KR100276749B1 - 저밀도리포단백증의콜레스테롤의정량법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저밀도 리포단백 (LDL) 을 함유하는 시료에서 고밀도 리포단백 중의 콜레스테롤을 제거한 후에, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 산화 환원 효소를 작용시켜 발생하는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 정량하는 것을 특징으로 하는 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법에 관한 것이다.

Description

저밀도 리포단백중의 콜레스테롤의 정량법 {METHOD OF QUANTITATING CHOLESTEROL IN LOW-DENSITY LIPOPROTEIN}

종래, LDL 콜레스테롤의 정량은 우선 검체 중의 총 콜레스테롤 양을 측정한 후에, 별도 검체에 LDL 및 초저밀도 리포단백 (VLDL) 의 침전제를 첨가하고 원심 분리해서 상청의 고밀도 리포단백 (HDL) 중의 콜레스테롤 (이하 ″HDL 콜레스테롤″ 이라 한다) 양을 측정하고 Friedewald 의 환산식으로 산출하는 방법에 의해 행해 졌다 (일본임상 광범위 혈액·요화학검사 면역학적 검사 상권, 일본임상사 출판, 615 페이지, 1995 년). 이 방법으로는 총 콜레스테롤 양과 HDL 콜레스테롤 양의 두 가지를 측정할 필요가 있고, 또한 원심 분리 조작 등이 필요하고 번잡했다. 그러나, 단순히 혈청 검체를 직접 콜레스테롤 에스테라아제와 콜레스테롤 옥시다아제가 함유된 시약에 첨가해도 총 콜레스테롤 양을 측정하는 계와 변함이 없고 LDL 콜레스테롤에 특이성이 없다.

특허소 58―165800 에는, 특수한 계면활성제의 존재 하에 분리 조작 없이 직접 LDL 콜레스테롤 양을 측정하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 그 방법으로는 LDL 콜레스테롤과 동시에 HDL 콜레스테롤도 반응하고, LDL 특이성이 낮으며 또한 반응의 조건 설정이 번잡하여 다양한 검체에 적용하는 것이 곤란하다.

또한, 특개평 7―280812 에는 LDL 을 일단 응집시킨 후에 LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 제거하고, 또한 응집한 LDL 를 해응집시켜 LDL 콜레스테롤을 효소반응시켜 LDL 콜레스테롤 양을 측정하는 방법이 개시되어 있다.

본 발명은 임상진단의 분야에 있어서, 동맥경화의 진단에 중요한 저밀도 리포단백 (LDL) 중의 콜레스테롤 (이하, ″LDL 콜레스테롤″ 이라 한다) 의 정량법에 관한 것이다.

도 1 은 LDL 콜레스테롤 228.4 ㎎/㎗ 를 함유하는 혈청의 희석 배율과 실시예 1 의 방법에 의하여 측정된 흡광도와의 상관 관계를 나타내는 것이다.

도 2 는 초원심법으로 분리한 HDL, LDL, VLDL 및 인간 혈청을 사용하여 실시예 9 의 방법에 의하여 히타치 7250 자동 분석기로 측정한 흡광도의 타임 코스를 나타낸 것이다.

도 3 은 LDL 콜레스테롤 228.4 ㎎/㎗ 를 함유하는 혈청의 희석 배율과 실시예 11 의 방법에 의하여 측정된 흡광도와의 상관 관계를 나타낸 것이다.

다음에 실시예를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최량의 상태

발명의개시

본 발명자들은, a) HDL 이외의 리포단백 즉, LDL, VLDL 및 카이로미크론 (CM) 을 반응 저해하는 시약의 존재 하에 콜레스테롤 반응시약을 사용하여 HDL 콜레스테롤을 특이적으로 반응시켜 제거한 후에, 필요에 따라 LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약의 존재 하에 콜레스테롤 반응시약을 사용하여 콜레스테롤 정량의 효소반응을 시킴으로써, 특히 분리하는 일 없이 LDL 을 함유하는 시약 중의 LDL 콜레스테롤을 특이적으로 정량할 수 있는 것, b) LDL 만을 반응 저해하고 콜레스테롤 반응시약을 사용하여 LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 반응시켜 제거한 후에 콜레스테롤 반응시약을 사용하여 콜레스테롤 정량의 효소반응을 시킴으로써, 특히 분리하는 일 없이 LDL 을 함유하는 시약 중의 LDL 콜레스테롤을 특이적으로 정량할 수 있는 것을 찾아내 본 발명에 이르렀다.

여기에서, HDL 이외의 리포단백을 반응 저해한다는 것은 HDL 이외의 리포단백을 응집시키든지 HDL 이외의 리포단백의 외벽의 반응성을 약화시켜 이들 리포단백의 외벽만을 선택적으로 붕괴되지 않게 함으로써 HDL 중의 콜레스테롤을 선택적으로 효소반응을 받을 수 있는 상태에 놓이는 것을 말한다. 또한, LDL 콜레스테롤을 반응 가능화한다는 것은 LDL 의 외벽을 붕괴시킴으로써, LDL 콜레스테롤이 효소반응을 받을 수 있는 상태에 놓여져 있는 것을 말한다. 또한, LDL 만을 반응 저해한다는 것은 역으로 LDL 를 응집시키든지 LDL 의 외벽의 반응성을 약화시켜 LDL 의 외벽만을 선택적으로 붕괴되지 않게 함으로써, LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤이 선택적으로 효소반응을 받을 수 있는 상태에 놓여져 있는 것을 말한다.

본 발명은, LDL 를 함유하는 시료에서 HDL 콜레스테롤을 제거한 후에, 필요에 따라 LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약의 존재 하에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 산화 환원효소를 작용시켜, 발생하는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 정량하는 것을 특징으로 하는 LDL 콜레스테롤의 정량법에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 의하여 HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약 및 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약을 성분으로 하는 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약, 또는 HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약과 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약을 조합하여 이루어진 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하여 LDL 만을 반응 저해하는 시약을 성분으로 하는 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약, LDL 만을 반응 저해하는 시약 및 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약을 성분으로 하는 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약, 또는 LDL 만을 반응 저해하는 시약과 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약을 조합하여 이루어진 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약을 제공할 수 있다.

상기 정량법의 하나로는, HDL 이외의 리포단백 즉, LDL, VLDL 및 CM 을 반응 저해하는 시약의 존재 하에 콜레스테롤 반응시약을 사용하여 HDL 콜레스테롤을 특이적으로 반응시켜 제거한 후에, 필요에 따라 LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약의 존재 하에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 산화 환원 효소를 작용시켜 발생하는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 정량하는 방법이, 또한, 다른 방법으로는 LDL 만을 반응 저해하는 시약의 존재 하에 콜레스테롤 반응시약을 사용하여 LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 제거한 후에, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 산화 환원 효소를 작용시켜 발생하는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 정량하는 방법을 들 수 있다.

예를 들면, HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약의 존재 하에 HDL 및 LDL 을 함유하는 시료에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 작용시켜 과산화수소를 생성시키고, 이어서 또는 동시에 카탈라아제, 퍼옥시다아제와 아닐린화합물, 퍼옥시다아제와 페놀화합물 또는 퍼옥시다아제와 4-아민안티피린을 첨가하여 과산화수소를 제거하고, 그 후에 색소원 (카탈라아제를 사용한 경우엔 퍼옥시다아제도 첨가한다) 및 적당한 계면활성제, 시크로덱스트린류, 혹은 LDL 에 작용하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소를 첨가하여 발색시킴으로써 LDL 콜레스테롤을 정량할 수 있다. 여기에서, LDL 에 작용한다는 것은 반응 저해된 LDL 의 외벽을 붕괴시킴으로써 LDL 콜레스테롤을 효소 반응으로 얻을 수 있는 상태에 놓여져 있는 것을 말한다.

또한, LDL 만을 반응 저해하는 시약의 존재 하에, LDL 을 함유하는 시료에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 및 색소원을 첨가하여 발색시키고, 이 때 LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤이 반응한 후의 흡광도의 변화를 측정함으로써 LDL 콜레스테롤을 정량할 수 있다.

또한, LDL 만을 반응 저해하는 시약 (다음에서 서술하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소가 LDL 만을 반응 저해하는 경우엔 불필요함) 의 존재 하에, LDL 를 함유하는 시료에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 작용시켜 과산화수소를 생성시키고, 이어서 또는 동시에 카탈라아제, 퍼옥시다아제와 아닐린 화합물, 퍼옥시다아제와 페놀 화합물 또는 퍼옥시다아제와 4-아미노안티피린을 첨가하여 과산화수소를 제거하고, 그 후에 색소원 (카탈라아제를 사용한 경우엔 퍼옥시다아제도 첨가한다) 및 LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약 (다음에서 서술하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소가 LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 경우엔 불필요함), 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (최초에 더한 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소가 LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약에 의하여 LDL 콜레스테롤과 반응 가능화해지는 경우엔 불필요함) 을 첨가하여 발색시킴으로써 LDL 콜레스테롤을 정량할 수 있다.

본 발명 방법은 혈액, 오줌 등의 LDL을 함유하는 체액에 적용할 수 있다.

다음에 본 발명의 정량법에 대해 예를 들어 설명하겠다.

예 1

① HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약을 함유하는 중성 부근의 완충액을 일정량의 검체에 첨가하고, 예를 들면 37 ℃ 에서 수분간 가온해서 LDL, VLDL 및 CM 을 반응 저해하고, ② LDL 과 반응성이 없는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (바람직하게는 화학 수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소), LDL 과 반응성이 없는 콜레스테롤 산화 효소 (바람직하게는 화학 수식된 콜레스테롤 산화수소) 〔또는 콜레스테롤 산화 환원 효소 (바람직하게는 화학 수식된 콜레스테롤 산화 환원 효소)〕 및 카탈라아제, 퍼옥시다아제와 아닐린 화합물, 퍼옥시다아제와 페놀 화합물 또는 퍼옥시다아제와 4-아미노안티피린 〔또는 NAD(P)〕 를 더하여 HDL 콜레스테롤을 반응시켜 제거하고, ③ 계면활성제, 시크로텍스트린류, 킬레이트제, LDL 에 작용하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (바람직하게는 화학 수식되지 않는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소), LDL 에 작용하는 콜레스테롤 산화 효소 (바람직하게는 화학 수식되지 않는 콜레스테롤 산화 효소) 또는 LDL 에 작용하는 콜레스테롤 산화 환원 효소 (바람직하게는 화학 수식되지 않는 콜레스테롤 산화 환원 효소) 및 색소원을 첨가 〔콜레스테롤 산화 환원 효소를 사용하는 경우에는 첨가하지 않거나 또는 NAD(P) 를 첨가〕 해서 LDL 콜레스테롤을 과산화수소로 이끌어 내 발색시키고 〔또는 NAD(P)H 로 이끌어 내〕, ④ 생성하는 색소의 극대 파장에 있어서의 흡광도를 분광 광도계로 측정한다 〔콜레스테롤 산화 환원 효소를 사용하는 경우에는 NAD(P)H 의 증가를 300 ∼ 500 ㎚, 바람직하게는 330 ∼ 400㎚, 예를 들면 340 ㎚ 에서의 흡광도로 측정한다 (디아포라아제, 테트라졸륨염을 첨가하여 포르마잔 색소의 발색으로 이끌어 내 포르마잔 색소를 비색 정량하는 것도 가능하다)〕. 여기에서, LDL 과 반응성이 없다는 것은 LDL 의 외벽을 붕괴시키지 않고, LDL 콜레스테롤을 효소 반응을 받을 수 있는 상태에 놓이도록 하지 않는 것을 말한다. LDL 콜레스테롤 양은 별도로 같은 조건 아래에서 이미 알고 있는 농도의 LDL 콜레스테롤을 함유하는 표준액을 사용하여 측정한 경우의 흡광도와 비교해서 산출한다. 또한 ① 및 ② 는 동시에 행할 수도 있다.

HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약의 한 예로서는 응집제 및 2 가의 금속염의 조합을 들 수 있다. 응집제로서는, 헤파린 또는 그의 염, 인텅스텐산 또는 그의 염, 덱스트란황산 또는 그의 염, 폴리에틸렌글리콜, 황산화 시크로덱스트린 또는 그의 염, 황산화 올리고당 또한 그의 염 또는 이들 혼합물 등을 들 수 있고, 시크로덱스트린으로서는 α-시크로덱스트린, β-시크로덱스트린, γ-시크로덱스트린 등을 들 수 있고, 올리고당으로서는 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥타오스, 말토헵타오스 등을 들 수 있고, 염으로서는 나트륨염, 칼슘염, 리튬염, 암모늄염, 마그네슘염 등을 들 수 있다. 2 가의 금속염으로서는 마그네슘염, 칼슘염, 망간염, 니켈염, 코발트염 등을 들 수 있다.

응집제로서는 0.02 ∼ 10 mM 의 분자량 5000 ∼ 20000 의 헤파린 또는 그의 염, 0.1 ∼ 10 mM 의 분자량 4000 ∼ 8000 의 인텅스텐산 또는 그의 염, 0.01 ∼ 5 mM 의 분자량 10000 ∼ 500000 의 덱스테란황산 또는 그의 염, 0.1 ∼ 20 mM 의 분자량 1000 ∼ 10000 의 덱스트란황산 또는 그의 염, 0.3 ∼ 100 mM 의 분자량 4000 ∼ 25000 의 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 0.1 ∼ 50 mM 의 분자량 1000 ∼3000 의 황산화 시크로덱스트린 또는 그의 염, 0.1 ∼ 50 mM 의 분자량 400 ∼ 3000 의 황산화 올리고당 또는 그의 염 또는 그것들의 혼합물 등이 바람직하게 사용된다. 또한, 바람직하게는 0.03 ∼ 1 mM 의 분자량 14000 ∼ 16000 의 헤파린 또는 그의 염, 0.1 ∼ 3 mM 의 분자량 5000 ∼ 7000 의 인텅스텐산 또는 그의 염, 0.01 ∼ 5 mM 의 분자량 150000 ∼ 250000 의 덱스트란황산 또는 그의 염, 0.1 ∼ 10 mM 의 분자량 1000 ∼ 5000 의 덱스트란황산 또는 그의 염, 1.0 ∼ 50 mM 의 분자량 5000 ∼ 22000 의 PEG, 0.1 ∼ 10 mM 의 분자량 1000 ∼ 2000 의 황산화 시크로덱스트린 또는 그의 염, 0.1 ∼ 10 mM 의 분자량 400 ∼ 2000 의 황산화 올리고당 또는 그의 염 또는 그것들의 혼합물 등이 사용된다.

2 가의 금속염으로서는 0.1 ∼ 50 mM 의 마그네슘염, 칼슘염, 망간염, 니켈염, 코발트염 등을 들 수 있고, 바람직하게는 0.1 ∼ 50 mM 의 마그네슘염이 사용된다.

HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약으로서는 항아포 B 항체, 항아포 C 항체 등을 사용할 수도 있다. 항아포 B 항체, 항아포 C 항체로서는 인간 혈청에서 정제한 아포 단백 B 또는 아포 단백 C 를 집토끼에게 면역시켜 수득되는 항아포 B 항혈청 또는 항아포 C 항혈청을 황안 침전, 염석해서 수득되는 IgG 분획, 혹은 상기 아포 단백 B 또는 아포 단백 C 를 마우스에게 면역해서 수득되는 항아포 B 모노클로날 항체, 항아포 C 모노클로날 항체 [단 클론 항체 실험 조작 입문, 안도민에이 (安東民衛) 저, 고단샤 (講談社) 사이엔티픽, 21 페이지, 1991 년] 등을 들 수 있다.

효소로서는 통상 시판되고 있는 콜레스테롤 에스테르를 가수분해하는 능력을 갖고 있는 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 에스테라아제나 리포프로테인리파아제, 콜레스테롤을 산화해서 과산화수소를 생성하는 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 옥시다아제, 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 데히드로게나아제 등을 들 수 있고, 이들 효소의 특이성, 안정성을 더욱 올리기 위해서 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 수용성의 올리고당 잔기 등의 구조에 당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 폴리우레탄기 등에서 상기 효소를 화학적으로 수식한 것도 사용된다. 또한, 유전자 조작에 의하여 이들 유전자를 취하고, 다른 미생물에 도입해서 발현시킨 효소 또는 이들을 화학적으로 수식한 수식체, 또는 이들 유전자를 변경해서 발현시킨 효소 또는 이들을 화학적으로 수식한 수식체 등도 적합하게 사용된다.

효소를 수식하기 위한 시약 (화학 수식제) 으로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜에 아미노기와 결합 가능한 기를 결합시킨 화합물 ｛폴리에틸렌글리콜에 N-히드록시삭신이미드기 등의 아미노기와 결합 가능한 기를 결합시킨 샘브라이트 VFM 4101 [일본유지주식회사제] 등｝, 폴리알킬렌글리콜 구조 및 산무수물 구조를 갖는 샘브라이트 AKM 시리즈, 동 ADM 시리즈, 동 ACM 시리즈 [모두 일본유지주식회사제 : 화학공학론 문집, 제 20 권, 제 3 호, 459 페이지, 1994 년], 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체에 아미노기와 결합 가능한 기를 결합시킨 화합물, 폴리에틸렌글리콜 모노메타클릴 모노메틸에테르와 무수 말레인산의 공중합체 등을 들 수 있다. 또한, 폴리우레탄의 화학 수식제인 폴리우레탄 P 4000 activated (뵈링거만하임사 제 Enzyme modification set 능서), 덱스트란의 화학 수식제인 덱스트란 T 40, TCT-activated (동), 1, 3-프로판셀튼 등도 사용할 수 있다. 이들 화학 수식제에 의하여 효소를 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 구조에 당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 폴리우레탄기 등으로 수식할 수 있다.

다음에 효소에 상기 화학 수식제를 반응시키는 방법을 예시하는데, 이것에 의하여 제약받지 않는다. 우선, 효소를 pH 8 이상의 헤페스 완충액 등의 완충액 중에 용해시키고, 0 ∼ 50 ℃ 에서 예를 들면 0.01 ∼ 500 배 몰량의 샘브라이트]를 첨가하여 5 ∼ 60 분간 교반한다. 이 반응액을 그대로 또는 필요에 따라 한외 여과막에 의하여 저분자물을 제거하여 사용한다. 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 콜레스테롤 산화 환원 효소는 0.1 ∼ 100 u/㎖ 로 사용하는 것이 바람직하다.

LDL 과 반응성이 없는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 산화 환원 효소로서는 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 수용성의 올리고당 잔기 등의 구조에 당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 폴리우레탄기 등으로 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 산화 환원 효소를 화학적으로 수식한 것이 바람직하다.

LDL 에 작용하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 산화 환원 효소로서는 미수식의 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 산화 환원 효소가 바람직하지만, 이들을 안정화시키기 위해서 약간의 수식을 가한 것도 LDL 만에 작용하는 범위에서 사용할 수 있다. 수식제로서는 상기 샘브라이트 VFM 4101 [일본유지주식회사제] 등을 들 수 있다. 효소의 사용 단위로서는 0.5 ∼ 100 u/㎖ 가 바람직하다.

LDL 과 반응성을 갖게 하기 위해서 사용되는 계면활성제로서는 트리톤 X-100 등의 비이온계 계면활성제, 양이온계 계면활성제 혹은 음이온계 계면활성제를 들 수 있고, 0.02 ∼ 10 %의 범위에서 사용된다. 또한, LDL 과 반응성을 갖게 하기 위해 사용되는 시크로덱스트린류로서는 α-시크로덱스트린, β-시크로덱스트린, γ-시크로덱스트린, 디메틸-α-시크로덱스트린, 디메틸-β-시크로덱스트린, 디메틸-γ-시크로덱스트린, 히드록시프로필-α-시크로덱스트린, 히드록시프로필-β-시크로덱스트린, 히드록시프로필-γ-시크로덱스트린, 2, 3, 6-O-메틸-β-시크로덱스트린, 폴리-β-시크로덱스트린 등을 들 수 있고, 0.1 ∼ 10 % 의 범위에서 사용된다. 또한, LDL 과 반응성을 갖게 하기 위해 사용되는 킬레이트제로서는 마그네슘과 착체를 형성하는 화합물이 바람직하게 사용되고, 에틸렌디아미노 4초산 (EDTA) 류, 트리에틸렌테트라민-N, N, N', N'', N''', N'''-6초산 (TTHA), 트랜스-1, 2-시크로헥산디아민-N, N, N', N'-4초산 (CyDTA) 1 수화물 등을 들 수 있고, 0.005 ∼ 2 % 의 범위에서 사용된다. 과산화수소를 검출하는 콜레스테롤 산화 효소의 기질이 되는 색소원으로서는, 일반적으로 사용되는 4-아미노안티피린과 페놀, 4-클로로페놀, m-클레졸, 3-히드록시-2, 4, 6-트리요드 벤조산 (HTIB) 등의 페놀류와의 조합 이외에 4-아미노안티피린과 트린다 시약으로서 알려져 있는 (동인 화학 연구소 등 19 판 총합 카탈로그, 1994 년) N-술포프로필아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨이딘 (TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3, 5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3, 5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-술포프로필-m-톨이딘 (TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3, 5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N, N-디에틸-m-톨이딘, N, N-디술포프로필-3, 5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-술포프로필-m-아니시딘, N-에틸-N-술포프로필아닐린, N-에틸-N-술포프로필-3, 5-디메톡시아닐린, N-술포프로필-3, 5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-술포프로필-3, 5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-아니시딘, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필) 아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3, 5-디메톡시아닐린 등의 아닐린류 혹은 N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-삭시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민 등의 조합을 사용할 수 있다. 또한, 고감도의 색소원으로서 특공소 60-33479 로 표시되는 10-(N-메틸카르바모일)-3, 7-비스(디메틸아미노) 페노티아딘 (MCDP), 특공평 4-27839 로 표시되는 비스[3-비스(4-클로로페닐) 메틸-4-디메틸아미노페닐] 아민 (BCMA), 특개소 62-296 으로 표시되는 색소원 등도 사용 가능하고, 이들에 4-아미노안티피린 혹은 상기에서 나타낸 트린더 시약을 조합해서 사용할 수도 있다. 색소원의 농도로서는 0.01 ∼ 10 ㎎/㎖ 이 바람직하고 용해도의 관계에서 제한된다.

또한, HDL 를 제거할 때에 퍼옥시다아제와 함께 사용되는 페놀 화합물 및 아닐린 화합물로서는 상기 페놀류 및 아닐린류가 동일하게 사용된다.

완충제로서는 인산염 등 이외에 트리스, 굿의 완충제 등이 적합하게 사용되고, 그의 농도로서는 5 ∼ 500 mM 이 바람직하다. pH 는 5 ∼ 9 의 범위가 좋다.

예 2

① 아스코르빈산 옥시다아제를 함유하는 완충액에 검체를 첨가하고, 이것에 LDL 과의 반응성이 낮은 (즉, LDL 만을 반응 저해하는) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, LDL 과의 반응성이 낮은 콜레스테롤 산화 효소 (또는 LDL 과의 반응성이 낮은 콜레스테롤 산화 환원 효소) 및 퍼옥시다아제와 색소원 [또는 NAD(P)] 을 함유하는 시약을 첨가한다. ② LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤의 반응이 이미 완료되었기에 그 후의 흡광도의 변화를 분광 광도계로 측정하고, 별도로 같은 조건에서 이미 알고 있는 농도의 LDL 콜레스테롤을 함유하는 표준액을 사용하여 측정한 경우의 흡광도의 변화와 비교해서 LDL 콜레스테롤 양을 산출한다.

LDL 과의 반응성이 낮은 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로서는 화학 수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소가 바람직하고, LDL 과의 반응성이 낮은 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 산화 환원 효소로서는 화학 수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 산화 효소 혹은 화학 수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 산화 환원 효소가 함께 사용된다. 수식제로서는 상기 샘브라이트 VFM 4101 [일본유지주식회사제] 등을 들 수 있다. 효소의 사용 단위로서는 0.5 ∼ 100 u/㎖ 가 바람직하다.

색소원 및 완충제로서는 예 1 에 기재한 색소원 및 완충제가 동일하게 사용된다.

예 3

① LDL 만을 반응 저해하는 시약 (후술하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소가 LDL 만을 반응 저해하는 경우엔 불필요함), 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 (또는 콜레스테롤 산화 환원 효소) 및 카탈라아제, 퍼옥시다아제와 아닐린 화합물, 퍼옥시다아제와 페놀 화합물 또는 퍼옥시다아제와 4-아미노안티피린 [또는 NAD(P)] 를 함유하는 완충액에 검체를 가하여 LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 반응시켜 제거하고, ② LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약 (후술하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소가 LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 경우엔 불필요함), 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (최초에 가하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소가 LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약에 의하여 LDL 콜레스테롤과 반응 가능이 되는 경우엔 불필요함) 및 색소원을 첨가 [또는 무첨가 혹은 NAD(P) 를 첨가] 하여 (카탈라아제를 사용한 경우에는 퍼옥시다아제도 첨가한다) LDL 콜레스테롤을 과산화수소로 이끌어 내 발색시키고 [또는 NAD(P)H 로 이끌어 내], ③ 생성하는 색소의 가장 큰 파장에 있어서의 흡광도를 분광 광도계로 측정한다 [콜레스테롤 산화 환원 효소를 사용하는 경우에는 NAD(P)H 의 증가를 300 ∼ 500 ㎚, 바람직하게는 330 ∼ 400 ㎚, 예를 들면 340 ㎚ 에서의 흡광도에서 측정한다 (디아포라아제, 테트라졸륨염을 첨가해서 포르마잔 색소의 발색으로 이끌어 내고 포르마잔 색소를 비색 정량하는 것도 가능하다)]. LDL 콜레스테롤 양은 별도로 동일한 조건 하에서, 이미 알고 있는 농도의 LDL 콜레스테롤을 함유하는 표준액을 사용하여측정한 경우의 흡광도와 비교해 산출한다.

LDL 만을 반응 저해하는 시약으로서는, LDL 만을 반응 저해하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 등을; LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약으로서는 LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 계면활성제, 킬레이트 등을 들 수 있다.

계면활성제 및 킬레이트제로서는 예 1 에 기재한 계면활성제 및 킬레이트제가 동일하게 사용된다.

효소로서는 예 1 에 기재한 효소를 들 수 있다.

LDL 만을 반응 저해하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로서는 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소에 몰비로 해서 10 배 이상의 화학 수식제를 첨가하여 조제한 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 이외에 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로 동일한 특이성을 갖는 것 혹은 이것들의 유전자를 변경 발현시켜 동일한 특이성을 부여한 것이 바람직하다. 구체적으로는 슈도모나스 혹은 크로모박테리움 등 미생물 유래의 콜레스테롤 에스테라아제의 수용액에 10 배 이상의 몰비의 예 1 에 기재한 화학 수식제를 첨가하여 반응시킨 것 등을 들 수 있다. 화학 수식제의 몰비는, 바람직하게는 10 ∼ 500 배이고, 특이성이 출현하는 효과와 수식에 의한 활성의 저하를 감안하여 결정된다. 또한, 화학 수식되지 않은 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로서 예를 들면 블레비박테리움 유래의 리파아제의 유전자 배열의 일부를 랜덤으로 변화시키고, 다른 예를 들면 대장균에 도입하여 발현시키고 그 중에 효소 활성이 있고 또한 LDL 만을 반응 저해하는 콜레스테롤 에스테라아제를 생산하는 것을 스크린닝으로 검출하여 대량 배양해서 생산한 것도 사용할 수 있다. 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소는 0.1 ∼ 100 u/㎖ 으로 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 특이성을 높이기 위해서 ① 의 단계에서 LDL 를 응집시키지 않는 범위에서 헤파린, 인텅스텐산, 덱스트란황산, 황산화 시클로덱스트린, 황산화 올리고당 또한 이들의 염, 혹은 폴리에틸글리콜과, 마그네슘염, 칼슘염, 망간염, 니켈염, 코발트염 등의 2 가의 금속염을 병용해서 첨가할 수도 있다. 시크로덱스트린, 올리고당 및 염으로서는 예 1 에 기재한 시크로덱스트린, 올리고당 및 염을 들 수 있다.

LDL 콜레스테롤을 반응 가능화하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로서는 미수식의 콜레스테롤 에스테라아제가 바람직하고, 0.5 ∼ 100 u/㎖ 으로 사용하는 것이 바람직하다.

콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 산화 환원 효소로서는, 콜레스테롤을 산화해서 과산화수소를 생성하는 미생물 유래의 콜레스테롤 옥시다아제, 동물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 데히드로게나아제가 바람직하게 사용되 지만, 이들 효소의 특이성, 안정성을 한층 높이기 위해서 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기나 수용성의 올리고당 잔기 등에서 상기 효소를 화학적으로 수식해도 좋다. 이 경우의 화학 수식제의 몰비는, 바람직하게는 0.1 ∼ 500 배로 안정화 효과와 수식에 의한 활성의 저하를 감안하여 결정된다. 콜레스테롤 산화 효소 및 콜레스테롤 산화 환원 효소는 0.1 ∼ 100 u/㎖ 로 사용하는 것이 바람직하다.

다음에, 효소에 상기 화학 수식제를 반응시키는 방법을 예시하지만, 이것에 의하여 제약받지 않는다. 우선, 효소를 pH 8 이상의 헤페스 완충액 등의 완충액 중에 용해시켜 0 ∼ 50 ℃ 에서 예를 들면 소정 배 몰량의 샘브라이트를 첨가하여 1 ∼ 24 시간 교반한다. 이 반응액을 그대로 또는 필요에 따라 한외 여과막에 의하여 저분자물을 제거하여 사용한다.

LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 제거할 때에 퍼옥시다아제와 함께 사용되는 페놀 화합물 및 아닐린 화합물로서는 상기 페놀류 및 아닐린류가 동일하게 사용되고, 색소원 및 완충제로서는 상기의 색소원 및 완충제가 동일하게 사용된다.

상기 본 발명의 각 계는, 통상의 콜레스테롤을 측정하는 계를 함유하기 위해서 콜레스테롤 산화 효소를 활성화하기 위해서 바람직하게 사용되는 계면활성제 또는 콜산류도 사용 가능하고, 또한 글로블린 등의 단백 등을 가용화하기 위한 여러 가지의 염류를 사용할 수도 있다. 계면활성제로서는 비이온계, 음이온계, 양이온계의 계면활성제가 0 ∼ 1 % 의 범위에서 사용되고, 콜산류로서는 콜산, 데옥시콜산, 타울로콜산, 케노옥시콜산 등이 0 ∼ 5 % 의 범위에서 사용되고, 염류로서는 염화 나트륨, 황산 나트륨, 염화 칼륨, 황산 칼륨, 염화 마그네슘, 황산 마그네슘, 아세트산 마그네슘, 질산 마그네슘, 염화 리튬, 황산 리튬, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 염화 칼슘, 질산 칼슘, 아세트산 칼슘, 염화 니켈, 질산 니켈, 아세트산 니켈, 염화 코발트, 질산 코발트 등이 0 ∼ 100 mM 의 범위에서 사용된다.

실시예 1 LDL 콜레스테롤의 정량

(1) 효소의 화학 수식

슈도모나스 유래의 콜레스테롤 에스테라아제 1 g 을 20 mM 인산 완충액 (pH = 8) 100 ㎖ 에 용해시켜 5 ℃ 로 냉각한 후에 이것에 샘브라이트 VFM 4101 [일본유지주식회사제] 15 g 를 첨가하여 4 시간 동안 반응시켰다. 시약 B 의 PEG 수식 콜레스테롤 에스테라아제로서는 이 반응액 대로 사용하였다 (PEG 부분 분자량 = 6000) . 또한 브레비박테리움 유래의 콜레스테롤 옥시다아제 1 g 및 샘브라이트 VFM 4101, 0.1 g 를 사용하여 상기와 동일하게 반응시켰다. 시약 B 의 PEG 수식 콜레스테롤 옥시다아제로서는 이 반응액 대로 사용하였다 (PEG 부분 분자량 = 6000) .

(2) LDL 콜레스테롤의 정량

시약 A

3-몰폴리프로판

술폰산 (MOPS) 완충제 20 mM (pH = 7)

덱스트란황산 0.7 g/l

황산 Mg·7 수화물 7.5 g/l

아지화 나트륨 0.1 g/l

아스코르빈산 옥시다아제 3 u/ml

시약 B

MOPS 완충제 20 mM (pH = 7)

퍼옥시다아제 30 u/ml

PEG 수식 콜레스테롤 에스테라아제 1 u/ml

PEG 수식 콜레스테롤 옥시다아제 3 u/ml

콜산 나트륨 5 u/ml

EMSE 0.3 u/ml

시약 C

MOPS 완충제 20 mM (pH = 7)

미수식 콜레스테롤 에스테라아제 2 u/ml

4-아미노안티피린 0.4 g/l

LDL 콜레스테롤 228.4 ㎎/㎗ 을 함유하는 혈청을 ① 그대로, ② 생리 식염수로 8/10 희석한 것, ③ 동 6/10 희석한 것, ④ 동 4/10 희석한 것, ⑤ 동 2/10 희석한 것 및 ⑥ 생리 식염수만의 각각을 검체로서 하기의 조작을 행하였다.

검체 20 ul 를 시약 A, 2.25 ml 에 첨가하여 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션하여 이어서 시약 B, 0.75 ml 를 첨가하여 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션해서 HDL 콜레스테롤을 제거하고, 이 때의 555 nm 에 있어서의 흡광도 (EL) 를 측정했다. 또한, 시약 C, 0,75 ml 를 첨가하여 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션한 후에 파장 555 nm 에 있어서의 흡광도 (E2) 를 측정했다. LDL 콜레스테롤의 농도는 콜레스테롤 농도 200 ㎎/㎗ 의 표준액을 사용하고 동일한 조작을 행하여 (E2 - E1) × 희석 배율의 값을 비교함으로써 산출하였다. 단, 희석 배율이란 (시약 A + 시약 B) / (시약 A + 시약 B + 시약 C) 의 용량비이다.

LDL 콜레스테롤 228.4 ㎎/㎗ 을 함유하는 혈청을 사용하여 수득된 결과를 제 1 도에 나타낸다.

실시예 2

실시예 1 (2) 에 기재된 시약 B 및 시약 C 를 사용하고 시약 A 에 사용되는 응집제 및 2 가의 금속염을 하기와 같이 여러 가지 재편성하여 혈청 검체를 히타치 7070 자동 분석기 (검체 4 μl, 시약 A 270 μl, 시약 B 90 μl, 시약 C, 90 μl 의 조건) 에서 각각 측정하였다. 한편, 히타치 RPL 42 T 로터를 사용하고 의학의 경위, 제 94 권 (제 8 호), 359 페이지, 1975 년 에 기재된 방법 (초원심법) 에 준하여 LDL 콜레스테롤을 정량하였다. 그 결과 제 1 표에 나타난 바와 같이 어떠한 경우에도 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

가. 인텅스텐산 10 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 7.5 ㎎/㎖

나. 덱스트란황산

나트륨 (MW = 4000) 1 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 10 ㎎/㎖

다. 헤파린나트륨 10 ㎎/㎖

염화 Ca·2 수화물 10 ㎎/㎖

라. PEG 20000 50 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 5 ㎎/㎖

마. 인텅스텐산 10 ㎎/㎖

덱스트란황산나트륨 (MW = 200000) 7.5 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 7.5 ㎎/㎖

바. 인텅스텐산 10 ㎎/㎖

헤파린나트륨 7.5 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 7.5 ㎎/㎖

사. 인텅스텐산 10 ㎎/㎖

PEG 6000 7.5 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 7.5 ㎎/㎗

시약 A	측정치
가	177.7 ㎎/㎗
나	178.9 〃
다	178.1 〃
라	177.2 〃
마	179.0 〃
바	178.8 〃
사	176.5 〃
초원심법	178.4 〃

실시예 3

샘브라이트 VFM 4101 로 바꾸어 샘브라이트 AKM 1511 [일본유지주식회사제], 폴리우레탄 P 4000 activated (뵈링거만하임사 제) 또는 덱스트란 T 40, TCT-activated (뵈링거만하임사 제) 를 사용하고 실시예 1 (1) 과 동일하게 하여 효소를 화학 수식하였다. 실시예 1 (2) 에 기재된 시약 A 및 시약 C 를 사용하고, 시약 B 에 있어서 PEG 수식 콜레스테롤 에스테라아제 및 PEG 수식 콜레스테롤 옥시다아제로 바꾸어 상기에서 수득된 화학 수식 효소를 사용하고, 실시예 2 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 2 와 동일하게 해서 측정하였다. 그 결과 각각 178.0 ㎎/㎗, 179.1 ㎎/㎗, 179.8 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 4

실시예 1 (2) 에 기재된 시약 A 를 사용하고, 시약 B 에 있어서 퍼옥시다아제로 바꾸어 카탈라아제를 300 u/ml 의 농도로 사용하고, 시약 C 에 퍼옥시다아제 30 u/ml 를 가하여 사용하고, 실시예 2 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 2 와 동일하게 해서 측정하였다. 그 결과 178.6 ㎎/㎗ 와 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 5

실시예 1 (2) 에 기재된 시약 A 및 시약 C 를 사용하고, 시약 B 에 있어서 EMSE로 바꾸어 TOOS (측정 파장 555 nm), DAOS (측정 파장 593 nm), MAOS (측정 파장 630 nm) 또는 TOPS (측정 파장 550 nm) 를 같은 농도로 사용하고, 실시예 2 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 2 와 동일하게 해서 측정하였다. 그 결과 각각 177.9 ㎎/㎗, 177.8 ㎎/㎗, 179.2 ㎎/㎗, 178.8 ㎎/㎗과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 6

실시예 1 (2) 에 기재된 시약 A 및 시약 B 를 사용하고, 시약 C 에 있어서 4-아미노안티피린으로 바꾸어 MCDP (측정 파장 666 nm) 또는 BCMA (측정 파장 755 nm) 를 0.1 ㎎/㎖ 의 농도로 사용하고, 실시예 2 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 2 와 동일하게 해서 측정하였다. 그 결과 각각 178.3 ㎎/㎗, 179.0 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 7

실시예 1 (2) 에 기재된 시약 A 및 시약 B 를 사용하고, 시약 C 에 있어서 미수식 콜레스테롤 에스테라아제로 바꾸어 디메틸-β-시클로덱스트린을 20 mg/ml 의 농도로 사용하고, 실시예 2 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 2 와 동일하게 해서 측정하였다. 그 결과 177.4 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 8

실시예 1 (2) 에 기재된 시약 A 와 시약 B 를 3 : 1 의 비율로 혼합하여 시약 D 로 하고 이 용액 3 ㎖ 에 실시예 2 에서 사용된 혈청 검체 20 ㎕ 가해서 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션하여 이 때의 555 nm 에 있어서의 흡광도 (E1) 를 측정하였다. 또한 시약 C, 0.75 ㎖ 를 첨가하여 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션한 후에 파장 555 nm 에 있어서의 흡광도 (E2) 를 측정하였다. LDL 콜레스테롤의 농도는 콜레스테롤 농도 200 ㎎/㎗ 의 표준액을 사용하고 동일한 조작을 행하여 (E2-E1) × 희석 배율의 값을 비교함으로써 산출하였다. 단, 희석 배율이란 (시약 D) / (시약 D + 시약 C) 의 용량비이다. 그 결과 177.6 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 9

시약 A

MOPS 완충제 10 mM (pH = 7)

황산 Na 2 ㎎/㎖

EMSE 0.3 ㎎/㎖

아스코르빈산 옥시다아제 3 u/㎖

시약 B

MOPS 완충제 10 mM (pH = 7)

4-아미노안티피린 0.5 ㎎/㎖

콜산 나트륨 3 ㎎/㎖

PEG 수식 콜레스테롤 에스테라아제 5 u/㎖

미수식 콜레스테롤 옥시다아제 7 u/㎖

퍼옥시다아제 10 u/㎖

PEG 수식 콜레스테롤 에스테라아제로서는 실시예 1 에서 사용한 것과 동일한 것을 사용하였다.

상기의 시약을 사용하고 히타치 7250 자동 분석기를 사용하여 실시예 2 에서 사용된 혈청 검체를 측정하였다. 시약 B 첨가 후에 3.5 분에서 5 분의 흡광도 변화 (E3) 를 측정하였다. LDL 콜레스테롤의 농도는 콜레스테롤 농도 200 ㎎/㎗ 의 표준액을 사용하고 동일한 조작을 행하여 (E4), E3 과

E4 의 값을 비교함으로써 산출하였다. 그 결과 178.6 ㎎/㎗ 와 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

또한 제 2 도에 초원심법으로 분리한 HDL, LDL, VLDL 및 인간 혈청의 타임 코스를 나타낸다.

실시예 10

시약 A

MOPS 완충제 10 mM (pH = 7)

덱스트란 황산 나트륨 (MW = 500000) 0.5 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수염 5 ㎎/㎖

EMSE 0.3 ㎎/㎖

퍼옥시다아제 10 u/㎖

PEG 수식 콜레스테롤 에스테라아제 2 u/㎖

미수식 콜레스테롤 옥시다아제 3 u/㎖

아스코르빈산 옥시다아제 3 u/㎖

시약 B

MOPS 완충제 10 mM (pH = 7)

4-아미노안티피린 0.5 ㎎/㎖

트리톤 X-100 3 ㎎/㎖

EDTA·4 나트륨 5 u/㎖

PEG 수식 콜레스테롤 에스테라아제로서는 실시예 1 에서 사용된 것과 동일한 것을 사용하였다.

상기의 시약을 사용하고 히타치 7250 자동 분석기를 사용하여 실시예 2 에서 사용된 혈청 검체를 측정하였다 (E5). LDL 콜레스테롤의 농도는, 콜레스테롤 농도 200 ㎎/㎗ 의 표준액을 사용하고 동일한 조작을 행하여 (E6), E5 와 E6 의 값을 비교함으로써 산출하였다. 그 결과 177.3 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다. 또한 자동 분석기의 측광점은 시약 B 첨가 5 분 후로 했다.

실시예 11

(1) 효소의 화학 수식

슈도모나스 유래의 콜레스테롤 에스테라아제 1 g 을 20 mM 인산 완충액 (pH = 8) 100 ㎖ 에 용해시켜 15 ℃ 로 냉각한 후에 이것에 샘브라이트 VFM 4101 [일본유지주식회사제] 25 g 을 첨가하여 4 시간 동안 반응시켰다. 시약 B 의 PEG 수식 콜레스테롤 에스테라아제로서는 이 반응액 대로 사용하였다 (PEG 부분 분자량 = 6000). 또한 브레비박테리움 유래의 콜레스테롤 옥시다아제 1 g 및 샘브라이트 VFM 4101, 0.5 g 를 사용하여 상기와 동일하게 반응시켰다. 시약 A 의 PEG 수식 콜레스테롤 옥시다아제로서는 이 반응액 대로 사용하였다 (PEG 부분 분자량 = 6000).

(2) LDL 콜레스테롤의 정량

시약 A

MOPS 완충제 20 mM (pH = 7)

황산 Mg·7 수화물 2 g/l

퍼옥시다아제 30 u/㎖

PEG 수식 콜레스테롤 에스테라아제 2 u/㎖

PEG 수식 콜레스테롤 옥시다아제 5 u/㎖

콜산 나트륨 1 g/l

EMSE 0.3 g/l

아스코르빈산 옥시다아제 3 u/㎖

시약 B

MOPS 완충제 20 mM (pH = 7)

미수식 콜레스테롤 에스테라아제 3 u/㎖

4-아미노안티피린 0.4 g/l

초원심법으로 측정하여 LDL 콜레스테롤 228.4 ㎎/㎗ 를 함유하는 혈청을 ① 그대로, ② 생리 식염수로 8/10 희석한 것, ③ 동 6/10 희석한 것, ④ 동 4/10 희석한 것, ⑤ 동 2/10 희석한 것 및 ⑥ 생리 식염수만을 각각 검체해서 하기의 조작을 행하였다.

검체 20 ㎕ 를 시약 A, 2.25 ㎖ 에 첨가하여 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션하여 LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 제거하였다. 이어서 시약 B, 0.75 ㎖ 를 첨가하여 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션한 후에 파장 600 nm 에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 수득된 결과를 제 3 도에 나타낸다.

한편, 별도로 미리 시약 A 와 시약 B 를 3 : 1 의 비율로 혼합한 액에 콜레스테롤 200 ㎎/㎗ 의 표준액 20 ㎕ 를 첨가하여 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션한 후에 파장 600 nm 에 측정하여 수득된 흡광도에 의하여 상기 혈청 검체의 LDL 콜레스테롤 농도를 산출한 바, 229.7 ㎎/㎗ 와 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 12

실시예 11 (2) 에 기재된 시약 B 를 사용하고, 시약 A 에 하기의 여러 가지의 조합의 응집제 및 2 가의 금속염을 가하여 사용하고, 실시예 11 (2) 에서 사용된 혈청 검체를 히타치 7070 자동 분석기 (검체 4 ㎕, 시약 A, 270 ㎕, 시약 B, 90 ㎕ 의 조건) 로 각각 측정하였다. 한편, 히타치 RPL 42 T 로터를 사용하고, 현대의료, 제 23 권 (제 1 호), 113 페이지, 1991 년에 기재된 방법 (초원심법) 에 준하여 LDL 콜레스테롤을 정량하였다. 그 결과 표 2 에 나타난 바와 같이 어떠한 경우에도 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

가. 인텅스텐산 0.1 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 1 ㎎/㎖

나. 덱스트란황산나트륨 (MW = 20000) 1 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 2 ㎎/㎖

다. 헤파린나트륨 0.3 ㎎/㎖

염화 Ca·2 수화물 3 ㎎/㎖

라. PEG 20000 20 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 3 ㎎/㎖

마. 인텅스텐산 0.1 ㎎/㎖

덱스트란황산나트륨 (MW = 200000) 0.1 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 2 ㎎/㎖

바. 인텅스텐산 0.1 ㎎/㎖

헤파린나트륨 0.1 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 2 ㎎/㎖

사. 덱스트란황산 (MW = 500000) 0.1 ㎎/㎖

PEG 6000 5 ㎎/㎖

황산 Mg·7 수화물 2 ㎎/㎖

시약 A	측정치
가	224.5 ㎎/㎗
나	229.1 〃
다	226.6 〃
라	227.3 〃
마	227.0 〃
바	230.8 〃
사	225.9 〃
초원심법	228.4 〃

실시예 13

샘브라이트 VFM 4101 로 바꾸어 샘브라이트 AKM 1511 [일본유지주식회사제], 폴리우레탄 P 4000 activated (뵈링거만하임사 제) 혹은 덱스트란 T 40, TCT-activated (뵈링거만하임사 제) 를 사용하고 실시예 11 (1) 과 동일하게 하여 효소를 화학 수식하였다. 실시예 11 (2) 에 기재된 시약 B 를 사용하고, 시약 A 에 있어서 PEG 수식 콜레스테롤 에스테라아제 및 PEG 수식 콜레스테롤 옥시다아제로 바꾸어 상기에서 수득된 화학 수식 효소를 사용하고, 실시예 11 (2) 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 11 (2) 와 동일하게 해서 측정하였다. 그 결과 각각 228.0 ㎎/㎗, 229.1 ㎎/㎗, 226.8 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 14

실시예 11 (2) 에 기재된 시약 A 에 있어서 퍼옥시다아제로 바꾸어 카탈라아제를 300 u/㎖ 의 농도로 사용하고, 시약 B 에 퍼옥시다아제 300 u/㎖ 및 아지화 나트륨 0.5 ㎎/㎖ 를 가하여 사용하고, 실시예 11 (2) 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 11 (2) 와 동일하게 해서 측정하였다. 그 결과 228.6 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 15

실시예 11 (2) 에 기재된 시약 B 를 사용하고, 시약 A 에 있어서 EMSE 으로 바꾸어 TOOS (측정 파장 555 nm), DAOS (측정 파장 593 nm), MAOS (측정 파장 630 nm) 또는 TOPS (측정 파장 550 nm) 를 같은 농도로 사용하고, 실시예 11 (2) 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 11 (2) 와 동일하게 해서 측정하였다. 그 결과 각각 227.9 ㎎/㎗, 227.4 ㎎/㎗, 225.2 ㎎/㎗, 224.8 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 16

실시예 11 (2) 에 기재한 시약 A 에 있어서 EMSE 를 제거하고, 시약 B 에 있어서 4-아미노안티피린으로 바꾸어 MCDP (측정 파장 666 nm) 또는 BCMA 황산염 (측정 파장 755 nm) 를 0.1 ㎎/㎖ 농도로 사용하고, 실시예 11 (2) 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 11 (2) 와 동일하게 해서 측정하였다. 그 결과 각각 228.3 ㎎/㎗, 229.0 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 17

실시예 11 (2) 에 기재된 시약 A 를 사용하고, 시약 B 에 폴리옥시에틸렌모노라우레이트 5 ㎎/㎖, 트리톤 X-100, 5 ㎎/㎖ 또는 도데실벤젠술폰산 나트륨 1 ㎎/㎖ 를 가하여 사용하고, 실시예 11 (2) 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 11 (2) 와 동일하게 해서 측정하였다. 반응은 3 분 이내에 완료되었고, 그 결과 각각 228.6 ㎎/㎗, 226.1 ㎎/㎗, 227.0 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 18

실시예 11 (2) 에 기재된 시약 A 를 사용하고, 시약 B 에 있어서 미수식 콜레스테롤 에스테라아제로 바꾸어 폴리옥시에틸렌모노우라레이트 5 ㎎/㎖, 트리톤 X-100, 5 ㎎/㎖ 혹은 도데실벤젠술폰산 나트륨 1 ㎎/㎖ 를 사용하고, 실시예 11 (2) 으로 사용된 혈청 검체를 실시예 11 (2) 와 동일하게 해서 측정하였다. 반응은 3 분 이내에 완료되었고, 그 결과 각각 227.9 ㎎/㎗, 229.2 ㎎/㎗, 226.1 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

실시예 19

실시예 11 (2) 에 기재된 시약 B 를 사용하고, 시약 A 에 있어서 콜산으로 바꾸어 데옥시콜산 혹은 타울로콜산을 같은 농도로 사용하고, 실시예 11 (2) 에서 사용된 혈청 검체를 실시예 11 (2) 와 동일하게 해서 측정하였다. 그 결과 각각 229.9 ㎎/㎗, 225.7 ㎎/㎗ 과 초원심법으로 수득된 값과 잘 일치한 값이 수득되었다.

본 발명에 의하면 번잡한 분리 조작이 필요없는 간단한 LDL 콜레스테롤의 정량법을 제공할 수 있다.

Claims (30)

1. 하기와 같이 이루어지는 것을 특징으로 하는, 저밀도 리포단백 (LDL) 을 함유하는 시료에서 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법으로,

   - LDL 과의 반응을 저해하는 시약의 존재하에서, 상기 시료에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소, 콜레스테롤 산화효소 (또는 콜레스테롤 산화환원효소) 및 카탈라아제, 퍼옥시다아제와 아닐린 화합물, 퍼옥시다아제와 페놀화합물, 또는 퍼옥시다아제와 4-아미노안티피린 [또는 NAD(P)] 첨가 반응시켜 HDL 중의 콜레스테롤을 제거한 다음,

   - 상기 시료에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소를 작용시키고 및 콜레스테롤 산화효소 (또는 콜레스테롤 산화환원효소)를 작용시켜 발생하는 과산화수소 또는 환원형 보효소를 정량하여 콜레스테롤을 정량하는 것을 특징으로 하는 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
2. 제 1 항에 있어서, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소를 작용시키고 및 콜레스테롤 산화 효소 (또는 콜레스테롤 산화 환원 효소)를 작용시킬 때에 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약을 존재시키는 것으로 이루어진 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
3. 제 2 항에 있어서, HDL 중의 콜레스테롤을 제거하는 방법이 HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약의 존재 하에, 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소를 작용시키고 및 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 산화 효소 (또는 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 산화 환원 효소)를 작용시키는 방법인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
4. 제 3 항에 있어서, HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약이 헤파린 또는 그의 염, 인텅스텐산 또는 그의 염, 덱스트란 황산 또는 그의 염, 폴리에틸렌글리콜, 황산화 시크로덱스트린 또는 그의 염, 황산화 올리고당 또는 그의 염, 또는 이들의 혼합물 및 2 가의 금속염으로 이루어진 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
5. 제 3 항에 있어서, HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약이 항아포 B 항체 또는 항아포 C 항체인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학 수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 또는 화학 수식된 콜레스테롤 산화 효소 (또는 화학 수식된 콜레스테롤 산화 환원 효소)에 있어서의 수식 부분이 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 구조에 당류를 함유하는 기, 술포프로필기 또는 폴리우레탄기인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
7. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약이 비이온계, 양이온 또는 음이온계 계면활성제, 시크로덱스트린류, LDL 에 작용하는 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, LDL 에만 작용하는 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 산화 효소 (또는 LDL 에 작용하는 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 산화 환원 효소)인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
8. 제 1 항에 있어서, HDL 중의 콜레스테롤을 제거하는 방법이 LDL 만을 반응 저해하는 시약의 존재 하에서 LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 제거하는 방법인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
9. 제 8 항에 있어서, LDL 이외의 리포단백 중의 콜레스테롤을 제거한 후에 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약을 가하는 것으로 이루어진 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
10. 제 9 항에 있어서, LDL 만을 반응 저해하는 시약이 LDL 만을 반응 저해하는 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
11. 제 10 항에 있어서, 화학 수식된 콜레스테롤 에스테라아제에 있어서의 수식 부분이 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 구조에 당류를 함유하는 기, 술포프로필기 또는 폴리우레탄기인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약이 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
13. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약이 계면활성제 또는 킬레이트제인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
14. 제 1 항 내지 제 5 항 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 산화 환원 효소가 동물, 식물 또는 미생물 유래의 효소 또는 그들의 유전자를 취하고, 다른 미생물에 도입해서 발현시킨 효소, 혹은 이들 유전자를 변경해서 발현시킨 효소인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
15. 제 1 항 내지 제 5 항 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 과산화수소를 정량하는 방법이 과산화수소를 퍼옥시다아제와 색소원의 작용에 의해 색소로 변경시켜 정량하는 방법인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
16. HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약 및 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약을 성분으로 하는, 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 기재된 LDL 중의 콜레스테롤 정량법에 이용가능한, LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
17. 제 16 항에 있어서, HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약과 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약이 각각 분리되어 존재하고, 이를 조합하여 사용하는 것으로 이루어진 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
18. 제 16 항에 있어서, HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약이 헤파린 또는 그의 염, 인텅스텐산 또는 그의 염, 덱스트란황산 또는 그의 염, 폴리에틸렌글리콜, 황산화 시크로덱스트린 또는 그의 염, 황산화 올리고당 또는 그의 염 혹은 이들의 혼합물, 및 2 가의 금속염으로 이루어진 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
19. 제 16 항에 있어서, HDL 이외의 리포단백을 반응 저해하는 시약이 항아포 B 항체 또는 항아포 C 항체인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
20. 제 16 항에 있어서, LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약이 비이온계, 양이온계 또는 음이온계 계면활성제, 시크로덱스트린류, LDL 에 작용하는 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, LDL 에만 작용하는 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 산화 효소 (또는 LDL 에 작용하는 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 산화 환원 효소)인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
21. LDL 만을 반응 저해하는 시약 및 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약을 성분으로 하는, 제 1 항, 제 8 항 또는 제 9 항에 기재된 LDL 중의 콜레스테롤 정량법에 이용가능한, LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
22. 제 21 항에 있어서, LDL 만을 반응 저해하는 시약과 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약이 각각 분리되어 존재하고, 이를 조합해서 사용하는 것으로 이루어진 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
23. 제 21 항에 있어서, LDL 만을 반응 저해하는 시약이 LDL 만을 반응 저해하는 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
24. 제 23 항에 있어서, 화학 수식된 콜레스테롤 에스테라아제에 있어서의 수식 부분이 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 구조에 당류를 함유하는 기, 술포프로필기 또는 폴리우레탄기인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
25. 제 21 항에 있어서, LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약이 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
26. 제 21 항에 있어서, LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약이 계면활성제 또는 킬레이트제인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
27. 제 22 항에 있어서, LDL 만을 반응 저해하는 시약이 LDL 만을 반응 저해하는 화학 수식되거나 미수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
28. 제 27 항에 있어서, 화학 수식된 콜레스테롤 에스테라아제에 있어서의 수식 부분이 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 구조에 당류를 함유하는 기, 술포프로필기 또는 폴리우레탄기인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
29. 제 22 항에 있어서, LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약이 LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.
30. 제 22 항에 있어서, LDL 중의 콜레스테롤을 반응 가능화하는 시약이 계면활성제 또는 킬레이트제인 LDL 중의 콜레스테롤의 정량 시약.