FR2555196A1 - Nouvelle bilirubine oxydase, son procede de production, composition reactive la contenant et son application au dosage de la bilirubine - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE BILIRUBINE OXYDASE NOUVELLE APPELEE BILIRUBINE OXYDASE M-1. ELLE CONCERNE EGALEMENT UNE COMPOSITION POUR LA RECHERCHE DE LA BILIRUBINE, QUI CONTIENT LADITE BILIRUBINE OXYDASE M-1 NOUVELLE. CETTE DERNIERE EST OBTENUE PAR CULTURE D'UNE SOUCHE PRODUCTRICE DE BILIRUBINE OXYDASE M-1 APPARTENANT AU GENRE TRACHYDERMA, NOTAMMENT TRACHYDERMA TSUNODAE K-2593. APPLICATION AU DOSAGE QUANTITATIF DE LA BILIRUBINE, NOTAMMENT PAR COLORIMETRIE.

Description

La présente invention concerne une bilirubine oxydase nouvelle élaborée

par une souche appartenant au genre Trachyderma de la classe des Basidiomycètes et son procédé de production, une composition réactive pour la recherche de la bilirubine, contenant cette bili- rubine oxydase nouvelle, une méthode de dosage quantitatif de la bilirubine dans des solutions à analyser telles

que des fluides biologiques avec ladite composition réacti-

ve, et l'application de ladite composition réactive à des méthodes analytiques dans lesquelles l'interférence

de la part de la bilirubine nécessite d'être éliminée.

La bilirubine est une substance jaune qui

est formée dans le sang par dégradation de l'hémoglobine.

La détection rapide et précise de la bilirubine dans du sérum humain a une importance vitale pour le diagnostic médical d'états pathologiques tels que la jaunisse, chez l'homme. Le taux de bilirubine dans le sérum sanguin croit anormalement chez les patients atteints de jaunisse,

si bien que l'intensité de la jaunisse peut être diagnosti-

quée par le dosage de la bilirubine dans le sérum sanguin.

Pour le dosage quantitatif de la bilirubine on a principalement utilisé jusqu'à présent une méthode de. dosage chimique appelée méthode diazo, dans laquelle

on utilise des sels de diazonium tels que l'acide diazosul-

fanilique (I. Kanai et M. Kanai: Manual of Clinical Assay, 28ème édition, pages XII-24, publié par Kinbara en 1978). Toutefois, cette méthode de dosage chimique présente des inconvénients tels que la spécificité de la réaction, la complexité de l'opération, les propriétés stimulatrices et corrosives du réactif, etc. Il est donc démontré que cette méthode soulève de nombreux problèmes en ce qui concerne son adaptation à des appareillages automatiques d'analyse, l'entretien et le réglage des appareillages, la précision des mesures, etc. Toutefois, une méthode est à l'étude depuis quelques années pour le dosage quantitatif de la bilirubine

avecun enzyme. Un enzyme capable de réagir avec la biliru-

bine a été mentionné pour la première fois par R. Broderson et P. Bortels [European Journal of Biochemistry, Vol. , 468) (1969)]. Les auteurs rapportent qu'une birirubine oxydase insoluble isolée du cerveau du cobaye oxyde la bilirubine en biliverdine, mais ils n'observent pas si du peroxyde d'hydrogène est ou non présent dans le produit de réaction. On affirme également qu'une préparation enzymatique tirée d'Agaricus bisporus réagit spécifiquement avec la bilirubine en provoquant un changement de couleur (brevet japonais publié sous le N 11 194/1983). Le produit

de réaction obtenu à partir de cette préparation enzymati-

que et de bilirubine est une substance qui montre un pic d'absorption à environ 510 nm et qui, par excitation avec une radiation de longueur d'onde égale à 450 nm, produit une fluorescence à environ 525 nm, et la formation ou l'absence de formation de peroxyde d'hydrogène dans cette réaction dépend de la manière dont cette préparation enzymatique est obtenue. Une méthode de dosage quantitatif de la bilirubine dans des liquides biologiques avec cette préparation enzymatique d'origine fongique spécifique de la bilirubine est proposée, mais le fait de savoir si la réaction de ladite préparation enzymatique avec la bilirubine est catalysée par un seul enzyme ou par un système de plusieurs enzymes reste très vague. De plus, attendu qu'il n'existe pas de détails suffisants sur les propriétés de cette préparation enzymatique envers la bilirubine, cette méthode ne peut pas être considérée comme une méthode avantageuse pour le dosage quantitatif de la bilirubine. De même, aucune allusion n'est faite en ce qui concerne l'action dudit enzyme sur la bilirubine liée à l'albumine et sur la bilirubine conjuguée à l'acide glucuronique, chacune représentant l'une des formes de bilirubine présentes dans le sérum sanguin. Une méthode de dosage quantitatif de la bilirubine par addition d'un agent tensio-actif, etc., comme activateur de réaction est proposée depuis peu [demande de brevet japonais mise à l'Inspection Publique sous le N 17999/1984] pour le

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dosage quantitatif de la bilirubine dans des liquides biologiques avec la bilirubine oxydase élaborée par le genre Myrothecium [demande de brevet japonais mise à l'Inspection Publique sous le I 141783/1983], attendu que cet enzyme n'agit pas à lui seul sur la bilirubine

liée à l'albumine.

Comme décrit ci-dessus, la bilirubine oxydase est utilisée dans le dosage quantitatif de la bilirubine dans le sérum sanguin, mais en plus de cela, cet enzyme

est également utile pour éliminer la bilirubine qui intro-

duit une erreur dans le dosage de substances autres que la bilirubine lors de l'analyse d'échantillons. Dans le dosage du glucose ou du cholestérol dans le sérum sanguin, on utilise le plus couramment comme méthode classique d'investigation une méthode colorimétrique

dans laquelle on fait agir la glucose oxydase ou la choles-

térol oxydase sur le sérum sanguin et on fixe à la peroxy-

dase le peroxyde d'hydrogène qui est formé. En particulier,

une méthode à développement de couleur utilisant le 4-

aminoantipyrine-phénol est parvenue à constituer une partie principale de la méthode enzymatique, en ce qui concerne sa simplicité et sa rapidité de même que la

stabilité du réactif. Cette méthode colorimétrique compor-

te la mesure à 500 nm du colorant quinonique rouge formé, mais la présence de bilirubine dans le sérum sanguin provoque une erreur négative. En conséquence, en faisant agir à l'avance de la bilirubine oxydase sur le sérum sanguin pour éliminer la bilirubine et en faisant agir ensuite la glucose oxydase ou la cholestérol oxydase sur le sérum sanguin, on pourrait obtenir le taux correct de glucose ou le taux correct de cholestérol du sérum sanguin. Dans l'analyse de divers composants dans des liquides biologiques tels que le sérum sanguin, l'urine, etc., on a utilisé jusqu'à présent les méthodes suivantes impliquant l'élimination de la bilirubine de liquides biologiques: dosage enzymatique quantitatif du glucose dans des liquides biologiques par addition de traces

de ferrocyanure de potassium ou de ferricyanure de potas-

sium à un échantillon à analyser, et élimination de l'in-

terférence des substances réductrices telles que la biliru-

bine par l'utilisation du potentiel d'oxydo-réduction (brevet japonais mis à l'Inspection Publique sous le N 25840/1980); dosage de composants dans des liquides biologiques par abaissement du pouvoir réducteur de la

bilirubine avec un agent oxydant [demande de brevet japo-

nais mise à l'Inspection Publique sous le N 107161/1981] dosage de composants voulus dans des liquides biologiques par dégradation de la bilirubine avec la préparation d'enzymes fongiques spécifiques de la bilirubine mentionnée ci-dessus pour éliminer son interférence (brevet japonais publié sous le N 11194/1983), etc. Parmi les préparations d'enzymes fongiques spécifiques de la bilirubine qui ont été utilisées dans la dernière méthode mentionnée

ci-dessus, il en existe une qui forme du peroxyde d'hydro-

gène. Cette préparation n'est pas avantageuse pour une méthode de mesure utilisant une réaction destinée au dosage quantitatif de certains composants dans des liquides

biologiques avec une oxydase, une peroxydase et un chromo-

gène cédant de l'hydrogène. On connaît de même depuis quelques années une méthode de dosage de composants autres que la bilirubine dans des liquides biologiques, par élimination de l'interférence de la part de la bilirubine coexistant dans le liquide biologique en utilisant de la bilirubine oxydase qui oxyde la bilirubine,mais qui ne forme pas de peroxyde d'hydrogène [demande de brevet

japonais mise à l'Inspection Publique sous le N 18/1984].

La caractéristique de cette méthode réside dans le fait qu'une substance qui favorise la réaction de la bilirubine oxydase (par exemple des agents tensio-actifs) et une substance qui interfère avec une réaction colorée (par exemple le fluorure de sodium) sont ajoutées conjointement avec la bilirubine oxydase. Mais cette bilirubine oxydase, dans la méthode par développement de couleur avec une peroxydase et un chromogène cédant de l'hydrogène que l'on utilise pour la recherche du peroxyde d'hydrogène,

agit en provoquant la condensation par oxydation quantita-

tive du chromogène, par exemple 4-aminoantipyrine et phénol, de sorte que le chromogène a une couleur rouge. Lorsque la substance qui interfère avec la réaction colorée est ajoutée à la solution réactionnelle, l'action de la bilirubine oxydase est perturbée en même temps, si bien que l'élimination totale de la bilirubine n'est pas obtenue, ce qui rend difficile d'obtenir la valeur de mesure précise

de composants de liquides biologiques.

Antérieurement, la Demanderesse a procédé à des essais de sélection sur de la bilirubine oxydase élaborée par des souches appartenant à la classe des Basidiomycètes et elle a découvert en conséquence que Schizophyllum commune produisait de la bilirubine oxydase dans le filtrat de bouillon de culture (demande de brevet

japonais mise à l'Inspection Publique sous le N 10149/1983).

Toutefois, étant donné que cet enzyme s'est montré quelque peu instable et inadapté à la production industrielle, la Demanderesse a poursuivi ses travaux de recherches

sur la bilirubine oxydase élaborée par des souches apparte-

nant à la classe des Basidiomycètes. La Demanderesse est parvenueà découvrir que l'espèce Trachyderma tsunodae appartenant au genre Trachyderma produisait une grande

quantité de bilirubine oxydase douée d'excellentes proprié-

tés dans le filtrat du bouillon de culture, et elle a

élucidé les propriétés enzymologiques de cet enzyme.

Ainsi, la Demanderesse est parvenue à la conclusion que

l'enzyme de la présente invention constituait une biliru-

bine oxydase nouvelle différente de celle qui était déjà connue. L'enzyme de la présente invention est appelé

bilirubine oxydase M-1 nouvelle.

La présente invention concerne dans ses grandes lignes la bilirubine oxydase M-1 nouvelle ainsi qu'une composition réactive destinée à la bilirubine,

ladite composition étant caractérisée en ce qu'elle con-

tient la bilirubine oxydase M-1 nouvelle.

L'un des objets de la présente invention est de trouver une méthode de dosage quantitatif de la bilirubine, qui consiste à faire agir la composition

réactive ci-dessus contenant la bilirubine oxydase M-

1 nouvelle sur une solution à analyser contenant de la bilirubine et à mesurer par colorimétrie la modification de la bilirubine ainsi produite, ou qui consiste à faire agir la 3-méthyl-3-benzothiazolinone-hydrazone (appelée ci-après MBTH) et ladite composition réactive contenant la bilirubine oxydase M-1 nouvelle sur une solution à

analyser contenant de la bilirubine et à doser par colori-

métrie le colorant bleu formé, dans des conditions acides.

Un autre but de la présente invention est de trouver une nouvelle méthode d'analyse. La méthode nouvelle de dosage de composants autres que la bilirubine dans une solution à analyser contenant de la bilirubine par l'utilisation d'une réaction avec une oxydase, une peroxydase et un chromogène cédant de l'hydrogène, o la bilirubine se comporte comme un agent qui interfère, est caractérisée en ce qu'elle comprend (a) une étape dans laquelle la composition réactive ci-dessus contenant la bilirubine oxydase M-1 nouvelle agit sur la solution à analyser pour éliminer l'effet d'interférence de la bilirubine co-existante et (b) une étape de dosage du composant désiré présent dans la solution à analyser restante. Un autre but de la présente invention est de trouver un procédé de production de bilirubine oxydase M-1 nouvelle, qui consiste à faire incuber la souche productrice de bilirubine oxydase M-1 appartenant au genre Trachyderma et à séparer du bouillon de culture

la bilirubine oxydase M-1 nouvelle.

De plus amples détails de la présente inven-

tion ressortent de la description qui suit, faite en

partie en regard des dessins annexés sur lesquels: - la figure 1 montre la relation qui existe entre le pH et l'activité de la bilirubine oxydase

M-1 nouvelle obtenue par la présente invention.

- la figure 2 montre la relation qui existe entre température et activité; - la figure 3 montre la relation qui existe entre le pH et l'activité après traitement pendant 60 minutes de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle à 37 C et à des pH variables; - la figure 4 montre la relation qui existe entre la température et l'activité après 10 minutes de traitement de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle à un pH égal à 7,0 et à des températures variables; - la figure 5 est une représentation graphique du spectre d'absorption (en traits interrompus) d'un produit de réaction (colorant rouge) entre la bilirubine et la MBTH, obtenu avec la bilirubine oxydase M-1 nouvelle et un graphique illustrant le spectre d'absorption (trait

plein) du colorant bleu produit dans des conditions d'aci-

dification à l'acide chlorhydrique; - la figure 6 est une courbe d'étalonnage obtenue dans l'exemple 2, cette courbe représentant la relation qui existe entre la concentration en bilirubine et la différence d'absorption; - la figure 7 est une courbe d'étalonnage obtenue obtenue dans l'exemple 3, cette courbe représentant la relation qui existe entre la concentration en bilirubine et la différence d'absorption; et - la figure 8 montre une courbe d'étalonnage obtenue dans l'exemple 4, cette courbe représentant la relation qui existe entre la concentration en bilirubine

et la différence d'absorption.

La souche utilisée dans la présente invention est une souche appartenant au genre Trachyderma de la classe des Basidiomycètes, par exemple Trachyderma tsunodae K-2593. Cette souche a été isolée du corps fructifère se développant sur le tronc d'un hêtre mort à Mt. Daisen

Préfecture de Tottori, Japon, en Août 1977.

Les caractéristiques morphologiques du corps fructifère et des spores de cette souche sont les suivantes:

Champignon annuel, sans stipe.

Chapeau: semi-circulaire, en forme de spatule ou d'éven-

tail, plat ou légèrement en dome à sa surface supérieure; 5-15 cm x 3-15 cm dans le sens transversal; la cuticule est non brillante et de couleur cannelle foncée, recouverte de petites rides et de mucrons durs granuleux, d'apparence grossière et généralement recouverte de spores de couleur brun foncé; la chair est presque blanche, et elle est coriace et tenace pendant la phase de croissance et forme un tissu ligneux très dur par temps sec; la surface inférieure est presque blanche et vire

plus tard au brun foncé.

Pores: environ 1,5 cm de longueur, de couleur cannelle

pâle; les ostioles sont fines.

Spores: du type Ganoderma, de couleur jaune pâle, affec-

tant la forme d'un grand ellipsoide-ovoide mesu-

rant 20-241mx14-16,5im; la membrane externe

se distingue nettement de la membrane interne.

En comparant les caractéristiques ci-dessus

avec la description donnée dans les ouvrages suivants:

Rokuya Imazeki et Tsugio Hongo: Colored Illustrations

of Fungi of Japan, Volumes 1 et 2 (publiés par Hoiku-

sha Co., Osaka, Japon) et Seiya Ito: Mycological Flora of Japan, Vol. 2, N 4, 1955 (publié par Yoken-do, Tokyo, Japon), il apparaît que cette souche appartient à l'espèce

Trachyderma tsunodae. Cette souche est déposée au Fermenta-

tion Research Institute, Agency of Industrial Science

and Technology, Japan, sous le numéro FERM BP-387.

Conformément à la présente invention, dont on donne ci-après de plus amples détails, on peut ajouter au milieu de culture toute source nutritive bien connue,

du moment qu'elle peut être exploitée par la souche.

Comme source de carbone, on peut utiliser par exemple le glycérol, le glucose, l'amidon, le saccharose, le

maltose, le lactose, la dextrine, des huiles et des grais-

ses, etc. Comme source d'azote, on peut utiliser avantageu-

sement de l'extrait de levure, de la peptone, un extrait soluble de mais, du soja dégraissé, du soja en poudre, un extrait de viande, etc. On peut aussi utiliser des substan- ces inorganiques et des sels métalliques tels que des phosphates, des sels de potassium, des sels de magnésium, etc. Etant donné que le bilirubine oxydase M-1 nouvelle de la présente invention est un enzyme contenant du cuivre, l'addition de sulfate de cuivre au milieu de culture améliore grandement la production d'enzyme. Par exemple, l'addition de 5 ppm de sulfate de cuivre produit 5 à fois plus de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle que

lorsqu'il n'y a pas d'addition de sulfate de cuivre.

Dans la culture de la souche appartenant

à la classe des Basidiomycètes. la production de la biliru-

bine oxydase M-1 nouvelle de la présente invention varie grandement selon les conditions de la culture. Toutefois, en général, la température de la culture est de preférence de 20 à 35 C, le pH de la culture est de préférence de

4 à 7 et la production de la bilirubine oxydase M-1 nouvel-

le de la présente invention atteint son maximum par culture pendant 3 à 15 jours dans des conditions d'agitation et d'aération. Dans ce cas, il est naturel de déterminer les conditions de la culture de manière à obtenir une production maximale de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle conformément aux souches et aux compositions du milieu

de culture que l'on utilise.

La bilirubine oxydase M-1 nouvelle produite par la souche de la présente invention est présente dans le bouillon de culture et peut être séparée sous forme de précipité par addition de 50 à 80% en volume d'un solvant organique (par exemple alcool, acétone) ou de à 60% en poids/volume d'un agent précipitant (par exemple le sulfate d'ammonium) au filtrat du bouillon de culture. Le précipité obtenu est débarrassé des sels par dialyse ou par traitement sur "Sephadex" pour obtenir une solution de l'enzyme brut. Pour purifier la solution d'enzyme brut obtenue, on la traite comme suit: on adsorbe

la solution sur une colonne de "DEAE-Sephadex A-50" préala-

blement tamponnée avec un tampon au phosphate 0,03M (pH 7,0) et on lave la matière adsorbée avec un tampon au phosphate 0,1 M (pH 7,0) et on l'élue avec un tampon au phosphate 0,3M (pH 7,0) pour recueillir une fraction active. Cette fraction active est ensuite concentrée et débarrassée des sels par ultrafiltration, adsorbée sur une colonne de "DEAE-Sepharose CL-6B" tamponnée avec un tampon au phosphate 0,03M (pH 7, 0) et la matière adsorbée est lavée avec un tampon au phosphate 0,01M (pH 7,0) et éluée avec un tampon au phosphate 0,2M (pH 7,0) pour recueillir une fraction active. Cette fraction active est ensuite concentrée avec une membrane de collodion, filtrée sur gel sur une colonne de "Sephacryl S-200" préalablement tamponnée avec un tampon au phosphate 0,1M (pH 7,0) et la fraction active obtenue est dialysée contre un tampon au phosphate 0,01M (pH 7,0) et lyophilisée en donnant l'enzyme purifié en poudre. Cet enzyme en poudre est une substance simple d'après l'analyse par

électrophorèse sur disquE de gel de polyacrylamide.

Les diverses propriétés de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle de la présente invention sont les suivantes:

I. Propriétés enzymologiques et physico-chimiques.

(1) Action: L'enzyme de l'invention agit en oxydant la bilirubine (du type lié à l'albumine, du type conjugué avec l'acide glucuronique et du type libre) en présence d'oxygène, allant jusqu'à une substance pratiquement

incolore en passant par la biliverdine, puis par une subs-

tance violet pale, mais ne forme pas de peroxyde d'hydro-

gène. (2) Spécificité envers le substrat: L'enzyme de l'invention agit sur la bilirubine

de même que sur la biliverdine, toutefois le degré d'oxyda-

tion de cette dernière atteint environ 12% de celui de 1 1 la première. Il agit également sur l'hydroquinone, le pyrocatéchol, la pphénylènediamine, le pyrogallol, la 4-amino-antipyrine et un monophénolmais n'exerce aucune

action sur l'hémine, la vitamine B12 et l'hémoglobine.

(3) pH optimal et stabilité au pH: L'enzyme de l'invention a un- pH optimal au voisinage de 5,5 (figure 1) et est stable entre pH et pH 9 lorsqu'il est traité pendant 60 minutes à 37 C

et à des pH variables (figure 3).

(4) Température optimale et stabilité thermique: L'enzyme de l'invention a une température optimale au voisinage de 50 C (figure 2) et est stable jusqu'à 55 C lorsqu'il est traité pendant 10 minutes à un pH de 7,0 et à des températures variables (figure

4).

(5) Poids moléculaire:

Le poids moléculaire de l'enzyme de l'inven-

tion est d'environ 83 000 d'après la méthode de filtration

sur gel de "Sephacryl S-200" (produit de la firme Pharmacia).

(6) Homogénéité: Une électrophorèse sur disques a été conduite en utilisant 7,5% de gel de polyacrylamide (pH 9,4)pour effectuer une coloration des protéines et une coloration d'après l'activité. On a observé une bande colorée de protéine, ce qui signifie que l'enzyme de l'invention est une substance simple. Attendu que cet enzyme provoque le développement quantitatif d'une couleur rouge de la part de la 4-aminoantipyrine et du phénol, on a observé, en effectuant la coloration d'activité, une bande rouge dans la même position que celle qui est occupée par

la bande colorée de protéine.

(7) Point isoélectrique:

Le point isoélectrique de l'enzyme de l'inven-

tion est à 3,92 + 0,05 d'après la méthode de concentration isoélectrique avec le produit "Pharmalyte" (pH 3-10;

produit de la firme Pharmacia).

(8) Effet des ions métalliques, des ions interférants, etc.: L'enzyme de l'invention est inhibé par l'acide L-ascorbique, l'azoture de sodium, le dithiothréito!, le cyanure de potassium, la L-cystéine, l'EDTA, les ions 2+

Fe etc. (tableau I).

TABLEAU I

Additif Pourcentage d'interférence(%) Acide L-ascorbique (1 mM) 100 Azoture de sodium (1 mM) 60 " (5 mM) 100 Dithiothréitol (1 mM) 86 Cyanure de potassium (1 mM) 84 L-cystéine (1 mM) 74 EDTA (1 mM) 59 Fe2+ (1 mM) 57 Glutathion réduit (1 mM) 38 o-Phénanthroline (1 mM) 34 2-Mercaptoéthanol (1 mM) 31 a,'-Dipyridyle (1 mM) 30 Acide iodacétique (1 mM) 10 (9) Spectre d'absorption visible: Par mesure du spectre d'absorption visible d'une solution de l'enzyme de l'invention, on a observé un maximum d'absorption à 610 nm, révélant la présence d'une

protéine bleue.

(10) Teneur en sucre: On a effectué une électrophorèse sur disques en utilisant du gel à 7,5% de polyacrylamide (pH 9,4) pour conduire une coloration PAS [Analytical Biochemistry, Vol. 30, 148 (1969)] et on a trouvé la même position de coloration que celle de la protéine colorée. Cela signifie que l'enzyme de l'invention est une glucoprotéine contenant un sucre. La teneur en sucre est d'environ

4,5% d'après la méthode au phénol et à l'acide sulfurique.

(11) Teneur en cuivre: La teneur en cuivre de l'enzyme de l'invention a été déterminée en utilisant un analyseur d'absorption atomique et on a trouvé qu'une mole du présent enzyme contenait 4 moles de cuivre. (12) Détermination de l'activité enzymatique: L'activité enzymatique a été déterminée par mesure d'une réduction de l'absorption de la bilirubine à 460 nm. On a conduit la réaction à 37 C pendant10 minutes en utilisant 3, 0 ml d'un mélange réactionnel contenant 0,1 ml d'OMEGA-chemistry Control Serum Elevated Bilirubin

( produit de la firme Hyland CO., des Etats-Unis d'Améri-

que), 300 micromoles de tampon au phosphate (pH 7,0) et 0,1 ml d'une solution d'enzyme convenablement diluée, et on a mesuré une réduction de l'absorption à 460 nm due à la bilirubine. Une unité de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle a été définie comme étant la quantité d'enzyme qui oxyde une micromole de bilirubine par minute dans

le système réactionnel ci-dessus.

Une comparaison de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle utilisée dans la présente invention avec la bilirubine oxydase classique est illustrée sur le

Tableau II.

TABLEAU II

Bilirubine oxydase M-1 nouvelle Enzyme provenant d'Agaricus Enzyme provenant de Myrothe-

utilisée dans la présente inven- bisporus *1 cium verrucaria *2 tion Bilirubine-+biliverdine--sub- Agit sur la bilirubine Bilirubine- substance verte stance vert pale--substance seuleen provoquant un -- substance vert pale--y

Action rouge pâle-- substance pratique- changement de couleur. substance violet pale.

ment incolore. Forme du peroxyde d'hy- Ne forme pas de peroxyde

drogène d'hydrogène.

Ne forme pas de peroxyde d'hy-

drogène. Spécificité Bilirubine 100 % Agit sur la bilirubine Bilirubine 100 % envers le Biliverdine 12 %seule. Biliverdine 1 % substrat Stable jusqu'à 55 C lors d'un Stable dans l'intervalle Stable jusqu'à 40 C lors d'un traitement de 10 minutes à pH de pH de 7,3 à 9,0. traitement de 15 minutes à

Stabilité 7,0. Stable dans l'intervalle pH 8,0. Stable dans l'inter-

de pH de 5 à 9 lors d'un trai- valle de pH de 6 à 10 lors tement de 60 minutes à 37 C d'un traitement de 60 min à

37C -

Température 50 C environ 20 à environ 50 C 40 C optimale pH optimal 5,5 7, 3 à 8,0 6,0 à 7,0 Poids molé- environ 83 000 environ 52 000 culaire tn Lnl Point iso- 3,92 + 0,05 4,1 électrique Agent interfé- Acide L- ascorbique, azoture de Fe2+, cyanure de potassium, rant sodium, dithiothréitol, cyanure azoture de sodium, thiourée de potassium Absorption Le maximum d'absorption apparaît Pas de maximum d'absorption visible à 610 nm au voisinage de 375 nm et de 460 nm Teneur en Environ 4, 5% Environ 7,8 % sucre

Teneur en 4 moles par mole d'enzyme 1 mole par mole d'enzyme.

cuivre Valeur K 1,67 x 10-4 M (bilirubine) m

*1 Enzyme décrit dans le brevet japonais publié sous le n 11194/1983.

*2 Enzyme décrit dans la demande de brevet japonais mise à l'Inspection Publique sous le No 141783/1983.

Ln C%

La composition réactive contenant la biliru-

bine oxydase M-1 nouvelle de -la présente invention peut

renfermer les composants usuels autres que ladite biliru-

bine oxydase M-1. En particulier, l'addition du sel de métal alcalin ou du sel de métal alcalino-terreux de l'acide désoxycholique (par exemple le désoxycholate de sodium) active la réaction. La quantité d'enzyme contenue dans la composition réactive n'est, au minimum, pas inférieure à 0,0001 unité, elle est de préférence

comprise entre 10 et 0,001 unité et elle est convenable-

ment réglée conformément à la durée de mesure et aux applications. Le désoxycholate de sodium est présent en proportion de 0,01 à 1,0%, de préférence 0,05 à 0,5 %. Le cas échéant, on peut en outre ajouter des solutions tampons, des agents stabilisants pour enzymes et d'autres additifs bien connus. La composition réactive est préparée par des opérations bien connues telles que dissolution, lyophilisation, imprégnation dans une feuille de support, etc. De même, l'enzyme peut être utilisé sous une forme liée à un support insoluble,

préparée conformément à des opérations bien connues.

II. Dosage quantitatif de la bilirubine Conformément - à la présenteinvention, la teneur en bilirubine de solutions à analyser qui en contiennent, par exemple des liquides biologiques tels que sérum sanguin, urine, etc. et leurs solutions de pré-traitement, peut être déterminée quantitativement en exploitant la propriété indiquée ci-dessus [(1) Action] de la bilirubine oxydase -M-1 nouvelle. Tout d'abord, on indique la méthode de dosage quantitatif suivante:

étant donné que la bilirubine oxydase M-1 nouvelle utili-

sée ici oxyde la bilirubine en présence d'oxygène jusqu'au stade d'une substance pratiquement incolore en passant par la biliverdine puis par une substance violet pâle, le dosage quantitatif de bilirubine dans des liquides biologiques tels que le sérum sanguin, l'urine, etc., est possible en provoquant l'action de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle sur la solution à analyser et en mesurant le taux de réduction de l'absorption à 460

nm. Par exemple, la concentration en bilirubine de l'é-

chantillon à analyser (par exemple sérum sanguin) peut être mesurée en ajoutant, à 10-100 gl de l'échantillon à analyser, 0,1 à 2,0 unités de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle et d'une solution tampon (pH 5 5 à 7,0), en conduisant la réaction à 20-40 C, de preference à 37 C pendant 1 à 30 minutes, de préférence pendant 5 à 10 minutes et en notant une différence d'absorption à 460 nm avant et après addition de la bilirubine oxydase M1 nouvelle. De même, la réaction de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle utilisée ici est activée de façon plus remarquable par le désoxycholate de sodium que par le cholate de sodium qui est un activateur de réaction pour la bilirubine oxydase dont il a été question jusqu'ici

(tableau III).

TABLEAU III

Additif (concentra- Activité relative tion finale, 0,167%) (%) Pas d'addition 100 Cholate de sodium 120 Désoxycholate de sodium 1650 Comme décrit ci-dessus, la bilirubine oxydase M-1 nouvelle utilisée conformément à l'invention agit d'elle-même sur toute forme de bilirubine présante dans

du sérum sanguin, c'est-à-dire Q la forme liée à l'albu-

mine, O la forme conjuguée avec l'acide glucunronique et Q la forme libre. On ne connaît pas encore d'enzyme doué d'une telle propriété. Cette propriété est supérieure à celle des enzymes bien connus dans le dosage quantitatif de la bilirubine ainsi que dans l'élimination de l'effet

de bilirubine décrit ci-après.

En second lieu, on indique la méthode de dosage quantitatif suivante: la Demanderesse a découvert que la bilirubine oxydase M-1 nouvelle catalysait la réaction de condensation entre la MBTH et la bilirubine, et que le dosage quantitatif de la bilirubine était possible par détermination colorimétrique du produit de condensation formé, en milieu acide. Par exemple, en ajoutant 0,1 à 3 micromoles de MBTH, une solution

tampon (pH 5,0 à 7,0) et 0,005 à 0,1 unité de la bilirubi-

ne oxydase M-1 nouvelle à 10-100 il d'un échantillon à analyser (par exemple du sérum sanguin) et en conduisant la réaction à 20-40 C, de préférence à 37 C pendant 1 à 20 minutes, de préférence pendant 3 à 6 minutes, il apparaît un colorant rouge dont l'absorption maximale se situe au voisinage de 520 nm et de 550 nm. Ce colorant rouge est converti dans des conditions acides, par exemple

dans des conditions acides créées par l'acide chlorhydri-

que ou l'acide sulfurique, en un colorant bleu ayant une absorption maximale à 610 nm et possédant un grand coefficient d'extinction moléculaire. En conséquence, la bilirubine contenue dans des échantillons à analyser

peut être dosée quantitativement par mesure de l'absorp-

tion à 610 nm de ce colorant bleu. Par exemple, lorsqu'on ajoute 1 micromole de MBTH, 1,0 ml de tampon au citrate 0,3 M (pH 5,5) et 0,05 unité de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle à 100 Bl de Control Serum Elevated Bilirubin d'OMEGA-Chemistry (20 mg/dl; produit de la firme Hyland Co., des Etats-Unis d'Amérique), le volume total du mélange est ajusté à 2,0 ml et la réaction est conduite à 37 C pendant 5 minutes, il se forme un colorant rouge ayant un maximum d'absorption au voisinage de 520 nm et de 550 nm. Lorsqu'on ajoute 1,0 ml de HC1 1N à cette substance et que l'on acidifie le système, il se forme un colorant bleu ayant une absorption maximale à 610 nm et un grand coefficient d'extinction moléculaire (figure 5). La figure 5 est un graphique illustrant la relation qui existe entre la longueur d'onde (nm) en abscisses, et l'absorption (en ordonnées). Sur la figure 5, le spectre d'absorption du colorant rouge est représenté par une courbe en traits interrompus et celui du colorant bleu est représenté par une courbe

en trait plein.

255 5 1 9 6

III. Méthode d'élimination de l'effet de la bilirubine dans l'analyse de composants de liquides biologiques

Pour le dosage de divers composants de liqui-

des biologiques tels que le sérum sanguin, l'urine, etc., en utilisant la réaction avec une oxydase, du peroxydase et un chromogène cédant de l'hydrogène, on expliquera une méthode d'élimination de la bilirubine coexistante avec la bilirubine oxydase M-1 nouvelle. Comme décrit à propos de la propriété [(6) Homogénéité] de ladite bilirubine oxydase M-1, cet enzyme, dans la méthode de développement d'une couleur avec la peroxydase et

un chromogène cédant de l'hydrogène destinée à la détec-

tion de peroxyde d'hydrogène, exerce une action en provo-

quant la liaison par oxydation quantitative du chromogène, par exemple un système 4-amino-antipyrine/phénol, en sorte que le chromogéne prend une couleur rouge. Pour

cette raison, dans une méthode de dosage de divers compo-

sants dans des liquides biologiques, tels que glucose, chlolestérol total, etc., les valeurs mesurées précises de ces composants peuvent être obtenues par un traitement préalable de l'échantillon à analyser avec la bilirubine

oxydase M-1 nouvelle pour éliminer l'effet de la bilirubi-

ne qui est une substance réductrice, en ajoutant ensuite un agent interférant convenable tel que l'azoture de sodium, [on renvoie à la propriété (8) Effet des ions

métalliques, des agents interférants, etc.] pour interfé-

rer totalement avec l'action de la bilirubine oxydase

M-1 nouvelle sur le chromogène cédant de l'hydrogène.

La réaction entre la bilirubine oxydase M-1 nouvelle et un échantillon à analyser peut être conduite dans des conditions convenables conformément aux composants à doser qui sont présents dans des liquides

biologiques et aux méthodes de dosage qui sont utilisées.

Toutefois, en général, on ajoute 0,01 à 0,20 unité de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle et une solution tampon (pH 5,5 à 7,0) à 10-100 l1 d'un échantillon à analyser tel que du sérum sanguin, de l'urine, etc. et après conduite de la réaction à 20-40 C, de préférence à 37 C pendant 1 à 30 minutes, de préférence 10 à 20 minutes, on ajoute un agent interférant pour la bilirubine oxydase M-1 nouvelle de manière que sa concentration finale soit de 1 à 50mM, par exemple on ajoute de préférence de l'azoture de sodium de manière que sa concentration finale soit de 5mM. Le traitement subséquent peut être conduit conformément à la méthode de mesure usuelle

pour chaque composant. De même, dans la méthode de traite-

ment décrite ci-dessus, on peut utiliser une modification telle que l'on ajoute préalablement un agent interférant pour la bilirubine oxydase M-1 nouvelle au réactif de dosage de chaque composant, et on ajoute ensuite le mélange résultant à l'échantillon à analyser traité

avec la bilirubine oxydase M-1 nouvelle. Dans le pré-

traitement de l'échantillon à analyser avec la bilirubine oxydase M-1 nouvelle, l'addition de désoxycholate de sodium, agent activatetr de réaction (concentration finale 0,05 à 0,5%) rend possible la réduction de la quantité d'enzyme utilisée dans le pré-traitement et

raccourcit également la durée de pré-traitement.

La présente invention sera illustrée ci-

après par des exemples, mais il y a lieu de remarquer qu'elle ne doit pas être interprétée comme étant limitée

aux exemples seulement.

Exemple 1

Production de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle Un milieu de culture inclinée comprenant 2% de glucose, 0,5% d'Ebios et 1,5% de gélose (milieu Ebios) a été inoculé avec Trachyderma tsunodae K-2593, et la culture a été conduite en maintenant le milieu à 25 C pendant une semaine pour obtenir un champignon d'ensemencement. En opérant séparément, on a introduit 100 ml d'un milieu de culture comprenant 2,0% de glycérol, 0,3% d'extrait de levure, 1% de peptone, 0,3% de KH2PO4 et 0,1% de MgSO4.7H20 dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml et après stérilisation à 120 C pendant 20 minutes,

on a refroidi le milieu et on l'a inoculé avec le champi-

gnon d'ensemencement ci-dessus. Ensuite, on a conduit

la culture à 27 C pendant 7 jours pour préparer un bouil-

ilon de culture ensemencé. En opérant séparément, on a chargé 20 litres de milieu de culture comprenant 2% de glycérol, 0,3% d'extrait de levure, 1% de peptone, 0,3% de KH2P04, 0,1% de MgS04.7H20, 5 ppm de CuSO4. 5H20 et 0,03% d'agent anti-moussant (CB-442; produit de la firme Nippon Yushi Co.) dans un appareil de fermentation à cuve de 30 litres et on a stérilisé le milieu à 120 C pendant 20 minutes. Après refroidissement, le milieu de culture a été inoculé avec 100 ml du bouillon de culture d'ensemencement ci-dessus et on a conduit la

culture à 27 C pendant 7 jours dans des conditions choi-

sies de manière que la vitesse d'aération soit de 20 litres par minute et que la vitesse d'agitation soit de 250 tr/min. Une fois la culture terminée, le mycélium a été enlevé par filtration pour obtenir un filtrat de culture. L'activité en bilirubine oxydase M-1 nouvelle de ce filtrat de culture était de 1,08 unité/ml. Du sulfate d'ammonium a été ajouté à 17 litres de ce filtrat de culture jusqu'à 60% de la saturation et, après repos pendant une journée et une nuit entières, le précipité de sulfate d'ammonium résultant a été dialysé pendant une journée et une nuit entière contre une grande quantité

de tampon au phosphate 0,03M (pH 7,0). La solution d'enzy-

me brut ainsi obtenue a été adsorbée sur une colonne (diamètre 11,0 cm x 10 cm) de "DEAE"-Sephadex A-50" préalablement tamponnée avec un tampon au phosphate 0,03M (pH 7,0) et la matière adsorbée a été lavée avec un tampon au phosphate 0,1M (pH 7,0) et éluée avec un tampon au phosphate 0, 03M (pH 7,0). La fraction active sous forme d'éluat a été concentrée et les sels en ont été éliminés par ultrafiltration et elle a été adsorbée

sur une colonne (diamètre 5,0 cm x 5 cm) de "DEAE-Sepharo-

se CL-6B" tamponnéeavec un tampon au phosphate 0,03M (pH 7,0) et la matière adsorbée a été lavée avec un tampon au phosphate 0,1M (pH 7,0) et éluée avec un tampon au phosphate 0,2M (pH 7,0), pour recueillir une fraction active. Cette fraction active a été concentrée avec une membrane de collodion et filtrée sur gel à travers une colonne (diamètre 3,6 cm x 90 cm) de "Sephacryl S-200" préalablement tamponnée avec un tampon au phosphate 0,1M (pH 7,0). La fraction active ainsi obtenue a été dialysée contre un tampon au phosphate 0,01M (pH 7,0) et, après addition de saccharose comme agent stabilisant

de manière que sa concentration finale soit de 0,1%,-

elle a été lyophilisée pour obtenir 760 mg d'enzyme purifié sous forme de poudre. L'activité spécifique de cette poudre était de 17,8 unités/mg. Cet enzyme en poudre était une substance simple d'après l'analyse

par électrophorèse sur disques de gel de polyacrylamide.

L'étape de purification décrite ci-dessus est illustrée

sur le tableau IV.

TABLEAU IV

Teneur en pro- Activité Activité Rende-

téine totale totale spécifique ment (mg) (U) (U/mg) (%) Filtrat de culture 211 500 17 970 0,085 100 Relargage au sulfate d'ammonium 56 670 19 640 0,347 109 "DEAE-Sephadex A-50" 6 400 18 510 2,89 103 "DEAE- Sepharose 831 15 560 18,7 86,6 CL-6B "Sephacryl S-200" 421 13 570 32,2 75, 5

Exemple 2

Dosage quantitatif de la bilirubine par la méthode

de réduction de l'absorption à 460 nm.

On a préparé des solutions de bilirubine contenant 5 mg/dl, 10 mg/dl, 15 mg/dl, 20 mg/dl, 25 mg/dl et 30 mg/dl de bilirubine (du type lié à l'albumine; produit de la firme Daiichi Kagaku Yakuhin Co.). On a ajouté à 0,1 ml de chacune de ces solutions 190 ml de tampon au phosphate de potassium 0,3M (pH 7,0) et 0,5 unité de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle et, après avoir complété le volume totaldela solution à 3,0 ml, on a conduit la réaction à 37 C pendant 10 minutes.

Ensuite, on a mesuré l'absorption à 460 nm (DOéchantillon).

* On procédant séparément, on a répété le même mode opéra-

toire que ci-dessus mais sans ajouter de bilirubine oxydase M-1 nouvelle, en tant qu'essai témoin pour obtenir une absorption à 460 nm (DOblanc) et on a déterminé la différence ADO460 entre la valeur DOblanc et la valeur DO échantillon. Les résultats sont reproduits sur la figure 6. La figure 6 est une représentation graphique illustrant une courbe d'étalonnage qui représente la relation existant entre la concentration en bilirubine (mg/dl) (abscisses) et la différence d'absorption

(ADO460) (ordonnées).

Comme le fait apparaître la figure 6, on peut, en utilisant la bilirubine oxydase M-1 nouvelle

de la présente invention, doser avec précision la biliru-

bine dans des liquides biologiques d'après une variation

d'absorption à 460 nm.

Exemple 3

Dosage quantitatif de la bilirubine par la méthode de réduction de l'absorption à 460 nm (effet du désoxycholate de sodium) On a préparé les mêmes solutions de bilirubine que dans l'exemple 2. On a ajouté à 0,1 ml de chacune de ces solutions 1,0 ml d'un tampon au phosphate de potassium 0,3M (pH 7,0), 0,5 ml de désoxycholate de sodium à 1,2% et 0,05 unité de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle et,après avoir ajusté le volume total de solution à 3,0 ml, on a conduit la réaction à 37 C pendant minutes. On a ensuite mesuré l'absorption à 460 nm (DO échantillon). En procédant séparément, on a répété le même mode opératoire que ci-dessus mais sans ajouter de bilirubine oxydase nouvelle, comme essai témoin pour

obtenir une absorption à 460 nm (DOblanc) et on a déter-

miné la différence ADO460 entre la valeur DOblanc et la valeur DOéchantillon Les résultats sont reproduits

sur la figure 7.

Comme le fait apparaître la figure 7, il est possible, par l'addition de désoxycholate de sodium, qui est un agent activateur de réaction pour la bilirubine oxydase M-1 nouvelle, à un système de dosage quantitatif de la bilirubine, de réduire la quantité d'enzyme en proportion atteignant environ 1/10 comparativement à

l'absence d'addition de désoxycholate de sodium.

Exemple 4

Dosage quantitatif de la bilirubine avec la MBTH On a préparé des solutions de bilirubine contenant 5 mg/dl, 10 mg/dl, 15 mg/dl et 20 mg/dl de bilirubine (du type lié à l'albumine; produit de la firme Daiichi Kagaku Yakuhin Go.). On a ajouté à 0,1

ml de chacune de ces solutions 1,0 ml de tampon au citra-

te 0,3M (pH 5,5), 0,1 ml de MBTH 10 mM et 0,05 unité de la bilirubine oxydate M-1 nouvelle, et après avoir complété le volume total de la solution à 2,0 ml, on a conduit la réaction à 37 C pendant 5 minutes. Ensuite, on a ajouté 1,0 ml de HC1l 1N et on a mesuré l'absorption à 610 nm (DO échantillon). En procédant séparément, on a répété le même mode opératoire que ci-dessus mais sans ajouter de bilirubine oxydase M-1 nouvelle, en tant qu'essai témoin pour obtenir une absorption à 610

nm (DOblanc) et on a obtenu une valeur ADO610 en effec-

tuant la différence entre DOchantillonet DOblanc Les échantillon t bDanc'Le résultats sont reproduits sur la figure 8. La figure 8 est une représentation graphique illustrant une courbe d'étalonnage qui représente la relation existant entre la concentration en bilirubine (mg/dl) (abscisses) et la différence d'absorption (A)0 610) (ordonnées). Comme le fait apparaître la figure 8, on peut, en utilisant

la bilirubine oxydase M-1 nouvelle de la présente inven-

tion,doser avec précision la bilirubine dans des liquides biologiques d'après une variation de l'absorption à

610 nm.

Exemple 5

Elimination de l'interférence de la part de la bilirubine dans une épreuve de dosage du chlolestérol total dans le sérum sanguin (1) Réactif coloré: On a dissous 167 mg de 4-amino-antipyrine, 1,32 g de phénol et 80 mg (100 unités/mg) de peroxydase de raifort (type I; produit de la firme Sigma Chemical Co., Etats-Unis d'Amérique) dans 100 ml de tampon au

phosphate de potassium 0,1M (pH 7,0).

(2) Solution de cholestérol estérase: On a cultivé Coriolus versicolor N1213 (déposé sous la référence FERM-P N 4820) dans un milieu contenant de l'huile de graine de cotonnier, de la peptone, une solution de glucose, etc., pour obtenir un filtrat

de culture contenant une activité en cholestérol estérase.

Ce filtrat de culture a été soumis successivement à une chromatographie sur colonne de "Amberlite CG-50", une ultrafiltration, une chromatographie sur colonne de "DEAE-Sephadex", une chromatographie sur colonne de "SP-Sephadex" et une chromatographie sur colonne

de "Sephadex G-150" pour obtenir un échantillon authenti-

que de l'enzyme purifié (70 unités/mg) (d'après la méthode décrite dans Collection of Summaries of Lectures, page

93, Great Meeting of Nippon Nogei-agaku Kai de 1982).

mg de cet échantillon authentique ont été dissous dans 10 ml de tampon au phosphate de potassium

0,1M (pH 7,0) (35 unités/ml).

(3) Solution de chlorestérol oxydase: On a cultivé Agrocybe pediades K-1 (déposé sous la référence FERM-P N 4343) dans un milieu contenant de l'amidon soluble, de l'huile de soja, de la peptone, etc. pour obtenir un filtrat de culture contenant une activité en cholestérol oxydase. Ce filtrat de culture a été soumis successivement à une chromatographie sur colonne de Amberlite CG-50, une ultrafiltration, une chromatographie sur colonne de "DEAE-Sephadex", une chromatographie sur colonne de "SPSephadex" et une chromatographie sur colonne de "Sephadex G-100" pour obtenir un échantillon authentique de l'enzyme purifié (15 unités/mg)( par la méthode décrite dans Collection of Summaries of Lectures, page 99, Great Meeting of Nippon Nogei-kagaku Kai de 1978). On a dissous 10 mg de cet échantillon authentique dans 5 ml de tampon au

phosphate de potassium 0,1M (pH 7,0) (30 unités/ml).

(4) Mode opératoire: On a ajouté dans un tube à essai 0,1 ml de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle (0,02 unité), 1 ml de tampon au phosphate de potassium 0,3M (pH 7,0), 0,3 ml de solution à 3% de "Triton X-100", 0, 02 ml de

Control Serum (produit de la firme Hyland Co., Etats -

Unis d'Amérique) et 0,02 ml de bilirubine liée à l'albumi-

ne à 20 mg/dl (produit de la firme Daiichi Kagaku Yakukin Co.) et on a conduit la réaction sous agitation par secousses dans un incubateur à température constante (37 C) pendant 20 minutes. Ensuite, on a ajouté 0,3 ml d'azoture de sodium 50 mM, 0,3 ml du réactif coloré, 0,1 ml de solution de cholestérol estérase, 0,1 ml de solution de cholestérol oxydase et 0,76 ml d'eau distillée et,après avoir conduit la réaction pendant 5 minutes, on a effectué une mesure d'absorption à 500 nl. En opérant

séparément, on a conduit les essais témoins sans traite-

ment à la bilirubine oxydase M-1 nouvelle et sans addition de bilirubine liée à l'albumine, respectivement, afin

de mesurer l'absorption. Par les moyens décrits ci-

dessus, on a examiné l'élimination de l'interférence par développement de couleur de la bilirubine dans une épreuve de dosage du cholestérol total dans du sérum

sanguin en utilisant l'enzyme de la présente invention.

Les résultats sont reproduits sur le tableau V.

TABLEAU V

DO500 nm Pourcentage (%) Pas d'addition de bilirubine 0,160 100 liée à l'albumine Bilirubine oxydase M-1 nouvelle pas de traitement 0,127 79,4 traitement pendant 20 min. 0,158 98,8 Comme le fait apparaître le tableau V, en utilisant la méthode de la présente invention, il est devenu possible d'éliminer l'interférence de la part de la bilirubine pour obtenir ainsi la valeur précise

du cholestérol total dans le sérum sanguin.

Exemple 6

Elimination de l'interférence de la bilirubine dans une épreuve de dosage du cholestérol

total dans le sérum sanguin (effet du désoxy-

cholate de sodium) (1) Réactif coloré: On a utilisé le réactif coloré de l'exemple 5. (2) Solution de cholestérol estérase et solution de de cholestérol oxydase: On a utilisé les solutions d'enzymes de

l'exemple 5.

(3) Mode opératoire: On introduit dans un tube à essai 0,1 ml de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle (0,002 unité), 1,0 ml de tampon au phosphate de potassium 0,3M (pH 7,0), 0,02 ml de Control Serum (produit de la firme

Hyland Co., des Etats-Unis d'Amérique), 0,02 ml de biliru-

bine liée à l'albumine à 20 mg/dl (produit de la firme Daiichi Kagaku Yakuhin Co.), 0,25 ml de désoxycholate de sodium à 1,2% et 0,11 ml d'eau distillée, et on a conduit la réaction sous agitation par secousses dans un incubateur à température constante (37 C) pendant minutes. Ensuite, on a ajouté 0,3 ml de solution à 3% de "Triton X-100", 0,3 ml d'azoture de sodium 50 mM, 0,3 ml de réactif coloré, 0,1 ml de solution de cholestérol estérase, 0,1 ml de solution de cholestérol oxydase et 0,4 ml d'eau distillée et,après avoir conduit la réaction pendant 5 minutes, on a effectué une mesure d'absorption à 500 nm. En opérant séparément, on a conduit des essais témoins respectivement sans traitement avec la bilirubine oxydase M-1 nouvelle et sans addition

de bilirubine liée à l'albumine, afin de mesurer l'absorp-

tion. On a examiné par les moyens décrits ci-dessus

l'effet du désoxycholate de sodium pour éliminer l'inter-

férence de la bilirubine dans le développement de couleur dans une épreuve de dosage du cholestérol total dans le sérum sanguin. Les résultats sont reproduits sur

le tableau VI.

TABLEAU VI

DO 500 n Pourcentage (%) D500 nm

Pas d'addition de biliru-

bine liée à l'albumine 0,159 100 Bilirubine oxydaze M-1 nouvelle Pas de traitement 0,126 79,2 Traitement pendant 10 min. 0,158 99,4 Gomme le fait apparaître le tableau VI, en utilisant le désoxycholate de sodium pour éliminer l'interférence de la bilirubine, il est devenu possible

de réduire la quantité d'enzyme utilisée dans le pré-

traitement et aussi de raccourcir la durée du pré-traitement.

Exemple 7

Elimination de l'interférence de la bilirubine dans une épreuve de dosage du glucose dans le sérum sanguin (1) Réactif coloré: On a utilisé le réactif coloré de l'exemple 5. (2) Solution de glucose oxydase: On a dissous 20 mg de glucose oxydase (produit de la firme TOYOBO Co.; 100 unités/mg) dans 2 ml de tampon au phosphate de potassium 0,1M (pH 7,0) (1000 unités/ml). (3) Mode opératoire: On a introduit dans un tube à essai 0,1 ml de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle (0,02 unité), 1 ml de tampon au phosphate de potassium 0,3M (pH 7,0), 0,02 ml de "Control Serum" (produit de la firme Hyland Go., des Etats-Unis d'Amérique) et 0, 02 ml de bilirubine liée à l'albumine à 20 mg/dl (produit de la firme Daiichi Kagaku Yakuhin Co.) et on a conduit la réaction en agitant par secousses dans un incubateur à température constante (37 C) pendant 20 minutes. Ensuite, on a ajouté 0,3 ml d'azoture de sodium 50 mM, 0,3 ml du réactif coloré, 0,1 ml de solution de glucose oxydase et 1,16 ml d'eau distillée et après avoir conduit la réaction pendant minutes, on a effectué une mesure de l'absorption à 500 nm. En opérant séparément, on a effectué des essais témoins respectifs sans traitement à la bilirubine oxydase

M-1 nouvelle et sans addition de bilirubine liée à l'albu-

mine, pour mesurer l'absorption. Par les moyens décrits ci-dessus, on a examiné l'élimination de l'interférence de la bilirubine dans le développement de couleur dans une épreuve de dosage du glucose dans le sérum sanguin en utilisant l'enzyme de la présente invention. Les

résultats sont reproduits sur le tableau VII.

TABLEAU VII

DO500 nm Pourcentage (%)

Pas d'addition de biliru-

bine liée à l'albumine 0,193 100 Bilirubine oxydase M-1 nouvelle Pas de traitement 0,148 76,7 Traitement pendant 20 min. 0,192 99,5 Comme le fait apparaître le tableau VII, il est devenu possible,en utilisant la méthode de la présente invention, d'éliminer l'interférence de la bilirubine, ce qui a permis d'obtenir une valeur précise

du taux de glucose dans le sérum sanguin.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Bilirubine oxydase M-1 nouvelle, caractéri-

sée en ce qu'elle possède les propriétés physicochimiques suivantes: (1) Action: Agit en oxydant la bilirubine en présence d'oxygène jusqu'à la formation d'une substance presque incolore en passant par la biliverdine puis par une substance

violet pâle, mais ne forme pas de peroxyde d'hydrogène.

(2) Spécificité envers le substrat: Agit sur la bilirubi-

ne et a un certain degré sur la biliverdine de même

que sur le phénol, le catéchol et l'hydroquinone.

(3) pH optimal et stabilité au pH: a un pH optimal au voisinage de 5,5 et est stable entre pH 5 et pH 9 pendant un traitement de 60 minutes à 37 Co (4) Température optimale et stabilité thermique: a une température optimale au voisinage de 50 C et est stable jusqu'à 55 C pendant 10 minutes de traitement

à pH 7,0.

(5) Poids moléculaire: environ 83 000 (méthode de filtra-

tion sur gel).

(6) Point isoélectrique: 3,92 + 0,05 (7) Agent interférant: inhibé par l'azoture de sodium, l'acide L-ascorbique, le dithiothréitol et le cyanure

de potassium.

(8) Spectre d'absorption visible: a un maximum d'absorp-

tion au voisinage de 610 nm.

(9) Teneur en sucre: contient environ 4,5% de sucre (10) Teneur en cuivre: contient 4 moles de cuivre par mole. 2. Composition réactive pour la bilirubine, caractérisée en ce qu'elle contient la bilirubine oxydase

M-1 nouvelle.

3. Composition réactive pour la bilirubine suivant la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle

contient un sel d'acide désoxycholique.

4. Méthode de dosage quantitatif de la biliru-

bine, caractérisée en ce qu'une composition réactive

pour la bilirubine contenant la bilirubine oxydase M-

1 nouvelle est amenée à agir sur une solution à analyser contenant de la bilirubine et une variation de la teneur

en bilirubine ainsi provoquée est mesurée par colorimétrie.

5. Méthode suivant la revendication 4, carac- térisée en ce que ladite composition contient un sel

d'acide désoxycholique.

6. Méthode de dosage quantitatif de la biliru-

bine, caractérisée en ce que de la 3-méthyl-2-benzothiazo-

linone-hydrazone et une composition réactive pour la bilirubine contenant la bilirubine oxydase M-1 nouvelle sont ajoutées à une solution à analyser contenant de la bilirubine, la solution mixte est mise en réaction et, après acidification de la solution réactionnelle, la bilirubine est dosée quantitativement par la méthode colorimétrique.

7. Méthode analytique pour la recherche de composants autres que la bilirubine dans une solution à analyser contenant de la bilirubine, par l'utilisation

d'une réaction avec l'oxydase, la peroxydase et un chromo-

gène cédant de l'hydrogène, méthode dans laquelle la

bilirubine se comporte comme un agent interférant, carac-

térisée en ce qu'elle comprend (a) une étape dans laquelle une composition réactive pour la bilirubine contenant la bilirubine oxydase M- 1 nouvelle est amenée à agir sur la solution à analyser pour éliminer l'interférence de la part de la bilirubine co-existante et (b) une étape d'analyse du composant désiré présent dans la solution à analyser restante, une substance interférant pour la bilirubine M-1 nouvelle étant de préférence ajoutée après- que l'étape (a) a été accomplie, et

l'étape (b) est effectuée ensuite.

8. Méthode analytique suivant la revendication 7, caractérisée en ce que ladite composition contient

un sel d'acide désoxycholique.

9. Procédé de production de la bilirubine oxydase M-1 nouvelle, caractérisé en ce qu'une souche

255'5196

productrice de bilirubine oxydase M-1 nouvelle appartenant au genre Trachyderma est cultivée et la bilirubine oxydase

M-1 nouvelle produite est séparée du bouillon de culture.

10. Procédé suivant la revendication 9,

caractérisé en ce que ladite souche productrice de biliru-

bine oxydase M-1 nouvelle appartenant au genre Trachyderma

est Trachyderma tsunodae K-2593.