FR3126783A1 - Procédé pour caractériser le microbiote d’un échantillon biologique et ses utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé pour caractériser les microorganismes contenus dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : (a) mettre en contact ledit échantillon avec au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils, (b) détecter et éventuellement quantifier le ou les composés volatils émis suite à ladite mise en contact, et (c) déterminer, à partir du ou des composés volatils détectés et éventuellement quantifiés lors de l’étape (b), un profil d’émission des composés volatils, caractérisant lesdits microorganismes contenus dans ledit échantillon biologique. La présente invention concerne également l’utilisation d’un tel procédé pour comparer des microorganismes contenus dans différents échantillons biologiques, pour étudier l’évolution, dans le temps, des microorganismes contenus dans un échantillon biologique ou pour identifier un composé apte à empêcher la production des composés volatils.
Description
La présente invention appartient au domaine général de la caractérisation des flores microbiennes.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour caractériser des flores microbiennes telles que des microbiotes présents sur la peau humaine ou dans l’environnement notamment au sein de stations d’épuration, d’industries ou encore d’élevage d’animaux, ce procédé étant basé sur l’étude de la susceptibilité des flores microbiennes à générer des composés volatils organiques (COVs) ou non en présence d’une combinaison de précurseurs.
L’invention concerne aussi l’utilisation d’un tel procédé pour comparer des microorganismes issus de microbiotes variés, pour évaluer l’évolution, dans le temps, des microorganismes d’un même microbiote et/ou pour identifier des composés aptes à empêcher la production de composés volatils malodorants.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
Lorsqu’un environnement est dit « odorant » au nez humain, il s’agit le plus souvent de mauvaises odeurs émises par des flores microbiennes sous forme de composés volatils organiques (COVs) ou non organiques i.e. des composés émis en phase gazeuse. L’étude de ces flores microbiennes est très souvent complexe et peu de choses sont généralement connues sur leur capacité à émettre des mauvaises odeurs. Malgré tout, il est parfois nécessaire d’évaluer précisément cette capacité afin d’apporter une réponse adaptée/personnalisée au risque d’émission de mauvaises odeurs.
Ces odeurs peuvent être gênantes dans la vie quotidienne et de nombreuses stratégies sont développées pour les diminuer ou les masquer, telles que l’utilisation de déodorants corporels ou de parfums lorsqu’il s’agit d’odeurs corporelles, ou l’isolement géographique lorsque ces mauvaises odeurs sont émises depuis des stations d’épuration ou des sites d’élevage d’animaux. Pour ces stations ou sites, une autre stratégie vise à contrôler directement le type de microorganismes s’y trouvant, en utilisant, par exemple, le procédé de Nutriox de Yara France[1], lequel consiste à injecter des sels de nitrates au niveau des postes de refoulement afin de privilégier les bactéries dénitrifiantes au détriment des bactéries sulfato-réductrices, bloquant ainsi la formation de sulfure d’hydrogène et la production de sulfures.
La caractérisation des composés volatils remonte au début des années 1980 avec les travaux de Leydenet al, en 1981, qui établissent la relation entre le niveau de mauvaises odeurs axillaires et la composition de la flore microbienne responsable de la production de ces composés volatils[2]. Une autre étude datant des années 1990 démontre que les microorganismes sont directement responsables du niveau de mauvaises odeurs et non la composition qualitative et quantitative des sécrétions[3]. Des travaux plus récents se sont attachés à décrire les systèmes impliqués dans la biosynthèse des composés volatils et ont en effet montré le cheminement biochimique entre des précurseurs de ces composés volatils et le métabolisme bactérien présent en même temps sur la même surface, par exemple en surface du tissu cutané, en surface des muqueuses, au niveau du système digestif ou encore dans l’environnement comme au niveau des stations d’épuration, des industries ou encore des élevages d’animaux.
Parmi les précurseurs des composés volatils identifiés, on trouve des acides aminés tels que la leucine, l’isoleucine ou la valine qui peuvent être métabolisés, grâce à des enzymes spécifiques des microorganismes, en acides organiques comme l’acide isovalérique ayant une odeur désagréable. Par ailleurs,Clostridium butyricumpeut fabriquer de l’acide butyrique par fermentation du pyruvate présent dans le métabolisme humain. De plus, la bactérieStaphylococcus epidermidisest souvent associée à des mauvaises odeurs. Le métabolisme global et les enzymes bactériennes impliqués sont assez bien connus[ 4 ]. Toutefois, même si ces mécanismes biochimiques sont bien connus, ils le sont pour une espèce bactérienne déterminée et non pour un microbiote.
Des analyses de séquençage, à partir d’échantillons biologiques issus de sécrétions humaines, ont permis d’identifier des types de microorganismes responsables de la génération de composés volatils[ 5 ]. Ces analyses systématiques sont intéressantes mais sont peu adaptées à l’étude des flores complexes et économiquement non abordables en routine. Enfin, l’approche génomique pour la caractérisation des individus composant des flores microbiennes, bien que très exhaustive, informe sur le potentiel génétique individuel à générer des mauvaises odeurs et non sur le potentiel phénotypique exprimé par un microbiote, excluant de fait les phénomènes de coopération et de compétition microbienne : le produit d’un microorganisme devient le substrat ou l’inhibiteur d’un autre microorganisme.
D’autres approches reposant sur des tests phénotypiques existent. Elles cherchent à révéler la présence d’une enzyme bien particulière en mettant en évidence soit la disparition d’un substrat facilement détectable, soit la formation d’un produit facilement détectable. Cependant, la disparition d’un substrat n’informe pas sur le caractère malodorant des produits formés et ces derniers peuvent ne pas être détectés s’ils deviennent, à leur tour, le substrat d’une nouvelle réaction. A titre d’exemple, le composé volatil malodorant qu’est l’ammoniac est transformé en nitrate, qui n’est pas un composé malodorant, via une oxydation catalysée parNitrosomonas eutropha.
Un test phénotypique classique s'intéresse à la présence d'une enzyme. Par exemple, l’uréase est une enzyme qui catalyse l’hydrolyse de l’urée, considérée alors comme un précurseur, en dioxyde de carbone et en ammoniac. Un autre exemple d’enzyme est la tryptophanase qui catalyse l’hydrolyse du tryptophane, le précurseur dans cet exemple, en ammoniac, en indole et en pyruvate, autres composés volatils malodorants. Ces deux exemples montrent que l’ammoniac peut être synthétisé via plusieurs voies métaboliques. Aussi, pour évaluer la capacité d’une flore microbienne à générer de l’ammoniac basée sur l’étude des enzymes présentes, il faudrait rechercher, de manière exhaustive, l’ensemble des enzymes connues pour en générer, en utilisant autant de substrats différents et également pouvoir détecter les enzymes impliquées dans son éventuelle catalyse. Un tel test est bien trop complexe pour une utilisation routinière et de terrain et par conséquent non utilisé.
Par ailleurs, la composition et la quantité de microorganismes d’un microbiote donné est plutôt stable au cours du temps. Ceci est valable non seulement pour les flores microbiennes présentes sur la peau au niveau des aisselles, de l’aine, et plus généralement sur l’ensemble de la surface corporelle ou dans les sécrétions, mais aussi pour des flores bactériennes présentes dans l’environnement, comme les stations d’épuration, les industries ou encore les élevages d’animaux. Cependant il peut survenir un déséquilibre entre les microorganismes constituant ces microbiotes, avec comme conséquence ou cause l’émergence d’une maladie infectieuse chez un individu. Il est donc avantageux de pouvoir bénéficier de méthodes permettant d’évaluer rapidement l’évolution d’un microbiote pour pouvoir administrer, par exemple, un traitement antibiotique à un patient. La caractérisation des microorganismes issus de prélèvement peut être réalisée par leur mise en culture avec pour but de les identifier et/ou de les quantifier. Cependant entre le prélèvement et le résultat de l’examen, il peut se passer plusieurs jours et donc plusieurs jours avant la mise en œuvre d’une réponse curative adaptée.
La demande internationale WO 2017/205981 A1 décrit des méthodes de caractérisation de microbiotes basées sur l’étude du protéome par marquage des protéines après mise en culture dans un milieu contenant de l’azote marqué[ 6 ]. Cette méthode de caractérisation n’est cependant pas applicable à des composés gazeux.
La demande internationale WO 2013/001465 A2 décrit un procédé utilisé pour la détection d’un microorganisme spécifique dans un milieu biologique issu d’un prélèvement sanguin ou urinaire, afin de porter un diagnostic[ 7 ]. Le procédé revendiqué comprend la mise en présence du milieu biologique susceptible de contenir le microorganisme recherché avec un substrat enzymatique spécifique de ce dernier et métabolisable en un composé volatil, la production du composé volatil étant révélée par transduction optique. Ce procédé ne permet pas de caractériser une flore microbienne dans son ensemble.
Bien que l’objectivation des odeurs reste encore difficile, certaines approches ont été développées. Une première méthode pour objectiver les odeurs repose sur une analyse sensorielle utilisant le nez humain. Elle implique une évaluation sensorielle par des panels d’experts hautement qualifiés, cette méthode est toutefois peu reproductible et variable. D’autres méthodes sont basées sur des analyses chimiques des composés volatils émis par différentes techniques comme la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) directe ou indirecte, ou l’utilisation de nez électroniques[ 8-11 ]. Ces techniques permettent cependant de ne faire qu’un constat sur le niveau d’odeurs. Elles sont notamment utilisées en cosmétique pour évaluer l’efficacité de produits tels que des déodorants.
D’autres approches cherchent à caractériser de manière plus globale et visuelle les odeurs. La demande de brevet CA 2801978 A1 propose d’utiliser des bandelettes de papier qui, mises au contact de la peau, conduisent à une réaction colorimétrique entre des composés présents à la surface de la peau et des substrats « naturels » couplés à des chromogènes, déposés à la surface des bandelettes de papier[ 12 ]. Ainsi, le sodium de nitrite et l’acriflavine sont utilisés pour détecter localement la présence d’acide carboxylique. L’intensité de l’odeur peut ainsi être évaluée de manière qualitative de par l’intensité lue sur la bandelette. L’une des principales difficultés rencontrées avec ce type de méthode est que l’analyse des composés est réalisée en laboratoire et en phase liquide, alors que les mauvaises odeurs sont systématiquement issues de composés volatils, donc systématiquement émises en phase gazeuse.
La demande internationale WO 2009/054913 A1 décrit justement une méthode de détection et d’identification des composés volatils en phase gazeuse à partir d’une culture bactérienne, afin d’identifier la présence d’une bactérie spécifique cible[ 1 3 ]. Cette méthode suppose de connaître la cible recherchée. Elle convient donc pour du diagnostic mais n’est pas adaptée pour la comparaison de flores complexes. Elle ne permet de caractériser ni l’odeur émise par une flore microbienne, ni sa capacité à en émettre.
En conséquence, les inventeurs se sont fixé pour but de proposer un procédé permettant de caractériser simplement un microbiote sur la base de sa capacité à générer des odeurs dans des conditions prédéfinies afin de comparer, de façon standardisée, des flores microbiennes complexes, tout en s’affranchissant des résultats difficilement exploitables fournis par les méthodes de l’art antérieur.
La présente invention permet d’atteindre le but que se sont fixé les inventeurs et de résoudre tout ou partie des inconvénients des méthodes de l’art antérieur.
La présente invention cherche à caractériser une flore microbienne prélevée sur un échantillon, sans en décrire la composition qualitative et quantitative des microorganismes présents ou leurs constituants du type génome ou protéome. Mais, au contraire, elle caractérise cette flore microbienne en étudiant sa capacité à générer des odeurs en considérant un potentiel global résultant des diverses interactions possibles entre les différents microorganismes du type inhibition, synergie ou encore utilisation de métabolites secondaires et ce, à partir de composés précurseurs desdits composés volatils utilisés dans des conditions standardisées.
Ainsi, les inventeurs s’intéressent aux produits odorants produits indépendamment de la voie enzymatique qui a conduit à les produire. De plus, la mise en œuvre du procédé selon l’invention permet de déporter le microbiote à tester de son site natif et donc de dissocier les composés volatils produits en vue de la caractérisation de ce microbiote, des composés volatils (diversité ou concentration) présents dans la phase gazeuse au moment du prélèvement.
Les microorganismes qui génèrent au moins un composé volatil malodorant à analyser selon le procédé de l’invention proviennent de l’échantillon à traiter, ils sont donc endogènes. De plus, ils ne sont pas isolés avant de mettre en œuvre le procédé, ce qui constitue un avantage par rapport aux autres méthodes phénotypiques.
Enfin, le procédé de caractérisation d’un microbiote donné, basé sur l’analyse de la susceptibilité des microorganismes qui le constituent à générer des composés volatils est fortement simplifiée par rapport à l’art antérieur, la méthode comprenant trois étapes, une étape de mise en contact d’un échantillon contenant des microorganismes avec une combinaison de précurseurs donnée, une étape de détection des composés volatils et enfin une étape de détermination du profil d’émission des composés volatils, caractéristique des microorganismes de l’échantillon avec éventuellement l’attribution d’un score numérique.
Plus particulièrement, la présente invention propose un procédé pour caractériser les microorganismes contenus dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :
(a) mettre en contact ledit échantillon avec au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils,
(b) détecter et éventuellement quantifier le ou les composés volatils émis suite à ladite mise en contact, et
(c) déterminer, à partir du ou des composés volatils détectés et éventuellement quantifiés lors de l’étape (b), un profil d’émission des composés volatils caractérisant lesdits microorganismes contenus dans ledit échantillon biologique.
L’échantillon biologique mis en œuvre dans le cadre de la présente invention peut être tout échantillon biologique contenant des microorganismes aptes à produire des composés volatils et notamment des composés volatils malodorants.
L’échantillon biologique mis en œuvre dans le procédé selon l’invention est avantageusement choisi dans le groupe constitué par un fluide biologique ; un prélèvement corporel ; de l’eau de ville, de rivière, de mer, de piscines, de tours aéro-réfrigérées ou d’origine souterraine; un prélèvement dans une station d’épuration ; un prélèvement à partir d’un effluent industriel liquide ; de l’eau usée provenant notamment d’élevages intensifs ; un prélèvement provenant d’une filtration d’air ou d’un revêtement ; un prélèvement sur un objet tel qu’un fragment de tissu, un habit, une semelle ou une chaussure et un de leurs mélanges.
Plus particulièrement, l’échantillon biologique mis en œuvre dans le procédé selon l’invention est choisi dans le groupe constitué par un fluide biologique ; un prélèvement corporel ; un prélèvement dans une station d’épuration ; un prélèvement à partir d’un effluent industriel liquide ; de l’eau usée provenant notamment d’élevages intensifs et un de leurs mélanges.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « prélèvement » tout type de collecte d’échantillons, par exemple, par contact, raclage, écouvillonnage, forage, découpage, poinçonnage, broyage, lavage, rinçage, aspiration ou pompage. De fait, par « prélèvement corporel », on entend avantageusement un prélèvement effectué sur une zone corporelle par contact, raclage, écouvillonnage, lavage, rinçage, aspiration ou pompage. Cette zone corporelle peut être les aisselles, l’aine, la peau, le cuir chevelu, la bouche, l’œsophage, l’estomac, l’intestin, les voies oropharyngées, la vessie, le vagin ou l’utérus.
Le fluide biologique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par la salive, le crachat, les larmes, la sueur, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, un mucus ou fluide du tractus intestinal, un mucus ou fluide du tractus génito-urinaire ou un de leurs mélanges. Ainsi, le fluide biologique peut être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d’un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d’un corps humain ou animal, par toute technique connue de l’homme du métier telle qu’une extraction, un prélèvement ou un lavage.
Le prélèvement corporel et les étapes de récupération et d’isolement de ces différents fluides à partir du corps humain ou animal sont réalisés préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l’invention.
Ainsi, l’échantillon mis en œuvre dans le cadre du procédé selon la présente invention peut se présenter sous forme liquide ou solide.
Parmi les microorganismes contenus dans l’échantillon biologique, on trouve aussi bien des microorganismes procaryotes tels que les bactéries ou les archées, que des microorganismes eucaryotes comme les levures et autres champignons microscopiques et les protistes comme les algues ou protozoaires.
Les microorganismes contenus dans l’échantillon biologique mis en œuvre forment la flore microbienne caractéristique de cet échantillon. Cette dernière se définit par un ensemble potentiellement très vaste et varié de microorganismes tels que précédemment définis qui cohabitent sur une surface donnée ou dans un milieu donné et qui sont susceptibles d’évoluer dans le temps (multiplication ou disparition) de sorte que les ratios des différentes espèces ne sont pas les mêmes au cours du temps. Typiquement, la présente invention se limite au cas où cette flore est en contact avec un milieu gazeux de sorte qu’il y ait toujours au moins une interface liquide-gaz ou solide-gaz, le gaz étant la plupart du temps l’air ambiant étant donné que l’on s’intéresse aux mauvaises odeurs dans l’air.
Le procédé objet de la présente invention est applicable à tout type de flores susceptibles de générer des composés volatils et notamment des composés volatils malodorants telles que la flore cutanée, le microbiote intestinal, le microbiote vaginal, le microbiote buccal, le microbiote utérin ou encore la flore issue de sécrétions ou d’excrétions humaines ou animales. Le procédé est également applicable sur un prélèvement issu d’un système microbien complexe comme le microbiote digestif, le microbiote des voies oropharyngées ou encore des microbiotes environnementaux issus de stations d’épuration, d’industries ou d’élevages d’animaux. Pour rappel, un microbiote correspond à l’ensemble des microorganismes vivants au sein d’un écosystème donné.
A titre d’exemples illustratifs et non limitatifs de microorganismes contenus dans l’échantillon biologique mis en œuvre dans le cadre de la présente invention, on peut citer les bactéries du genreStaphylococcus, les bactéries du genreStreptoco c c us, les bactéries du genreCutibacterium, les bactéries du genreCorynebacterium, les bactéries du genreP ropionibacterium, les bactéries du genre Micrococcus, les bactéries du genre Brevibacterium, les bactéries du genreAnaerococcus, les bactéries du genrePeptoniphilus, les bactéries du genreKytococcus, les bactéries du genreLactobacillus, les bactéries du genreFaecalibacterium, les bactéries du genreEu bacterium, les bactéries du genreBactéroïdes, les bactéries du genrePrevotella, les bactéries du genreXylanibacter, les bactéries du genreCollinsella, les bactéries du genreBifidobacterium, les bactéries du genreAkkermansia, les bactéries de la famille desEnteriobacteriaceae, les bactéries du genreDesulvibrio, les bactéries du genreEscherichia, les levures du genreCandida, les levures du genreSaccharomyces, les champignons du genreAspergillus, les champignons du genrePenicilliumet/ou les archées du genreMethanobrevibacter.
Préalablement à la mise en contact avec les composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils i.e. préalablement à l’étape (a) du procédé selon l’invention, l’échantillon biologique peut être soumis à une étape de préparation au moyen de tout processus de préparation d’un échantillon microbien connu par l’homme du métier. Cette étape peut notamment consister, de manière non exhaustive, en une dilution, une concentration, une division en portions équivalentes ou non, une mise en suspension ou un transfert sur un support solide.
L’étape (a) du procédé selon l’invention met en œuvre, outre un échantillon biologique tel que précédemment défini, au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils.
Un composé métabolisable, par voie enzymatique, en composé volatil est également désigné, dans la présente description, par le terme « précurseur ». Cette expression et ce terme sont équivalents et utilisables de façon interchangeable. Ce composé, au sens de la présente invention, se définit comme étant une molécule ou une famille de molécules utilisées comme substrat pour une réaction enzymatique dans une voie métabolique spécifique au métabolisme des microorganismes éventuellement présents dans l’échantillon biologique.
Pour rappel, une voie métabolique est un ensemble de réactions chimiques catalysées par une série d'enzymes qui agissent de manière séquentielle. Chaque réaction constitue une étape d'un processus complexe de synthèse ou de dégradation d'une molécule biologique finale. Dans une voie métabolique, le produit de la réaction catalysée par une enzyme sert de substrat ou de précurseur pour la réaction suivante. Une enzyme est une biomolécule dotée de propriétés catalytiques, permettant d’abaisser l’énergie d’activation d’une réaction chimique.
Les composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils mis en œuvre dans la présente invention peuvent être naturels ou synthétiques. Lorsqu’ils sont d’origine naturelle, ils peuvent être prélevés sur le site d’origine de l’échantillon biologique à caractériser ou sur un site similaire. Par exemple, la sueur d’un individu A peut être la source de composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils, utilisée pour caractériser les microorganismes prélevés au niveau des aisselles d’un individu B.
Lors de l’étape (a) du procédé selon la présente invention sont mis en œuvre au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils, notamment entre deux et vingt et, en particulier, entre trois et dix composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils.
L’homme du métier saura déterminer, sans effort inventif, la quantité de composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils à utiliser lors de l’étape (a) du procédé selon l’invention en tenant compte que ces composés doivent être en excès afin de ne pas être limitants dans la réaction enzymatique et ainsi optimiser l’activité enzymatique.
Avantageusement, les composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils sont choisis dans le groupe constitué par (i) les acides aminés et leurs dérivés tels que l’alanine, la glycine, la lysine, la norvaline, l’ornithine, l’isoleucine, la leucine, le tryptophane, la valine, la sérine, la glutamine, l’aspartate, la phénylalanine, la proline, la thréonine, la tyrosine, la cystéine, l’histidine, l’urée, la cystéine-glycine-3-méthyl-3-sulfonylhexane-1-ol, (ii) les acides gras tels que les glycérides, les cérides, les stérols, le squalène et, plus particulièrement, les acides isostéarique, isopalmitique et méthylcaprilique, (iii) les hormones stéroïdiennes telles que l’androstérone et ses dérivés.
Le choix des composés utilisés lors de l’étape (a) est étroitement lié à l’application visée.
Ainsi, seront choisis de façon préférentielle, les composés précurseurs couramment retrouvés au niveau du cuir chevelu lorsqu’il s’agit de caractériser un échantillon biologique microbien issu du cuir chevelu.
A titre d’exemple additionnel, pour tester un échantillon biologique issu des aisselles, les composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils seront utilisés pour le procédé selon l’invention seront ceux couramment présents dans la sueur, ou présents, dans cette dernière, de façon anormale notamment lors de situations pathologiques.
De plus, pour tester un échantillon biologique issu d’une station d’épuration ou d’un élevage intensif, les composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils utilisés pour le procédé selon l’invention seront ceux couramment présents dans ces lieux, ou présents, dans ces derniers, de façon anormale notamment lors de situations de mauvais fonctionnement.
Lors de l’étape (a) du procédé selon l’invention, la mise en contact entre l’échantillon biologique et les composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils peut être réalisée de différentes façons.
Dans une première variante, la mise en contact peut être réalisée sur un support solide. Cette variante correspond au cas d’un échantillon biologique liquide dont au moins une partie est déposée sur un support solide sur lequel ont été préalablement déposés au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils. Elle correspond également au cas où un support solide sur lequel ont été préalablement déposés au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils est utilisé pour le prélèvement de l’échantillon biologique. Le support solide utilisable dans cette variante peut être un écouvillon, une gaze, une compresse, une bandelette en papier ou encore un milieu de culture de type gélose contact.
Dans une seconde variante, la mise en contact peut être réalisée en phase liquide. Cette variante correspond au cas d’un échantillon biologique liquide, éventuellement dilué, mis en contact avec au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils ou avec une solution dans laquelle sont ajoutés, préalablement, pendant ou après cette mise en contact, au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils. Elle correspond également au cas où un échantillon biologique solide prélevé sur un support solide est remis en suspension dans une solution contenant au moins deux composés métabolisables mais également au cas où un échantillon biologique solide prélevé sur un support solide est remis en suspension dans une solution puis la suspension résultante est mise en contact avec au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils ou avec une solution dans laquelle sont ajoutés, préalablement, pendant ou après cette mise en contact, au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils.
Les solutions utilisées lors de ces différentes variantes sont notamment choisies dans le groupe constitué par l’eau, de l’eau distillée, une solution aqueuse notamment une solution aqueuse tamponnée telle qu’un tampon PBS, un tampon TRIS ou un tampon HEPES, du sérum physiologique composé d'eau distillée et de Chlorure de sodium (NaCl) dilué à une concentration de 8 à 9 g.L-1et un milieu de culture permettant la croissance microbienne. A noter que, lorsque plusieurs solutions sont utilisées dans une même variante, ces dernières peuvent être identiques ou différentes. De plus, ces solutions peuvent contenir des molécules antimicrobiennes ayant pour but d’inhiber une partie de la flore présente dans l’échantillon biologique.
Les échantillons biologiques aussi bien solides que liquides peuvent être testés, selon l’une quelconque des variantes ci-dessus, après avoir été divisés en portions équivalentes ou non. Dans ce cas de figures, les composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils peuvent être introduits dans une même portion ou dans plusieurs portions différentes, chacune d’elles pouvant contenir un ou plusieurs composés différents.
Lors de l’étape (a) ou suite à cette dernière et préalablement à l’étape (b) du procédé selon la présente invention, l’échantillon biologique mis en contact avec les composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils peuvent être placés dans un contenant tel qu’un conteneur de type flacon, micro-chambre réactionnelle ou tout autre contenant permettant de générer un espace de tête, avec ou sans période d’incubation. Le milieu gazeux environnant l’échantillon biologique mis en contact avec les composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils est classiquement appelé « Espace de tête » ou par l’équivalent, en langue anglaise, « head-space ». Lorsque l’échantillon a été placé dans un contenant, ce milieu gazeux est le milieu gazeux dans le volume interne du contenant. En cas de prélèvement lors de l’étape (b), ce dernier est typiquement effectué au niveau du milieu gazeux dans le volume interne du contenant. En effet, l’étape (b) du procédé selon la présente invention consiste à détecter le ou les composés volatils produits par les microorganismes suite à la mise en contact avec les composés métabolisables et présents dans cet espace de tête.
Les composés volatils détectés et éventuellement quantifiés dans le procédé selon la présente invention peuvent être des composés organiques volatils (COVs) ou des composés inorganiques volatils et correspondent typiquement à de mauvaises odeurs. La notion de « mauvaise odeur », au sens de la présente invention, est définie par un échantillon gazeux qui contient des composés volatils suffisamment concentrés comme l’indole qui sent très mauvais à haute concentration et qui est pourtant ajouté à très faible dose dans les parfums pour la note animale, suscitant chez l’homme une réaction communément admise de répulsion.
A ce titre, les composés volatils détectés et éventuellement quantifiés sont choisis dans le groupe constitué par (i’) les composés soufrés, tels que le sulfure d’hydrogène, le mercaptan éthylique, le mercaptan méthylique, le sulfure de diméthyle, le disulfure de diméthyle, lesulfure de diéthyle, le disulfure de diéthyle, le 4-mercapto-4-methylpentan-2-one (4MMP), le 3-mercaptohexan-1-ol (3MH), le 3-mercaptohexyl acétate (3MHA), le benzèneméthanethiol ; (ii’) les composés aminés et diaminés tels que l’ammoniac, l’indole, le scatole, la putrescine, la cadavérine, le monométhylamine, le diméthylamine, l’éthylamine, le triméthylamine, l’isopropylamine, le méthyléthylamine, le diméthyléthylamine, le diéthylamine, le méthyldiéthylamine ; (iii’) les acides organiques à chaînes courtes tels que l’acide acétique et l’acide caprique ainsi que leur dérivés méthylés tel que l’acide isovalérique ; et (iv’) les composés hétérocycliques volatils tels que l’indole, le scatole, l’aniline, la méthylaniline, la naphtylamine, le pyrrole, la pyridine, la quinoléine, l’imidazole, la pyrazine, la triazine et la quinoléine.
Toute technique permettant une détection des composés volatils, de façon quantitative et/ou qualitative, connue de l’homme du métier est utilisable lors de l’étape (b) du procédé selon l’invention.
Ainsi, la détection et l’éventuelle quantification des composés volatils lors de l’étape (b) dans le procédé selon la présente invention peuvent être réalisées par une instrumentation analytique de laboratoire telle que la spectrométrie de masse, une instrumentation de quantification telle que la spectrométrie de masse à tube d'écoulement à ions sélectionnés (SIFT-MS), un ensemble de capteurs spécifiques de composés volatils, la chromatographie en phase gazeuse (CG), couplée ou non à la spectrométrie de masse, un nez humain ou un nez électronique. Ainsi, la mesure des composés volatils issus de la mise en œuvre du procédé peut également se faire via des capteurs spécifiques qui renseignent sur la composition chimique des produits générés ou via des capteurs non spécifiques comme un nez humain ou un nez électronique.
Pour rappel, un « nez électronique » est un appareil permettant de détecter des composés cibles en phase gazeuse tels que des composés odorants. Le nez électronique doit son nom à l’analogie qui existe entre son fonctionnement et celui du système olfactif humain. Le nez électronique se compose principalement de trois systèmes, à savoir :
(1) un système fluidique pour le transport d’un échantillon gazeux de l’extérieur du nez électronique vers l’intérieur de ce nez, ce système jouant le rôle du système respiratoire ;
(2) un système de détection qui comprend un réseau de capteurs à réactivité croisée vis-à-vis de composés volatils présents dans un échantillon du milieu gazeux, les capteurs jouant le rôle des récepteurs olfactifs du nez humain ; et
(3) un système informatique assurant le traitement des réponses émises par les capteurs sous forme de signaux, ce système jouant le rôle du cerveau humain.
Lors de l’étape (b) du procédé, la détection et éventuellement quantification peuvent se faire en point final (une seule mesure de l’espace de tête) ou de façon répétée dans le temps (analyse cinétique) afin de générer des signatures olfactives temporelles, notamment selon le procédé décrit dans la demande internationale WO 2021/123601 A1[ 14 ].
Lors de l’étape (c) du procédé selon la présente invention, le profil d’émission des composés volatils caractérisant les micro-organismes contenus dans l’échantillon biologique peut se présenter sous forme d’un score, d’une réponse à n dimensions, d’une signature normalisée, d’une signature olfactive temporelle ou d’une représentation graphique.
En effet, la détection et éventuellement quantification des composés volatils émis lors de l’étape (b) du procédé selon l’invention peut conduire au calcul d’un score caractéristique de la flore complexe contenue dans l’échantillon biologique. Ce score est décorrélé des microorganismes contenus dans l’échantillon biologique mais aussi décorrélé des composés volatils (diversité ou concentration) présents dans la phase gazeuse au moment du prélèvement, comme précédemment expliqué. La compilation des scores peut être utilisée pour fournir un score global simple caractérisant la flore complexe contenue dans l’échantillon biologique et analysée. Les notes obtenues sont donc liées à des compositions de précurseurs dont la préparation et la robustesse sont très bien maîtrisées assurant ainsi la reproductibilité du procédé selon l’invention.
Le score caractéristique de la flore complexe contenue dans l’échantillon biologique est déterminé comme le résultat de la différence entre la valeur détectée pour l’échantillon biologique mis en contact avec au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils et la valeur détectée pour l’échantillon biologique sans ajout d’un quelconque composé métabolisable, par voie enzymatique, en un composé volatil. Ce score peut être évalué de la façon suivante :
- simplement qualitative : présence ou absence d’au moins un composé volatil émis ;
- semi-quantitative : attribution du score selon un barème, une échelle qui est définie par l’utilisateur.
Lorsque la détection lors de l’étape (b) est effectuée via un nez électronique, un prélèvement effectué dans l’espace de tête tel que précédemment défini est convoyé via le système fluidique (1) du nez électronique vers le système de détection (2) de ce dernier et ce, pour exposer le réseau de capteurs du nez électronique au prélèvement et donc aux composés volatils qu’il contient.
La partie sensible des capteurs du nez électronique qui interagit avec les composés volatils présents dans le prélèvement peut être constituée d’oxydes métalliques semi-conducteurs, de polymères semi-conducteurs ou encore être fonctionnalisée par une ou des biomolécules, i.e. des molécules présentes naturellement chez les êtres vivants telles que des oligonucléotides, des acides nucléiques, des glucides, des peptides, des protéines, des lipides etc., ou des molécules biomimétiques i.e. des molécules qui imitent structurellement et/ou fonctionnellement des biomolécules.
L’étape (c) du procédé selon la présente invention comprend la conversion des interactions physico-chimiques se produisant entre la partie sensible des capteurs et les composés volatils en signaux exploitables.
Typiquement, chacun des capteurs que comprend le système de détection du nez électronique peut comprendre son propre système de mesure -ou transducteur- ou partager, avec d’autres capteurs, un système de mesure qui leur est commun. Dans les deux cas, le système de mesure peut être tout système de mesure permettant de générer un signal exploitable lors de l’interaction physico-chimique entre un composé volatil et la partie sensible d’un capteur et peut, notamment, être de type résistif, piézo-électrique, mécanique, acoustique ou optique. En d’autres termes, les capteurs peuvent être des capteurs résistifs, piézo-électriques, mécaniques, acoustiques et/ou optiques.
Avantageusement, les capteurs sont des capteurs optiques à résonance des plasmons de surface, des capteurs interférométriques ou bien des capteurs à transducteur ultrasonore micro-usiné et, en particulier, des capteurs à transducteur ultrasonore capacitif micro-usiné (ou CMUT) ou à transducteur ultrasonore piézoélectrique micro-usiné (ou PMUT).
Dans le cas des capteurs optiques à résonance des plasmons de surface, ce type de transduction combine généralement une source lumineuse, par exemple de type LED, afin de provoquer une excitation plasmonique et une caméra CCD pour enregistrer le signal résultant de la résonance plasmonique. A ce titre, on préfère tout particulièrement que les signaux émis par capteurs soient suivis en mode imagerie qui consiste à suivre les variations de signal de tous les pixels constituant l'image de la caméra CCD utilisée.
La mesure ainsi réalisée génère une réponse à n dimensions, dont on peut extraire une signature normalisée en utilisant des méthodes telles que PCA (analyse en composantes principales), MDS (pour « MultiDimensional Scaling » i.e. positionnement multidimensionnel) et réseaux neuronaux pour obtenir une dimensionnalité réduite. A titre d’exemple particulier, lorsque le nez électronique utilisé est le NeOse Pro de la société Aryballe, chaque mesure génère une réponse à 68 dimensions du fait d’un réseau de 68 capteurs en parallèle et une signature normalisée peut être obtenue à partir de cette réponse, comme expliqué dans la demande internationale WO 2021/123601 A1[ 14 ].
Dans un mode de réalisation particulier utilisant un nez électronique, le score obtenu comme le résultat de la différence entre la valeur, telle qu’une signature normalisée ou non, détectée pour l’échantillon biologique mis en contact avec au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils et la valeur, telle qu’une signature normalisée ou non, détectée pour l’échantillon biologique sans ajout de composé métabolisable peut être classé de la façon suivante :
- valeur comprise entre 0 et 0,3 (valeur exclue) : flore microbienne présente dans l’échantillon biologique, faiblement génératrice de composés volatils,
- valeur comprise entre 0,3 et 0,5 (valeurs incluses) : flore microbienne présente dans l’échantillon biologique, moyennement génératrice de composés volatils,
- valeur du score supérieure à 0,5 : flore microbienne présente dans l’échantillon biologique, hautement génératrice en composés volatils.
Comme précédemment évoqué, il est possible d’effectuer la détection et l’éventuelle quantification des composés volatils émis à différents temps compris entre le temps t0 correspondant à la mise en contact des microorganismes contenus dans l’échantillon avec les composés métabolisables et le temps d’analyse final. Cette variante apporte des informations plus précises et peut éventuellement servir à tracer des profils cinétiques de scores comme une signature olfactive temporelle au lieu d’un seul score final.
Cette variante peut être mise en œuvre avec une installation composée d’un nez électronique et d’une vanne de distribution permettant de réaliser l’acquisition de manière automatisée. Dans un mode de réalisation particulier de cette variante, on teste les microorganismes contenus dans un échantillon biologique sur trois types de composés métabolisables tels que l’urée, le tryptophane et la leucine. Avec les trois contrôles négatifs associés, cela fait six échantillons à contrôler au cours du temps. Un Neose Pro équipé d’une heptavalve permet de réaliser simplement cette expérience. On peut typiquement utiliser un intervalle de temps de 30 min moyennant quoi une mesure des six flacons est effectuée toutes les 30 min au lieu de mesurer le point final.
A partir des mesures à chacun des temps de prélèvement et d’analyse, on obtient une réponse à n dimensions et éventuellement une signature normalisée pour chacun des temps de prélèvement et d’analyse. La signature olfactive temporelle obtenue à l’issue de l’étape (c) du procédé selon l’invention correspond donc à l’ensemble des réponses à n dimensions et éventuellement des signatures normalisées, obtenues à l’issue du procédé selon l’invention.
Lors de la détermination du profil d’émission des composés volatils, caractérisant les microorganismes contenus dans l’échantillon biologique, il est possible de tenir compte du nombre de microorganismes présents dans ce dernier. Ainsi, lorsque le procédé selon l’invention est mis en œuvre dans un environnement laboratoire analytique ou laboratoire de microbiologie, un comptage précis des microorganismes peut être établi. De cette façon, un score quantitatif peut être établi qui prend en compte la quantité de microorganismes mis en jeu, à mettre en rapport avec la quantité de composés volatils, mesurée par la technique analytique utilisée (instrumentation de quantification type SIFT-MS, ensemble de capteurs spécifiques aux composés volatils recherchés, chromatographie en phase gazeuse (CG), couplée ou non à la spectrométrie de masse, nez électronique, panel humain, tube colorimétrique…). La précision du résultat i.e. la précision du score dépend donc de l’environnement de travail permettant une analyse fine des résultats (en environnement laboratoire) ou une analyse qualitative pour l’usage terrain.
L’ensemble des scores peut servir à générer une représentation graphique donnant ainsi une image caractéristique des microorganismes contenus dans l’échantillon biologique étudié. Une telle représentation graphique peut être une carte de type radar chart.
La compilation de ces scores peut également servir à calculer un score global caractérisant les microorganismes contenus dans l’échantillon biologique étudié. Le calcul mis en œuvre peut alors être un pourcentage, une moyenne, ou une autre formule tenant compte du nombre de précurseurs testés et/ou du nombre de microorganismes prélevés et/ou de seuils olfactifs.
Le détail du calcul du score est très dépendant de l’application visée. Ainsi, par exemple, pour une analyse des microorganismes contenus dans un échantillon biologique du type prélèvement d’aisselle dans un laboratoire d’analyse, une concentration en ppm de composés volatils tels qu’ammoniac, sulfure d’hydrogène, mercaptan méthylique, l’indole, etc. peut être obtenue pour chaque précurseur utilisé. Cette valeur quantitative sera reportée dans des tableaux de données servant à des analyses ultérieures.
Dans le cas d’une application terrain typiquement en magasin de produits hygiéniques ou pharmacie, le score sera présenté sous la forme d’un diagramme de couleur vert (pas de susceptibilité), orange (susceptibilité moyenne), rouge (forte susceptibilité), et ces choix de seuils seront laissés à l’utilisateur et non dépendants de la méthode utilisée.
Le procédé pour caractériser les microorganismes contenus dans un échantillon biologique, objet de la présente invention peut également être défini comme un procédé pour évaluer le potentiel des microorganismes contenus dans un échantillon biologique i.e. les microorganismes d’un microbiote à générer des composés volatils malodorants.
La présente invention concerne également l’utilisation d’un tel procédé :
- pour comparer des microorganismes contenus dans différents échantillons biologiques,
- pour étudier l’évolution, dans le temps, des microorganismes contenus dans un échantillon biologique ou
- pour identifier un composé apte à empêcher la production des composés volatils.
Cette dernière utilisation correspond à un procédé de criblage de composés présentant un potentiel élevé d’un point de vue cosmétique ou environnemental. Le terme « composé » tel qu’utilisé dans la présente invention fait référence à une molécule de n’importe quel type comprenant un composé chimique ou un mélange de composés chimiques, une séquence peptidique, une séquence nucléotidique comme une séquence antisens, une macromolécule biologique ou un extrait d’un matériel biologique issu d’algues, de bactéries, de cellules ou de tissus d’animaux en particulier de mammifères, de plantes ou de champignons. Ledit composé peut donc être un composé naturel ou un composé synthétique notamment obtenu par chimie combinatoire.
Quelle que soit l’utilisation envisagée, cette dernière se définit comme un procédé de comparaison des microorganismes contenus dans deux échantillons biologiques E1 et E2 particuliers.
Par conséquent, la présente invention concerne un tel procédé de comparaison consistant à
- caractériser les microorganismes contenus dans l’échantillon E1 selon un procédé de caractérisation tel que précédemment défini et obtenir le profil d’émission des composés volatils, caractérisant les microorganismes contenus dans ledit échantillon E1 ;
- caractériser les microorganismes contenus dans l’échantillon E2 selon un procédé de caractérisation tel que précédemment défini et obtenir le profil d’émission des composés volatils, caractérisant les microorganismes contenus dans ledit échantillon E2 ; et
- comparer le profil d’émission des composés volatils, caractérisant les microorganismes contenus dans ledit échantillon E1 et le profil d’émission des composés volatils, caractérisant les microorganismes contenus dans ledit échantillon E2.
Lorsque ce procédé est un procédé pour comparer les microorganismes contenus dans différents échantillons biologiques, les échantillons E1 et E2 peuvent être deux échantillons prélevés sur une même zone chez deux individus distincts, deux échantillons prélevés sur des zones différentes d’un même individu ou encore deux échantillons prélevés sur deux sites distincts comme deux stations d’épuration.
Lorsque ce procédé est un procédé pour étudier l’évolution, dans le temps, des microorganismes contenus dans un échantillon biologique, les échantillons E1 et E2 peuvent être deux échantillons prélevés, à deux temps distincts, sur une même zone d’un même individu ou sur un même site.
Lorsque ce procédé est un procédé pour identifier un composé apte à empêcher la production des composés volatils, les échantillons E1 et E2 correspondent à deux parties, typiquement de même volume et/ou de même taille, d’un même échantillon, le composé à tester étant ajouté à l’un parmi l’échantillon E1 et l’échantillon E2.
Il est évident que les conditions opératoires des étapes de caractérisation des microorganismes à partir des échantillons E1 et E2 doivent être identiques. A titre d’exemples de telles conditions opératoires, on peut citer une même quantité (volume ou masse) d’échantillons E1 et E2 ; des supports solides sur lesquels sont éventuellement déposés les échantillons E1 et E2 de nature identique ; des conditions de température et/ou d’humidité des étapes de caractérisation, identiques ; des prélèvements et analyses à des temps identiques ; des instrumentations de mesure telles que des nez électroniques avec des caractéristiques identiques et notamment une même instrumentation de mesure ; un même procédé pour obtenir, à partir des composés volatils émis, le profil d’émission de ces derniers comme, par exemple, un même procédé pour convertir les interactions physico-chimiques se produisant entre la partie sensible des capteurs et les composés volatils en signaux exploitables et/ou un même procédé pour convertir les signaux exploitables en signature normalisée.
Dans un mode de réalisation, l’étape de caractérisation des microorganismes contenus dans l’échantillon E1 et l’étape de caractérisation des microorganismes contenus dans l’échantillon E2 sont réalisées de façon simultanée. Dans ce mode de réalisation, les deux étapes de caractérisation i.e. à partir de l’échantillon E1 et à partir de l’échantillon E2 peuvent être effectuées sur des nez électroniques différents mais présentant des caractéristiques identiques. En variante, ces deux étapes de caractérisation peuvent être réalisées en utilisant le même nez électronique. Dans cette variante et en pratique, à un temps donné, l’échantillon E1 est mis en contact avec le réseau de capteurs du nez électronique utilisé puis ce dernier est rincé avant d’être mis en contact avec l’échantillon E2. Lorsque le profil d’émission des composés volatils se présente sous forme d’une signature olfactive temporelle, la différence de temps entre les deux mises en contact est minime eu égard à l’intervalle entre deux temps consécutifs de prélèvement moyennant quoi les échantillons E1 et E2 ont sensiblement le même « âge » lors de ces deux mises en contact.
Dans un autre mode de réalisation, l’étape de caractérisation des microorganismes contenus dans l’échantillon E1 et l’étape de caractérisation des microorganismes contenus dans l’échantillon E2 sont séparées dans le temps. Ce mode de réalisation est notamment utilisé lorsque l’étape de caractérisation des microorganismes contenus dans l’un des deux échantillons a été préalablement réalisée et enregistrée dans une base de données.
L’étape de comparaison des profils d’émissions des composés volatils caractérisant l’échantillon E1 et l’échantillon E2 utilise des processus très classiques de l’analyse de données.
Lorsque les profils d’émission des composés volatils à comparer se présentent sous forme de deux signatures olfactives temporelles, l’homme du métier trouvera, dans la demande internationale WO 2021/123601 A1[ 14 ], des informations quant à la comparaison de signatures olfactives temporelles, utilisables dans le procédé selon l’invention.
Lorsque les profils d’émission des composés volatils à comparer entre les échantillons E1 et E2 se présentent sous forme d’un score issu d’une réponse à n dimensions (une dimension = un capteur) et éventuellement d’une signature normalisée lorsque celle-ci a été extraite de la réponse à n dimensions, le score est le rapport de comparaison entre les deux échantillons E1 et E2, lequel est établi en moyennant les valeurs absolues résultantes de la différence d’intensité entre les flores des échantillons E1 et E2 pour chaque dimension, ces valeurs absolues sont ensuite transformées en pourcentage.
Dans un mode de réalisation particulier, chaque capteur mesure le même échantillon gazeux, conduisant au calcul suivant, pour les échantillons E1 et E2, à partir des « n » valeurs d’intensité (normalisées min/max) obtenues pour les « n » capteurs (« n » dimensions) :
- Calcul de la différence (valeur absolue) E1-E2 pour chaque capteur et
- Moyenne des « n » différences transformée en % = score de comparaison (Tableau 1 ci-après).
La comparaison des profils d’émission des composés volatils des échantillons E1 et E2 se fonde donc sur un rapport de comparaison avec la classification suivante :
- rapport entre 0 et 3% (valeur exclue) = Echantillons E1 et E2 peu différents,
- rapport entre 3% (valeur incluse) et 10% (valeur exclue) = Echantillons E1 et E2 significativement différents,
- rapport supérieur ou égal à 10% = Echantillons E1 et E2 très différents.
Il convient de noter que tout ce qui vient d’être explicité quant à la comparaison de deux échantillons E1 et E2 est applicable à la comparaison de plus de deux échantillons distincts et notamment à la comparaison de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 échantillons différents, voire à la comparaison de plus de 11 échantillons différents.
D’autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront encore à l’homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatifs, en référence aux figures annexées.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
Exemple
1
: Evaluation de la susceptibilité d’une flore à générer des odeurs.
Protocole expérimental
Un prélèvement microbien d’aisselle est réalisé à l’aide d’une compresse stérile (Medicomp Hartmann) de 25 cm2de surface. Pour ce faire, la compresse est vigoureusement frictionnée sous la première aisselle pendant 10 secondes puis sous la deuxième aisselle pendant 10 secondes.
La compresse est ensuite transférée dans un tube de 15 mL contenant 10 mL d’eau physiologique afin de subir un traitement par sonication (5 min). Chaque tube est plongé dans un bain de sonication (XUB12, Grant Instrument).
500 µL de la solution obtenue sont transférés dans 4 flacons en verre de contenance 60 mL, fermés par un bouchon avec septum en silicone/PTFE.
Différents précurseurs sont utilisés dans cet exemple : urée (VWR, réf. 661161ZAMP), cystéine (Sigma Aldrich, réf. 168149-25G), tryptophane (Sigma Aldrich, réf. T0254-25G) et eau physiologique (Merck, réf. 07982-100TAB-F). Les flacons reçoivent 500 µL de précurseurs selon la répartition donnée dans le Tableau 2 ci-après :
Les flacons sont incubés, toute une nuit, à 37°C. Avant mesure, les flacons sont ramenés à température ambiante pendant 30 min.
Les mesures d’espace de tête sont réalisées à l’aide du nez électronique développé par la société Aryballe (NeOse Pro) et le logiciel associé (NeOse Pro app) selon les recommandations d’utilisation du fabriquant.
Les composés volatils malodorants ciblés sont l’ammoniac pour le flacon n°1, le sulfure d’hydrogène pour le flacon n°2 et l’indole pour le flacon n°3. Pour cela, des capteurs présents en trois exemplaires et sensibles à ces composés sont sélectionnés. Les valeurs d’intensité moyenne de réponse pour ces capteurs sont utilisées après normalisation L2 (moyenne des trois exemplaires) pour le calcul du score de susceptibilité à générer des mauvaises odeurs (SMO), par soustraction des valeurs moyennes obtenues pour ces capteurs, à partir du flacon n°4.
Résultats obtenus :
Flacon n°1 : SMO ammoniac = 0,81-0,59 = 0,22.
Flacon n°2 : SMO sulfure d’hydrogène = 0,72-0,15 = 0,57.
Flacon n°3 : SMO indole = 0,83-0,49 = 0,34.
Suite à l’obtention de ces scores de susceptibilité, on peut les classer dans une catégorie selon la classification suivante : flore microbienne peu, moyennement ou hautement susceptible de générer le composé volatil odorant testé.
Dans le cas présent, cette classification peut être telle que présentée dans le Tableau 3 ci-après :
Conclusion
La méthode décrite permet de conclure, de façon simple et rapide, que la flore microbienne testée se caractérise par une forte susceptibilité à générer des odeurs de type indole, une susceptibilité moyenne à générer des odeurs soufrées et une faible susceptibilité à générer des odeurs de type ammoniac.
Exemple
2
. Comparaison des microbiotes axillaire
s
provenant de 2 individus.
Protocole expérimental
Six prélèvements de microbiote axillaire sont réalisés le même jour sur 2 individus A et B dont les aisselles non pas été savonnées et n’ont pas reçues de traitement cosmétique durant les 24 heures précédentes.
Les prélèvements sont réalisés à l’aide de gaze stérile de 25 cm2de surface (Medicomp Hartmann). Chacun des 6 prélèvements est réalisé en frottant une même gaze pendant 10 secondes sous l’aisselle droite puis pendant 10 secondes sous l’aisselle gauche.
Chaque gaze est ensuite pliée et introduite dans un flacon en verre de contenance 60 mL fermé par un bouchon avec septum en silicone/PTFE.
Pour chacun des 2 individus, 3 prélèvements reçoivent 100 µL d’une solution de précurseurs composée d’urée (VWR, réf. 661161ZAMP) à la concentration de 20 g/L et de leucine (Sigma Aldrich, réf. L8000-50G) à la concentration de 10 mg/L. Les flacons sont ainsi respectivement nommés AU1 à AU3 et BU1 à BU3. Les 3 autres prélèvements servent de témoins non additionnés de précurseurs et sont respectivement nommés A1 à A3 et B1 à B3.
Les flacons sont incubés pendant 20 heures à 37°C. A l’issue de la période d’incubation, Les signatures olfactives de chaque échantillon sont obtenues à l’aide du nez électronique développé par la société Aryballe (NeOse Pro) et le logiciel associé (NeOse Pro app) selon les recommandations d’utilisation du fabriquant.
Le calcul du rapport de comparaison entre les flores A (i.e. flore de l’individu A) et B (i.e. flore de l’individu B) est réalisé en moyennant les valeurs absolues résultantes de la différence d’intensité entre les flores A et B obtenues pour chaque capteur, avec la classification suivante en fonction du rapport :
- entre 0 et 3% (exclu) = microbiotes peu différents
- entre 3% (inclus) et 10% (exclu) = microbiotes significativement différents
- supérieur ou égale à 10% = microbiotes très différents.
Résultats obtenus
Les signatures olfactives normalisées min/max obtenues sans ajout de précurseurs pour les 3 prélèvements de l’individu A et de l’individu B sont présentées respectivement aux Figures 1A et 1B, alors que la présente les signatures moyennes de chaque individu sans ajout de précurseurs.
Les signatures olfactives normalisées min/max obtenues avec ajout de la solution de précurseurs pour les 3 prélèvements de l’individu A et de l’individu B sont présentées respectivement aux Figures 2A et 2B, alors que la présente les signatures moyennes de chaque individu avec ajout de précurseurs.
Les valeurs du calcul du rapport de comparaison sont donc :
- entre les flores A et Bavecajout de précurseurs = 5,06% et
- entre les flores A et Bsansajout de précurseurs = 1,47%
Conclusion
La méthode décrite permet de conclure de façon simple et rapide à une différence significative entre les microbiotes des individus A et B.
BIBLIOGRAPHIE
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[ 12 ]Demande de brevet CA 2801978 A1 publiée le 14 juillet 2014.
[1 3 ]Demande internationale WO 2009/054913 A1 publiée le 30 avril 2009.
[ 14 ]Demande internationale WO 2021/123601 A1 publiée le 24 juin 2021.
Claims (12)
- Procédé pour caractériser les microorganismes contenus dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes :
(a) mettre en contact ledit échantillon avec au moins deux composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils,
(b) détecter et éventuellement quantifier le ou les composés volatils émis suite à ladite mise en contact, et
(c) déterminer, à partir du ou des composés volatils détectés et éventuellement quantifiés lors de l’étape (b), un profil d’émission des composés volatils, caractérisant lesdits microorganismes contenus dans ledit échantillon biologique. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est choisi dans le groupe constitué par un fluide biologique ; un prélèvement corporel ; un prélèvement dans une station d’épuration ; un prélèvement à partir d’un effluent industriel liquide ; de l’eau usée provenant notamment d’élevages intensifs et un de leurs mélanges.
- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, préalablement à ladite étape (a), ledit échantillon biologique est soumis à une étape de préparation consistant en une dilution, une concentration, une division en portions équivalentes ou non, une mise en suspension ou un transfert sur un support solide.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits composés métabolisables, par voie enzymatique, en composés volatils sont choisis dans le groupe constitué par (i) les acides aminés et leurs dérivés tels que l’alanine, la glycine, la lysine, la norvaline, l’ornithine, l’isoleucine, la leucine, le tryptophane, la valine, la sérine, la glutamine, l’aspartate, la phénylalanine, la proline, la thréonine, la tyrosine, la cystéine, l’histidine, l’urée, la cystéine-glycine-3-méthyl-3-sulfonylhexane-1-ol, (ii) les acides gras tels que les glycérides, les cérides, les stérols, le squalène et, plus particulièrement, les acides isostéarique, isopalmitique et méthylcaprilique, (iii) les hormones stéroïdiennes telles que l’androstérone et ses dérivés. .
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite mise en contact est réalisée sur un support solide.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite mise en contact est réalisée en phase liquide.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdits composés volatils détectés et éventuellement quantifiés sont choisis dans le groupe constitué par (i’) les composés soufrés, tels que le sulfure d’hydrogène, le mercaptan éthylique, le mercaptan méthylique, le sulfure de diméthyle, le disulfure de diméthyle, lesulfure de diéthyle, le disulfure de diéthyle, le 4-mercapto-4-methylpentan-2-one (4MMP), le 3-mercaptohexan-1-ol (3MH), le 3-mercaptohexyl acétate (3MHA), le benzèneméthanethiol ; (ii’) les composés aminés et diaminés tels que l’ammoniac, l’indole, le scatole, la putrescine, la cadavérine, le monométhylamine, le diméthylamine, l’éthylamine, le triméthylamine, l’isopropylamine, le méthyléthylamine, le diméthyléthylamine, le diéthylamine, le méthyldiéthylamine ; (iii’) les acides organiques à chaînes courtes tels que l’acide acétique et l’acide caprique ainsi que leur dérivés méthylés tel que l’acide isovalérique ; et (iv’) les composés hétérocycliques volatils tels que l’indole, le scatole, l’aniline, la méthylaniline, la naphtylamine, le pyrrole, la pyridine, la quinoléine, l’imidazole, la pyrazine, la triazine et la quinoléine.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite détection et éventuelle quantification sont réalisées par une instrumentation analytique de laboratoire telle que la spectrométrie de masse, une instrumentation de quantification telle que la spectrométrie de masse à tube d'écoulement à ions sélectionnés (SIFT-MS), un ensemble de capteurs spécifiques de composés volatils, la chromatographie en phase gazeuse (CG), couplée ou non à la spectrométrie de masse, un nez humain ou un nez électronique.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, lors de ladite étape (c), le profil d’émission des composés volatils caractérisant les micro-organismes contenus dans l’échantillon biologique se présente sous forme d’un score, d’une réponse à n dimensions, d’une signature normalisée, d’une signature olfactive temporelle ou d’une représentation graphique.
- Utilisation d’un procédé tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 9,
- soit pour comparer des microorganismes contenus dans différents échantillons biologiques,
- soit pour étudier l’évolution, dans le temps, des microorganismes contenus dans un échantillon biologique,
- soit pour identifier un composé apte à empêcher la production des composés volatils. - Procédé de comparaison des microorganismes contenus dans deux échantillons biologiques E1 et E2, consistant à :
- caractériser les microorganismes contenus dans l’échantillon E1 selon un procédé de caractérisation tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 9 et obtenir le profil d’émission des composés volatils caractérisant les microorganismes contenus dans ledit échantillon E1 ;
- caractériser les microorganismes contenus dans l’échantillon E2 selon un procédé de caractérisation tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 9 et obtenir le profil d’émission des composés volatils caractérisant les microorganismes contenus dans ledit échantillon E2 ; et
- comparer le profil d’émission des composés volatils caractérisant les microorganismes contenus dans ledit échantillon E1 et le profil d’émission des composés volatils caractérisant les microorganismes contenus dans ledit échantillon E2. - Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la comparaison du profil d’émission des composés volatils caractérisant les microorganismes contenus dans ledit échantillon E1 et du profil d’émission des composés volatils caractérisant les microorganismes contenus dans ledit échantillon E2 se fonde sur un rapport de comparaison avec la classification suivante :
- rapport entre 0 et 3% (valeur exclue) = Echantillons E1 et E2 peu différents,
- rapport entre 3% (valeur incluse) et 10% (valeur exclue) = Echantillons E1 et E2 significativement différents,
- rapport supérieur ou égal à 10% = Echantillons E1 et E2 très différents.
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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