditions maintenant, au moins partiellement, un métabolisme cellulaire et/ou des fonctions cellulaires. La culture du substitut cutané comprend donc aussi bien les cultures de cellules cutanées en monocouche (par ex. de kératinocytes) ou les cultures de cellules cutanées en bicouche que des modèles tissulaires, dont les cultures de peaux reconstruites.
Les cultures de cellules cutanées en monocouche ou en bicouche sont connues et utilisées depuis très longtemps. Par ailleurs, de nombreux modèles tissulaires, dont en particulier des modèles de peaux reconstruites (Rosdyet al.,In Vitro Toxicol., 10(1) : 39-47, 1997 ; Ponecet al.,J Invest Dermatol., 109(3) : 348-355, 1997 ; Ponecet al.,Int J Pharm., 203(1-2) : 211-225, 2000 ; Schmalzet al.,Eur J Oral Sci., 108(5) : 442-448, 2000 ; Blacket al.,Tissue Eng, 11(5-6) : 723-733, 2005 ; Dongari-Batgtzoglou et Kashleva,Nat Protoc, 1(4) : 2012-2018, 2006 ; Bechtoilleet al.,Tissue Eng, 13(11) : 2667-2679, 2007 ; Vranaet al.,Invest Ophthalmol Vis Sci, 49(12) : 5325-5331, 2008 ; Kinicogluet al.,Biomaterials, 30(32) : 6418-6425, 2009 ; Auxenfanset al.,Eur J Dermatol, 19(2) : 107-113, 2009 ; Kinicogluet al.,Biomaterials, 32(25) : 5756-5764, 2011 ; Costinet al.,Altern Lab Anim, 39(4) : 317-337, 2011 ; Auxenfanset al.,J Tissue Eng Regen Med, 6(7) : 512-518, 2012 ; Lequeuxet al.,Skin Pharmacol Physiol, 25(1) : 47-55, 2012 ; EP 29 678 ; EP 285 471 ; EP 789 074 ; EP 1 451 302 B1 ; EP 1 878 790 B1 ; EP 1 974 718 ; US 2007/0148,771 ; US 2010/0,099,576 ; WO 02/070729 ; WO 2006/063864 ; WO 2006/0,63865 ; WO 2007/064305) sont à la disposition de la personne du métier et sont compris dans la portée de l’invention.
Préférablement, le modèle de peau reconstruite est sélectionné dans le groupe comprenant les modèles d’épiderme constitué principalement de kératinocytes, les modèles de peau comprenant un derme et un épiderme, et les modèles de peau comprenant un derme, un épiderme et un hypoderme. Les modèles comprenant au moins un derme, forment des tissus de type conjonctifs, tandis que les modèles comprenant au moins un épiderme forment des épithélia stratifiés comprenant les couches caractéristiques du tissu considéré. Par exemple, on peut identifier dans les modèles d’épiderme une couche basale (stratum basalis), une couche épineuse (stratum spinosum), une couche granuleuse (stratum granulosum), et une couche cornée (stratum corneum).
Avantageusement, ledit modèle de peau est un modèle d'épiderme comprenant un support matriciel de préférence choisi parmi :
- un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi- perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable ;
dans ce groupe on trouve les modèles Epiderme reconstruits (Skinethic®) ainsi que le modèle EpiDerm®, (Mattek Corporation) ;
- un film ou une membrane à base d'acide hyaluronique et/ou de collagène et/ou de fibronectine et/ou de fibrine.
Dans ce groupe on peut citer particulièrement les modèles : Laserskin® (Fidia Advanced Biopolymers), Episkin ® (L'Oréal).
Ces modèles peuvent être ensemencés par des fibroblastes dans la partie dermique.
Ces modèles, dans lesquels peuvent être intégrés ou non des fibroblastes, servent de support pour l’ensemencement des kératinocytes et la reconstitution de l’épiderme. Avantageusement, sont introduites, outre les kératinocytes, des cellules pigmentaires, des cellules immunocompétentes, des cellules nerveuses ; de préférence les cellules immunocompétentes sont des cellules de Langerhans.
Il existe par ailleurs des modèles dédiés à la thérapie tissulaire qui peuvent également être utilisés dans le cadre de la présente invention. On peut citer les modèles Epidex (Modex Thérapeutiques), Epibase® (Laboratoire Genévrier), EpicellTM(Genzyme), AutodermTMet TransdermTM(Innogenetics).
Le support matriciel est ensuite ensemencé par des kératinocytes pour reconstruire l’épiderme et obtenir finalement une peau reconstruite.
Avantageusement, le modèle de peau utilisé comprend un modèle dans lequel a été incorporé au moins un type cellulaire complémentaire, comme des cellules endothéliales (CE) et/ou des cellules immunitaires telles que lymphocytes, macrophages, mastocytes, cellules dendritiques et/ou des cellules adipeuses et/ou des annexes cutanées, comme des poils, des cheveux, des glandes sébacées.
Le modèle de peau reconstituée de l’invention est particulièrement simple à mettre en œuvre. En outre, il ne nécessite pas d’utiliser une lignée cellulaire commerciale particulière, et s’avère avantageusement adaptable.
Par « composante microbienne » on entend un ensemble de micro-organismes composés d’au moins quatre genres de bactéries différentes. De préférence, la composante microbienne est une composante microbienne cutanée. Par « composante microbienne cutanée » on entend un ensemble de micro-organismes composés d’au moins quatre genres de bactéries différentes, ledit au moins quatre genres de bactéries étant présents sur la peau d’un sujet, de préférence d’un sujet humain. De préférence, la composante microbienne comprend au moins quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, ou dix genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genresCutibacterium , Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia , Finegoldia , Gemella , Veillonella , Kocuia , Corynebacterium, Methylobacterium ,etBrevibacterium, plus préférentiellement l’ensemble de genres décrits ci-dessus. De préférence, les au moins quatre genres comprend les genres suivants :Cutibacterium , Staphylococcus, Streptococcus,etBurkholderia .La composante microbienne peut également comprendre un ou plusieurs genres ou espèces de champignon et/ou de virus.
De préférence, la composante microbienne correspond au microbiote de la peau d’au moins un sujet. Par « microbiote » on entend l’ensemble de micro-organismes qui est présent dans un environnement. Le microbiote de la peau correspond donc à l’ensemble de micro-organismes présent sur la peau. Bien entendu, la composition du microbiote peut varier selon le site de la peau. De préférence, la composante microbienne cutanée correspond au microbiote de la peau de visage, de préférence du front, d’au moins un sujet. Aussi, selon un mode de réalisation préférentielle, la composante microbienne cutanée est issue d’un prélèvement d’au moins un sujet, plus préférentiellement au niveau du visage et encore plus préférentiellement au niveau du front. Dans un mode de réalisation particulier, le prélèvement de la composante microbienne peut se faire sur une zone de peau atteinte d’un trouble cutané comme par exemple une dermatose inflammatoire. De préférence, la composante microbienne à une viabilité de 5 000 RLU (2 x 105CFU / ml) au moment qu’elle est ajoutée sur la surface du substitut cutané. Après 48h d’incubation, la composante microbienne à de préférence une viabilité d’environ 100 000 RLU/0,66 cm2de substitut cutané. La viabilité est déterminée en utilisant le kit « BacTiter ATP Lite » de Promega.
Par « composante lipidique » on entend un mélange d’au moins deux, trois, ou quatre composants choisis parmi les acides gras libres, les triglycérides, le squalène, le cire et/ou esters de cire, et le cholestérol et/ou esters de cholestérol. De préférence, la composant lipidique est une source de nutriments pour au moins une espèce bactérienne présente dans la composante microbienne. De préférence, la composante lipidique permet de protéger le substitut cutané et/ou au moins une espèce bactérienne de la dessiccation. De préférence, la composant lipidique comprend un mélange de d’acides gras libres, de triglycérides, de squalène, de cire et/ou esters de cire, et de cholestérol et/ou esters de cholestérol. De préférence, les acides gras libres comprennent C16:0, C18:0, C16:1, C18:1, et/ou C18:2. De préférence, les cires et/ou esters de cire comprennent C16:0/C16:0, C18:0/C18:0, C16:1/C16:1, et/ou C18:1/C18:1. De préférence, les triglycérides comprennent C16:0, C18:0, C16:1, et/ou C18:1. De préférence, la composante lipidique comprend 30 à 50 % p/p de triglycérides. De préférence, la composante lipidique comprend 15 à 30 % p/p d’acides gras libres. De préférence, la composante lipidique comprend 25 à 30 % p/p de cires et/ou esters de cire. De préférence, la composante lipidique comprend 12 à 20 % p/p de squalène. De préférence, la composante lipidique comprend 4,5 à 8,5 % p/p de cholestérol et/ou esters de cholestérol. Plus préférentiellement, la composante lipidique est composée de 30 à 50 % p/p de triglycérides, de 15 à 30 % p/p d’acides gras libres, de 25 à 30 % p/p de cires et/ou esters de cire, de 12 à 20 % p/p de squalène et de 4,5 à 8,5 % p/p de cholestérol et/ou esters de cholestérol. De préférence, la composante lipidique comprend 3,0 à 6,0 % p/p de cholestérol et de 1,5 à 2,5% p/p d’esters de cholestérol. De préférence, la composante lipidique est en forme de hydrolipide, c.-à-d. en forme d’émulsion avec de l’eau. De préférence, la composante lipidique est du sébum. De préférence, la composante lipidique est issue d’un prélèvement d’au moins un sujet, plus préférentiellement au niveau du visage et encore plus préférentiellement au niveau du front. De préférence, la composante lipidique est ajoutée à une concentration finale de 30 à 70µg/cm², plus préférentiellement à une concentration finale de 40µg/cm² de substitut cutané. Le substitut cutané étant composé d’au moins une couche de cellules cutanées, la composante microbienne et la composante lipidique sont présentes sur la surface dudit substitut.
Par « sujet », on entend ici toute personne humaine, que ce soit un adulte ou un enfant. Par « enfant », on entend selon l’invention un individu dont l’âge est inférieur ou égal à 16 ans. Sont ainsi compris dans la catégorie des enfants selon l’invention, les nouveau-nés, dont l’âge est compris entre 0 et 1 mois, les nourrissons, qui ont entre 1 mois et 2 ans, et les enfants proprement dits, qui sont âgés d’au moins 2 ans. Un « nouveau-né », comme on l’entend ici, peut aussi bien être né à terme qu’être prématuré. Un « adulte » au sens de la présente invention est une personne qui n’est pas un enfant, autrement dit une personne âgée de plus de 16 ans.
Un autre objet de l’invention porte sur un procédé d’obtention d’un modèle de peau reconstituée comprenant :
- Fourniture d’un substitut cutané,
- Application sur ledit substitut cutané, de façon concomitante ou séquentielle, d’une composante microbienne et d’une composante lipidique.
Le substitut cutané est tel que décrit ci-dessus. La composante lipidique peut être appliqué avant la composant microbienne, ou inversement. De préférence, la composante microbienne et la composante lipidique sont mélangés ensemble avant application sur le substitut cutané. De préférence, la composante microbienne et/ou la composante lipidique est/sont appliquée(s) sur le substitut cutané à l’aide d’une pipette et d’un doigtier. De préférence, la composante microbienne est appliquée frais ; autrement dit, elle n’a pas subi d’étape de congélation au préalable.
Selon un aspect particulier, la peau reconstituée est stressée. De préférence, le procédé d’obtention comprend en outre une étape de réalisation d’au moins un stress exogène. Aussi, selon un autre aspect, le procédé d’obtention d’un modèle de peau reconstituée est caractérisé en ce que la peau reconstituée est stressée et en ce que le procédé comprend en outre une étape
c) de réalisation d’au moins un stress exogène.
L’étape c) peut être réalisée avant ou après l’étape b) du procédé d’obtention du modèle. Dans certains cas, l’étape c) peut être réalisée sur la composante microbienne et/ou la composante lipidique avant leur application sur le substitut cutané. De préférence, l’étape c) est réalisé après l’étape b) du procédé.
Par « stress exogène » on entend tout facteur extérieur affectant l’intégrité de la peau et pouvant entraîner, le cas échéant, une diminution progressive de l’efficacité des fonctions de celle-ci. Le stress exogène peut être un stress chimique et/ou physique.
Les stress physiques englobent notamment les stress environnementaux (par ex. le température) et les stress mécaniques (par ex. les frottements). De préférence le stress physique est choisi parmi rayonnement ultraviolet, lumière solaire, infra-rouge, proche infra-rouge, thermique, rayonnement hertzien dont, micro-ondes et ondes des téléphones portables, rayonnements ionisants dont beta, gamma, X, rayonnements non ionisants, le rayonnement d'un champ magnétique, ozone, un changement de pression, le chaud, le froid, les frottements, les étirements, des particules.
De préférence, le stress physique est un rayonnement mimant un rayonnement solaire, plus préférentiellement une irradiation dans le domaine UV dont UVA et/ou UVB ; et/ou lumière visible dont lumière bleue haute énergie visible et/ou infrarouge. Par « rayonnement ultraviolet » on entend des rayons électromagnétiques dont la longueur d’onde est comprise de 153 nm à 400 nm. Préférentiellement, l’exposition aux UV selon l’invention comprend l’exposition à des UVA et/ou à des UVB. Par UVA, on entend au sens de l’invention des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 400 à 320 nm. Par UVB, on entend au sens de l’invention des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 320 à 290 nm. Par « lumière visible » on entend des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 400 à 700 nm. Par « lumière bleue haute énergie visible » on entend la lumière visible avec une longueur d'onde compris de 400 à 450 nm. Par « infrarouge » on entend des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 700 nm à 2500 nm.
Selon un mode de réalisation préféré, l’exposition aux UV selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVA. Selon un autre mode de réalisation préféré, l’exposition aux UV selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVB. Selon un mode de réalisation avantageux, l’exposition aux UV selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVA et à des UVB. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l’exposition aux rayonnements selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVA et/ou UVB et/ou lumière bleue haute énergie visible et/ou IR. Dans un mode de réalisation particulier, les longueurs d’onde appliques sont comprises entre 290 et 450 nm ou entre 290 à 400 nm. Dans un autre mode de réalisation particulier, le modèle de peau est exposé à une dose unique aiguë d'UV de 16,5 J/cm2pendant environ 45 minutes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la dose d’UVB est comprise entre 80 et 150 mJ/cm2d’UVB ; de préférence 120 mJ/cm2d’UVB. La réalisation d’une irradiation peut être effectué dans des conditions bien connues de la personne du métier (cf. par ex. Iordanov et al, J. Biol. Chem. 1998).
De préférence, le stress chimique est au moins une substance chimique dont l’application topique conduit à une altération de la structure et/ou de la fonction de la peau. De préférence, le stress chimique est au moins un allergène un agent polluant, un tensioactif, un solvant, ou au moins un réactif de stimulation pro-inflammatoire tel qu’une cytokine ; préférentiellement un cocktail de cytokines spécifiques apte à induire le trouble cutané étudié. De tels réactifs sont bien connus, et sont décrits par exemple dans la demande WO 2015/014949. Selon un aspect particulier, le stress chimique comprend un ou deux composantes choisies parmi l’interleukine 1b, un ligand du récepteur TLR-2, et un ligand du récepteur TLR-3. De préférence, le stress chimique comprend l’interleukine 1b et optionnellement le ligand TLR (Poly (1:C) et/ou Pam3CSK4, plus préférentiellement les trois composantes. La réalisation d’un stress chimique comprenant l’application d’au moins l’interleukine IL-1β sur le modèle de peau reconstituée permet avantageusement de mimer la DA. Bien entendu, d’autres stress chimiques peuvent également permettre de mimer la DA, tels que la combinaison de Poly I:C et TNFα ; la combinaison IL4 et IL13 ; la combinaison Poly I:C, IL-4, IL13 ; la combinaison IL-4, IL-13, IL-31 et optionnellement TNFα ; la combinaison IL-4, IL-13, IL-22, TNFα.
À titre d’exemple particulier, afin de mimer l’effet de la pollution sur la peau, des particules ou des molécules chimiques peuvent notamment être mise(s) en contact avec le substitut cutané. Par exemple, des «particles matter» (PM10), issue de lots ERM-CZ100/CZ120, sont sous forme de poussière très fine. À titre d’exemple, 10 µL/cm² de solution de particules fines suspendues dans l’acétone peut être déposée à la surface des épidermes reconstruits avant ajout du microbiote et du sébum. De façon alternative, le benzo(a)pyrène (B(a)P) peut être appliqué à la surface du substitut cutané. Le B(a)P est un bon représentant des polluants extérieurs car conduisant à des métabolites très toxiques. De façon alternative, le Tetrabisphenol A (TBBPA), qui est un retardateur de flammes bromé retrouvé dans la majorité des fournitures intérieur (meubles, tissus, …) et considéré comme un polluant de l’intérieur, peut être appliqué à la surface du substitut cutané. Enfin, le cortisol est connu comme l’hormone du stress. Des niveaux élevés et persistants de cortisol peuvent être très dommageables pour la peau. Les effets négatifs peuvent inclure des signes visibles indésirables du vieillissement tels que les rides et ridules, l’amincissement de la peau, une élasticité réduite et une fonctionnalité moindre de la barrière cutanée. Afin d’obtenir un modèle de peau stressée, l’étape (c) peut correspondre à une mise en contact du le substitut cutané avec du cortisol, par exemple à une concentration de 4 µM.
Sans être limitatif, certains stress exogènes, permettant de mimer certains troubles de la peau, pouvant être réalisé dans le contexte de la présente invention, ainsi que les marqueurs associés audit trouble de la peau qui peuvent être mesurés dans le contexte de la présente invention sont décrits dans le Tableau 1, ci-après.
Trouble / Pathologie | Stress | Marqueurs associés |
DA | mélange IL4+IL13+IL31 ±TNFα, mélange (IL1beta + Poly(I :C) + Pam3CSK4), melange IL4+IL13+IL22+TNFα | TSLP, IL8, Voie JAK/STAT, filaggrine, claudine 1, peptides antimicrobiens |
Acné | biofilm ou extrait membranaire de cutibacterium acnes; squalène peroxydé | peptides anti microbiens, IL8, IL6, IL17, inhibition de la lipogénèse |
Psoriasis | Cocktail IL17+OSM+TNFα ± IMQ(imiquimod) ; TH17activés ± IMQ |
IL8, IL6, PAMs, Ki67 |
Rosacée | FSL1+LL37+TNFα | IL8, VEGF, IL6, MMP9 |
Prurit | IL31 ; TSLP ; NGF | Substance P, CGRP, Histamine, SEMA3A, JAK/STAT |
Peau sèche Xérose | Déshydratation | FNH, protéases épidermiques, caspase 14, peptidyl arginine desiminase, filaggrine, céramides |
Peau réactive | SDS, Histamine | Substance P, CGRP ; Histamine |
Altération de la fonction barrière | SDS, Stripping | Claudine, Filaggrine, Transglutaminase-1, desmogléine, céramides, acides gras, organisation de la barrière lipidique |
Vieillissement | UVA, fumée tabac, lumière bleue, cortisol, ozone, poussière urbaine | Stress oxydant, glutathion, matrice extra-cellulaire (collagène, acide hyaluronique, glycosaminoglycane, fibres d'élastine), métalloprotéinases (par ex. MMP1,), mélanine |
Pollution | Ozone, particules, HAP, métaux lourds, TBBPA | Passage et métabolisme des HAP, enzymes du métabolisme (CYP1A1, CYP1B1…), transporteurs, stress oxydant, MDA, lipides, MMP, mélanine, collagène, oxydation des protéines, inflammation… |
Irradiation solaire | UV solaire, UVB, UVA, Lumière bleue, Infrarouge | Apoptose (Caspase-3, sunburn cells) Viabilité (Test MTT, LDH) Génotoxicité (Lésions ADN CPD 64PP) Inflammation (IL8, IL6, prostaglandines) Stress oxydant (malondialdéhyde, Catalase, superoxyde dismutase, qPCR) Dégradation matrice extracellulaire et protéases (MMP1, Elastase, collagène, élastine, GAG) |
Stress endogène | Cortisol, | Lipides du stratum corneum, épaisseur épiderme |
Vergetures | Étirement | Migration des kératinocytes, prolifération des fibroblastes, MMP9 |
L’invention porte également sur un modèle de peau reconstituée obtenu par le procédé tel que décrit ici.
Dans un mode de réalisation particulier, au moins deux stress exogènes, identiques ou différents sont réalisés sur le modèle de peau reconstituée selon l’invention.
Dans un autre aspect, l’invention permet d’identifier des actifs ou des formulations permettant de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané ou d’évaluer l’efficacité des actifs ou des formulations permettant de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané. L’invention permet en particulier de distinguer les actifs ou les formulations selon leur activité pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané.
L’invention a donc également pour objet une méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes :
- L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée ;
- La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ;
- Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et
- Déterminer si ledit actif ou de ladite formulation cosmétique permet de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c).
L’invention a également pour objet une méthode d’évaluation de l’efficacitéin vitrod’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes :
- L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée ;
- La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ;
- Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et
- Évaluer l’efficacité dudit actif ou de ladite formulation cosmétique en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c).
L’étape a) peut être réalisée avant ou après l’étape b) de la méthode de criblage pour l’identification in vitro d’un actif ou d’une formulation cosmétique ou dans la méthode d’évaluation de l’efficacitéin vitrod’un actif ou d’une formulation cosmétique. En effet, la réalisation de l’étape a) avant l’étape b) peut notamment permettre d’évaluer la capacité d’un actif ou formulation cosmétique à prévenir au moins un trouble cutané alors que la réalisation de l’étape a) après l’étape b) peut notamment permettre d’évaluer la capacité d’un actif ou formulation cosmétique à améliorer au moins un trouble cutané.
L’application de l’actif d’intérêt sur le modèle de peau selon l’étape a) peut être faite directement. Alternativement, il pourra être avantageux de formuler l’actif d’intérêt, par exemple de façon à obtenir une composition liquide, afin de faciliter son application sur le modèle de peau. Ainsi, selon un mode de réalisation de l’invention, le procédé comprend en outre une étape de formulation de l’actif, notamment sous forme d’une solution liquide, en particulier aqueuse, préalablement à l’étape a) d’application dudit actif avec un modèle de peau.
L’actif candidat est un actif pour la prévention et/ou l’amélioration d’au moins un trouble cutané si ledit actif candidat permet de moduler l’expression d’au moins un marqueur biologique de l’invention. Cette modulation peut correspondre, selon les cas, et en particulier selon la nature du marqueur biologique, à une augmentation ou à une diminution de l’expression dudit marqueur. De la même façon, la formulation candidate est une formulation pour la prévention et/ou l’amélioration d’au moins un trouble cutané, si ladite formulation candidate permet de moduler l’expression d’au moins un marqueur biologique de l’invention. Cette modulation peut correspondre, selon les cas, et en particulier selon la nature du marqueur biologique, à une augmentation ou à une diminution de l’expression dudit marqueur.
Par exemple, il serait avantageux d’identifier des actifs ou des formulations minimisant les effets du stress exogène ou du trouble cutané sur les marqueurs de la barrière, afin de maintenir l’intégrité de la barrière cutanée.
Par « l’efficacitéin vitrod’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané », on entend au sens de la présente demande la capacité de la formulation ou de l’actif à annuler ou diminuer les effets liés à au moins un trouble cutané. La prévention s’entend dans le cas présent d’un traitement qui est administré avant le développement du trouble cutané (c-à-d. avant la réalisation d’un stress exogène à l’étape b)), tandis que la réduction correspond à un traitement qui est administré une fois que les effets du trouble cutané sont apparus (c-à-d. après la réalisation d’un stress exogène à l’étape b)).
Le terme « augmenté », tel qu'il est utilisé ici, signifie une plus grande quantité, par exemple, une quantité légèrement supérieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité en grand excès par rapport à la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, « augmentation » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % ou 20 % de plus que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité accrue est comparé, ou encore au moins 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 550 %, 600 %, 650 %, 700 %, 750 %, 800 %, 900 %, 950 %, 1 000 %, 1 100 %, 1 200 %, 1 300 %, 1 400 %, 1 500 %, 1 600 %, 1 700 %, 1 800 %, 1 900 % ou 2 000 % de plus que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité accrue est comparé. Les termes « augmenté », « plus grand que », et « accru » sont utilisés ici de manière interchangeable.
Le terme « diminué », tel qu'il est utilisé ici, signifie une moins grande quantité, par exemple, une quantité légèrement inférieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité fortement réduite par rapport à la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, « diminution » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % ou 20 % de moins que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité diminuée est comparé, ou encore au moins 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 550 %, 600 %, 650 %, 700 %, 750 %, 800 %, 900 %, 950 %, 1 000 %, 1 100 %, 1 200 %, 1 300 %, 1 400 %, 1 500 %, 1 600 %, 1 700 %, 1 800 %, 1 900 % ou 2 000 % de moins que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité diminuée est comparé. Les termes « diminué », « plus petit que », et « réduit » sont utilisés ici de manière interchangeable.
Afin de déterminer si l’expression d’un marqueur est accrue ou diminuée dans le modèle de peau de l’invention, le niveau d’expression dudit marqueur pourra être comparé avec un niveau d’expression de référence.
Selon ce mode de réalisation préféré, l’étape d), permettant de déterminer si l’actif ou la formulation cosmétique prévient et/ou améliore au moins un trouble cutané, peut comprendre une comparaison du niveau d’expression du marqueur biologique de l’étape c) avec un niveau d’expression de référence.
Par « un niveau d’expression de référence d’un marqueur biologique », on entend au sens de la présente demande tout niveau d’expression dudit marqueur utilisé à titre de référence. Par exemple, un niveau d’expression de référence peut être obtenu en mesurant le niveau d’expression du marqueur d’intérêt dans un modèle de peau normale. Un tel modèle de peau normale peut, par exemple, correspondre à un modèle de peau reconstituée obtenu à partir de cellules cutanées d’un sujet sain ou sans pathologie apparente. On peut aussi utiliser comme modèle de peau normale, un modèle de peau reconstituée sans réalisation du stress exogène. Dans ce cas, l’expression du marqueur biologique peut être mesurée avant l’étape b) ; le niveau ainsi déterminé est alors le niveau d’expression de référence dudit marqueur biologique.
Dans d’autres modes de réalisation, le niveau d’expression de référence d’un marqueur biologique correspond au niveau d’expression dudit marqueur dans le modèle de peau en absence ou en présence d’un traitement particulier. Par exemple, dans un mode de réalisation particulier, le niveau d’expression de référence d’un marqueur biologique est obtenu en mesurant l’expression dudit marqueur dans le modèle de peau qui n’a pas été mis en contact avec un actif ou une formulation et/ou qui n’a pas subi de stress exogène. Dans un autre mode de réalisation particulier, l’expression dudit marqueur est mesurée dans le modèle de peau traité avec un actif ou une formulation connus pour être efficaces contre un trouble cutané.
La personne du métier comprendra en outre aisément que la comparaison de l’étape d) est de préférence effectuée entre des mesures de niveaux d’expression obtenus pour des modèles de peau obtenus à partir de substituts cutanés de structures histologiques similaires, voire identiques. Par « structures histologiques similaires », on entend au sens de la présente demande que les proportions relatives des types cellulaires compris dans les modèles de peau comparés sont similaires. Ainsi, il est préférable que les proportions relatives des types cellulaires et/ou de types de micro-organismes compris dans le modèle de peau de l’étape a) ne diffèrent pas de plus de 5 % des proportions relatives des types cellulaires et/ou de types de micro-organismes compris dans le modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d). Par « proportion relative d’un type cellulaire » on entend au sens de la présente demande le rapport du nombre de cellules correspondant à ce type cellulaire sur le nombre de cellules totales comprises dans le modèle de peau. Ainsi, il est par exemple préférable que la proportion de kératinocytes sur le nombre de cellules totales dans le modèle de peau de l’étape a) ne diffère pas de plus de 5 % de la proportion de kératinocytes sur le nombre de cellules totales dans le modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d). Par « proportion relative d’un type de micro-organisme » on entend au sens de la présente demande le rapport de l’abondance d’un genre ou espèce de micro-organisme sur le nombre de micro-organismes totaux compris dans le modèle de peau. De préférence, la proportion relative d’un genre ou espèce de bactérie est le rapport de l’abondance dudit genre ou espèce sur le nombre de bactéries totales.
Par « structures histologiques identiques », on entend au sens de la présente demande que les proportions relatives des types cellulaires compris dans les modèles de peau comparés sont identiques. Au sens de la présente invention, les proportions relatives des types cellulaires compris dans le modèle de peau de l’étape a) sont identiques aux proportions relatives des types cellulaires compris dans le modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d) lorsqu’elles ne diffèrent pas de plus de 0,1 %. Avantageusement, la proportion de kératinocytes sur le nombre de cellules totales dans le modèle de peau de l’étape a) ne diffère pas de plus de 0,1% de la proportion de kératinocytes sur le nombre de cellules totales dans le modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d).
La personne du métier comprendra tout aussi aisément que la comparaison de l’étape d) est de préférence effectuée entre des mesures de niveaux d’expression obtenus pour des modèles de peau qui sont de taille, de volume ou de poids similaires, voire identiques. Ainsi, il est préférable que la taille, le volume, ou le poids du modèle de peau de l’étape a) ne diffère pas de plus de 5 % de la taille, du volume, ou du poids du modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d). Plus préférentiellement, la taille, et le volume et le poids du modèle de peau de l’étape a) ne diffèrent pas de plus de 5 % de la taille, du volume et du poids du modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d). Encore plus préférentiellement, la taille, et le volume et le poids du modèle de peau de l’étape a) ne diffèrent pas de plus de 0,1 % de la taille, du volume et du poids du modèle de peau utilisé pour l’obtention du niveau d’expression de référence de l’étape d).
Alternativement, si les modèles de peau diffèrent de plus de 5 % de par la taille, le volume et le poids, l’homme du métier pourra normaliser le niveau obtenu à l’étape c) et le niveau de référence de l’étape d) à l’aide d’un facteur de normalisation.
Ce facteur de normalisation pourra par exemple être un marqueur physique directement accessible tel que la masse de cellules de l’échantillon, ou la masse d’un constituant cellulaire, comme la masse d’ADN cellulaire ou la masse de protéines cellulaires.
Il peut aussi être avantageux d’utiliser comme facteur de normalisation le niveau d’expression d’un gène qui est exprimé au même niveau dans toutes les cellules, ou presque, de l’organisme. En d’autres termes, selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, on utilise comme facteur de normalisation le niveau d’expression d’un gène de ménage. Selon un autre mode de réalisation, le niveau obtenu à l’étape c) et le niveau de référence de l’étape d) sont normalisés en utilisant le niveau d’expression, non pas des gènes de ménage, mais des protéines codées par ceux-ci. Un gène de ménage est un gène exprimé dans tous les types cellulaires, qui code une protéine ayant une fonction de base nécessaire pour la survie de tous les types cellulaires. Une liste de gènes de ménage humains peut être trouvée dans Eisenberget al.(Trends in Genet,19: 362-365, 2003). Les gènes de ménage selon l’invention incluent par exemple les gènes RPS28, GAPDH, B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IPO8 et HMBS.
L’étape c) est réalisée après les étapes a) et b). La détermination de l’étape d) se fera avantageusement en comparant le niveau d’expression de l’étape c) avec un niveau d’expression de référence (voir ci-dessus). Par exemple, le modèle de peau qui n'a pas été traité par l’actif ou la formulation peut être utilisé comme témoin. Dans ce cas, le niveau d'expression du marqueur biologique de l'invention est mesuré dans ledit modèle de peau avant et après application de l’actif ou de la formulation cosmétique. De façon alternative, le niveau d’expression du marqueur biologique de l'invention est mesuré dans un modèle de peau sans application de l’actif ou de la formulation cosmétique et dans un modèle de peau avec de l’actif ou de la formulation cosmétique. Le niveau de d'expression du marqueur biologique de l'invention peut aussi être comparé avec celui mesuréin vivodans une peau normale ou in vivo dans une peau ayant subi un stress exogène. Par « peau normale », on entend ici une peau provenant d’un sujet sain ou sans pathologie cutanée apparente.
Le niveau d’expression de référence est de préférence le niveau d’expression dudit marqueur biologique dans un modèle de peau qui n'a pas été en contact avec l’actif ou la formulation, ce qui permet d'effectuer une comparaison significative entre le niveau d'expression de l'étape c) et ledit niveau de référence. Par exemple, un modèle de peau qui n'a pas été traité par l’actif ou la formulation (c.-à-d. sans réalisation de l’étape a) ou avant réalisation de l’étape a)) peut être utilisé comme témoin. Dans ce cas, le niveau d'expression du marqueur biologique de l'invention est mesuré dans ledit modèle de peau avec et sans application de l’agent actif ou la formulation cosmétique (ou avant et après réalisation de l’étape a)).
Le procédé de l'invention peut en outre comporter une comparaison de la viabilité cellulaire dans le modèle de peau traité avec l'actif ou la formulation et dans l'échantillon témoin. Dans ce cas, l'actif ou la formulation cosmétique est bien toléré par la peau si la viabilité cellulaire de l'échantillon n'est pas affectée par la présence de l’agent actif ou la formulation cosmétique.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend donc une étape supplémentaire de détermination de la viabilité cellulaire dans le modèle de peau traité avec l’actif ou la formulation cosmétique, de détermination de la viabilité cellulaire dans l'échantillon témoin et de comparaison entre les deux.
De nombreux tests pour déterminer la viabilité cellulaire sont disponibles pour la personne du métier et sont couramment utilisés en cosmétologie. On citera en particulier le test MTT, décrit par exemple dans Mosman et al. (J Immunol Methods, 65(1-2) : 55-63, 1983).
Par « troubles cutanés », il est ici entendu toutes les réactions anormales qui peuvent subvenir sur la peau d'un individu. Ces conditions touchent aussi bien la peau en elle-même (c’est-à-dire l’épiderme, le derme et/ou l’hypoderme), que les pores de la peau, les glandes sudoripares et sébacées qui y sont annexées, et/ou le microbiote.
Les troubles cutanés selon l’invention se traduisent plus particulièrement par des lésions, ce qui correspond à une peau endommagée ou en mauvais état. La peau endommagée comprend par exemple la peau sensible réactive, la peau sèche (la xérose), la peau endommagée par le soleil, par les radiations, par le froid, par le stress ou par la pollution, par une allergie, par un urticaire, par un eczéma et d'autres formes de dermatites comme la dermatite atopique, l’impétigo, la dermatite irritative, en particulier la dermite irritative du siège ou érythème fessier, la dermatite de contact, la dermite séborrhéique de la peau et du cuir chevelu (croute de lait), le psoriasis, la maladie de Lainer-Moussous, ou encore par des plaies ou des brûlures. Par trouble cutané, on entend donc des troubles aussi divers que les dartres, les angiomes (y compris tubéreux, sous-cutanés ou plans), les hémangiomes, l’acné du nourrisson, l’acné de l’adolescent, les ichtyoses (par exemple vulgaris, congénitale, arlequin...), la rosacé, le prurit, etc. Un trouble cutané peut aussi être causé ou exacerbé par une infection externe par exemple d’origine parasitaire, virale, bactérienne ou fongique. Sont ainsi incluses en particulier dans les troubles cutanés les verrues, le prurigo strophulus, la gale, la pédiculose du cuir chevelu, ou encore les mycoses. Ces dernières sont des parasitoses causées par la prolifération de champignons microscopiques parasites de l’organisme. Parmi les mycoses les plus fréquentes, on peut citer les candidoses et les pityrosporoses, qui sont provoquées par la prolifération de levures de la peau. De préférence, le trouble cutané est choisi parmi les troubles liés au vieillissement, à la pollution, au rayonnement ; les dermatoses inflammatoires, préférentiellement la dermatite atopique, l’acné, le psoriasis ; la rosacée ; le prurit ; une altération de la fonction barrière ; les peaux réactives ; les xéroses.
Par « marqueur biologique », on entend au sens de la présente demande une caractéristique qui est objectivement mesurée et évaluée comme indicateur de processus biologiques normaux, de processus pathogéniques, ou de réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique. Un marqueur biologique désigne donc toute une gamme de substances et de paramètre divers. Par exemple, un marqueur biologique peut être une substance dont la détection indique un état pathologique particulier (par exemple la présence de la protéine C réactive en tant que marqueur d'une infection), ou au contraire une substance dont la détection indique un état physiologique spécifique. Préférentiellement, ledit marqueur biologique est un marqueur biologique d’un trouble cutané si son niveau d’expression est différent dans une peau saine et dans une peau présentant les caractères cliniques dudit trouble cutané. De façon plus préférée, ledit marqueur caractérise un trouble cutané si ledit marqueur est exprimé de façon différentielle dans un modèle de peau dans lequel un stress exogène a été réalisé et le modèle de peau n’ayant pas subis de stress exogène. Cela se traduit par un rapport à l’étape d) qui est différent de 1 lorsque le mesure du niveau d’expression est comparé entre ces deux conditions.
Le marqueur biologique selon l’invention est préférablement un gène, les produits d’un gène tels que ses transcrits et les peptides issus de ses transcrits, un lipide, un sucre ou un métabolite. Des exemples de marqueurs biologiques selon l’invention sont notamment fournis dans le Tableau 1, ainsi que ci-après. Pour chacun de ces types de marqueurs, de nombreuses méthodes sont à la disposition de la personne métier pour mesurer l’expression dudit marqueur biologique.
Dans un mode de réalisation particulier, au moins deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, ou dix biomarqueurs sont mesurés. Lesdits biomarqueurs sont discriminants, permettant ainsi de cribler des actifs ou formulations cosmétiques pour prévenir ou traiter des troubles de la peau ou d’évaluer l’efficacité des actifs ou formulations cosmétiques pour prévenir ou traiter des troubles de la peau.
La personne du métier cherchant à déterminer à quelle classe appartient un marqueur biologique pourra facilement consulter la littérature scientifique pertinente ou se rapporter à des bases de données publiques telles que, par exemple, celles regroupées sur le site internet du National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).
Le marqueur biologique de l’invention est avantageusement un marqueur sélectionné parmi les marqueurs de l’inflammation, du stress oxydatif, de la fonction barrière, et/ou de la composante microbienne. Le marqueur biologique peut être mesuré dans le substitut cutanée et/ou dans la composante microbienne/composante lipidique qui sont présentes sur la surface dudit substitut cutanée du modèle. Selon un aspect, le marqueur biologique est mesuré au moins dans la composante microbienne, de préférence dans la composante microbienne. Selon un autre aspect, le marqueur biologique est mesuré au moins dans le substitut cutané, de préférence dans le substitut cutané.
Les « marqueurs de l’inflammation » selon l’invention comprend les marqueurs qui sont modulés lors d’une réponse inflammatoire dans la peau. Ils comprennent des cytokines, telles que l’IL-8 ou la TSLP, ainsi que des peptides anti-microbiens, tels que la psoriasine, codé par le gène S100A7, et la beta-défensine 2, codé par le gène DEFB4A.
Parmi les cytokines, la protéine IL-8 est une cytokine qui est induite précocement dans l’inflammation cutanée. Elle est notamment produite par synthèse de novo dans les kératinocytes stimulés par IL1α et/ou TNF. De ce fait, c’est un marqueur prédictif d’une réponse biologique, même en l’absence de signes visibles d’irritation cutanée. La séquence protéique de l’interleukine IL-8 humaine correspond à la séquence de référence NCBI : NP_000575. Cette protéine est codée par le gène IL8 humain (référence NCBI : Gene ID : 3576). La séquence de celui-ci est accessible sous la référence NCBI : NM_000584.
La protéine TSLP une cytokine inflammatoire caractéristique de la DA. Sa sécrétion est nettement stimulée dans le cas de la dermatite atopique et promeut l’initiation d’une réponse inflammatoire par les Th2. De ce fait, c’est un bon marqueur de la DA. D’autres marqueurs, tels que RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7 et/ou IL-6 sont également indicatifs de la DA et peuvent être mesurés dans le cadre de la présente invention.
Les « marqueurs du stress oxydatif » selon l’invention comprennent les marqueurs qui sont exprimés dans la peau et/ou dans la composante microbienne en cas de stress oxydatif. De préférence, les marqueurs du stress oxydatif sont des métabolites. De préférence, un moins un métabolite parmi xanthine, acide urique, et glutathion est mesuré.
Les « marqueurs de la fonction barrière » selon l’invention comprennent les marqueurs qui sont spécifiquement exprimés dans les couches de l’épiderme les plus externes et qui participent à la fonction barrière. Préférentiellement, les marqueurs de la fonction barrière selon l’invention sont des marqueurs exprimés dans lestratum corneumou des marqueurs exprimés dans les jonctions serrées dustratum granulosum. Ces marqueurs comprennent notamment les claudines, dont la claudine-1 (CLDN1), les transglutaminases, comme par exemple la transglutaminase 1 (TGM1), les kératines, notamment la kératine 1 (KRT1) et la kératine 10 (KRT10), la peptidyl arginine deiminase type 1 humaine (PAD1), la caspase 14 (CASP14), l’aquaporin 3 (AQP3), la loricine (LOR), la scielline (SCEL), la protéine BARX Homeobox 2 (BARX2), la desmogleine-1 (DSG1), la filaggrine (FLG), l’involucrine (IVL), la sphingomyélinase ou sphingomyéline diestérase (SMPD), la cornéodesmosine (CSDN), etc. De préférence, au moins un marqueur parmi la claudine-1 (CLDN1), la transglutaminase 1 (TGM1) et la filaggrine (FLG) est mesuré. Selon un autre aspect, les marqueurs de la fonction barrière comprennent un ou plusieurs métabolites discriminants de la fonction barrière. De préférence, un moins un métabolite parmi acide octanoïque, sérine, glutamate, phosphorylcholine, histidine, L-glutamine, L-alanine, méthionine, et xanthine est mesuré.
Les « marqueurs de la composante microbienne » selon l’invention comprennent les marqueurs qui sont modulés dans la composant microbienne en réponse à un stress exogène et/ou un actif ou formulation cosmétique. Ils comprennent notamment des métabolites, tels que formate, acétate, glucose et maltose, glycérol, bétaïne, octanoate, tyrosine, panthénol, phénylalanine.
L’expression d’un gène peut être mesurée par exemple au niveau nucléotidique, en mesurant la quantité de transcrits dudit gène, et peut aussi être mesurée par exemple au niveau peptidique, en mesurant par exemple la quantité des protéines issus desdits transcrits. Ainsi, par « mesure du niveau d’expression d’un gène » on entend au sens de l’invention la mesure de la quantité ou de la concentration cellulaire de produit du gène sous sa forme peptidique ou sous sa forme nucléotidique. En particulier, l’expression d’au moins un gène (par ex. 16S) peut être mesurée afin de déterminer la présence ou absence d’au moins un micro-organisme dans le microbiote du modèle.
De façon générale, l’expression du marqueur biologique selon l’invention sera détectée in vitro à partir du modèle de peau reconstituée.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l’invention peut comprendre une ou plusieurs étapes intermédiaires entre l’obtention du modèle de peau reconstituée et la mesure de l’expression du marqueur biologique, lesdites étapes correspondant à l’extraction à partir dudit modèle de peau reconstituée d’un échantillon lipidique, d’un échantillon de NMF, d’un échantillon d’ARNm (ou de l’ADNc correspondant) ou d’un échantillon de protéine. Celui-ci peut ensuite être directement utilisé pour mesurer l’expression du marqueur. La préparation ou l’extraction d’ARNm (ainsi que la rétrotranscription de celui-ci en ADNc), de protéines, de lipides ou de NMF à partir d’un échantillon de cellules de peau ne sont que des procédures de routine bien connues de la personne du métier.
Dans le cas de marqueurs qui sont sécrétés dans le milieu de culture, la personne du métier peut simplement doser le marqueur à partir dudit milieu de culture.
Une fois qu’un échantillon d’ARNm (ou d’ADNc correspondant) ou de protéine est obtenu, l’expression du marqueur, au niveau soit des ARNm (c’est-à-dire dans l’ensemble des ARNm ou des ADNc présents dans l’échantillon), soit des protéines (c’est-à-dire dans l’ensemble des protéines présentes dans l’échantillon), peut être mesurée. La méthode utilisée pour ce faire dépend alors du type de transformation (ARNm, ADNc ou protéine) et du type d’échantillon disponible.
Quand l’expression du marqueur est mesurée au niveau de l’ARNm (ou d’ADNc correspondant), n’importe quelle technologie habituellement utilisée par la personne du métier peut être mise en œuvre. Ces technologies d’analyse du niveau d’expression des gènes, comme par exemple l’analyse du transcriptome, incluent des méthodes bien connues telles que la PCR (Polymerase Chain Reaction, si on part d’ADN), la RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, si on part d’ARN) ou la RT-PCR quantitative ou encore les puces d’acides nucléiques (dont les puces à ADN et les puces à oligonucléotides) pour un plus haut débit.
Par « puces d’acides nucléiques », on entend ici plusieurs sondes d’acides nucléiques différentes qui sont attachées à un substrat, lequel peut être une micropuce, une lame de verre, ou une bille de la taille d’une microsphère. La micropuce peut être constituée de polymères, de plastiques, de résines, de polysaccharides, de silice ou d’un matériau à base de silice, de carbone, de métaux, de verre inorganique, ou de nitrocellulose.
Les sondes peuvent être des acides nucléiques tels que les ADNc (« puce à ADNc »), les ARNm (« puce à ARNm ») ou des oligonucléotides (« puce à oligonucléotides »), lesdits oligonucléotides pouvant typiquement avoir une longueur comprise entre environ 25 et 60 nucléotides.
Pour déterminer le profil d’expression d’un gène particulier, un acide nucléique correspondant à tout ou partie dudit gène est marqué, puis mis en contact avec la puce dans des conditions d’hybridation, conduisant à la formation de complexes entre ledit acide nucléique cible marqué et les sondes attachées à la surface de la puce qui sont complémentaires de cet acide nucléique. La présence de complexes hybridés marqués est ensuite détectée.
Ces technologies permettent de suivre le niveau d’expression d’un gène en particulier ou de plusieurs gènes voire même de tous les gènes du génome (full genome ou full transcriptome) dans un échantillon biologique (cellules, tissus...). Ces technologies sont utilisées en routine par la personne du métier et il n’est donc pas besoin de les détailler ici. Des exemples de mises en œuvre de l’invention basées sur l’analyse d’expression génique (puces à ADNc) et sur la PCR quantitative sont décrits dans la section expérimentale.
Alternativement, il est possible d’utiliser toute technologie actuelle ou future permettant de déterminer l’expression des gènes sur la base de la quantité d’ARNm dans l’échantillon. Par exemple, la personne du métier peut mesurer l’expression d’un gène par hybridation avec une sonde d’acide nucléique marquée, comme par exemple par Northern blot (pour l’ARNm) ou par Southern blot (pour l’ADNc), mais aussi par des techniques telles que la méthode d'analyse sérielle de l'expression des gènes (SAGE) et ses dérivés, tels que LongSAGE, SuperSAGE, DeepSAGE, etc. Il est aussi possible d’utiliser des puces à tissu (aussi connues en tant que TMAs : « tissue microarrays »). Les tests habituellement employés avec les puces à tissu comprennent l’immunohistochimie et l’hybridation fluorescente in situ. Pour l’analyse au niveau de l’ARNm, les puces à tissu peuvent être couplées avec l’hybridation fluorescente in situ. Enfin, il est possible d’utiliser le séquençage massif en parallèle pour obtenir déterminer la quantité d’ARNm dans l’échantillon (RNA-Seq ou « Whole Transcriptome Shotgun Sequencing »). À cet effet, plusieurs méthodes de séquençage massif en parallèle sont disponibles. De telles méthodes sont décrites dans, par exemple, US 4,882,127 ; US 4,849,077 ; US 7,556,922 ; US 6,723,513 ; WO 03/066896 ; WO 2007/111924 ; US 2008/0020392 ; WO 2006/084132 ; US 2009/0186349 ; US 2009/0181860 ; US 2009/0181385 ; US 2006/0275782 ; EP-B1-1141399 ; Shendure & Ji,Nat Biotechnol., 26(10) : 1135-45, 2008 ; Pihlaket al.,Nat Biotechnol., 26(6) : 676- 684, 2008 ; Fulleret al.,Nature Biotechnol.,27(11) : 1013-1023, 2009 ; Mardis,Genome Med.,1(4): 40, 2009 ; Metzker,Nature Rev . Genet.,11(1) : 31-46, 2010.
Quand l’expression du marqueur est mesurée au niveau protéique, il est possible d’employer des anticorps spécifiques, en particulier dans des technologies bien connues telles que l’immunoprécipitation, l’immunohistologie, le western blot, le dot blot, l’ELISA ou l’ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l’immunohistochimie. Parmi les autres techniques qui peuvent être utilisées sont comprises les techniques de FRET ou de BRET, la cytométrie de flux, les méthodes de microscopie ou d’histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale, de microscopie à fluorescence, de microscopie électronique, de microscopie à force atomique, les méthodes basées sur l’utilisation d’une ou plusieurs longueurs d’onde d’excitation et d’une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltamétrie et d’ampérométrie), et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie résonance multipolaire, confocale et non-confocale, comme la détection de fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, ou « surface plasmon resonance » en anglais, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc.), l’imagerie par résonance radioisotopique ou magnétique, l’analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par électrophorèse bidimensionnelle, par spectrophotométrie, par spectrométrie de masse et spectrométrie de masse en tandem, par chromatographie liquide ou gazeuse couplée à la spectrométrie de masse ou à la spectrométrie de masse en tandem. Toutes ces techniques sont bien connues de la personne du métier et il n’est pas nécessaire de les détailler ici.
Si le marqueur biologique est un lipide, notamment un céramide ou un acide gras, ou un métabolite, la personne du métier pourra utiliser toutes les méthodes à sa disposition pour mesurer la teneur en lipide dans un échantillon de cellules cutanées. Ces méthodes comprennent, entre autres, la chromatographie liquide (HPLC, voir par exemple Sullivanet al.,Arch Ophthalmol ., 120(12) : 1689-99, 2002), la chromatographie liquide couplée à un détecteur évaporatif à diffraction de la lumière (HPLC-ESD, voir Nordbäcket al.,J. High Resolut . Chromatogr., 22 : 483–486, 1999 ; Torreset al.,J. Chromatogr . A., 1078 : 28–34, 2005) ; la chromatographie en couche mince (TLC, par exemple Downinget al.,J Invest Dermatol., 77(4) : 358-360, 1981; Nordstromet al.,J Invest Dermatol ., 87(2) : 260-263, 1986) ; la résonance magnétique nucléaire (NMR, voir par exemple Roboskyet al.,J Lipid Res., 49(3) : 686-692, 2008) ; la microspectroscopie confocale in vivo de Raman ; la spectrométrie de masse, la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS, voir O’Neillet al.,J Chromatogr Sci., 14(1) : 28-36, 1976) ; la chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme ; la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (voir par exemple van Smedenet al.,J Lipid Res, 52(6):1211-1221, 2011) ; la chromatographie en phase liquide ultra-performante (UPLC, voir Rainvilleet al.,J Proteome Res., 6(2):552-558, 2007 ; Castro-Perezet al.,J Proteome Res., 10(9) : 4281-4290, 2011). On peut également analyser l'organisation de ces lipides dans la peau et plus particulièrement dans lestratum corneum(ou couche cornée), organisation lamellaire ou latérale, par des techniques par exemple de diffraction aux rayons X (Bouwstraet al.,J Invest Dermatol ., 97(6): 1005-1012, 1991 ; van Smedenet al.,J Lipid Res., 52(6):1211-1221, 1991) ou par spectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier (Gorceaet al.,Int J Pharm. Nov 10, 2011) ou par une analyse morphométrique en microscopie électronique (Daehnhardt-Pfeifferet al.,Skin Pharmacol Physiol., 25(3): 155-161, 2012) ou par une analyse en microscopie électronique de section vitreuse de peau combinée à une analyse moléculaire (Iwaiet al.,J Invest Dermatol ., Apr 26, 2012).
Le dosage du NMF est une procédure bien connue de la personne du métier. Il est en particulier possible de doser le NMF par l’utilisation de microspectroscopie confocale in vivo de Raman. C’est une procédure couramment utilisée dans le domaine depuis au moins 15 ans. À titre d’exemple, on citera entre autres les publications de Casperset al.(J Invest Dermatol., 116(3) : 434-442, 2001), Vyumvuhoreet al.(J Biomed Opt., 19(11) : 111603, 2014), ou encore Falconeet al.(Skin Pharmacol Physiol, 28 : 307–317, 2015). Il est aussi possible de doser les NMF par la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse. On se réfèrera par exemple à Piraudet al.(Rapid Commun Mass Spectrom, 19(12) :1587-602, 2005), Petritiset al.(Journal of Chromatography A, 833(2): 147-155, 1999), Henriksenet al.(J Am Soc Mass Spectrom,16(4): 446-455, 2005) ou encore Yang (Application of biophysics and bioengineering to the assessment of skin barrier function. Thesis (Doctor of Philosophy (PhD)). University of Bath, UK, 2011).
Dans un mode de réalisation particulier, l’actif évalué est au moins un filtre solaire. Par filtre solaire, on entend toute substance capable de filtrer le rayonnement solaire pour protéger une surface, typiquement la peau ou les cheveux, contre les effets nocifs de ces radiations.
Le filtre solaire est choisi parmi ceux classiquement connus dont
- les filtres solaires organiques tels que les dérivés de triazine, les dérivés de benzotriazole et phényl benzotriazole, les dérivés du dibenzoylmethane, les dérivés de benzophénone et 2-hydroxybenzophénone amino-substitué, les dérivés de merocyanine dont le methoxypropylamino cyclohexenylidene ethoxyethylcyanoacetate, les dérivés de l’acide para aminobenzoïque, les dérivés salicyliques, les dérivés cinnamiques, les dérivés de β,β’-diphénylacrylate, les dérivés de benzylidène camphre, les dérivés de phenylbenzimidazole, les dérivés anthraniliques, les dérivés d’imidazolines, et les dérivés de benzalmalonate.
- les filtres solaires inorganiques tels que les oxydes métalliques enrobés ou non comme par exemple les oxydes de titane, de fer, de zinc, de zirconium, ou de cérium.
De préférence, l’actif évalué dans est au moins un filtre solaire. De préférence, la méthode d’évaluation de l’efficacitéin vitrod’au moins un filtre solaire ou d’une formulation cosmétique le ou les comprenant pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène consistant en une irradiation UV, infrarouge, ou lumière bleue.
Méthode d'évaluationin vitrode la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique, comprenant les étapes suivantes :
- L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée ;
- Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique dans le modèle de peau de l’étape a) ; et
- Évaluer si ledit actif ou formulation cosmétique est bien toléré par le modèle de peau.
L'actif est un actif qui est bien toléré par la peau si ledit actif ne module pas l'expression du marqueur biologique de façon significative. De la même façon, la formulation cosmétique est bien tolérée si l’expression du marqueur biologique n’est pas modulée par son addition sur le modèle de peau reconstituée de façon significative. Par « significative » on entend un résultat obtenu par la mise en œuvre d'un test statistique, tel qu’un test Wilcoxon univarié, et ayant une valeur p inférieure à 0,05, préférentiellement une valeur p inférieure à 0,01, plus préférentiellement un valeur p inférieure à 0,001. Les tests statistiques appropriés sont bien connus de la personne du métier. Ladite modulation peut correspondre, selon les cas, et en particulier selon la nature du marqueur biologique, à une augmentation ou à une diminution de l'expression dudit marqueur. En particulier, l'expression des marqueurs de l'inflammation est connue pour être augmentée quand la peau est agressée, par exemple par un stress exogène. En revanche, l'expression de ces marqueurs de l'inflammation n'est pas affectée par des actifs ou des formulations bien tolérés. Dans un mode de réalisation préféré, le marqueur biologique de l’étape b) est un marqueur de l'inflammation, par exemple parmi ceux décrit ici.
De préférence, la tolérance consiste au maintien de l’équilibre de la composante microbienne. Par « maintien de l’équilibre » on entend qu’au moins un micro-organisme, de préférence au moins un genre ou espèce bactérienne, est maintenu dans la composante microbienne du modèle suite à application de l’agent ou formulation cosmétique à l’étape a). De préférence, l’abondance dudit au moins un micro-organisme n’est pas significativement modifié suite à l’application de l’agent ou formulation cosmétique à l’étape a). Afin de déterminer si ledit au moins un micro-organisme est maintenu, voir à un niveau qui n’est pas significativement diffèrent, la présence du micro-organisme, ou son niveau d’abondance, est comparé à une condition ou niveau de référence, par exemple dans un modèle dans lequel l’agent n’a pas été appliqué ou dans la peau normale in vivo.
L’invention a pour autre objet un kit comprenant une composante microbienne et une composante lipidique destiné à être appliqué sur un substitut cutané, la composante microbienne comprenant au moins quatre genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genresCutibacterium , Staphylococcus, Streptococcus , Burkholderia , Finegoldia , Gemella , Veillonella , Kocuia , Corynebacterium, Methylobacterium ,etBrevibacterium.
De préférence, la composante microbienne comprend au moins cinq, six, sept, huit, neuf, ou dix genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genresCutibacterium , Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia , Finegoldia , Gemella , Veillonella , Kocuia , Corynebacterium, Methylobacterium ,etBrevibacterium, plus préférentiellement l’ensemble de genres décrits ci-dessus. De préférence, les au moins quatre genres comprend les genres suivants :Cutibacterium , Staphylococcus, Streptococcus,etBurkholderia .La composante microbienne peut également comprendre un ou plusieurs genres ou espèces de champignon et/ou de virus.
De préférence, la composante microbienne correspond au microbiote de la peau d’au moins un sujet. Par « microbiote » on entend l’ensemble de micro-organismes qui est présent dans un environnement. Le microbiote de la peau correspond donc à l’ensemble de micro-organismes présent sur la peau. Bien entendu, la composition du microbiote peut varier selon le site de la peau. De préférence, la composante microbienne cutanée correspond au microbiote de la peau de visage, de préférence du front, d’au moins un sujet. Aussi, selon un mode de réalisation préférentielle, la composante microbienne cutanée est issue d’un prélèvement d’au moins un sujet, plus préférentiellement au niveau du visage et encore plus préférentiellement au niveau du front. De préférence, la composante microbienne à une viabilité de 5 000 RLU.
La composante lipidique est telle que décrite ci-dessus.
De préférence, le kit comprend en outre une notice d’instructions.
De préférence, le kit comprend en outre au moins une composante chimique telle que décrite ici. De préférence, le kit comprend un allergène, un agent polluant, un tensioactif, un solvant, ou au moins un réactif de stimulation pro-inflammatoire tel qu’une cytokine, ou le cortisol.
Ledit kit permet avantageusement d’obtenir le modèle de peau reconstituée.
- Préparation du sébum: le sébum est prélevé sur le front de 10 volontaires sans pathologie cutanée apparente avec un kit de prélèvement standard. Chaque tube de prélèvement est ensuite lavé 3 fois avec de l’hexane pour extraire le sébum. Les extraits sont ensuite combinés puis le solvant est évaporé sous vide. La masse du sébum récolté est contrôlée (par ex. 1 100 mg pour une préparation) puis le sébum est repris dans 20 ml d’hexane. 100 fioles de sébum sont réalisées avec 9 mg de substance par fiole et conditionnés sous argon. Pour le dépôt du sébum sur l’épiderme reconstruit, les fioles sont ensuite reprises avec 250 μL d’éthanol absolu (Fischer Scientific, Illkirch, France) puis dilué au 1/20èmedans du sérum physiologique. Le sébum a été caractérisé par GC/MS (
- Préparation du microbiote: Le microbiote est prélevé sur 18 volontaires sans pathologie cutanée apparente à l’aide d’un écouvillon imbibé de sérum physiologique (Fischer Scientific, Illkirch, France) contenant 0,1 % en volume de Triton X-100 (Fischer Scientific, Illkirch, France). L’écouvillon est frotté énergétiquement sur le front du donneur durant 4 secondes. Chaque écouvillon est ensuite placé dans un tube pour être centrifugé. Après centrifugation, un liquide incolore est récupéré (environ 60 μL) et son volume est ajusté jusqu’à 120 μL avec du sérum physiologique. Chaque microbiote est ensuite mélangé avec le sébum afin de pouvoir réaliser le dépôt. 22 μL du mélange sébum/microbiote est déposé à la surface d’un épiderme reconstruit humain et étalé à l’aide d’un doigtier. Un mélange sébum/microbiote donné peut être appliqué sur jusqu’à 6 épidermes reconstruits. Les épidermes reconstruits humains sont incubés à 32°C, 5 % CO2, 60 % humidité.
Le temps d’incubation est fixé à 48 h ce qui permet d’avoir une quantité de bactéries suffisante sans endommager les épidermes reconstruits humains.
Sur le visage, on retrouve des quantités de sébum allant de >66µg/cm2pour la peau grasse,
33–66µg/cm2, peau normale et <33µg/cm2pour la peau sèche.
33–66µg/cm2, peau normale et <33µg/cm2pour la peau sèche.
Les inventeurs ont déposé sur les épidermes reconstruits de 0,6cm², 24µg de sébum ce qui correspond à une concentration de 40µg/cm².
Concernant le microbiote, selon la littérature, il y a environ 1 million de bactéries avec des centaines d’espèces différentes retrouvées par centimètre carré. Ces quantités variant en fonction de la zone étudiée. À la fin des 48h, on retrouve environ 100 000 RLU par RHE de 0,6cm², ce qui correspond à une croissance de 1 à 2 log.
Exemple 2 :Établissement du modèle de peau reconstituée avec ou sans ajout d’un stress
Méthodes
L’épiderme a été reconstruit à partir d’exérèses cutanées provenant de chirurgie esthétique selon la méthode décrite par Frankart et al. (Frankart et al., Exp. Dermatol. 2012, 21(11), 871-875).
Brièvement, les cellules (kératinocytes) ont été isolées des exérèses cutanées, puis mises en culture avant d’être ensemencées sur des inserts de cultures en immersion dans du milieu de culture puis les inserts de cultures sont mis à l’interface air/liquide dans un incubateur à 37°C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2, pour former lestratum corneum.
A 14 jours (J14), un épiderme reconstruit d’une surface de 0,6cm² est formé. Le milieu de culture est renouvelé toutes les 24 heures.
À J10 les épidermes reconstruits sont placés dans un milieu de culture sans antibiotique. À J13, les épidermes reconstruits sont placés dans des plaques 12 puits avec du milieu de maintenance sans antibiotiques (voir Frankart et al., 2012) et avec du Rouge de Phénol. Après 2h, un mélange sébum/microbiote, obtenu comme décrit à l’Exemple 1, est déposé à la surface de chaque épiderme reconstruit humain et étalé à l’aide d’un doigtier. Les épidermes humains reconstruits sont ensemencés avec un inoculum de microbiote d’une viabilité d’environ 5000 RLU.
La mise en survie des épidermes est réalisée en conditions stériles. Chaque insert contenant un épiderme est posé dans un puits d’une nouvelle plaque 12 puits contenant le nouveau milieu de maintenance seul ou supplémenté afin d’induire un stress. La plaque est incubée à 32°C sous 5% de CO2et 60% d’humidité relative. Le milieu de culture est renouvelé toutes les 24 heures jusqu’à 48h d’incubation.
Afin de mimer un stress inflammatoire de type dermatite atopique, le milieu utilisé est le milieu de maintenance (1 mL/puit) additionné d’interleukine 1b à 0,06µg/mL, du ligand TLR (Poly (1:C) à 10µg/ml, et Pam3CSK4 à 5µg/ml).
A réception, la viabilité du microbiote est mesurée à l’aide du kit BacTiter ATP Lite, Promega suivant le protocole du fournisseur. La viabilité du microbiote après culture est évaluée à l’aide de ce même kit. La mesure de viabilité est un test bioluminescent mettant en jeu la luciférase. La quantité de lumière émise est proportionnelle à la quantité d’ATP présente dans l’échantillon et donc au nombre de cellules vivantes. Afin de suivre la croissance bactérienne durant l’expérience, une lecture de viabilité est réalisée en duplicat sur le microbiote prélevé à partir de chaque épiderme (kit BacTiter-Glo Microbial Viability Cell Assay, Promega). Le mix ATP et le microbiote sont disposés dans chaque puit selon un ratio 1 :1. Après dépôt, la plaque (Low Binding Greiner 655209) est agitée pendant 30 secondes à 500 rpm puis incubée à température ambiante pendant 5 minutes. La lecture est ensuite réalisée via lecteur de plaques Clariostar.
L’ADN des microorganismes avant et/ou après croissance sur épiderme reconstruit est extrait à l’aide d’un Qiacube en suivant le protocole QIAamp DNA Investigator Kit de Qiagen.
Quantification absolue de microorganismes d’intérêt en
ddPCR
La Droplet Digital PCR (ddPCR) est une technique de PCR digitale basée sur la génération de gouttelettes grâce à une émulsion eau/huile. À partir d’un échantillon, elle permet de générer plus de 20 000 gouttelettes au sein desquelles est réalisée l’amplification PCR. Après amplification, chaque gouttelette est analysée afin de quantifier le nombre de gouttelettes positives dans l’échantillon. Cette technique a notamment l’avantage de permettre l’amplification d’ADN présent en faible quantité dans un échantillon.
La ddPCR est réalisée en plaque 96 puits : 5 μL d’échantillon sont ajoutées à 15 μL de mix ddPCR comme explicité dans le protocole Biorad. Les sondes utilisées correspondent aux espèces recherchées, par ex.S. epidermidis,S. aureus,C. acnes.
La génération de droplets est réalisée grâce à l’appareil QX200 Droplets Generator de Biorad puis la plaque est placée dans le thermocycleur pour l’amplification. La plaque est ensuite lue via l’appareil QX200 Droplet Reader de Biorad et analysée grâce au logiciel QuantaSoft.
L’impact de la « culture sur épiderme humain reconstruit » sur le microbiote est évalué par séquençage ciblé.
Le séquençage a été réalisé sur un séquenceur MiSeq (Illumina) avec les amorces adaptées à chacune des cibles. Le prétraitement des séquences est réalisé par un pipeline informatique développé par INRAE fonctionnant sous Mothur (version 1.44.0).
Les amorces utilisées ciblent les régions variables V1-V3 de la séquence de l’ARN ribosomique 16S des procaryotes (bactéries et archées). Le prétraitement des séquences est réalisé par un pipeline informatique développé par INRAE fonctionnant sous Mothur (version 1.44.0).
Les barcodes et les amorces ainsi que les chimères ont été retirés des fichiers de séquences au cours des étapes de filtrage. Les séquences présentant 100% d’homologie entre elles, ont été regroupées en séquences uniques, puis en OTU (operational taxonomic unit : seuil de 97 %) qui seront identifiés par la suite.
L’analyse bioinformatique des données de séquençage permet d’identifier les microorganismes présents à différents niveaux taxonomiques (phylum, genre (par ex. pourStaphylococcus), et espèce (par ex. pourC. acnes)). L’analyse permettant l’affiliation phylogénétique jusqu’au niveau genre a été réalisée à l’aide des outils bioinformatiques pour le traitement des grandes quantités de données de séquences (Mothur). L’identification a été réalisée sur la base de la taxonomie Greengenes pour les bactéries.
Séquençage des espèces de Staphylococcus cible « Tuf »
Les amorces utilisées ciblent le gène TUF. L’analyse bioinformatique des données de séquençage permet d’identifier lesStaphylococcusprésents à différents niveaux taxonomiques (genre et espèce sont ciblés). L’analyse permettant l’affiliation phylogénétique jusqu’au niveau espèce a été réalisée à l’aide des outils bioinformatiques pour le traitement des grandes quantités de données de séquences (Mothur). L’identification a été réalisée sur la liste de Staphylococcus.
Évaluation de l’impact du microbiote en culture sur les épidermes reconstruits sains et/ou stressés
L’expression des gènes codant pour des protéines de la fonction barrière (Claudine 1, Filaggrine et TGM1) ou des peptides anti-microbiens humain (DEFB4A et S100A7) a été évaluée par RT-qPCR.
Les moitiés d’épidermes reconstruits sont conservés dans 300 μL d’une solution de RLT (Qiagen) à 1% de β-mercaptoéthanol et congelés à -80°C en attendant l’extraction. Dans un premier temps, les RHEs sont séparés de leur membrane à l’aide d’une pince. Afin de lyser mécaniquement les cellules, une bille Stainless Steel Beads 5 mm (Qiagen) est ensuite ajoutée dans chaque tube puis ces derniers sont passés au Tissue Lyser (Qiagen) pendant 2 minutes (2x) à 20 Hz. Dans un deuxième temps, l’ARN est extrait selon le protocole d’extraction RNA Fibrous Tissue Mini Kit de Qiagen. Les extractions sont réalisées via Qiacube (Qiagen). La quantité d’ARN extraite est dosée au Nanodrop.
Le volume d’ARN est ensuite ajusté de façon à rétro-transcrire 1 μg d’ARN par échantillon. 4 μL de mix SuperScript VILO MasterMix sont ensuite ajoutés aux échantillons.
Les cDNA obtenus sont ensuite dilués au vingtième et disposés en plaque 384 puits (triplicats) à l’aide du robot EpMotion de Qiagen. 5,5 μL de mix de réaction (5 μL de TaqMan Fast Advanced Master Mix + 0,5 μL de sondes par réaction) sont ensuite ajoutés dans chaque puit.
GAPDH, YWHAZ et UBC sont les gènes de référence choisis pour l’analyse de la qPCR.
L’IL-8 est dosé dans les surnageants de culture (24H, 48H et 72H) grâce au kit Bioplex ELISA IL-8 de R&D Bio-Techne. Les surnageants sont dosés en triplicats. La lecture de plaques (Costar 3590 Corning) est réalisée sur le lecteur de plaques Clariostar. De la même façon, le TSLP est dosé dans les surnageants grâce au kit Bioplex TSLP de R&D Bio-Techne.
Croissance du microbiote dans le modèle de peau reconstituée
Le suivi de la viabilité durant le temps de mise en œuvre de ce modèle rend compte de la croissance du microbiote sur les épidermes.
Les résultats de croissance du microbiote sur les épidermes sains ou inflammatoires sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous.
Croissance du microbiote sur épidermes évalué par la différence entre la viabilité à 48h – viabilité à T0. NS : non-significatif ; S : significatif
Viabilité (T48h-T0) | Valeur P | Signification statistique | |
Épidermes sains | 72 814 | 0,8252 | NS |
Épidermes inflammatoires | 1 003 647 | 0,0036 | S |
La croissance des microbiotes sur les épidermes complets est de 1 à 2 log en 48h. On observe une croissance significativement plus importante sur les épidermes inflammatoires que sur les épidermes sains. Sans être liée par la théorie, on peut penser que la barrière est altérée dans l’épiderme inflammé, ce qui permet aux micro-organismes d’accéder à des nutriments supplémentaires et donc de croître davantage.
La composition bactérienne du microbiote a été évaluée à J13 (avant inoculation sur le modèle).
À J13, les genres bactériens identifiés dans le microbiote sont les suivants :
Cutibacterium (plus particulièrementC. acnes ),Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia , Finegoldia , Gemella , Veillonella , Kocuia , Corynebacterium, MethylobacteriumetBrevibacterium .
Les espèces deStaphylococcusont été déterminé de façon plus précise. Les espèces deStaphylococcusidentifiées dans le microbiote sont les suivantes :S. epidermidis, S. capitis , S. warneri , S. hominisetS. aureus.
Parmi les genres bactériens identifiés dans le microbiote à 48h,CutibacteriumetStaphylococcusont notamment été détectés.Les espèces deStaphylococcusont été déterminé de façon plus précise. Les espèces deStaphylococcusidentifiées dans le microbiote à 48h sont les mêmes que celles initialement présentes (S. epidermidis, S. capitis , S. aureus, S. warneri , S. hominis).
Évaluation de l’impact du
microbiote/sébum sur les épidermes sains
- Effet du microbiote/sébum sur la sécrétion de cytokines inflammatoires par l’épiderme sain
Les effets du microbiote/sébum sur la sécrétion d’IL-8 sont résumés dans le Tableau 3.
Cinétique de production d’IL-8 en fonction du temps de croissance du microbiote/sébum sur épidermes.
Épidermes sains | ||
Moyenne (pg) d’IL-8 sécrété par puit de culture, n=18 | ||
Temps (H) | Sans microbiote/sébum | Avec microbiote/sébum |
24 | 46,32 | 338,18 |
48 | 69,9 | 620,78 |
La présence de microbiote/sébum sur les épidermes sains, entraine une production d’IL-8, il existe donc une réaction de l’épiderme à la présence de microorganismes.
TSLP est une cytokine inflammatoire caractéristique de la dermatite atopique. Sa sécrétion est nettement stimulée dans le cas de la dermatite atopique et promeut l’initiation d’une réponse inflammatoire par les Th2. Elle est mesurée dans le surnageant après 24h de culture.
Les épidermes sains produisent peu de TSLP.
Les effets du microbiote/sébum sur la sécrétion de TSLP sont résumés dans le Tableau 4.
Production de TSLP par les épidermes sains avec et sans microbiote/sébum
Épidermes sains | ||
Moyenne (pg) de TSLP sécrété par mL de culture | ||
Temps (H) | Sans microbiote/sébum (n=3) | Avec microbiote/sébum (n=18) |
24 | 3,08 | 3,6 |
La production de TSLP n’est pas modifiée par la présence de microbiote sur épidermes sains.
3/ Effets sur l’expression des peptides antimicrobiens
Le gène DEFB4A code pour la β-defensine 2, un peptide antimicrobien cutané sécrété par les kératinocytes. La production de peptides anti-microbien est stimulée par la présence des microorganismes. S100A7 code pour la protéine connue sous le nom de psoriasine aux propriétés antimicrobiennes.
Les effets du microbiote/sébum sur l’expression de deux peptides antimicrobiens sont présentés dans le tableau 5.
Expression de DEFB4A et S100A7 par les épidermes sains avec et sans microbiote
Épidermes sains | ||
Temps (H) | Expression du gène DEFB4A par rapport à l’épiderme sain sans microbiote/sébum (RQ) | |
Sans microbiote/sébum (n=3) | Avec microbiote/sébum (n=18) | |
48H | 1 | 3,03 (p=0,14) |
Expression du gène S100A7 par rapport à l’épiderme sain sans microbiote/sébum (RQ) | ||
Sans microbiote/sébum (n=3) | Avec microbiote/sébum (n=18) | |
48H | 1 | 4,75 |
RQ : «Relative quantification», RQ > 2 : surexpression, 0,5 < RQ : sous-expression
La présence de microbiote/sébum sur les épidermes sains entraine une légère augmentation de l’expression des peptides antimicrobien DEFB4A et S100A7 par l’épiderme. La présence de microbiote/sébum sur les épidermes sains stimule une réponse immunitaire « innée ».
4/Effets sur l’expression des gènes de la fonction barrière
Afin de savoir si le microbiote/sébum a un effet sur la fonction barrière des épidermes sains, les inventeurs ont quantifié par RT-qPCR l’expression du gène codant pour la Claudine-1, une protéine impliquée dans les jonctions serrées et l’expression du gène codant pour la Filaggrine.
Le gène TGM1 code pour la transglutaminase-1, enzyme impliquée dans la formation dustratum corneumet la fonction barrière.
Les effets du microbiote/sébum sur l’expression de TGM1 est présenté dans le tableau 6.
Expression de TGM1 par les épidermes sains avec et sans microbiote
Épidermes sains | ||
Temps (H) | Expression du gène TGM1 par rapport à l’épiderme sain sans microbiote/sébum (RQ) | |
Sans microbiote/sébum (n=3) | Avec microbiote/sébum (n=18) | |
48H | 1 | 2,1 (p=0,028) |
RQ > 2 : surexpression, 0,5 < RQ : sous-expression
La présence de microbiote/sébum sur les épidermes sains n’entraine pas de modification significative de l’expression des gènes codants pour les protéines impliquées dans la fonction barrière, Filaggrine et Claudine 1 (résultats non montrés). L’expression du gène codant pour l’enzyme TGM1 est augmentée.
- Évaluation de l’impact du microbiote sur les épidermes inflammatoires
Les effets du microbiote sur la sécrétion d’IL-8 sont résumés dans le Tableau 7.
Exemple illustratif de la production d’IL-8 à 24h et 48H sur des épidermes inflammatoires
Épidermes inflammatoires | ||
Moyenne (pg) d’IL-8 sécrété par puit de culture, n=18 | ||
Temps (H) | Sans microbiote/sébum | Avec microbiote/sébum |
24 | 2020,04 | 3712,16 |
48 | 4091,36 | 6884,42 |
La production d’IL-8 est multiplié de 1.7 à 2.2 fois. La présence de microbiote/sébum sur les épidermes inflammatoires entraine une augmentation significative de la production d’IL-8 ce qui rend compte d’une amplification de la réaction inflammatoire de l’épiderme en présence de microbiote.
Des résultats similaires sont décrits dans la littérature chez des patients atteints de dermatite atopique (Casas et al., 2008, Skin Pharmacology and Physiology 21, 260-268). Par ailleurs, la production d’IL-8 est augmenté de 2 à 10-fois dans le modèle en condition inflammatoire par rapport au modèle « sain » (sans ajout de stress inflammatoire). Ces résultats sont également similaires à ceux décrits dans Casas et al., 2008, où la production d’IL-8 a été augmenté d’un facteur de 4,3 (2087/487, voir le Tableau 3).
Ces résultats illustrent que le modèle selon l’invention, comprenant un microbiote et du sébum, est représentatif de ce qui se passe in vivo, notamment dans des conditions inflammatoires.
Les effets du microbiote/sébum sur la sécrétion de TSLP sont résumés dans le Tableau 8.
Production de TSLP par les épidermes inflammatoires avec et sans microbiote
Épidermes inflammatoires | ||
Moyenne (pg) de TSLP sécrété par mL de culture (n=18) | ||
Temps (H) | Sans microbiote/sébum | Avec microbiote/sébum |
24 | 49,28 | 34,63 |
La production de TSLP par les épidermes inflammatoires nous permet de valider ce modèle.
En effet, comme attendu, TSLP est produit dans des conditions inflammatoires par rapport au modèle « sain » (sans ajout de stress inflammatoire), mais la présence du microbiote/sébum ne modifie pas de façon significative la production de TSLP.
3/ Effets sur l’expression des peptides antimicrobiens
Les effets du microbiote sur l’expression de deux peptides antimicrobiens sont présentés dans le tableau 9.
Expression de DEFB4A et S100A7 par les épidermes inflammatoires avec et sans microbiote/sébum.
Épidermes inflammatoires | ||
Temps (H) | Expression du gène DEFB4A par rapport à l’épiderme sain sans microbiote/sébum (RQ) | |
Sans microbiote/sébum (n=3) | Avec microbiote/sébum (n=18) | |
48H | 16,63 (p<0,023) | 117,05 (p=0,009) |
Expression du gène S100A7 par rapport à l’épiderme sain sans microbiote/sébum (RQ) | ||
Sans microbiote/sébum (n=3) | Avec microbiote/sébum (n=18) | |
48H | 62,7 (p<0,00001) | 86,03 (p=0,001) |
Expression relative au témoin épidermes sains sans microbiote. RQ > 2 : surexpression, 0,5 < RQ : sous-expression
La présence de microbiote/sébum sur les épidermes inflammatoires entraine une augmentation significative de l’expression des peptides antimicrobien DEFB4A et S100A7 par l’épiderme. Comme attendu, on observe une sensibilité de l’épiderme inflammatoire exacerbée en présence de microbiote/sébum.
4/Effets sur l’expression des gènes de la fonction barrière
Les effets du microbiote/sébum sur l’expression de TGM1 sont présentés dans le tableau 10.
Expression de TGM1 par les épidermes inflammatoires avec et sans microbiote/sébum.
Épidermes inflammatoires | ||
Temps (H) | Expression du gène TGM1 par rapport à l’épiderme sain sans microbiote/sébum (RQ), (n=18) | |
Sans microbiote/sébum | Avec microbiote/sébum | |
48H | 1,8 (p=0,151) | 5,97 (p=0,003) |
Calcul des RQ par rapport à l’expression du gène des épidermes sains sans microbiote. RQ > 2 : surexpression, 0,5 < RQ : sous-expression
La présence de microbiote sur les épidermes inflammatoires entraine une augmentation significative de l’expression de TGM1 par l’épiderme, ce qui confirme une sensibilité de l’épiderme inflammatoire exacerbée en présence de microbiote.
Au vu des résultats ci-dessus, les inventeurs mettent clairement en évidence l’intérêt du modèle de peau reconstitué comprenant un substitut cutané ainsi qu’une composante microbienne et un composant lipidique. En effet, dans des conditions non-pathologique, la présence d’une composante microbienne et d’un composant lipidique induit la production de certains marqueurs inflammatoires comme, par exemple, l’IL-8, et une augmentation légère de l’expression de peptides antimicrobiens stimulant donc une immunité innée. Cela suggère que le microbiote induit un niveau basal d’inflammation dans ces conditions. En outre dans des conditions de stress chimique, inflammatoire, le microbiote induit une réponse inflammatoire exacerbée, ce qui conduit à une fonction barrière altérée. Ainsi, en présence de stress chimique inflammatoire, le modèle reproduit avantageusement une inflammation de type dermatite atopique.
Ce modèle est donc tout à fait adapté pour évaluer de nouveaux actifs qui seraient potentiellement utiles dans la prévention ou le traitement de la dermatite atopique.
Ce modèle est également adapté pour évaluer de nouveaux actifs qui seraient potentiellement utiles dans la prévention ou le traitement des dermatoses inflammatoires, comme par exemple le psoriasis, l’acné, la dermite séborrhéique, l’urticaire chronique, l’eczéma, la rosacée.
Enfin, ce modèle intégré est particulièrement intéressant pour tester de nouveaux actifs ayant une activité putative dans la protection, voire le renforcement de la fonction barrière.
Exemple
3
:
Évaluation de l’effet d’un stress imitant l’exposition solaire sur le
modèle
de peau reconstruite ainsi que l’effet d’un filtre solaire
Un stress physique est appliqué au modèle de peau reconstruit comprenant du microbiote et du sébum. Précisément, le modèle est exposé à des rayonnements UV mimant ainsi une exposition solaire. Un filtre solaire, la 5,6,5’,6’-tétraphényl-3,3’-(1,4-phénylène)-bis[1,2,4]triazine mise en formulation (Formulation A, décrit dans le Tableau 10 ci-dessous) est appliquée 1 heure avant les rayonnements pour étudier la protection de ce dernier sur ce modèle intégré.
Tableau 11 : Formulation A
Ingrédients | % (m/m) |
5,6,5’,6’-tetraphényl-3,3’-(1,4-phénylène)-bis[1,2,4]triazine | 3-3,5 |
Glycérine | 5,0 |
Eau déminéralisée | qsp 100 |
Gomme xanthane | 0,2 |
C12-C15 alkyl benzoate | 12,0 |
Dicaprylyl carbonate | 9,0 |
Triglycérides caprylique/caprique | 9,0 |
Conservateurs | qs |
Alcool stéarylique | 1,0 |
Monostéarate de glycérol | 0,5 |
Béhénate de glycérol | 0,4 |
PEG-100 stéarate | 0,5 |
VP / eicosène copolymère | 1,0 |
Polyacrylate | 0,2 |
Cétyl phosphate de potassium | 2,0 |
Le modèle décrit à l’exemple 2 a été utilisé.
Dix-huit épidermes reconstruits (correspondant à 3 donneurs avec six épidermes reconstruits obtenus par donneur) avec du microbiote provenant de 18 donneurs distincts et du sébum sont utilisés par condition (non traité/ non irradié, non traité/ irradié, Formulation A/ irradié, Formulation A/ non irradié). La réalisation d’un stress exogène est effectuée 24h après l’ajout du microbiote/sébum, soit à J14.
Les épidermes reconstruits sont irradiés par des rayonnements solaires simulés en utilisant une chambre Suntest CPS+ ATLAS, Material Testing Technology BV, Moussy le Neuf, France) équipée d'une lampe à xénon NXE 1500, et munie d'un filtre UV pour éliminer les longueurs d'onde inférieures à 290 nm. L’irradiance dans les spectres UV est d'environ 70 W/m2 de 290 à 400 nm. Les modèles de peau sont exposés à une dose unique aiguë d'UV de 16,5 J/cm2 (environ 45 min) et la chambre d'irradiation est maintenue à 37 °C à l'aide d'eau glacée et d'un flux d'air.
La Formulation A est appliquée à la dose de 2 mg/cm² sur la surface du modèle de peau reconstituée 2h avant exposition aux rayonnements. Après irradiation avec le spectre solaire total (jusqu’à 790nm), le modèle est maintenu en culture 24 heures à 32 °C et 60 % d’humidité.
À la fin de l'expérience, la surface des épidermes reconstruits est lavée deux fois avec 100µl de sérum physiologique, et ensuite séchée avec un coton-tige. Cette étape a pour but de récupérer le microbiote cutané ainsi que les lipides (ici le sébum) pour analyse séparément des cellules de peau.
À la fin de l’étude, les épidermes reconstruits sont séparés de l’insert et sont pesés afin de standardiser les résultats obtenus avec l’approche métabolomique. Les épidermes reconstruits sont broyés et 108 échantillons sont extraits. Brièvement, les échantillons sont broyés dans 2 x 1mL d'acétonitrile/eau 1/9 (v:v) avec un fastprep utilisant des tubes Lysing Matrix M, 6 cycles de 20 secondes à force 4, avec 2min sur glace entre chaque cycle. Un volume de 800µL de chaque échantillon a été évaporé à sec avec un SpeedVac, puis normalisé dans 220µL de D2O. Les échantillons ont été analysés en RMN puis spectrométrie de masse.
Les spectres RMN 1H sont obtenus à 300 K sur un spectromètre RMN Bruker Avance III HD 600 MHz (Bruker Biospin, Rheinstetten, Allemagne), fonctionnant à 600,13 MHz pour la fréquence de résonance 1H, en utilisant une cryosonde 1H-13C-15N-31P de 5 mm à détection inverse attachée à une Cryoplatforme (l'unité de préamplification). Les spectres de RMN 1H sont acquis en utilisant l'expérience NOESY 1D avec pré-saturation pour la suppression de l'eau (noesypr1d), avec un temps de mélange de 100 ms.
Après les analyses par RMN, les échantillons sont transférés des tubes RMN aux flacons UHPLC. Les échantillons sont centrifugés à 9000 g pendant 5 min. Un volume de 10 μL est ensuite injecté dans le système UHPLC ACQUITY de Waters (Manchester, UK), en utilisant de l'eau/méthanol/acide acétique 95/5/0,1 (v:v:v) comme phase mobile A et du méthanol/acide acétique 100/0,1 (v:v) comme phase mobile B, à un débit de 0,3 mL/min. Le gradient suivant est utilisé : 0-30 min : 0% à 100% de B, 30-34 min : 100% de B. La séparation est réalisée à 30°C avec une colonne Hypersil Gold C18 (100 x 2,1 mm, 1,9 μm) de Thermo Scientific (Les Ulis, France). Les paramètres d'électrospray suivants sont appliqués : tension capillaire de 0,5 kV, tension du cône d'échantillonnage de 30 V, température de la source de 120°C, température de désolvatation de 350°C, débit du gaz du cône de 50 L/h et débit du gaz de désolvatation de 600 L/h en mode positif ; tension capillaire de 0,5 kV, tension du cône d'échantillonnage de 30 V, température de la source de 120°C, température de désolvatation de 550°C, débit du gaz du cône de 30 L/h et débit du gaz de désolvatation de 600 L/h en mode négatif. Les spectres de masse à haute résolution sont acquis avec un spectromètre de masse Synapt G2-Si de Waters (Manchester, UK), entre m/z 50 et 800 dans les modes sensibilité et centroïde. Les échantillons sont analysés de manière aléatoire, et un échantillon QC correspondant à un pool de tous les échantillons, est analysé 11 fois le long de la séquence.
Les identifications structurelles des métabolites discriminants sont réalisées sur un spectromètre de masse LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific, Les Ulis, France) couplé à un système de chromatographie liquide U3000 (Thermo Scientific, Les Ulis, France
L'analyse statistique et la cartographie du réseau sont réalisées par la plateforme MetaboHUB-MetaToul-AXIOM.
Les données sont normalisées pour permettre la quantification des signaux détectés dans plusieurs échantillons.
L'analyse des composantes principales est d'abord appliquée pour vérifier la validité de l'acquisition, pour détecter les valeurs aberrantes potentielles et les clusters internes.
Dans un contexte biologique, des facteurs de confusion sont généralement rencontrés : ces facteurs ajoutent du bruit dans les données correspondant à une variabilité non désirée. Plusieurs sources de bruit sont possibles : expérimentales, instrumentales... Lorsque la variabilité due à ces facteurs est supérieure à la variabilité due au facteur d'intérêt, aucune discrimination entre les groupes de traitement ne peut être trouvée. L'analyse discriminante par la méthode des moindres carrés partiels orthogonaux (O-PLS-DA) vise à éliminer cette variation indésirable Un test de permutation est effectué pour évaluer la robustesse des modèles PLS-DA. La valeur de la variable Importance on Projection (VIP) (seuil=1) a été utilisée pour trouver des caractéristiques discriminantes.
Pour chaque caractéristique discriminante, un test de Wilcoxon univarié et une correction du taux de fausse découverte (FDR) sont effectués pour prendre en compte les tests multiples (seuil de la valeur de p corrigée par le FDR = 0,05).
Les analyses multivariées sont effectuées à l'aide du logiciel SIMCA v15 (Umetrics, Umeå, Suède). Le paquet mixOmics (Rohart et al., 2017) est utilisé pour effectuer des analyses multiniveaux.
Pour créer le réseau métabolique, un logiciel librement accessible est développé et utilisé par l'INRAE, Toxalim : MetExplore. Il s’agit un serveur web qui offre la possibilité de relier les métabolites identifiés dans des expériences métabolomiques non ciblées dans le contexte de réseaux métaboliques reconstruits à l'échelle du génome. Le pipeline d'analyse comprend le mappage des données métabolomiques sur le réseau métabolique spécifique d'un organisme, puis l'application de méthodes basées sur les graphes et d'outils de visualisation avancés pour améliorer l'analyse des données.
Analyse pharmacologique des voies et des métabolites
Le tableau qui suit rapporte les variations observées (Log 2 de variations) sous l’effet de l’irradiation UV pour différents métabolites discriminants du stress oxydatif dans l’épiderme du modèle de peau reconstituée.
MS Negative | NI CTRL vs. IR CTRL | NI FA vs. IR FA |
Acide urique | 2,62 | 1,34 |
Gluthation | -9,03 | -1,77 |
MS Positive | NI CTRL vs. IR CTRL | NI FA vs. IR FA |
Xanthine | 0,57 | ns |
Gluthation | -6,83 | -1,61 |
NI : Non irradié ; IR : Irradié ; CTRL : Contrôle ; FA : Formulation A ; ns : non significatif
Une modulation importante de ces métabolites est observée après exposition au rayonnement, avec une forte augmentation de la xanthine et de l'acide urique et une diminution significative de glutathion. Ces résultats sont en accord avec les étudesin vivosur des volontaires humains (Randhawa et al, PLoS One. 2014 ; 9(3): e90367). Ces résultats montrent la validation du modèle selon l’invention afin d'étudier l'exposition au soleil et de prédire l'effetin vivosur la peau humaine.
Par ailleurs, ces résultats montrent un effet protecteur significatif d’une formulation comprenant de la phénylène bis-diphényltriazine (Formulation A) sur le stress oxydatif dû à l'exposition au soleil. Aussi, le modèle permet également d’identifier ou d’évaluer l’efficacitéin vitrod’un actif pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène tel que l’irradiation UV.
2/ Fonction barrière et hydratation : approche métabolomique
Le tableau qui suit rapporte les variations observées (Log 2 de variations) sous l’effet de l’irradiation UV pour différents métabolites discriminants de la fonction barrière et de l’hydratation de la peau, dans l’épiderme du modèle.
RMN |
NI CTRL vs. IR CTRL | NI FA vs. IR FA |
Acide octanoïque | 1,77 | 0,72 |
Sérine | 0,34 | Ns |
Glutamate | -0,52 | -0,18 |
Phosphorylcholine | -0,41 | -0,27 |
MS Negative | NI CTRL vs. IR CTRL | NI FA vs. IR FA |
Histidine | -1,82 | -0,77 |
L-Glutamine | -2,35 | -0,85 |
MS Positive | NI CTRL vs. IR CTRL | NI FA vs. IR FA |
L-Alanine | -2,79 | -1,44 |
Méthionine | -1,02 | -0,48 |
Xanthine | 0,57 | Ns |
NI : Non irradié ; IR : Irradié ; CTRL : Contrôle ; FA : Formulation A ; Ns : non significatif
Ces résultats démontrent que l’application topique d’une formulation comprenant de la phénylène bis-diphényltriazine (Formulation A) permet d’amortir très significativement les déséquilibres induits par le rayonnement UV, et ainsi de préserver la fonction barrière et l’hydratation de la peau.
Le tableau qui suit rapporte les variations observées (Log 2 de variations) sous l’effet de l’irradiation UV pour différents métabolites détectés en surface du modèle en lien avec le microbiote du modèle.
RMN | NI CTRL vs. IR CTRL | NI FA vs. IR FA |
Formate | 0,68 | ns |
Acétate | 0,69 | ns |
Glucose + maltose | 1,60 | ns |
Glycérol | 1,55 | ns |
Betaine | 0,64 | ns |
Octanoate | 1,06 | ns |
MS Positive | NI CTRL vs. IR CTRL | NI FA vs. IR FA |
Tyrosine | 1,70 | ns |
Panthénol | 0,71 | ns |
Phénylalanine | 1,52 | ns |
NI : Non irradié ; IR : Irradié ; CTRL : Contrôle ; FA : Formulation A ; ns : non significatif
L’irradiation UV induit des modifications importantes dans un grand nombre de métabolites.
Ces résultats démontrent également que l’application topique d’une formulation comprenant de la phénylène bis-diphényltriazine (Formulation A) permet de réduire très significativement les déséquilibres induits par le rayonnement UV, et ainsi de maintenir l’équilibre de la composante microbienne cutanée. La phénylène bis-diphényltriazine présente donc une véritable action symbiotique.
C. acnesest une espèce bactérienne très abondante dans le microbiote du modèle.
Les inventeurs ont mis en évidence une abondance significativement augmentée sous l’effet de l’irradiation (voir le Tableau 15).
IR CTRL vs. NI CTRL | IR FA vs. NI FA | |
C. acnes | ++ (3.57 % / 1.59 %) p=0.0069 | ns |
NI : Non irradié ; IR : Irradié ; CTRL : Contrôle ; FA : Formulation A ; ns : non significatif
Ces résultats démontrent que l’application topique d’une formulation comprenant de la phénylène bis-diphényltriazine (Formulation A) permet de réduire très significativement les déséquilibres induits par le rayonnement UV, et ainsi de protéger le microbiote et de maintenir l’équilibre de la composante microbienne cutanée.
Grâce à ce modèle d’épiderme humain reconstruit avec microbiote et sébum, les inventeurs ont identifié une signature métabolomique très précise de la peau exposée à un rayonnement UV, mimant une exposition solaire.
Ce modèle intégré est particulièrement intéressant car il permet de se rapprocher des conditions observées in vivo.
En outre, les inventeurs ont montré non seulement que les effets de différents stress peuvent être observés au niveau métabolomique mais également que la Formulation A permet de protéger l'écosystème cutané de l'exposition au soleil et de préserver la symbiose et l'homéostasie de la peau.
Ces résultats confirment la validité du modèle de peau reconstituée. Ces résultats confirment également la validité du modèle de peau reconstituée pour une utilisation dans des méthodes de criblage ou d’évaluation de l’efficacité d’actifs cosmétiques pour prévenir ou traiter des troubles de la peau, ainsi quand dans des méthodes d’évaluation de la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique. De façon très avantageuse, l’effet d’un stress exogène ou d’un actif a pu être déterminé sur la base non seulement d’un seul marqueur mais de plusieurs marqueurs, permettant d’établir une signature métabolomique, et démontrant la pertinence physiopathologique du modèle de peau reconstituée.
Claims (17)
- Modèle de peau reconstituée comprenant :
- un substitut cutané, et
- une composante microbienne et une composante lipidique sur la surface dudit substitut cutané
Ladite composante microbienne comprenant au moins quatre genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genresCutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium,etBrevibacterium,préférentiellement au moins les genresCutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus,etBurkholderia.. - Modèle selon la revendication 1, caractérisé en ce que la composante lipidique comprend un mélange d’acides gras libres, de triglycérides, de squalène, de cire et/ou esters de cire, et de cholestérol et/ou esters de cholestérol.
- Modèle selon la revendication 2, caractérisé en ce que la composante lipidique comprend 30 à 50 % p/p de triglycérides, de 15 à 30 % p/p d’acides gras libres, de 25 à 30 % p/p de cires et/ou esters de cire, de 12 à 20 % p/p de squalène et de 4,5 à 8,5 % p/p de cholestérol et/ou esters de cholestérol.
- Modèle selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la composante lipidique est issu d’un prélèvement d’au moins un sujet, préférentiellement au niveau du visage.
- Modèle selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la composante microbienne est une composante microbienne cutanée issu d’un prélèvement d’au moins un sujet, préférentiellement au niveau du visage et encore plus préférentiellement au niveau du front.
- Procédé d’obtention d’un modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant
a) Fourniture d’un substitut cutané,
b) Application sur ledit substitut cutané, de façon concomitante ou séquentielle, d’une composante microbienne et d’une composante lipidique. - Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que la peau reconstituée est stressée et en ce que le procédé comprend en outre une étape
c) Réalisation d’au moins un stress exogène. - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que le stress exogène est un stress chimique ou physique.
- Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le stress physique est une irradiation dans le domaine UV dont UVA et/ou UVB ; et/ou lumière visible dont lumière bleue haute énergie visible et/ou infrarouge.
- Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le stress chimique est un réactif de stimulation pro-inflammatoire ou du cortisol.
- Méthode de criblage pour l’identificationin vitrod’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes :
a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ;
b) La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ;
c) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et
d) Déterminer si ledit actif ou de ladite formulation cosmétique permet de prévenir et/ou améliorer au moins un trouble cutané en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). - Méthode d’évaluation de l’efficacitéin vitrod’un actif ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène comprenant les étapes suivantes :
a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ;
b) La réalisation d’au moins un stress exogène sur ledit modèle ;
c) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique ; et
d) Évaluer l’efficacité dudit actif ou de ladite formulation cosmétique en fonction d’au moins un niveau d’expression mesuré à l’étape c). - Méthode selon la revendication 11 ou 12, selon laquelle le au moins un trouble cutané est choisi parmi les troubles liés au vieillissement, à la pollution, au rayonnement ; les dermatoses inflammatoires, préférentiellement la dermatite atopique, l’acné, le psoriasis ; la rosacée ; le prurit ; une altération de la fonction barrière ; les peaux réactives ; les xéroses.
- Méthode selon la revendication 12 d’évaluation de l’efficacitéin vitrod’au moins un filtre solaire ou d’une formulation cosmétique pour prévenir et/ou traiter au moins un trouble cutané induit suite à au moins un stress exogène consistant en une irradiation UV, infrarouge, ou lumière bleue.
- Méthode d'évaluationin vitrode la tolérance d’un actif ou d’une formulation cosmétique, comprenant les étapes suivantes :
a) L’application dudit actif ou de ladite formulation cosmétique sur le modèle de peau reconstituée selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 ;
b) Au moins une mesure du niveau d’expression d’au moins un marqueur biologique dans le modèle de peau de l’étape a) ; et
c) Évaluer si ledit actif ou formulation cosmétique est bien toléré par le modèle de peau. - Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que la tolérance consiste au maintien de l’équilibre de la composante microbienne.
- Kit comprenant une composante microbienne et une composante lipidique destiné à être appliqué sur un substitut cutané, la composante microbienne comprenant au moins quatre genres de micro-organismes sélectionnés parmi les genresCutibacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Burkholderia, Finegoldia, Gemella, Veillonella, Kocuia, Corynebacterium, Methylobacterium,etBrevibacterium.
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