JPS59125899A - 酵素法による直接ビリルビン測定用試薬および測定法 - Google Patents
酵素法による直接ビリルビン測定用試薬および測定法Info
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- JPS59125899A JPS59125899A JP57230125A JP23012582A JPS59125899A JP S59125899 A JPS59125899 A JP S59125899A JP 57230125 A JP57230125 A JP 57230125A JP 23012582 A JP23012582 A JP 23012582A JP S59125899 A JPS59125899 A JP S59125899A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵素法による直接（抱合）型ビｌ） ）レビン
の測定用試薬ならびに測定法に関する。
の測定用試薬ならびに測定法に関する。
ビリルビンは生体内色素の代表的なもので主として老廃
赤血球の崩壊により生成される血色素より作られる。こ
の遊離型ビリルビンは蛋白結合型となったり、または肝
臓のミクロソームでビリルビンの抱合酵素によって抱合
型ビＩＪ ）レビンとなり、肝細胞より胆汁中に排泄さ
れ、さらに腸管内に移行する。腸管内に移行したビＩＪ
）レビンは一部吸収され腸および肝臓を循環するが大
部分はウロビリン体となって体外に排泄される。血清ビ
リルビンの」１昇は、この生成から排泄への流れに障害
または変化が生じたことによるもので、その上昇がひど
くなれは黄痘症状を起ず。したがって、血清ビリルビン
を測定することにより、例えは肝胆道系疾患などの診断
に利用でき、臨床上古くがら採用されている。
赤血球の崩壊により生成される血色素より作られる。こ
の遊離型ビリルビンは蛋白結合型となったり、または肝
臓のミクロソームでビリルビンの抱合酵素によって抱合
型ビＩＪ ）レビンとなり、肝細胞より胆汁中に排泄さ
れ、さらに腸管内に移行する。腸管内に移行したビＩＪ
）レビンは一部吸収され腸および肝臓を循環するが大
部分はウロビリン体となって体外に排泄される。血清ビ
リルビンの」１昇は、この生成から排泄への流れに障害
または変化が生じたことによるもので、その上昇がひど
くなれは黄痘症状を起ず。したがって、血清ビリルビン
を測定することにより、例えは肝胆道系疾患などの診断
に利用でき、臨床上古くがら採用されている。
ところで、ビリルビンには、上述したとおり、遊離型お
よび蛋白結合型（非抱合型または間接型ともいう）と直
接型（抱合型ともいう）とがあり、直接型ビリルビン（
以下、単に直接ビリルビンという）は遊離（間接）型ビ
リルビン（以下、間接ビリルビンという）の側鎖のプロ
ピオン基にグルクロン酸が結合したもので、１個のみ結
合したもの（モノグルクロナイド）と２個結合したもの
（ジグルクロナイド）の２種類がある。これら直接ビリ
ルビンと間接ビリルビンを合せて総ビリルビンと称して
いる。
よび蛋白結合型（非抱合型または間接型ともいう）と直
接型（抱合型ともいう）とがあり、直接型ビリルビン（
以下、単に直接ビリルビンという）は遊離（間接）型ビ
リルビン（以下、間接ビリルビンという）の側鎖のプロ
ピオン基にグルクロン酸が結合したもので、１個のみ結
合したもの（モノグルクロナイド）と２個結合したもの
（ジグルクロナイド）の２種類がある。これら直接ビリ
ルビンと間接ビリルビンを合せて総ビリルビンと称して
いる。
一般に臨床検査で測定されるビリルビンは総ビリルビン
と直接ビリルビンであり、間接パ１リルビンはこれらの
差として求められている。これら２つの型のビリルビン
と病態との関係は、例えば急性閉塞性黄痘では血中に直
接ビリルビン（ジグルクロナイド）が、肝実質性黄痘（
肝細胞の破壊）では直接ビリルビン（モノグルクロナイ
ド）が、また溶血性黄痘では間接ビリルビンが増加する
。
と直接ビリルビンであり、間接パ１リルビンはこれらの
差として求められている。これら２つの型のビリルビン
と病態との関係は、例えば急性閉塞性黄痘では血中に直
接ビリルビン（ジグルクロナイド）が、肝実質性黄痘（
肝細胞の破壊）では直接ビリルビン（モノグルクロナイ
ド）が、また溶血性黄痘では間接ビリルビンが増加する
。
このように、例えは黄痕の鑑別診断の指標としても総ビ
リルビンとともに直接ビリルビンの測定が不可欠である
。
リルビンとともに直接ビリルビンの測定が不可欠である
。
従来技術
このような血清ビリルビンの測定法としては、一般に、
エヘリンーマロイ（Ｅｖｅｌｙｎ−Ｍａｌｌｏｙ）らに
よるジアゾ試薬による比色法−が採用されているが、こ
の方法では直接ビリルビンのうちジグルクロナイドはジ
アゾ反応が速やかに進行しくそのため、このものを１分
ビリルビンとも称す）、一方モノグルクロナイドは反応
が遅く（そのため遅延直接反応ビリルビンとも呼ばれる
）、そのためジアゾ反応時間を正確に規定しないと直接
ビリルビンの正確かつ精密な測定ができない欠点を有し
ている。
エヘリンーマロイ（Ｅｖｅｌｙｎ−Ｍａｌｌｏｙ）らに
よるジアゾ試薬による比色法−が採用されているが、こ
の方法では直接ビリルビンのうちジグルクロナイドはジ
アゾ反応が速やかに進行しくそのため、このものを１分
ビリルビンとも称す）、一方モノグルクロナイドは反応
が遅く（そのため遅延直接反応ビリルビンとも呼ばれる
）、そのためジアゾ反応時間を正確に規定しないと直接
ビリルビンの正確かつ精密な測定ができない欠点を有し
ている。
最近、酵素を用いたビリルビンの測定法が開発され、例
えば、ヤコブソンらによる過酸化水素とパーオキシダー
ゼによる方法〔Ｊａｃｏｂｓｏｎ、Ｇ、 ＆Ｗｅｎｎｂ
ｅｒｇ、Ｒ，Ｐ＋、ＣＩ ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、 ２０
、７８３ （１９７４）を参照〕、タイ−ウィン・つら
によるきのこ由来のビリルビンオキシダーゼを用いるビ
リルビンの黄色色調の減少を測定する方法（特開昭５６
−２７６５６号）があり、さらに村尾らはビリルビンオ
キシダーゼがミロセシウム属（ＭｙｒｏＬｈｅｃｉｕｍ
）の微生物より得られることを報告しティる（Ｍｕｒａ
ｏ、Ｓ、＆ Ｔａｎａｋａ、 Ｎ、、 Ａｇｒｉｃａｌ
。
えば、ヤコブソンらによる過酸化水素とパーオキシダー
ゼによる方法〔Ｊａｃｏｂｓｏｎ、Ｇ、 ＆Ｗｅｎｎｂ
ｅｒｇ、Ｒ，Ｐ＋、ＣＩ ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、 ２０
、７８３ （１９７４）を参照〕、タイ−ウィン・つら
によるきのこ由来のビリルビンオキシダーゼを用いるビ
リルビンの黄色色調の減少を測定する方法（特開昭５６
−２７６５６号）があり、さらに村尾らはビリルビンオ
キシダーゼがミロセシウム属（ＭｙｒｏＬｈｅｃｉｕｍ
）の微生物より得られることを報告しティる（Ｍｕｒａ
ｏ、Ｓ、＆ Ｔａｎａｋａ、 Ｎ、、 Ａｇｒｉｃａｌ
。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 −４５、２３８３（１９８１
）および特開昭５７−１５９４８７号を参照〕。
）および特開昭５７−１５９４８７号を参照〕。
このような酵素法はビリルビン測定の正確性、分析精度
などの点で優れたものではあるが、これでは一般に総ビ
リルビンのみを測定しており、直接ビリルビンは測定で
きていない。この酵素法による直接ビリルビンの測定に
関（−１高阪らは、上記村尾らによるミロセシウム属由
来めゼリルビンオキシダーゼを用い、ｐＨ８，６にてド
°デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはコール酸ナト
リウムの存在下または不存在下に反応させてそれぞれ総
ビリルビンと直接ビリルビンを測定し得たと報告してい
る〔高阪彰ら、臨床病理、−夫」−〔補則〕、１２３（
１９８２）を参照〕。しかしながら、この方法による直
接ビリルビン測定はビリルビンオキシダーゼが蛋白結合
型ビリルビンには全く作用しないことに基づいているが
、本発明者らの追試によれは全く作用しないとはいい難
い。
などの点で優れたものではあるが、これでは一般に総ビ
リルビンのみを測定しており、直接ビリルビンは測定で
きていない。この酵素法による直接ビリルビンの測定に
関（−１高阪らは、上記村尾らによるミロセシウム属由
来めゼリルビンオキシダーゼを用い、ｐＨ８，６にてド
°デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはコール酸ナト
リウムの存在下または不存在下に反応させてそれぞれ総
ビリルビンと直接ビリルビンを測定し得たと報告してい
る〔高阪彰ら、臨床病理、−夫」−〔補則〕、１２３（
１９８２）を参照〕。しかしながら、この方法による直
接ビリルビン測定はビリルビンオキシダーゼが蛋白結合
型ビリルビンには全く作用しないことに基づいているが
、本発明者らの追試によれは全く作用しないとはいい難
い。
発明の目的
上記のような事情のもとに、本発明者らは、酵素、とく
にミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼを用い
て直接ビリルビンを正確かつ効率的に測定する方法を見
い出すべく種々研究を重ねり結果、このビリルビンオキ
シダーゼの至適ｐＨは８０付近にあるが、これを低ｐＨ
領域、ことにｐｉ−１３，５〜４．５の範囲で反応させ
ることにより所望の直接ビリルビンが測定し得ることを
見い出し、本発明を完成するに到った。
にミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼを用い
て直接ビリルビンを正確かつ効率的に測定する方法を見
い出すべく種々研究を重ねり結果、このビリルビンオキ
シダーゼの至適ｐＨは８０付近にあるが、これを低ｐＨ
領域、ことにｐｉ−１３，５〜４．５の範囲で反応させ
ることにより所望の直接ビリルビンが測定し得ることを
見い出し、本発明を完成するに到った。
すｔ工わち、本発明は、ビリルビンオキシダーゼ、こと
にミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼを用い
た酵素法による直接ビリルビンの測定法ならびにその測
定用試薬を提供するものである。
にミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼを用い
た酵素法による直接ビリルビンの測定法ならびにその測
定用試薬を提供するものである。
発明の構成および効果
本発明による直接ビリルビンの測定は、ビリルビン含有
検体にビリルビンオキシダーゼを作用させて黄色のビリ
ルビンを酸化して緑色のビリベルジンに変換させ、それ
によるビリルビンの黄色の減少を比色法にて測定するこ
とにより行なわれ、その際、ｐＨ値を３．５〜４５に調
節することにより遊離型である間接ビリルビンは反応せ
づ”、抱合型の直接ビリルビンのみがはゾ完全に酸化さ
れるため、その比色定量により直接ビリルビンを高精度
にて直接測定し得る。
検体にビリルビンオキシダーゼを作用させて黄色のビリ
ルビンを酸化して緑色のビリベルジンに変換させ、それ
によるビリルビンの黄色の減少を比色法にて測定するこ
とにより行なわれ、その際、ｐＨ値を３．５〜４５に調
節することにより遊離型である間接ビリルビンは反応せ
づ”、抱合型の直接ビリルビンのみがはゾ完全に酸化さ
れるため、その比色定量により直接ビリルビンを高精度
にて直接測定し得る。
本発明による直接ビリルビンの測定には、ビリルビンオ
キシダーゼを所定のｐ Ｈ値、すなわちＰｔ１．３．５
〜４．５、好ましくは約４０にある緩衝液に溶解させ、
これにビリルビン含有の血清検体を反応させたのち常法
により比色定量する。この反応は通常の条件下に行なわ
れ、例えは温度２５〜４５°Ｃ１好ましくは３７°Ｃに
て、１０〜３０分間、好ましくは１５分間程度行なう。
キシダーゼを所定のｐ Ｈ値、すなわちＰｔ１．３．５
〜４．５、好ましくは約４０にある緩衝液に溶解させ、
これにビリルビン含有の血清検体を反応させたのち常法
により比色定量する。この反応は通常の条件下に行なわ
れ、例えは温度２５〜４５°Ｃ１好ましくは３７°Ｃに
て、１０〜３０分間、好ましくは１５分間程度行なう。
用いられる緩衝液としてはｐＨ３，５〜４．５のもので
あればよく、例えばクエン酸−リン酸緩衝液、クエン酸
−酢酸緩衝液、クエン酸−クエン酸すトリウム緩衝液、
クエン酸−乳酸緩衝液、クエン酸−酒石酸緩衝液、酒石
酸−水酸化す） ＩＪウム緩衝液、酒石酸−乳酸緩衝液
、酒石酸−リン酸緩衝液などが挙けられる。これに配合
するビリルビンオキシダーゼは、通常、１〜１０単位／
テスト、好ましくは２〜５単位／テストの用量で用いら
れる。
あればよく、例えばクエン酸−リン酸緩衝液、クエン酸
−酢酸緩衝液、クエン酸−クエン酸すトリウム緩衝液、
クエン酸−乳酸緩衝液、クエン酸−酒石酸緩衝液、酒石
酸−水酸化す） ＩＪウム緩衝液、酒石酸−乳酸緩衝液
、酒石酸−リン酸緩衝液などが挙けられる。これに配合
するビリルビンオキシダーゼは、通常、１〜１０単位／
テスト、好ましくは２〜５単位／テストの用量で用いら
れる。
なお本発明者らの研究ｌこよれば、フェリシアン化カリ
ウムの併用によりビリルビンオキシダーゼの用量を低減
することができることを見い出しており、例えばフェリ
シアン化カリウム１０〜５００μＭ／テストを併用すれ
ばビリルビンオキシダーゼの用量を０．０２５〜１単位
／テストとすることができる。
ウムの併用によりビリルビンオキシダーゼの用量を低減
することができることを見い出しており、例えばフェリ
シアン化カリウム１０〜５００μＭ／テストを併用すれ
ばビリルビンオキシダーゼの用量を０．０２５〜１単位
／テストとすることができる。
比色量１１′Ｃは常法によって行なわれ、例えは、市販
の分光范度計（例えは島津２２０型ダブルビーム分光光
度計）を用い、波長４６ ＯｎＩｎにて精製水を対照に
して光学的密度を測定する。なお、この際、対照として
一定量（既知濃度）の直接ビリルビン含有血清（以下、
標準ビリルビンという）を用いて同様に光学的密度を測
定し、さらに盲検としてこれら検体血清および標準ピリ
ル゛ビンにビリルビンオキシダーゼを含まない緩衝液を
添加したものについて同様に光学的密度を測定し、これ
らのデータに基づいて下記式により検体血清中の直接ビ
リルビン濃度（ｍｇ／ｄ７？＞ を算出する。
の分光范度計（例えは島津２２０型ダブルビーム分光光
度計）を用い、波長４６ ＯｎＩｎにて精製水を対照に
して光学的密度を測定する。なお、この際、対照として
一定量（既知濃度）の直接ビリルビン含有血清（以下、
標準ビリルビンという）を用いて同様に光学的密度を測
定し、さらに盲検としてこれら検体血清および標準ピリ
ル゛ビンにビリルビンオキシダーゼを含まない緩衝液を
添加したものについて同様に光学的密度を測定し、これ
らのデータに基づいて下記式により検体血清中の直接ビ
リルビン濃度（ｍｇ／ｄ７？＞ を算出する。
ヱい１コ、ＡＢ：検体血清の光学的密度（盲検）ＡＴ：
検体血清の光学的密度（酵素反応したもの）ＡＳＢ
： 標準ビリルビンの光学的密度（盲検）ＡＳＴ： 標
準ビリルビンの光学的密度（酵素反応したもの） Ｘ ： 標準ビリルビン中の直接ビリルビン濃度（ｍＶ
ｄｅ）上記測定操作をさらに具体的に説明す−ると、検
体盲検として検体血清に緩衝液（例えば１００ｍＭクエ
ン酸−リン酸緩衝液（’ｐａ１４．０ ）を加え、これ
をインキュベートしく例えば３７°Ｃ１１５分間）、こ
の溶液について精製水を対照にして４６０ ｎＩｎの光
学的密度（Ａ−Ｂ）を測定する。一方、検体血清に、」
−記と同じ緩衝液に所定単位のビリルビンオキシダーゼ
を溶かした酵素試液を加えて同様にインキュベートした
のち、同様に精製水を対照にして４６０ ｎｍの光学的
密度（ＡＴ）を測定する。さらに標準および標準盲検と
して、検体血清の代りに標準ビリルビンを用い、上記′
と同様に緩衝液および酵素試薬を加えて、それぞれイン
キュベートしたのち、各溶液について精製水を対照にし
てそれぞれの光学的密度（ＡＳＢおよびＡＳＴ）を測定
する。
検体血清の光学的密度（酵素反応したもの）ＡＳＢ
： 標準ビリルビンの光学的密度（盲検）ＡＳＴ： 標
準ビリルビンの光学的密度（酵素反応したもの） Ｘ ： 標準ビリルビン中の直接ビリルビン濃度（ｍＶ
ｄｅ）上記測定操作をさらに具体的に説明す−ると、検
体盲検として検体血清に緩衝液（例えば１００ｍＭクエ
ン酸−リン酸緩衝液（’ｐａ１４．０ ）を加え、これ
をインキュベートしく例えば３７°Ｃ１１５分間）、こ
の溶液について精製水を対照にして４６０ ｎＩｎの光
学的密度（Ａ−Ｂ）を測定する。一方、検体血清に、」
−記と同じ緩衝液に所定単位のビリルビンオキシダーゼ
を溶かした酵素試液を加えて同様にインキュベートした
のち、同様に精製水を対照にして４６０ ｎｍの光学的
密度（ＡＴ）を測定する。さらに標準および標準盲検と
して、検体血清の代りに標準ビリルビンを用い、上記′
と同様に緩衝液および酵素試薬を加えて、それぞれイン
キュベートしたのち、各溶液について精製水を対照にし
てそれぞれの光学的密度（ＡＳＢおよびＡＳＴ）を測定
する。
本発明の直接ビリルビン測定用試薬は、通常、（ｉ）ビ
リルビンオキシダーゼを含まない緩衝液、Φ）ビリルビ
ンオキシダーゼ含有酵素試薬、および （ｉｉ）−宙吊（既知濃度）の直接ビリルビン含有血清
（標準ビリルビン） からなるキットとして構成される。
リルビンオキシダーゼを含まない緩衝液、Φ）ビリルビ
ンオキシダーゼ含有酵素試薬、および （ｉｉ）−宙吊（既知濃度）の直接ビリルビン含有血清
（標準ビリルビン） からなるキットとして構成される。
つぎに本発明による直接ビリルビン測定効果を調べるた
めに、各種ｐＨ領域でのビリルビンの測定を行なった。
めに、各種ｐＨ領域でのビリルビンの測定を行なった。
実験
酵素、試薬および分析機器：
ビリルビンオキシダーゼとしてミ、ロセシウム属由来の
ビリルビンオキシダーゼ（大野製薬社製）〔以下、Ｂｏ
ｘと略称する〕を用い、緩衝液として、１００ ｍＭク
エン酸−リン酸緩衝液（ｐ［１３，０〜６．０）、１０
０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５。
ビリルビンオキシダーゼ（大野製薬社製）〔以下、Ｂｏ
ｘと略称する〕を用い、緩衝液として、１００ ｍＭク
エン酸−リン酸緩衝液（ｐ［１３，０〜６．０）、１０
０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５。
６．８ 、７．０ 、７．２オヨヒ’７．５ ）、１０
０ｍＭ）’Ｊス塩酸緩衝液（ｐｆｌ ８．０ 、８．５
および９ｏ）、１００ｍ〜■炭酸緩衝液（ｐＨ９，５お
よび１０．０）を用いた。直接ビリルビンを含むコント
ロール血清としてビリルビンコントロール血清（ハイラ
ンド社製）、さらにビリルビン標品として粉末ビリルビ
ン（ＩＣＮ社製）を用いた。
０ｍＭ）’Ｊス塩酸緩衝液（ｐｆｌ ８．０ 、８．５
および９ｏ）、１００ｍ〜■炭酸緩衝液（ｐＨ９，５お
よび１０．０）を用いた。直接ビリルビンを含むコント
ロール血清としてビリルビンコントロール血清（ハイラ
ンド社製）、さらにビリルビン標品として粉末ビリルビ
ン（ＩＣＮ社製）を用いた。
分析用機器として島津２２０型ダブルビーム分光光度計
を用いた。
を用いた。
方法：
前記の各種緩衝液にビリルビンコントロール血清を加え
、これにＢｏｘを加えて３７°Ｃで反応させ、４６００
ｍにて光学的密度の変化を測定した。
、これにＢｏｘを加えて３７°Ｃで反応させ、４６００
ｍにて光学的密度の変化を測定した。
試験したビリルビンが直接型か間接型かを知るには以下
の方法を行なう。
の方法を行なう。
ビリルビンコントロール血清をクロロホルムで処理して
間接ビリルビンを除去し、残存するビリルビンにＢｏｘ
を作用させる。また真鯛の方法（真鯛幸男、医学と生物
学、７８．’７３（１９６９）を参照）の変法にてビリ
ルビンを分画し、各ビリルビン画分に対するＢｏｘの反
応性を調べる。さらにミカｊ−ルソンらの方法［Ｍｉｃ
ｈａｅｌｓｓｏｎ、Ｍ：５ｃａｎ。
間接ビリルビンを除去し、残存するビリルビンにＢｏｘ
を作用させる。また真鯛の方法（真鯛幸男、医学と生物
学、７８．’７３（１９６９）を参照）の変法にてビリ
ルビンを分画し、各ビリルビン画分に対するＢｏｘの反
応性を調べる。さらにミカｊ−ルソンらの方法［Ｍｉｃ
ｈａｅｌｓｓｏｎ、Ｍ：５ｃａｎ。
Ｊ、Ｃｌ１ｎ、ＬａＩ３．Ｉｎｖｅｓｔ、、５ｕｐｐｌ
、、５６（１９５１）’：１の変法にて総ビリルビンお
よび直接ビリルビンを測定する。
、、５６（１９５１）’：１の変法にて総ビリルビンお
よび直接ビリルビンを測定する。
なお、間接ビリルビンに対するＢＯＸの反応性は５係ア
ルブミン液に粉末ビリルビンを添加し、これにＢｏｘを
作用させての酸化反応を調べる。
ルブミン液に粉末ビリルビンを添加し、これにＢｏｘを
作用させての酸化反応を調べる。
実験１ （ｐＩｌとＢｏｘの反応性との関係）上記各
種ｐＨ域の緩衝液を用い、ビリルビンとｌ５ｏｘとの反
応を行なった。その結果、ｐｌ−１３，Ｑ〜３５未満で
は酸化反応がほとんど進行せず、これはＢｏｘが活性を
示すｐｔｌ領域から外れているものと解される。一方、
ｐｔｌ ５．＜）〜１００の間では反応は連続的に徐々
に進み、時間と程度に若干の差が認められるが、最終的
には全てのビリルビンが酸化され、直接、間接の区別な
くビリルビンにｌ５ｏｘが反応するものと認められる。
種ｐＨ域の緩衝液を用い、ビリルビンとｌ５ｏｘとの反
応を行なった。その結果、ｐｌ−１３，Ｑ〜３５未満で
は酸化反応がほとんど進行せず、これはＢｏｘが活性を
示すｐｔｌ領域から外れているものと解される。一方、
ｐｔｌ ５．＜）〜１００の間では反応は連続的に徐々
に進み、時間と程度に若干の差が認められるが、最終的
には全てのビリルビンが酸化され、直接、間接の区別な
くビリルビンにｌ５ｏｘが反応するものと認められる。
これに対し、ｐＨ３，５〜４．５の領域では反応は比較
的速やかに進行するが、ある程度のところで完結し、そ
れ以上時間をかけてもその平衡状態になったところで止
まり、それ以上１３ｏｘを添加しても反応は全く進行し
ない。例えば、ビリルビン１８１１１９／ｄ７？を含む
検体血清にＢＯＸ２単位／テストを含むクエン酸−リン
酸緩衝液（ｐｌ−１４，０）を加えて３７°Ｃで反応さ
せたときの光学的密度と時間の関係をグラフで表わすと
第１図のとおりである。
的速やかに進行するが、ある程度のところで完結し、そ
れ以上時間をかけてもその平衡状態になったところで止
まり、それ以上１３ｏｘを添加しても反応は全く進行し
ない。例えば、ビリルビン１８１１１９／ｄ７？を含む
検体血清にＢＯＸ２単位／テストを含むクエン酸−リン
酸緩衝液（ｐｌ−１４，０）を加えて３７°Ｃで反応さ
せたときの光学的密度と時間の関係をグラフで表わすと
第１図のとおりである。
第１図中、実線は盲検の場合（Ｉ３ｏＸ′を含まない緩
衝液を加えて同様に処理したもの）で、点線が該Ｂｏｘ
と反応させた場合を示す。第１図に示すように、ｐｆｌ
４．０ 、＋ごてＢｏｘを反応させた場合には約２０
分後にはゾ平衡となり、これに１３ｏｘを追加してもそ
の平衡状態は変化しない。ところがこれにｌ Ｎ Ｎａ
ＱＨを添加して反応液のｐｉ−Ｉを６．５に上げると直
ちに反応が開始され、約１０分後には残っていたビリル
ビンは完全に酸化される。
衝液を加えて同様に処理したもの）で、点線が該Ｂｏｘ
と反応させた場合を示す。第１図に示すように、ｐｆｌ
４．０ 、＋ごてＢｏｘを反応させた場合には約２０
分後にはゾ平衡となり、これに１３ｏｘを追加してもそ
の平衡状態は変化しない。ところがこれにｌ Ｎ Ｎａ
ＱＨを添加して反応液のｐｉ−Ｉを６．５に上げると直
ちに反応が開始され、約１０分後には残っていたビリル
ビンは完全に酸化される。
実験２ （＋）ＩＩ３．５〜４．５で酸化されるビリ
ルビンの化学型） 上記実験１においてｐｉ−Ｉ３．５〜４．５でＢｏｘに
より酸化されたビリルビンがいかなる化学型のものであ
るかを調べるために、直接ビリルビンと間接ビリルビン
の水とクロロホルムに対する分配を利用して両者を分け
、その水層部ビリルビン（すなわち直接ビリルビン）に
対するＩλｏｘの反応性を調べた。
ルビンの化学型） 上記実験１においてｐｉ−Ｉ３．５〜４．５でＢｏｘに
より酸化されたビリルビンがいかなる化学型のものであ
るかを調べるために、直接ビリルビンと間接ビリルビン
の水とクロロホルムに対する分配を利用して両者を分け
、その水層部ビリルビン（すなわち直接ビリルビン）に
対するＩλｏｘの反応性を調べた。
すなわち、復水したビリルビンコントロール血清を５倍
量のクロロホルムで処理してビリルビンを分配させ、水
層部をさらにクロロポルムで処理して水層部から間接ビ
リルビンを完全に除去したのち、この水層部を１００ｍ
Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ＰＨ４，０）と１００ｍＭ
リン酸緩衝液（ＰＨ６，８）に加え、各々Ｂｏｘを作用
させた。対照として、クロロホルムで処理しないビリル
ビンコントロール血清を同様に反応させた。これらの反
応液について４６００ｍにおける光学的密度と反応時間
との関係をグラフで示すと第２図のとおりである。第２
図中、実線はクロロポルム無処理の場合、点線はクロロ
ホルム処理の場合を示す。
量のクロロホルムで処理してビリルビンを分配させ、水
層部をさらにクロロポルムで処理して水層部から間接ビ
リルビンを完全に除去したのち、この水層部を１００ｍ
Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ＰＨ４，０）と１００ｍＭ
リン酸緩衝液（ＰＨ６，８）に加え、各々Ｂｏｘを作用
させた。対照として、クロロホルムで処理しないビリル
ビンコントロール血清を同様に反応させた。これらの反
応液について４６００ｍにおける光学的密度と反応時間
との関係をグラフで示すと第２図のとおりである。第２
図中、実線はクロロポルム無処理の場合、点線はクロロ
ホルム処理の場合を示す。
第２図から明らかなように、り、ロロホルム無処理の場
合では、ＰＨ，４，’０でのＢｏｘの反応はｐＨ６，８
のものの約６０％であるのに対し、クロロホルム処理の
場合には、ｐＨ４，０もＰｉ−（６，８もはゾ同程度の
反応を示した。このことからｐｌ（４Ｑでは直接ビリル
ビンがほとんど完全にＢＯＸで酸化されていることが判
る。
合では、ＰＨ，４，’０でのＢｏｘの反応はｐＨ６，８
のものの約６０％であるのに対し、クロロホルム処理の
場合には、ｐＨ４，０もＰｉ−（６，８もはゾ同程度の
反応を示した。このことからｐｌ（４Ｑでは直接ビリル
ビンがほとんど完全にＢＯＸで酸化されていることが判
る。
実験３
上記実験２ではｐＨ４，０では直接ビリルビンがはゾ完
全に酸化されることが判ったが、間接ビリルビンは１３
ｏｘの改ｌＩ！１１ヲ受けるのか否かまたその程度につ
いてはかならずしも明らかでない。そこで、前記真鯛の
方法の変法にてビリルビンを分画し、蛋白結合型ビリル
ビン（間接ビリルビン）の画分工、グルクロン酸抱合型
ビリルビン（直接ビリルビン）の画分■、非抱合型ビリ
ルビン（間接ビリルビン）の両分Ｉｎならびにその他の
画分■に分け、これら各両分について、実験２と同様に
してｐＨ４，０およびｐＨ６，８にてＢｏｘと反応させ
た。その結果、ｐＨ５８ではいずれの画分ても反応が進
行したのに対し、ｐＨ４，０では画分■のみ反応し、他
の画分ては反応はほとんど進行しなかった。
全に酸化されることが判ったが、間接ビリルビンは１３
ｏｘの改ｌＩ！１１ヲ受けるのか否かまたその程度につ
いてはかならずしも明らかでない。そこで、前記真鯛の
方法の変法にてビリルビンを分画し、蛋白結合型ビリル
ビン（間接ビリルビン）の画分工、グルクロン酸抱合型
ビリルビン（直接ビリルビン）の画分■、非抱合型ビリ
ルビン（間接ビリルビン）の両分Ｉｎならびにその他の
画分■に分け、これら各両分について、実験２と同様に
してｐＨ４，０およびｐＨ６，８にてＢｏｘと反応させ
た。その結果、ｐＨ５８ではいずれの画分ても反応が進
行したのに対し、ｐＨ４，０では画分■のみ反応し、他
の画分ては反応はほとんど進行しなかった。
またほとんど間接ビリルビンから成ることが知られてい
る粉末ビリルビン（ＩＣＮ社製）についてｐＨ４，０に
て同様にＢＯＸを作用させたところ反応は全く起らなか
った。
る粉末ビリルビン（ＩＣＮ社製）についてｐＨ４，０に
て同様にＢＯＸを作用させたところ反応は全く起らなか
った。
実験４
前記実験２におけると同様にして各種濃度のビリルビン
を含む検体についてｐ Ｈ４，０にて、３７゜Ｃｌ２Ｏ
分間Ｂｏｘと反応させ、そ（７）４６００ｍでの光学的
密度と、別途、同検体について公知のジアゾ試薬（ビリ
ルビン−Ｎキット、日本商事（ハ）初を用いて測定した
直接ビリルビン濃度との相関々係をグラフに示すと第３
図のとおりとなり、はＮ′相関することが認められる。
を含む検体についてｐ Ｈ４，０にて、３７゜Ｃｌ２Ｏ
分間Ｂｏｘと反応させ、そ（７）４６００ｍでの光学的
密度と、別途、同検体について公知のジアゾ試薬（ビリ
ルビン−Ｎキット、日本商事（ハ）初を用いて測定した
直接ビリルビン濃度との相関々係をグラフに示すと第３
図のとおりとなり、はＮ′相関することが認められる。
上記実験から明らかなように、本発明によるビリルビン
オキシダーゼを用いてｐＨ３，５〜４．５の範囲で反応
させることにより直接ビリルビンのみが反応し、その光
学的密度を測定すれは、標準品との対比から容易に直接
ビリルビン濃度が測定されうる。
オキシダーゼを用いてｐＨ３，５〜４．５の範囲で反応
させることにより直接ビリルビンのみが反応し、その光
学的密度を測定すれは、標準品との対比から容易に直接
ビリルビン濃度が測定されうる。
実施例
つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的（こ説明す
る。
る。
実施例１
緩衝液：
１００ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐｌ−１３，５。
３．７，３．８，３．９，４．０，４．１，４．２．４
．３および４．５）、ならびに対照として１００ ｍＭ
＋）ン酸緩衝液（ｐＨ６，８）を用いる。
．３および４．５）、ならびに対照として１００ ｍＭ
＋）ン酸緩衝液（ｐＨ６，８）を用いる。
酵素反応液：
上記各緩衝液にミロ七゛シウム属由来のビリルビンオキ
シダーゼ（大野製薬社製）を２５単位今ストの割合で添
加して酵素反応液を調製する。
シダーゼ（大野製薬社製）を２５単位今ストの割合で添
加して酵素反応液を調製する。
標準ビリルビン：
８、０４ ｍＶｄ１の直接ビリルビンを含有する血清を
用いる。
用いる。
反応および結果。
ビリルビン含有検体血清１００μｌに各緩衝液３０−を
加え、３７°Ｃで１５分間インキュベートし、その反応
液−について島津゛２２０型ダブルビーム分光光度計を
用いて４６０１ｍにて精製水を対照にして光学的密度を
測定した。上記の方法を緩衝液の代りに酵素反応液を用
いて行ない、同様に光学的密度を測定した。さらに、上
記方法を検体血清の代りに標準ビリルビンを用いて行な
い、同様に光学的密度を測定した。
加え、３７°Ｃで１５分間インキュベートし、その反応
液−について島津゛２２０型ダブルビーム分光光度計を
用いて４６０１ｍにて精製水を対照にして光学的密度を
測定した。上記の方法を緩衝液の代りに酵素反応液を用
いて行ない、同様に光学的密度を測定した。さらに、上
記方法を検体血清の代りに標準ビリルビンを用いて行な
い、同様に光学的密度を測定した。
これらの結果を第１表に示す。またそれらのデータから
前記式（すにより直接ビリルビン濃度を算出し、合せて
表示する。
前記式（すにより直接ビリルビン濃度を算出し、合せて
表示する。
第 １ 表
実施例２
前記実施例１と同じ試液を用いてビリルビンコントロー
ルおよび患者血清についてそれぞれ実施例１の操作に従
２て連続１０回測定し、それぞれの光学的密度の差を求
めた。その結果を第２表に示す。この結果から明らかな
ように、良好な再現性を示しており、本発明方法の精度
の高いことが確認された。
ルおよび患者血清についてそれぞれ実施例１の操作に従
２て連続１０回測定し、それぞれの光学的密度の差を求
めた。その結果を第２表に示す。この結果から明らかな
ように、良好な再現性を示しており、本発明方法の精度
の高いことが確認された。
第 ２ 表
参考例 （検量線の作成〕
（１）試液の調製
緩衝液＝０１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（Ｐｆ（４，０
） 酵素反応液：０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４
，０）にミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼ
〔大野製薬社製〕を２５単＜ｕストの割合で添加して調
製する。
） 酵素反応液：０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４
，０）にミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼ
〔大野製薬社製〕を２５単＜ｕストの割合で添加して調
製する。
（２）標準血清の調製
ビリルビンコントロールを添付の溶解液でｍＨし、生理
食塩水で１／４ 、２／４ 、３／４ 、４／４に希釈
して調製する。
食塩水で１／４ 、２／４ 、３／４ 、４／４に希釈
して調製する。
（３）測定操作
試験管４本に上記各種濃度の標準血清各１００ ′
μｌをとり、これに上記酵素反応液３．０ ｍｌを加え
、３７°Ｇで１５分間反応させたのち、精製水を対照に
光学的密度〔Ｅｓｔ（Ｂ）〕を求めた。これらから各濃
度における標準血清の光学的密度の差△Ｅ４６ｏ 〔＝
Ｅ ｓ Ｌ （均Ｅ ｓ Ｌ ］を求め、検量線を作
成した。これを第４図に示す。これから明らかなように
、原点を通る直線が得られ、本発明方法の定量性が確認
された。
μｌをとり、これに上記酵素反応液３．０ ｍｌを加え
、３７°Ｇで１５分間反応させたのち、精製水を対照に
光学的密度〔Ｅｓｔ（Ｂ）〕を求めた。これらから各濃
度における標準血清の光学的密度の差△Ｅ４６ｏ 〔＝
Ｅ ｓ Ｌ （均Ｅ ｓ Ｌ ］を求め、検量線を作
成した。これを第４図に示す。これから明らかなように
、原点を通る直線が得られ、本発明方法の定量性が確認
された。
第１図はビリルビン含有検体血清にＰＩ−１４，０でビ
リルビンオキシダーゼを作用させた場合の反応液の光学
的密度と反応時間との関係を示したグラフ、第２図はビ
リルビン含有血清をクロロホルムで処理または非処理後
のビリルビンオキシダーゼによる作用をみた場−合の反
応液の光学的密度と反応時間との関係を示したグラフ、
第３図はビリルビンオキシダーゼ法によるビリルビン酸
化の場合の光学的密度と公知のジアゾ試薬により測定し
た一合のビリルビン濃度との相関関係を示すクラブ、＠
４図は本発明による直接ビリルビン測定における検量線
を示す。 特ｒ「出願人日本商事株式会社
リルビンオキシダーゼを作用させた場合の反応液の光学
的密度と反応時間との関係を示したグラフ、第２図はビ
リルビン含有血清をクロロホルムで処理または非処理後
のビリルビンオキシダーゼによる作用をみた場−合の反
応液の光学的密度と反応時間との関係を示したグラフ、
第３図はビリルビンオキシダーゼ法によるビリルビン酸
化の場合の光学的密度と公知のジアゾ試薬により測定し
た一合のビリルビン濃度との相関関係を示すクラブ、＠
４図は本発明による直接ビリルビン測定における検量線
を示す。 特ｒ「出願人日本商事株式会社
Claims (8)
- （１）ｐＨ３，５〜４．５の緩衝液にビリルビンオキシ
ダーゼを配合したことを特徴とする直接ビリルビン測定
用試薬。 - （２）ビリルビンオキシダーゼを１〜１０単位／テスト
配合した前記第（１）項の試薬。 - （３）ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属微生物
由来のビリルビンオキシダーゼである前記第（１）また
は（２）項の試薬。 - （４）該ビリルビンオキシダーゼ配合のｐｔＩ３．５〜
４．５の緩衝液を、ビリルビンオキシダーゼ無配合の同
緩衝液および既知濃度の直接ビリルビン含崩の標準ビリ
ルビンとのキットの形態とする前記第（１）〜（３）項
いずれか１つの試薬。 - （５）緩衝液のｐＨが約４．０である前記第（１）・〜
（４）項いずれか１つの試薬。 - （６）ビリルビン含有検体にｐｉ−１３，５〜４．５の
緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用させることを
特徴とする直接ビリルビンの測定法。 - （７）該緩衝液の・ｐＨが約４．０である前記第（６）
項の測定法。 - （８）該ビリルビンオキシダーゼによる反応を３７゜Ｃ
にて１０〜３０分間行ない、その反応液の４６Ｑ ｎｍ
での吸光度を測定する前記第（６）または（７）項の測
定法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57230125A JPS59125899A (ja) | 1982-12-29 | 1982-12-29 | 酵素法による直接ビリルビン測定用試薬および測定法 |
| US06/562,741 US4571383A (en) | 1982-12-29 | 1983-12-19 | Reagent for measuring direct bilirubin by enzymatic method and method for measurement thereof |
| DE8383112989T DE3367414D1 (en) | 1982-12-29 | 1983-12-22 | Reagent for measuring direct bilirubin by enzymatic method and method for measurement thereof |
| EP83112989A EP0114381B1 (en) | 1982-12-29 | 1983-12-22 | Reagent for measuring direct bilirubin by enzymatic method and method for measurement thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57230125A JPS59125899A (ja) | 1982-12-29 | 1982-12-29 | 酵素法による直接ビリルビン測定用試薬および測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59125899A true JPS59125899A (ja) | 1984-07-20 |
| JPS6144000B2 JPS6144000B2 (ja) | 1986-09-30 |
Family
ID=16902956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57230125A Granted JPS59125899A (ja) | 1982-12-29 | 1982-12-29 | 酵素法による直接ビリルビン測定用試薬および測定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4571383A (ja) |
| EP (1) | EP0114381B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59125899A (ja) |
| DE (1) | DE3367414D1 (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3249743C2 (ja) * | 1982-02-18 | 1990-10-04 | Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Nagoya, Aichi, Jp | |
| US4701411A (en) * | 1983-09-01 | 1987-10-20 | Eastman Kodak Company | Bilirubin-specific enzyme preparation, assay compositions, analytical elements and methods using same |
| US4600689A (en) * | 1983-11-21 | 1986-07-15 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Novel bilirubin oxidase, its production and use |
| WO1986000933A1 (en) * | 1984-07-28 | 1986-02-13 | Beckman Instruments, Inc. | Novel reagent and method employing same |
| DE3608453A1 (de) * | 1986-03-14 | 1987-09-17 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur enzymatischen bestimmung von bilirubin im serum |
| JP2578430B2 (ja) * | 1987-06-10 | 1997-02-05 | 旭化成工業株式会社 | 新規なビリルビン．オキシダーゼおよびその製造法 |
| US4937186A (en) * | 1988-01-28 | 1990-06-26 | Iqbal Siddiqi | Method for the determination of bilirubin in solution |
| JP2856757B2 (ja) * | 1989-03-13 | 1999-02-10 | ユニチカ株式会社 | 総ビリルビンの測定方法および測定用試薬 |
| JPH0771515B2 (ja) * | 1989-12-18 | 1995-08-02 | 日本商事株式会社 | ビリルビンの光学的測定法および測定用試薬 |
| JP3091094B2 (ja) * | 1993-12-28 | 2000-09-25 | ユニチカ株式会社 | 直接型ビリルビン測定用試薬 |
| JP3165654B2 (ja) * | 1996-03-22 | 2001-05-14 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | 対照血清及びカリブレーター中のビリルビンの安定化 |
| US20050249912A1 (en) * | 2004-05-06 | 2005-11-10 | C&A Floorcoverings, Inc. | Floor covering containing polyvinyl butyral and method of making same |
| US20050249911A1 (en) * | 2004-05-06 | 2005-11-10 | C&A Floorcoverings, Inc. | Polyvinyl butyral backed floor covering |
| EP2108703B1 (en) * | 2007-04-27 | 2012-08-08 | ARKRAY, Inc. | Method for bilirubin determination and analytical instrument used for bilirubin determination |
| CN103048282B (zh) * | 2012-10-26 | 2015-04-15 | 潍坊鑫泽生物科技有限公司 | 一种胆红素的检测方法及检测试剂盒 |
| EP2994759B1 (en) * | 2013-05-06 | 2018-09-12 | Bio-rad Laboratories, Inc. | Stabilization of labile analytes in reference materials |
| CN112710854B (zh) * | 2021-01-08 | 2021-11-23 | 中拓生物有限公司 | 一种抗干扰、稳定的血清总胆红素（酶法）测定试剂盒及其制备方法和应用 |
| CN114277088A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-04-05 | 深圳市锦瑞生物科技股份有限公司 | 一种总胆红素测定试剂、试剂球的制备方法及测定芯片 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4211844A (en) * | 1978-05-19 | 1980-07-08 | Eastman Kodak Company | Bilirubin-specific fungal enzyme preparation |
| DE3249743C2 (ja) * | 1982-02-18 | 1990-10-04 | Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Nagoya, Aichi, Jp |
-
1982
- 1982-12-29 JP JP57230125A patent/JPS59125899A/ja active Granted
-
1983
- 1983-12-19 US US06/562,741 patent/US4571383A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-22 EP EP83112989A patent/EP0114381B1/en not_active Expired
- 1983-12-22 DE DE8383112989T patent/DE3367414D1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0114381B1 (en) | 1986-11-05 |
| EP0114381A1 (en) | 1984-08-01 |
| JPS6144000B2 (ja) | 1986-09-30 |
| DE3367414D1 (en) | 1986-12-11 |
| US4571383A (en) | 1986-02-18 |
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