JP2856757B2 - 総ビリルビンの測定方法および測定用試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生体液中の各種ビリルビンの測定方法および
測定用試薬に関するものである。

（従来の技術） ビリルビンはテトラピロール類に属する黄色色素であ
り、生体液中では大別して非抱合型ビリルビン、抱合型
ビリルビンとして存在する。抱合型ビリルビンはグルク
ロン酸などの糖類がビリルビンのプロピオン酸基に１分
子または２分子結合したものである。非抱合型ビリルビ
ンは化学的に修飾を受けていないビリルビンである。

ところで、溶血性貧血、溶血性黄疽などの病態では主
に非抱合型ビリルビン量が増大し、また閉塞性黄疽など
の病態では、抱合型ビリルビン量が増大することが知ら
れている。従ってこれら各種のビリルビンの分別定量は
臨床診断などにおいて重要な位置を占めている。

各種のビリルビンを分別定量しうるものとしては、ジ
アゾ試薬を用いる方法、高速液体クロマトグラフィーを
利用する方法、ビリルビンオキシダーゼなどの酸化酵素
を利用する方法などが挙げられる。

このうちジアゾ試薬を用いる方法については、使用す
るジアゾ化反応促進剤の種類と、生成するアゾビリルビ
ンの定量方法の違いにより、種々のものが報告されてい
る。例えば代表的なものとしては、マロイとエヴェリン
（Malloy ＆ Evelyn）らによる試薬〔ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biologi
cal Chemistry）第119巻,481頁（1937年）〕などがあ
る。

高速液体クロマトグラフィーによって分画定量する方
法には、逆相のHPLCカラムを使用し各種ビリルビンをリ
ン酸緩衝液とイソプロパノールのグラジエントによって
溶出、分析するラウフ（Lauff）らの方法〔ジャーナル
オブ クロマトグラフィー（Journal of Chromatogra
phy）第226巻，第391頁（1981年）〕などがある。

酸化酵素を利用する方法は、酸化酵素を作用させるこ
とによってビリルビンを酸化し、ビリルビン自体の持つ
450nm付近の黄色を消失させ、反応前後の吸光度変化量
よりビリルビンを測定するものである。この場合反応条
件を種々変えることにより、各種ビリルビンのみを特異
的に若しくは全てのビリルビンを酸化させることが出来
る。この方法に於いて使用される試薬としては、例えば
ビリルビンオキシダーゼを用いる試薬〔クリニカル ケ
ミストリー（Clinical Chemistry）第20巻，第783頁（1
974年）〕、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アスコルビン
酸オキシダーゼなどの酸化酵素を用いる試薬（特開昭59
−17999号公報）、コール酸などの陰イオン性界面活性
剤や芳香族カルボン酸などを反応促進剤として使用して
いる総ビリルビン測定用試薬（特開昭60−249060号公報
など）、pH、緩衝液、界面活性剤の選定によって抱合型
ビリルビンのみにビリルビンオキシダーゼが働く条件を
設定した抱合型ビリルビン測定用試薬が提出されてい
る。この抱合型ビリルビン測定用試薬としては、例えば
pH9〜11の範囲の緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを
作用させて抱合型ビリルビンを定量する試薬（特開昭62
−58999号公報）、陰イオン性界面活性剤を含有するpH5
〜６の酸性緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用さ
せて抱合型ビリルビンを定量する試薬（特開昭60−1529
55号公報）、pH3.5〜4.5の緩衝液中でビリルビンオキシ
ダーゼを作用させて抱合型ビリルビンを定量する試薬
（特公昭61−44000号公報）などがある。以上に述べた
他に、陰イオン性界面活性剤を含有するpH8.0以上のア
ルカリ性緩衝液中で、検体中のビリルビンと試薬中のビ
リルビンオキシダーゼの比をある限定された範囲に保持
することにより、非抱合型ビリルビン（遊離ビリルビ
ン）を定量する方法（特開昭60−154162号公報）も提出
されている。

（発明が解決しようとする課題） ジアゾ試薬を用いる方法は、ジアゾ化反応の反応促進
剤を含有するか否かによって総ビリルビンと抱合型ビリ
ルビンを分別測定しているが、その分別性は実際上不十
分であるという問題点を有している。特にこの分別性の
不十分さは、アルブミンを含まない検体若しくはサリチ
ル酸などの薬剤を含む検体について顕著である。またこ
の方法の問題点として、抱合型ビリルビン、非抱合型ビ
リルビンがアゾ化されて生じた各種のアゾビリルビン
は、吸光係数などの分光学的性質において、それぞれ異
なるため、測定値に誤差が生じるということが挙げられ
る。さらに現在抱合型ビリルビンの標準物質として使用
されている人工基質のジタウロビリルビンと、生体液中
に存在する実際の抱合型ビリルビンは、反応性およびア
ゾ化したときの吸光係数等において、大きく異なるため
問題がある。

高速液体クロマトグラフィーによって分画定量する方
法は、十分な分別性を有してはいるが、高価で特殊な装
置を使用すること、分析時間が長いこと、及び多数の検
体を処理できないことなどの問題点を有する。

酸化酵素を利用した試薬による測定方法の大きな問題
点としては、ジアゾ試薬を用いる方法と同様に、現在適
切な標準物質が存在しないことが挙げられる。すなわち
標準物質として使用されるジタウロビリルビンもしくは
非抱合型ビリルビンは、実際の生体液中の抱合型ビリル
ビンとは、分光学的性質（吸光係数、極大吸収波長な
ど）あるいは試薬との反応性において異なるため測定誤
差が生じ、各種ビリルビンの測定値は正確な値を示して
いない。このように一種類の標準物質を用いて、複数種
のビリルビンが含まれる生体液中の各種ビリルビンを分
別測定する場合には、必然的に測定誤差が生じる。また
ジタウロビリルビン、非抱合型ビリルビンなどを複数混
合して標準物質とする場合も生体液に応じてその最適な
混合比率の選択が不可欠であることからその調製がきわ
めて難しい等の問題点を有する。また抱合型ビリルビン
測定用試薬で設定されている分別測定条件は、検体中の
アルブミンなどの蛋白質の存在を前提として設定されて
いるため、不十分であり、新生児の血清あるいはサリチ
ル酸等の薬剤を含む血清などに見られる様な、蛋白質と
遊離した状態のビリルビンの割合が高い検体などを正確
に測定することは困難である。さらに特公昭61−44000
号公報における抱合型ビリルビン測定用試薬のpH範囲は
ビリルビンオキシダーゼにとって安定性、活性の両方の
面できわめて不利な条件であり、測定法としても不都合
な状況を呈している。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは現在行われているビリルビン測定におい
て最も重要な標準物質に関わる問題点を解決するために
鋭意検討した結果、β−グルクロニダーゼなどの脱抱合
能を有する酵素を主成分として含む反応試薬をビリルビ
ン含有検体に作用させて、抱合型ビリルビンを非抱合型
ビリルビンに精度良く変換でき、その後さらにビリルビ
ン酸化能を有する酸化剤を作用させてこの非抱合型ビリ
ルビンを酸化し、それに伴う吸光度変化量を求めれば、
既知濃度の非抱合型ビリルビンのみを標準物質として、
検体中の非抱合型ビリルビン、即ち総ビリルビンを精度
良く測定できることを見出した。

すなわち第一の発明は、検体中の総ビリルビン量を測
定するに際し、脱抱合能を有する酵素を含む試薬によっ
て抱合型ビリルビンを予め脱抱合して非抱合型ビリルビ
ンとした後、検体中に存在する非抱合型ビリルビンを求
めることによって総ビリルビンを測定することを特徴と
する総ビリルビンの測定方法を要旨とするものであり、
第二の発明は、ビリルビン酸化能を有する酸化剤若しく
はジアゾ試薬と、脱抱合能を有する酵素とを含有するこ
とを特徴とする総ビリルビン測定用試薬を要旨とするも
のである。

本発明の総ビリルビン測定用試薬は、２試薬系で構成
される。第１試薬は抱合型ビリルビンを非抱合型ビリル
ビンに変換するための脱抱合能を有する酵素を主成分と
して含み、第２試薬は第１試薬によって生成した非抱合
型ビリルビンを定量するための酸化剤若しくはジアゾ試
薬を主成分として含む。

総ビリルビン測定用試薬の第１試薬に主成分として使
用する脱抱合能を有する酵素としては、例えばグルクロ
ニダーゼ、グルコシダーゼ及びガラクトシダーゼなど種
々の糖エステル加水分解酵素あるいはスルファターゼが
あり、これらを単独にもしくは複数混合して用いること
ができる。特に検体がヒト生体液である場合は、グルク
ロニダーゼ単独の使用が可能である。これら脱抱合能を
有する酵素は動物、植物若しくは微生物のいずれの起源
由来のものも使用することができるが、例えばグルクロ
ニダーゼとしては、ウシ肝臓、カタツムリ若しくは大腸
菌由来のもの、グルコシダーゼとしては酵母若しくはア
ーモンド由来のもの、ガラクトシダーゼとしては大腸菌
由来のもの及びスルファターゼとしてはカタツムリ由来
のものなどが使用できる。これらの脱抱合能を有する酵
素は0.01〜100ユニット/mlの濃度範囲で使用できる。さ
らに好ましくは0.05〜50ユニット/mlの濃度範囲で使用
できる。0.01ユニット/ml以下だと脱抱合反応が完結す
るのに長時間を要するため好ましくなく、又100ユニッ
ト/ml以上だと試薬が高価となり又高蛋白濃度のため反
応が遅くなり、更に酵素溶液中の夾雑物により抱合型ビ
リルビンが酸化されるなどの影響が出る場合もあり好ま
しくない。

総ビリルビン測定用試薬の第２試薬に用いる酸化剤と
しては、例えばビリルビンオキシダーゼ及びラッカーゼ
などの酸化酵素、グルコースオキシダーゼなどの過酸化
水素を生成するオキシダーゼとそれらの基質およびペル
オキシダーゼとの混合物、ビリルビン酸化能を有する２
価の銅イオン及び３価の鉄イオンなどの金属イオン若し
くはその塩、例えば硫酸銅、塩化銅、硫酸第２鉄など、
過硫酸カリウム及び過安息香酸ナトリウムなどの過酸化
物等が挙げられる。また、第２試薬にはジアゾ試薬を使
用することもでき、例えばスルファニル酸と亜硝酸の塩
酸溶液、2,4−ジクロロアニリンとスルファニル酸の混
液から選ばれるいずれか１種、またはそれらの組合せが
挙げられる。

前記第２試薬において、酸化剤として、前記酸化酵素
を用いる場合は0.01〜30ユニット/ml、好ましくは0.05
〜10ユニット/ml、前記過酸化物を用いる場合は0.01〜5
0mM、好ましくは0.05〜30mM、前記金属イオンもしくは
その塩を用いる場合は0.01〜20mM、好ましくは、0.05〜
5mMの濃度範囲であってよく、あるいはジアゾ試薬を、
0.05〜5mM、好ましくは0.1〜2mMの濃度範囲で使用して
もよい。これらの成分が上記範囲外の量で存在すると、
非抱合型ビリルビンに対する酸化反応の完結に長時間を
要するか、試薬の劣化が著しくなるか、或は試薬中に沈
澱を生成する可能性があるため好ましくない。尚、酸化
酵素の供給源は限定されるものではなく、種々の起源の
ものが使用される。例えばラッカーゼとしてはウルシ由
来あるいはポリポーラス属などの微生物由来のものが、
またビリルビンオキシダーゼとしてはミロセシウム属若
しくはエピタケ属由来のものが使用できる。あるいは、
グルコースオキシダーゼは、アスペルギルス属由来のも
のなどが使用できる。

総ビリルビン測定用試薬の第１試薬及び第２試薬に
は、上記の必須成分の他に、反応促進剤としての芳香族
カルボン酸、界面活性剤、緩衝液、キレート剤、通常使
用される賦活剤及び塩類を含むことができる。

上記芳香族カルボン酸としては、例えば、ｐ−トルエ
ンスルフォン酸、安息香酸などがあり、５〜75mM、好ま
しくは10〜50mMの濃度範囲で使用できる。この範囲外の
濃度では反応が完結するのに長時間を要するか、試薬中
に沈澱を生じる場合もあるため好ましくない。

また上記界面活性剤としては、陰イオン性界面活性
剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び
両性界面活性剤のいずれも使用できる。例としてはドデ
シル硫酸ナトリウム、コール酸あるいはポリオキシエチ
レングリコール、トリトンＸ−100、ツイン80、塩化ラ
ウリルピリジニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニ
ウム、Ｎ−ラウリル・ミリスチル−β−アミノプロピオ
ン酸、Ｎ−ラウリル−β−イミノ−ジプロピオン酸など
がある。これらの界面活性剤は通常使用される0.01〜10
％、好ましくは0.05〜２％の濃度範囲で使用できる。上
記界面活性剤の使用量が10％を超えると、試薬中に沈澱
を生じる可能性がある他、試薬の流動性が悪くなるため
自動分析機などへ適用できず好ましくない。

上記第１試薬の緩衝液としては、使用する脱抱合能を
有する酵素の至適pH付近に緩衝能を持つものを、上記第
２試薬の緩衝液としては、使用する酸化剤もしくはジア
ゾ試薬の作用する至適pH付近に緩衝能をもつものを使用
すれば良い。その様な第１試薬の緩衝液としては、脱抱
合能を有する酵素として、例えば、牛肝臓由来β−グル
クロニダーゼを用いた場合、フタル酸−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（pH5.0）、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH5.0）などが挙げられる。また、第２試薬の緩衝
液としては、酸化剤として、例えば、ビリルビンオキシ
ダーゼを用いたときは、リン酸緩衝液（pH7.0）、HEPES
緩衝液（pH7.0）などであってよい。それら緩衝液の濃
度としては20〜500mM、好ましくは30〜200mMで使用すれ
ば良い。20mM以下だと、試薬に検体を加えた段階で設定
したpHからずれる可能性が大きく、また500mM以上であ
ると、反応に長時間を要したり、試薬中に沈澱を生じる
場合もあるため好ましくない。

総ビリルビン測定用試薬の第１試薬及び第２試薬に添
加できるキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸
などのポリアミノカルボン酸あるいはクエン酸などのオ
キシカルボン酸などを0.01〜100mM、好ましくは0.05〜5
0mMを適宜使用することができる。

前記試薬に添加できる賦活剤としてはポリエチレング
リコール、アルブミン、糖類などを使用できる。ポリエ
チレングリコールを用いる場合は0.01〜10％、好ましく
は0.05〜２％、アルブミンを用いる場合は0.01〜50mM、
好ましくは0.05〜10mM、糖類を用いる場合は１〜100m
M、好ましくは５〜50mMを適宜使用することができる。

更に、塩類として、例えば塩化ナトリウム、塩化アン
モニウム、硫酸カリウムなどを、１〜500mMの範囲で、
好ましくは５〜100mMの範囲で本発明の総ビリルビン測
定用試薬の第１試薬及び第２試薬に添加しても良い。

さらに本発明の総ビリルビン測定用試薬の標準物質
は、既知濃度の非抱合型ビリルビンを含むものである。
濃度としては0.1〜80mg/dl、好ましくは0.5〜60mg/dlで
ある。この非抱合型ビリルビンとしては、通常市販され
ている非抱合型ビリルビン（第一化学薬品社製、シグマ
社製など）あるいはブタ、ウマ、ヒトなどの胆嚢から採
取、精製したものを使用できる。標準物質としてはこれ
ら非抱合型ビリルビンを単独で、またはポリエチレング
リコール、アルブミン、糖類、キレート剤、塩類などの
安定化剤あるいは賦活剤を適宜添加して調製できる。前
記のような添加剤を含む場合は、ポリエチレングリコー
ル、アルブミン、糖類などをそれぞれ0.01〜30％、0.01
〜50mM、１〜300mM、キレート剤としてエチレンジアミ
ン四酢酸などのポリアミノカルボン酸あるいはクエン酸
などのオキシカルボン酸などを0.01〜100mM、塩類とし
て塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸カリウムな
どを１〜500mMの濃度範囲で使用できる。また市販の高
ビリルビンコントロール標準血清を使用することもでき
るが、その場合非抱合型ビリルビンのみを含みかつその
含量が正確であることが望ましい。

以上の様な第１試薬、第２試薬および標準物質の存在
形態は、溶液状態、凍結状態あるいは乾燥状態等の何れ
に限られるものではなく使用時において溶液状態であれ
ばよい。溶液状態、凍結状態、乾燥状態にするのは通常
良く知られた方法で行なうことができる。

次に本発明によってヒト血清中の総ビリルビン量を求
めるのに好ましい総ビリルビン測定用試薬の組成例を挙
げる。

第１試薬は、牛肝臓由来のβ−グルクロニダーゼ0.05
〜10ユニット/ml、ｐ−トルエンスルフォン酸５〜75m
M、EDTA 0.01〜20mM、pH4〜６に調製されたコハク酸−
水酸化ナトリウム緩衝液20〜500mMを含む。

第２試薬は、ビリルビンオキシダーゼ0.05〜10ユニッ
ト/ml、ｐ−トルエンスルフォン酸10〜50mM、EDTA 0.05
〜50mM、pH5〜８に調製されたリン酸緩衝液20〜500mMを
含む。

検体中の総ビリルビンの測定方法としては、脱抱合能
を有する酵素を含む前記第１試薬によって、検体中の抱
合型ビリルビン全てを非抱合型ビリルビンに変換した
後、HPLCによってこれを直接測定するか、さらに酸化剤
若しくはジアゾ試薬を含む第２試薬を添加することによ
って、前記非抱合型ビリルビンを酸化もしくはアゾ化非
抱合型ビリルビンに変換し、特定吸収波長に於ける吸光
度変化量を測定すればよい。

本発明の測定方法においては、抱合型ビリルビンを含
む検体中の全てのビリルビンを非抱合型ビリルビンに変
換することで、標準物質として非抱合型ビリルビンのみ
を使用することが可能である。

本発明において、具体的な総ビリルビンの測定方法
は、例えば次の様にすれば良い。まず、上記の総ビリル
ビン測定用試薬の第１試薬0.6mlを分光計のセル室内に
て予備加温後、各種ビリルビンを含む検体（血清など）
適当量を加えて１〜10分間反応させ、検体中の抱合型ビ
リルビンをすべて非抱合型ビリルビンに変換し、460nm
における吸光度を測定する。次に上記酸化剤を含む総ビ
リルビン測定用試薬の第２試薬0.15mlを添加してさらに
１〜10分間反応させて非抱合型ビリルビンをすべて酸化
させ、460nmにおける吸光度を測定し、この値と先に測
定した吸光度の液量補正値とから吸光度変化量（Ａ）を
求める。次に既知濃度の非抱合型ビリルビンを含む標準
物質を同様に測定し吸光度変化量（Ｂ）を求める。検体
を作用させて求めた吸光度変化量（Ａ）と標準物質を作
用させて求めた吸光度変化量（Ｂ）とから、下記の数式
により検体中の総ビリルビン含量を求めることができ
る。

尚、予備加温温度、反応温度は25℃、30℃、37℃など
が適当である。また、検体量としては0.005〜0.1mlが好
ましい。測定波長は460nmに限定されるものでなく、400
nmから480nmの任意の波長を選ぶことができる。また第
１試薬、第２試薬、検体の液量は適宜変化させることが
できる。

なお本発明では検体中に抱合型ビリルビンのみを含む
場合、第２試薬を作用させた時の吸光度変化量は、検体
中の抱合型ビリルビン量に対応するとともに総ビリルビ
ン量にも対応する。

なお第２試薬で非抱合型ビリルビンを酸化してその吸
光度減少より定量する代りに、ジアゾ試薬によってアゾ
色素を生成させて定量することも可能である。また第１
試薬と検体を作用させた後、HPLCにて抱合型ビリルビン
を直接分析定量することもできる。

また、第１試薬と検体を作用させた後、HPLCにて分析
定量することもできる。

さらに、検体中に非抱合型ビリルビンと抱合型ビリル
ビンが混在する場合、総ビリルビン測定用試薬もしくは
方法によって検体中の総ビリルビン量を求め、さらに非
抱合型ビリルビン測定用試薬もしくは方法によって同一
検体中の非抱合型ビリルビン量を求め、得られた総ビリ
ルビン量と非抱合型ビリルビン量の差から、抱合型ビリ
ルビン量を容易に求めることができる。本発明の試薬
は、検体中に実際に存在する非抱合型ビリルビンを共通
の標準物質として使用しているため、前記手法により求
められる抱合型ビリルビン量の値は、本発明により得ら
れる総ビリルビン量と同様に、極めて正確な値となる。

（作用） 本発明の総ビリルビン測定用試薬により、検体中の抱
合型ビリルビンを非抱合型ビリルビンに変換し、次いで
この非抱合型ビリルビンと検体中に元より存在した非抱
合型ビリルビンとを酸化させ、生じた吸光度変化量より
検体中の総ビリルビン量を求めることができる。

（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。

参考例１ 抱合型ビリルビンの一種であるグルクロナイドビリル
ビンは、分析化学第31巻、E63頁（1982年）記載の方法
に準じて豚胆嚢中の胆汁から精製した。またこのグルク
ロナイドビリルビン及び非抱合型ビリルビンはラウフ
（Lauff）らの方法「ジャーナル オブ クロマトグラ
フィー（Journal of Chromatography）第226巻,391頁
（1981年）」を若干改良したHPLC法にて分析した。即
ち、リクロソルブRP−８（粒子径10μｍ）カラムを用い
て５％のメチルセルソルブを含有するリン酸緩衝液（pH
2.0）とアセトニトリルのグラジエント溶出を行い試料
を分析した。

実施例１ 総ビリルビン測定用試薬は次の様に調製した。第１試
薬は、牛肝臓由来の脱抱合酵素であるβ−グルクロニダ
ーゼ（シグマ社製,G0251）0.2ユニット/ml、ｐ−トルエ
ンスルフォン酸30mM、EDTA1mM、トリトンＸ−100 0.03
％及びフタル酸緩衝液（pH5.0）100mMとなる様に、第２
試薬は、酸化酵素のビリルビンオキシダーゼ（シグマ
社,B1515）４ユニット/ml、ｐ−トルエンスルフォン酸3
0mM、EDTA1mM、トリトンＸ−100 0.03％及びリン酸緩衝
液200mMとなる様に、また第２試薬のpHが10.0となる様
に調製した。第１試薬1mlを37℃にて２分間予備加温
し、参考例１で精製したグルクロナイドビリルビン0.05
mlを加え３分間同温で反応させた。さらに第２試薬0.25
mlを加え37℃にて３分間反応させた。第１試薬で反応さ
せた後の反応混液（ａ）、さらに引続き第２試薬で反応
させた後の反応混液（ｂ）中の各種ビリルビンをHPLCに
て分画し分析した。それぞれの結果を第１図中に示す。
また第１試薬からβ−グルクロニダーゼのみを除いて、
グルクロナイドビリルビンサンプルと反応させた反応混
液（ｃ）を同様にHPLCにて分析した。その結果を第１図
中に示す。

図中の約11分に溶出するピークはグルクロナイドビリ
ルビンであり、約18分に溶出するピークは非抱合型ビリ
ルビンである。第１図中（ａ）と（ｃ）を比べること
で、第１試薬によってグルクロナイドビリルビンが非抱
合型ビリルビンに完全に変換されたことが明らかであ
り、第１図中（ｂ）と（ａ）を比べることで、さらに第
２試薬によって非抱合型ビリルビンが酸化消去されたこ
とが明らかである。

実施例２ 参考例１で精製したグルクロナイドビリルビンの各種
濃度の希釈溶液を作成し、実施例１で調製した総ビリル
ビン測定用試薬を用いてグルクロナイドビリルビン含量
と吸光度変化量の関係を求めた。第１試薬1mlを分光計
セル室内で37℃にて２分間予備加温した後、各種濃度の
グルクロナイドビリルビン溶液を0.05ml加え、37℃で３
分間反応させ吸光度を460nmにて測定した。その後第２
試薬0.25mlを加え37℃にて５分間反応させ吸光度を460n
mにて測定した。第１試薬、第２試薬をそれぞれ反応さ
せた後の、液量補正した吸光度変化量と希釈率の関係を
求めた。その結果広い範囲にわたって希釈率と吸光度変
化量の間に良好な直線関係が成立つことが分かった。

実施例３ 参考例１で精製したグルクロナイドビリルビンにヒト
アルブミン（シグマ社製,A3782）、サリチル酸、EDTA及
びヘモグロビンを下記表１の濃度になる様に加え、実施
例１の総ビリルビン測定用試薬を用いて実施例２と同様
の方法で定量し、各添加物による測定値への影響につい
て調べた。その結果を表１に示す。標準物質として非抱
合型ビリルビン（第一化学薬品社製）をトリス−塩酸
（pH8.0）100mM中に溶解して5mg/dlとした溶液を用い
た。

表１より本発明の試薬によって求めた総ビリルビン定
量値は種々の添加物によって全く影響を受けず、従来の
試薬で問題となっていた薬物などの影響に関する問題点
を解決できることを確認した。

実施例４ 非抱合型ビリルビン（第一化学薬品社製）及び抱合型
ビリルビンの一種であるジタウロビリルビン〔ポルフィ
リン プロダクツ インク（Porphirin Products In
c.）より市販〕を各々トリス−塩酸（pH8.0）100mMにて
溶解し、それぞれ59mg/dl、80mg/dlの溶液を調製した。
またヒトアルブミンをトリス−塩酸（pH7.0）100mMにて
溶解し、67.0g/lのヒトアルブミン溶液を調製した。

前記非抱合型ビリルビン溶液59mg/dlおよびジタウロ
ビリルビン溶液80mg/dl、並びにヒトアルブミン溶液67g
/lを用いて、非抱合型ビリルビン10mg/dl、ジタウロビ
リルビン10mg/dl、ヒトアルブミン26.8g/lとなる標準物
質Ａを調製した。また参考例１のグルクロナイドビリル
ビンサンプル1mlの非抱合型ビリルビン10mg/dlを1ml混
合したサンプルＡを調製した。

本発明による実施例１の総ビリルビン測定用試薬を用
いて上記標準物質Ａを反応させ、吸光度変化量を求め
た。次にサンプルＡを同様に作用させ、吸光度変化量を
求めた。これら２つの吸光度変化量よりサンプルＡ中の
総ビリルビン量を求めた。その結果を表２に示す。

比較例１ 実施例４で調製したサンプルＡおよび標準物質Ａを、
参考例１に記載したHLPC分析法により分析した。各種ビ
リルビンのピーク面積を指標として次の様にサンプルＡ
中の総ビリルビン量、抱合型ビリルビン量および非抱合
型ビリルビン量を求めた。すなわちサンプルＡの非抱合
型ビリルビンのピーク面積と標準物質Ａの非抱合型ビリ
ルビンのピーク面積の比からサンプルＡ中の非抱合型ビ
リルビン量を求め、サンプルＡのグルクロナイドビリル
ビンのピーク面積と標準物質Ａのジタウロビリルビンの
ピーク面積の比よりサンプルＡ中の抱合型ビリルビン量
を求め、それらの和としてサンプルＡ中の総ビリルビン
量を得た。その結果を表２に示す。

なお、比較例１において、総ビリルビン量は、計算に
より非抱合型ビリルビン量に換算した（グルクロナイド
ビリルビンはすべてジグルクロナイドビリルビンとして
扱い、ジタウロビリルビンの分子量と非抱合型ビリルビ
ンの分子量より計算した）。

表２より、本発明による総ビリルビン測定用試薬で求
めた値が、HLPC分析で求めた値と極めて近いことが判っ
た。

これより本発明による試薬が極めて優れた性能を有し
ていることが判った。

（発明の効果） 本発明により、簡単な操作で精度良く、検体中のアル
ブミンあるいは薬剤含量に影響されることなく、検体中
の総ビリルビン量を定量できるようになった。これは安
定で入手の容易な非抱合型ビリルビンのみを標準物質と
して使用することで人工基質の使用時に生じていた測定
誤差、人工基質と血清中のグルクロナイドビリルビンと
の反応性の違い、あるいは真に相応しい標準物質が存在
しない等のビリルビン測定における問題点を解決し、各
種ビリルビンを非抱合型ビリルビンに統一して測定で
き、測定値として極めて正確な値を得ることができた。
また酵素を有利な条件で使用できるという面でもビリル
ビン測定用試薬の性能を向上させ、臨床検査の分野にお
いて従来にはなかった有利な試薬を提供できるものであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で調製した総ビリルビン測定用試薬を
参考例１で精製したグルクロナイドビリルビンに作用さ
せた時のHPLC分析パターンを示す。図内の実線は反応混
液（ａ）の分析パターンを、太破線は反応混液（ｂ）の
分析パターンを、細破線は反応混液（ｃ）の分析パター
ンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈴木 裕史 千葉県八千代市大和田新田1144 株式会 社ヤトロン八千代工場内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12Q 1/26

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】検体中の総ビリルビン量を測定するに際
   し、脱抱合能を有する酵素を含む試薬によって抱合型ビ
   リルビンを予め脱抱合して非抱合型ビリルビンとした
   後、検体中に存在する非抱合型ビリルビン量を求めるこ
   とによって総ビリルビンを測定することを特徴とする総
   ビリルビンの測定方法。
2. 【請求項２】ビリルビン酸化能を有する酸化剤若しくは
   ジアゾ試薬と、脱抱合能を有する酵素とを含有すること
   を特徴とする総ビリルビン測定用試薬。