JP3091230B2 - 低密度リポ蛋白中または超低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 - Google Patents
低密度リポ蛋白中または超低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、臨床診断の分野において脂質代謝の面で重
要な低密度リポ蛋白（LDL）または超低密度リポ蛋白（V
LDL）中のコレステロール（以下、LDLコレステロールお
よびVLDLコレステロールという）の定量法に関する。
要な低密度リポ蛋白（LDL）または超低密度リポ蛋白（V
LDL）中のコレステロール（以下、LDLコレステロールお
よびVLDLコレステロールという）の定量法に関する。
背景技術 LDLは、末梢細胞にコレステロールを供給する役割を
有するとされ、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬
化症の直接的因子であり、その血中レベルは動脈硬化性
疾患の指標となることが知られている。また、トリグリ
セライド（TG）を豊富に含有するVLDLも動脈硬化との関
連性が注目されている。従来のLDLコレステロールの定
量法としては、超遠心法、電気泳動法、換算法などがあ
り、VLDLコレステロールの定量法としては、超遠心法、
電気泳動法などがある。超遠心法は、基本的定量法とし
て用いられており、分離用超遠心器で比重の差によって
LDLあるいはVLDLを分離し、そのコレステロール量を測
定する〔アドバンスド・リピッド・リサーチ（Adv.Lipi
d Res.）、第６巻、１頁、1968年〕。しかしながら、
定量性、簡便性、経済性などの面で欠点がある。電気泳
動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜やアガ
ロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法によりコ
レステロールを定量する（臨床検査、第29巻、1344頁、
1985年）。この方法は、簡便性、経済性などの面で問題
がある。換算法では、次の計算式に従いLDLコレステロ
ール量を算出する〔クリニカル・ケミストリー（Clin.C
hem.）、第18巻、499頁、1972年〕。
有するとされ、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬
化症の直接的因子であり、その血中レベルは動脈硬化性
疾患の指標となることが知られている。また、トリグリ
セライド（TG）を豊富に含有するVLDLも動脈硬化との関
連性が注目されている。従来のLDLコレステロールの定
量法としては、超遠心法、電気泳動法、換算法などがあ
り、VLDLコレステロールの定量法としては、超遠心法、
電気泳動法などがある。超遠心法は、基本的定量法とし
て用いられており、分離用超遠心器で比重の差によって
LDLあるいはVLDLを分離し、そのコレステロール量を測
定する〔アドバンスド・リピッド・リサーチ（Adv.Lipi
d Res.）、第６巻、１頁、1968年〕。しかしながら、
定量性、簡便性、経済性などの面で欠点がある。電気泳
動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜やアガ
ロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法によりコ
レステロールを定量する（臨床検査、第29巻、1344頁、
1985年）。この方法は、簡便性、経済性などの面で問題
がある。換算法では、次の計算式に従いLDLコレステロ
ール量を算出する〔クリニカル・ケミストリー（Clin.C
hem.）、第18巻、499頁、1972年〕。
(LDLコレステロール量)＝(総コレステロール量) −(HDLコレステロール量)−(トリグリセライド量)/5 しかし、この方法は、血清中のTGの含有量および高脂
血症の型などにより制限されるため、簡便性、正確性、
多数検体処理などの面で問題がある。以上のように、従
来のLDLコレステロールまたはVLDLコレステロールの定
量法は、多数検体処理、迅速測定および臨床検査の分野
で多く使用されている自動分析装置には不向きである。
さらに、従来の定量法では、分離したLDL画分を定量ピ
ペットではかり取る場合などの人的誤差も生じ易い。し
かしながら、単純にLDLまたはVLDLを分画せずに血清検
体を直接コレステロールエステラーゼとコレステロール
オキシダーゼが含有された試薬に添加しても、総コレス
テロールを定量する系と変わりがなく、LDLコレステロ
ールまたはVLDLコレステロールを特異的に定量できな
い。
血症の型などにより制限されるため、簡便性、正確性、
多数検体処理などの面で問題がある。以上のように、従
来のLDLコレステロールまたはVLDLコレステロールの定
量法は、多数検体処理、迅速測定および臨床検査の分野
で多く使用されている自動分析装置には不向きである。
さらに、従来の定量法では、分離したLDL画分を定量ピ
ペットではかり取る場合などの人的誤差も生じ易い。し
かしながら、単純にLDLまたはVLDLを分画せずに血清検
体を直接コレステロールエステラーゼとコレステロール
オキシダーゼが含有された試薬に添加しても、総コレス
テロールを定量する系と変わりがなく、LDLコレステロ
ールまたはVLDLコレステロールを特異的に定量できな
い。
発明の開示 本発明者らは、糖化合物および／または蛋白可溶化剤
を存在させたコレステロール測定試薬の系により超遠心
で分画された高密度リポ蛋白（HDL）、LDL、VLDLおよび
カイロミクロン（CM）の各リポ蛋白を用いて測定したと
ころ、糖化合物および／または蛋白可溶化剤の組み合わ
せにより各リポ蛋白との反応性が異なり、その結果HDL
中のコレステロール、LDLコレステロール、VLDLコレス
テロール、CM中のコレステロールの反応性が異なること
を見い出し、本発明に至った。
を存在させたコレステロール測定試薬の系により超遠心
で分画された高密度リポ蛋白（HDL）、LDL、VLDLおよび
カイロミクロン（CM）の各リポ蛋白を用いて測定したと
ころ、糖化合物および／または蛋白可溶化剤の組み合わ
せにより各リポ蛋白との反応性が異なり、その結果HDL
中のコレステロール、LDLコレステロール、VLDLコレス
テロール、CM中のコレステロールの反応性が異なること
を見い出し、本発明に至った。
本発明は、糖化合物および／または蛋白可溶化剤存在
下、試料中のLDLコレステロール量またはVLDLコレステ
ロール量を測定することを特徴とするLDLコレステロー
ルまたはVLDLコレステロールの定量法に関する。上記測
定の際には、さらに特異性を上げるため、２価の金属塩
を併用して添加することもできる。
下、試料中のLDLコレステロール量またはVLDLコレステ
ロール量を測定することを特徴とするLDLコレステロー
ルまたはVLDLコレステロールの定量法に関する。上記測
定の際には、さらに特異性を上げるため、２価の金属塩
を併用して添加することもできる。
また、本発明により、糖化合物および／または蛋白可
溶化剤を成分とするLDLまたはVLDL中のコレステロール
の定量試薬、あるいは糖化合物と蛋白可溶化剤を組み合
わせてなるLDLまたはVLDL中のコレステロールの定量試
薬を提供することができる。
溶化剤を成分とするLDLまたはVLDL中のコレステロール
の定量試薬、あるいは糖化合物と蛋白可溶化剤を組み合
わせてなるLDLまたはVLDL中のコレステロールの定量試
薬を提供することができる。
糖化合物としては、グルコース誘導体が好ましく用い
られ、グルコース誘導体としては、例えば、一般式
（Ｉ） 〔式中、R1、R2およびR3は同一または異なって水素、置
換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のア
ルカノイル、SO3M2（式中、M2は水素または金属を表
す）、−（グルコシル）ｐ−Ｈ（式中、ｐは１または２
を表す）または−（マルトシル）ｑ−Ｈ（式中、ｑは１
または２を表す）を表し、R4およびR5は同一または異な
って水素、金属またはSO3M3（式中、M3は水素または金
属を表す）を表し、ｍは６〜８の整数を表す〕で表され
る化合物、一般式（II） 〔式中、R6、R7およびR8は同一または異なって水素また
はSO3M4（式中、M4は水素または金属を表す）を表し、R
9は水素、OM5（式中、M5は水素または金属を表す）また
はOSO3M6（式中、M6は水素または金属を表す）を表し、
R10は水素、金属またはSO3M7（式中、M7は水素または金
属を表す）を表し、ｎは４〜8000の整数を表す〕で表さ
れる化合物などがあげられる。
られ、グルコース誘導体としては、例えば、一般式
（Ｉ） 〔式中、R1、R2およびR3は同一または異なって水素、置
換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のア
ルカノイル、SO3M2（式中、M2は水素または金属を表
す）、−（グルコシル）ｐ−Ｈ（式中、ｐは１または２
を表す）または−（マルトシル）ｑ−Ｈ（式中、ｑは１
または２を表す）を表し、R4およびR5は同一または異な
って水素、金属またはSO3M3（式中、M3は水素または金
属を表す）を表し、ｍは６〜８の整数を表す〕で表され
る化合物、一般式（II） 〔式中、R6、R7およびR8は同一または異なって水素また
はSO3M4（式中、M4は水素または金属を表す）を表し、R
9は水素、OM5（式中、M5は水素または金属を表す）また
はOSO3M6（式中、M6は水素または金属を表す）を表し、
R10は水素、金属またはSO3M7（式中、M7は水素または金
属を表す）を表し、ｎは４〜8000の整数を表す〕で表さ
れる化合物などがあげられる。
蛋白可溶化剤としては、一般式（III） R11（C2H4O）ａ−（C3H6O）bR12 （III） 〔式中、ａおよびｂは０〜200の整数を表し、R11はR20
−Ｘ−Ｏ−（式中、R20はアルキルまたはアルケニルを
表し、Ｘは単結合またはCOを表す）またはＨ−（CH2CH2
O）ｃ−Ｎ（R21）−（式中、ｃは１〜200の整数を表
し、R21はアルキルまたはアルケニルを表す）を表し、R
12はC2H4COOR22、C3H6COOR23、C2H4CH（COOR24）２また
はC2H4CH（COOR25）（COOR26）（式中、R22、R23、
R24、R25およびR26は同一または異なって水素、金属、
アルキルまたはアルケニルを表す）を表す。ただし、ａ
およびｂは同時には０を表さず、両成分はランダムに存
在することができる〕で表される化合物、一般式（IV） （式中、R13、R14、R15、R16、R17およびR18は同一また
は異なってアルカノイルを表す）で表される化合物また
は一般式（Ｖ） R19−Ｙ−SO3M1 （Ｖ） 〔式中、R19はアルキル、アルケニルまたは置換もしく
は非置換のアリールを表し、Ｙは単結合、 −Ｏ−、−CH（R27）−（式中、R27はアルキルまたはア
ルケニルを表す）、−CH2CH（OH）（CH2）ｄ−（式中、
ｄは１〜22の整数を表す）、−CH＝CH（CH2）ｅ−（式
中、ｅは１〜22の整数を表す）、−OCOCH（CH2COOR28）
−（式中、R28はアルキルまたはアルケニルを表す）ま
たはこれらの混合物を表し、M1は水素または金属を表
す〕で表される化合物が好ましく用いられる。
−Ｘ−Ｏ−（式中、R20はアルキルまたはアルケニルを
表し、Ｘは単結合またはCOを表す）またはＨ−（CH2CH2
O）ｃ−Ｎ（R21）−（式中、ｃは１〜200の整数を表
し、R21はアルキルまたはアルケニルを表す）を表し、R
12はC2H4COOR22、C3H6COOR23、C2H4CH（COOR24）２また
はC2H4CH（COOR25）（COOR26）（式中、R22、R23、
R24、R25およびR26は同一または異なって水素、金属、
アルキルまたはアルケニルを表す）を表す。ただし、ａ
およびｂは同時には０を表さず、両成分はランダムに存
在することができる〕で表される化合物、一般式（IV） （式中、R13、R14、R15、R16、R17およびR18は同一また
は異なってアルカノイルを表す）で表される化合物また
は一般式（Ｖ） R19−Ｙ−SO3M1 （Ｖ） 〔式中、R19はアルキル、アルケニルまたは置換もしく
は非置換のアリールを表し、Ｙは単結合、 −Ｏ−、−CH（R27）−（式中、R27はアルキルまたはア
ルケニルを表す）、−CH2CH（OH）（CH2）ｄ−（式中、
ｄは１〜22の整数を表す）、−CH＝CH（CH2）ｅ−（式
中、ｅは１〜22の整数を表す）、−OCOCH（CH2COOR28）
−（式中、R28はアルキルまたはアルケニルを表す）ま
たはこれらの混合物を表し、M1は水素または金属を表
す〕で表される化合物が好ましく用いられる。
以下、一般式（Ｉ）〜一般式（Ｖ）で表される化合物
をそれぞれ化合物（Ｉ）〜化合物（Ｖ）という。
をそれぞれ化合物（Ｉ）〜化合物（Ｖ）という。
一般式（Ｉ）〜一般式（Ｖ）の各基の定義において、
アルキルおよびアルカノイルのアルキル部分としては、
直鎖または分枝状の炭素数１〜22の、例えば、メチル、
エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチ
ル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペン
チル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、デシル、ペ
ンタデシル、イコサニル、ドコサニルなどがあげられ、
アルケニルとしては、直鎖または分枝状の炭素数２〜22
の、例えば、ビニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニ
ル、ヘキセニル、ヘプテニル、デセニル、ペンタデセニ
ル、イコセニル、ドコセニルなどがあげられる。アリー
ルは、フェニルまたはナフチルを表し、金属としては、
リチウム、ナトリウム、カリウムなどがあげられる。
アルキルおよびアルカノイルのアルキル部分としては、
直鎖または分枝状の炭素数１〜22の、例えば、メチル、
エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチ
ル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペン
チル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、デシル、ペ
ンタデシル、イコサニル、ドコサニルなどがあげられ、
アルケニルとしては、直鎖または分枝状の炭素数２〜22
の、例えば、ビニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニ
ル、ヘキセニル、ヘプテニル、デセニル、ペンタデセニ
ル、イコセニル、ドコセニルなどがあげられる。アリー
ルは、フェニルまたはナフチルを表し、金属としては、
リチウム、ナトリウム、カリウムなどがあげられる。
置換アルキルおよび置換アルカノイルの置換基として
は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホなどがあ
げられる。置換アリールの置換基としては、例えば、ア
ルキルなどがあげられ、アルキルは、前記アルキルと同
意義を表す。
は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホなどがあ
げられる。置換アリールの置換基としては、例えば、ア
ルキルなどがあげられ、アルキルは、前記アルキルと同
意義を表す。
糖化合物としては、シクロデキストリン誘導体が、特
にメチル化シクロデキストリンなどが好ましく用いられ
る。例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキ
ストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−β−シ
クロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリ
ン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−
ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、２−ヒ
ドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、カルボキ
シメチル−β−シクロデキストリン、グルコシル−β−
シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキスト
リン、マルトシル−β−シクロデキストリン、パーシャ
リーメチル−β−シクロデキストリン、α−シクロデキ
ストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフ
ェートなどがあげられる。
にメチル化シクロデキストリンなどが好ましく用いられ
る。例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキ
ストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−β−シ
クロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリ
ン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−
ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、２−ヒ
ドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、カルボキ
シメチル−β−シクロデキストリン、グルコシル−β−
シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキスト
リン、マルトシル−β−シクロデキストリン、パーシャ
リーメチル−β−シクロデキストリン、α−シクロデキ
ストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフ
ェートなどがあげられる。
蛋白可溶化剤としては、化合物（III）、化合物（I
V）または化合物（Ｖ）などの界面活性剤の中でも、特
にノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤などが
好ましく用いられる。ノニオン系界面活性剤としては、
例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオ
キシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステ
アリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル、ポリオキシ
エチレンモノラウレート、ポリオキシエチレンモノステ
アレート、ポリオキシエチレンモノオレエート、ポリオ
キシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンステ
アリルアミン、しょ糖脂肪酸エステルなどがあげられ、
アニオン系界面活性剤としては、例えば、ドデシルベン
ゼンスルホン酸ナトリウム、ノルマルドデシルベンゼン
スルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、高級
アルコール硫酸エステルソーダなどがあげられる。
V）または化合物（Ｖ）などの界面活性剤の中でも、特
にノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤などが
好ましく用いられる。ノニオン系界面活性剤としては、
例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオ
キシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステ
アリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル、ポリオキシ
エチレンモノラウレート、ポリオキシエチレンモノステ
アレート、ポリオキシエチレンモノオレエート、ポリオ
キシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンステ
アリルアミン、しょ糖脂肪酸エステルなどがあげられ、
アニオン系界面活性剤としては、例えば、ドデシルベン
ゼンスルホン酸ナトリウム、ノルマルドデシルベンゼン
スルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、高級
アルコール硫酸エステルソーダなどがあげられる。
２価の金属塩としては、0.01〜20mMのマグネシウム
塩、カルシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、コバルト
塩などがあげられ、好ましくは、0.01〜20mMのマグネシ
ウム塩が用いられる。
塩、カルシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、コバルト
塩などがあげられ、好ましくは、0.01〜20mMのマグネシ
ウム塩が用いられる。
本発明は、糖化合物および／または蛋白可溶化剤をコ
レステロール測定試薬系と共存させる点に特徴を有する
ものであり、コレステロール測定系自体は下記の反応原
理に基づく一般法に従うものである。ただし、色素源お
よび測定波長はこれに限定されるものではない。
レステロール測定試薬系と共存させる点に特徴を有する
ものであり、コレステロール測定系自体は下記の反応原
理に基づく一般法に従うものである。ただし、色素源お
よび測定波長はこれに限定されるものではない。
例えば、色素源としては、一般に使用される４−アミ
ノアンチピリンとフェノール、４−クロロフェノール、
ｍ−クレゾール、３−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード
安息香酸（HTIB）などのフェノール類との組合せの他、
４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬として知られ
ている（同仁化学研究所第19版総合カタログ、1994年）
Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
（TOOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−3,5−ジメチルアニリン（MAOS）、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−3,5−ジメトキシアニリン（DAOS）、Ｎ−エチル
−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（TOPS）、Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−3,5−ジメ
トキシアニリン（HDAOS）、N,N−ジメチル−ｍ−トルイ
ジン、N,N−ジスルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリ
ン、Ｎ−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン、
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−3,5−ジメチルアニ
リン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−3,
5−ジメトキシアニリンなどのアニリン類あるいはＮ−
エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−サクシニ
ルエチレンジアミン（EMSE）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
メチルフェニル）−Ｎ′−アセチルエチレンジアミンな
どとの組合せが使用できる。また、高感度の色素源とし
て、特公昭60−33479で示される10−（Ｎ−メチルカル
バモイル）−3,7−ビス（ジメチルアミノ）フェノチア
ジン（MCDP）、特公平４−27839で示されるビス［３−
ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミ
ノフェニル］アミン（BCMA）、特開昭62−296で示され
る色素源なども使用可能であり、これらに４−アミノア
ンチピリンあるいは上記で示したトリンダー試薬を組み
合わせて用いることもできる。色素源の濃度としては、
0.01〜10mg/mlが好ましく、溶解度の関係で制限され
る。
ノアンチピリンとフェノール、４−クロロフェノール、
ｍ−クレゾール、３−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード
安息香酸（HTIB）などのフェノール類との組合せの他、
４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬として知られ
ている（同仁化学研究所第19版総合カタログ、1994年）
Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
（TOOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−3,5−ジメチルアニリン（MAOS）、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−3,5−ジメトキシアニリン（DAOS）、Ｎ−エチル
−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（TOPS）、Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−3,5−ジメ
トキシアニリン（HDAOS）、N,N−ジメチル−ｍ−トルイ
ジン、N,N−ジスルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリ
ン、Ｎ−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン、
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−3,5−ジメチルアニ
リン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−3,
5−ジメトキシアニリンなどのアニリン類あるいはＮ−
エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−サクシニ
ルエチレンジアミン（EMSE）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
メチルフェニル）−Ｎ′−アセチルエチレンジアミンな
どとの組合せが使用できる。また、高感度の色素源とし
て、特公昭60−33479で示される10−（Ｎ−メチルカル
バモイル）−3,7−ビス（ジメチルアミノ）フェノチア
ジン（MCDP）、特公平４−27839で示されるビス［３−
ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミ
ノフェニル］アミン（BCMA）、特開昭62−296で示され
る色素源なども使用可能であり、これらに４−アミノア
ンチピリンあるいは上記で示したトリンダー試薬を組み
合わせて用いることもできる。色素源の濃度としては、
0.01〜10mg/mlが好ましく、溶解度の関係で制限され
る。
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロー
ル酸化酵素あるいはコレステロール脱水素酵素として
は、通常市販されている、コレステロールエステルを加
水分解する能力を有する微生物または動物由来のコレス
テロールエステラーゼやリポプロテインリパーゼ、コレ
ステロールを酸化して過酸化水素を生成する微生物由来
のコレステロールオキシダーゼ、微生物または動物由来
のコレステロールデヒドロゲナーゼなどがあげられる
が、これら酵素の特異性、安定性をさらにあげるために
ポリエチレングリコールを主成分とする基、水溶性のオ
リゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記の酵素を化学
的に修飾したものも用いられる。また、遺伝子操作によ
ってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現
させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あ
るいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素または
これらを化学的に修飾した修飾体なども好適に用いられ
る。
ル酸化酵素あるいはコレステロール脱水素酵素として
は、通常市販されている、コレステロールエステルを加
水分解する能力を有する微生物または動物由来のコレス
テロールエステラーゼやリポプロテインリパーゼ、コレ
ステロールを酸化して過酸化水素を生成する微生物由来
のコレステロールオキシダーゼ、微生物または動物由来
のコレステロールデヒドロゲナーゼなどがあげられる
が、これら酵素の特異性、安定性をさらにあげるために
ポリエチレングリコールを主成分とする基、水溶性のオ
リゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記の酵素を化学
的に修飾したものも用いられる。また、遺伝子操作によ
ってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現
させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あ
るいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素または
これらを化学的に修飾した修飾体なども好適に用いられ
る。
酵素を修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、
例えば、ポリエチレングリコールにアミノ基と結合可能
な基を結合させた化合物｛ポリエチレングリコールにＮ
−ヒドロキシサクシンイミド基などのアミノ基と結合可
能な基を結合させたサンブライト VFM4101［日本油脂
（株）製］など｝、ポリアルキレングリコール構造およ
び酸無水物構造を有するサンブライトAKMシリーズ、同A
DMシリーズ、同ACMシリーズ［いずれも日本油脂（株）
製：化学工学論文集、第20巻、第３号、459頁、1994
年］、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコ
ールの共重合体にアミノ基と結合可能な基を結合させた
化合物、ポリエチレングリコールモノメタクリルモノメ
チルエーテルと無水マレイン酸の共重合体などがあげら
れる。また、ポリウレタンの化学修飾剤であるポリウレ
タンP4000activated（ベーリンガーマンハイム社製 En
zyme modification set能書）、デキストランの化学修
飾剤であるデキストランT40,TCT−activated（同）、1,
3−プロパンサルトンなども使用できる。
例えば、ポリエチレングリコールにアミノ基と結合可能
な基を結合させた化合物｛ポリエチレングリコールにＮ
−ヒドロキシサクシンイミド基などのアミノ基と結合可
能な基を結合させたサンブライト VFM4101［日本油脂
（株）製］など｝、ポリアルキレングリコール構造およ
び酸無水物構造を有するサンブライトAKMシリーズ、同A
DMシリーズ、同ACMシリーズ［いずれも日本油脂（株）
製：化学工学論文集、第20巻、第３号、459頁、1994
年］、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコ
ールの共重合体にアミノ基と結合可能な基を結合させた
化合物、ポリエチレングリコールモノメタクリルモノメ
チルエーテルと無水マレイン酸の共重合体などがあげら
れる。また、ポリウレタンの化学修飾剤であるポリウレ
タンP4000activated（ベーリンガーマンハイム社製 En
zyme modification set能書）、デキストランの化学修
飾剤であるデキストランT40,TCT−activated（同）、1,
3−プロパンサルトンなども使用できる。
次に、酵素に上記化学修飾剤を反応させる方法を例示
するが、これによって制約されない。まず、酵素をpH8
以上のリン酸緩衝液などの緩衝液中に溶解し、０〜50℃
で例えば0.01〜500倍モル量のサンブライトを添加し、
５分間〜24時間撹拌する。この反応液をそのままあるい
は必要に応じて限外濾過膜により低分子物を除去して用
いる。コレステロールエステル加水分解酵素、コレステ
ロール酸化酵素およびコレステロール脱水素酵素は、0.
1〜100u/mlで使用するのが好ましい。
するが、これによって制約されない。まず、酵素をpH8
以上のリン酸緩衝液などの緩衝液中に溶解し、０〜50℃
で例えば0.01〜500倍モル量のサンブライトを添加し、
５分間〜24時間撹拌する。この反応液をそのままあるい
は必要に応じて限外濾過膜により低分子物を除去して用
いる。コレステロールエステル加水分解酵素、コレステ
ロール酸化酵素およびコレステロール脱水素酵素は、0.
1〜100u/mlで使用するのが好ましい。
本発明方法は、血液、尿などのLDLあるいはVLDLを含
有する体液に適用できる。
有する体液に適用できる。
次に、本発明の定量法について例をあげて説明する。
方法１ 本発明を実施するに際しては、まず、糖化合物溶液お
よび／または蛋白可溶化剤溶液を調製する。糖化合物溶
液は、糖化合物を適当な緩衝液、例えば50mM Tris−HC
l緩衝液（pH7.4）に溶解し、反応時に例えば100mM以
下、好ましくは３〜80mMの濃度になるように調製する。
なお、糖化合物はあらかじめコレステロール測定試薬中
に共存させてもおいてもよい。蛋白可溶化剤溶液は、蛋
白可溶化剤を適当な緩衝液、例えば50mM Tris−HCl緩
衝液（pH7.4）に溶解し、コレステロール測定試薬と共
存させ、反応時に例えば50g/l以下、好ましくは0.1〜20
g/lの濃度になるように調製する。試薬は、糖化合物溶
液および／またはコレステロール測定試薬が共存した蛋
白可溶化剤溶液から調製し（蛋白可溶化剤溶液を使用し
ない場合は、糖化合物をあらかじめコレステロール測定
試薬中に共存させておく）、20〜50℃、好ましくは30〜
40℃で約５分保温する。次いで、上記試薬に試料そのも
のもしくは必要に応じて水あるいは生理食塩水で希釈し
た試料を加え、５〜30分間反応させる。反応終了後、反
応液の吸光度を340〜900nm、例えば単波長の場合は555n
mで、２波長の場合は主波長600nm、副波長700nmで測定
し、コレステロール量を算出する（２波長の場合は両波
長での吸光度の差から算出する）。
よび／または蛋白可溶化剤溶液を調製する。糖化合物溶
液は、糖化合物を適当な緩衝液、例えば50mM Tris−HC
l緩衝液（pH7.4）に溶解し、反応時に例えば100mM以
下、好ましくは３〜80mMの濃度になるように調製する。
なお、糖化合物はあらかじめコレステロール測定試薬中
に共存させてもおいてもよい。蛋白可溶化剤溶液は、蛋
白可溶化剤を適当な緩衝液、例えば50mM Tris−HCl緩
衝液（pH7.4）に溶解し、コレステロール測定試薬と共
存させ、反応時に例えば50g/l以下、好ましくは0.1〜20
g/lの濃度になるように調製する。試薬は、糖化合物溶
液および／またはコレステロール測定試薬が共存した蛋
白可溶化剤溶液から調製し（蛋白可溶化剤溶液を使用し
ない場合は、糖化合物をあらかじめコレステロール測定
試薬中に共存させておく）、20〜50℃、好ましくは30〜
40℃で約５分保温する。次いで、上記試薬に試料そのも
のもしくは必要に応じて水あるいは生理食塩水で希釈し
た試料を加え、５〜30分間反応させる。反応終了後、反
応液の吸光度を340〜900nm、例えば単波長の場合は555n
mで、２波長の場合は主波長600nm、副波長700nmで測定
し、コレステロール量を算出する（２波長の場合は両波
長での吸光度の差から算出する）。
血清から超遠心により分画されたHDL、LDL、VLDLおよ
びCMの各フラクションを使用して上記試薬によりコレス
テロール量を測定した。その結果、糖化合物および蛋白
可溶化剤の組み合わせによりHDLコレステロール、LDLコ
レステロール、VLDLコレステロール、CMコレステロール
の反応性が異なり、糖化合物および蛋白可溶化剤の組み
合わせにより各リポ蛋白との反応性が異なることが確認
された。
びCMの各フラクションを使用して上記試薬によりコレス
テロール量を測定した。その結果、糖化合物および蛋白
可溶化剤の組み合わせによりHDLコレステロール、LDLコ
レステロール、VLDLコレステロール、CMコレステロール
の反応性が異なり、糖化合物および蛋白可溶化剤の組み
合わせにより各リポ蛋白との反応性が異なることが確認
された。
コレステロール測定試薬（未修飾）に糖化合物5mMお
よび蛋白可溶化剤ポリオキシエチレンモノラウレート5g
/lを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の反応性
の差を第１表に示す。
よび蛋白可溶化剤ポリオキシエチレンモノラウレート5g
/lを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の反応性
の差を第１表に示す。
コレステロール測定試薬（未修飾）に糖化合物トリメ
チル−β−シクロデキストリン5mMおよび蛋白可溶化剤5
g/lを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の反応
性の差を第２表に示す。
チル−β−シクロデキストリン5mMおよび蛋白可溶化剤5
g/lを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の反応
性の差を第２表に示す。
方法２ 糖化合物溶液は、糖化合物を適当な緩衝液、例えば50
mM Tris−HCl緩衝液（pH7.4）に溶解し、反応時に例え
ば100mM以下、好ましくは３〜80mMの濃度になるように
調製する。蛋白可溶化剤溶液は、蛋白可溶化剤を適当な
緩衝液、例えば50mM Tris−HCl緩衝液（pH7.4）に溶解
し、反応時に例えば50g/l以下、好ましくは0.1〜20g/l
の濃度になるように調製する。あらかじめ20〜50℃、好
ましくは30〜40℃、例えば37℃で加温した糖化合物溶液
および／または蛋白可溶化剤溶液に試料そのものもしく
は必要に応じて水あるいは生理食塩水で希釈した試料を
添加して例えば37℃で５分間加温し、５分後、得られた
溶液の555nmにおける吸光度を測定する（E1）。次い
で、あらかじめ20〜50℃、好ましくは30〜40℃、例えば
37℃で加温したコレステロール測定試薬を添加して撹拌
し、５分後に同波長における吸光度を測定する［E2（濃
度補正後の値）］。コレステロール量は、既知濃度のコ
レステロールを含有する標準液を用いて同様の操作を行
い、（E2−E1）の値を比較することにより算出する。
mM Tris−HCl緩衝液（pH7.4）に溶解し、反応時に例え
ば100mM以下、好ましくは３〜80mMの濃度になるように
調製する。蛋白可溶化剤溶液は、蛋白可溶化剤を適当な
緩衝液、例えば50mM Tris−HCl緩衝液（pH7.4）に溶解
し、反応時に例えば50g/l以下、好ましくは0.1〜20g/l
の濃度になるように調製する。あらかじめ20〜50℃、好
ましくは30〜40℃、例えば37℃で加温した糖化合物溶液
および／または蛋白可溶化剤溶液に試料そのものもしく
は必要に応じて水あるいは生理食塩水で希釈した試料を
添加して例えば37℃で５分間加温し、５分後、得られた
溶液の555nmにおける吸光度を測定する（E1）。次い
で、あらかじめ20〜50℃、好ましくは30〜40℃、例えば
37℃で加温したコレステロール測定試薬を添加して撹拌
し、５分後に同波長における吸光度を測定する［E2（濃
度補正後の値）］。コレステロール量は、既知濃度のコ
レステロールを含有する標準液を用いて同様の操作を行
い、（E2−E1）の値を比較することにより算出する。
次に、実施例によって本発明の態様を説明する。
発明を実施するための最良の形態 実施例１ 直接LDLコレステロールを定量する本法とアガロース
電気泳動法（臨床検査、第29巻、1344頁、1985年）とを
比較した。
電気泳動法（臨床検査、第29巻、1344頁、1985年）とを
比較した。
本法の試薬組成 第一試薬 トリメチル−β−シクロデキストリン ５ mM ポリオキシエチレンモノラウレート ５ g/l EMSE 1.1mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM 第二試薬 コレステロールエステラーゼ（未修飾） 1.0U/ml コレステロールオキシダーゼ（未修飾） 5.0U/ml パーオキシダーゼ 25 U/ml ４−アミノアンチピリン 2.2mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM 本法では、まず、血清サンプル50μｌをあらかじめ37
℃で加温した第一試薬2.25mlに添加して37℃で５分間加
温し、５分後、得られた溶液の555nmにおける吸光度を
測定した（E1）。次いで、あらかじめ37℃で加温した第
二試薬0.75mlを添加して撹拌し、５分後に同波長におけ
る吸光度を測定した［E2（濃度補正後の値）］。LDLコ
レステロールの量は、コレステロール濃度200mg/dlの標
準液を用いて同様の操作を行い、（E2−E1）の値を比較
することにより算出した。
℃で加温した第一試薬2.25mlに添加して37℃で５分間加
温し、５分後、得られた溶液の555nmにおける吸光度を
測定した（E1）。次いで、あらかじめ37℃で加温した第
二試薬0.75mlを添加して撹拌し、５分後に同波長におけ
る吸光度を測定した［E2（濃度補正後の値）］。LDLコ
レステロールの量は、コレステロール濃度200mg/dlの標
準液を用いて同様の操作を行い、（E2−E1）の値を比較
することにより算出した。
アガロース電気泳動法では、電気泳動後の支持体状の
リポ蛋白分画に対してコレステロールの酵素染色を行
い、デンシトメトリー（クリニスキャン2;株式会社ヘレ
ナ研究所）によりLDLコレステロールを定量した。
リポ蛋白分画に対してコレステロールの酵素染色を行
い、デンシトメトリー（クリニスキャン2;株式会社ヘレ
ナ研究所）によりLDLコレステロールを定量した。
その結果を第３表に示す。
第３表に示すように、本発明の方法による結果は、電
気泳動法による結果と良好な相関を示した。
気泳動法による結果と良好な相関を示した。
実施例２ 第一試薬で使用する糖化合物および蛋白可溶化剤を組
み換える以外は、実施例１の本法と同様の操作を行い、
血清サンプル20検体につき、アガロース電気泳動法との
相関を相関係数でみた。
み換える以外は、実施例１の本法と同様の操作を行い、
血清サンプル20検体につき、アガロース電気泳動法との
相関を相関係数でみた。
第一試薬の組成 A.トリメチル−β−シクロデキストリン ５ mM ポリオキシエチレンモノラウレート ５ g/l EMSE 1.1mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM B.トリメチル−β−シクロデキストリン ５ mM ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ５ g/l EMSE 1.1mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM C.ジメチル−β−シクロデキストリン ５ mM ポリオキシエチレンモノラウレート ５ g/l EMSE 1.1mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM D.ジメチル−β−シクロデキストリン ５ mM ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ５ g/l EMSE 1.1mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM 本法では、それぞれ、日立7070自動分析装置を用いて
測定した。測定条件を下記に示す。
測定した。測定条件を下記に示す。
サンプル量: 4μｌ 第一試薬 :300μｌ 第二試薬 :100μｌ 測定波長 主波長:600nm、副波長:700nm 結果を第４表に示す。
第４表に示すように、本発明の方法による結果は、電
気泳動法による結果と良好な相関を示した。
気泳動法による結果と良好な相関を示した。
実施例３ 実施例２のB.およびD.においてさらに金属塩を添加す
る以外は、実施例２と同様の操作を行い、血清サンプル
20検体につき、アガロース電気泳動法との相関を相関係
数でみた。
る以外は、実施例２と同様の操作を行い、血清サンプル
20検体につき、アガロース電気泳動法との相関を相関係
数でみた。
第一試薬の組成 E.トリメチル−β−シクロデキストリン ５ mM ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ５ g/l 塩化Mg・６水和物 ６ mg/ml EMSE 1.1mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM F.ジメチル−β−シクロデキストリン ５ mM ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ５ g/l 塩化Mg・６水和物 ６ mg/ml EMSE 1.1mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM 結果を第５表に示す。
第５表に示すように、本発明の方法による結果は、電
気泳動法による結果と良好な相関を示した。
気泳動法による結果と良好な相関を示した。
実施例４ 直接VLDLコレステロールを定量する本法とアガロース
電気泳動法（臨床検査、第29巻、1344頁、1985年）と
を、実施例１と同様の操作を行うことにより比較した。
電気泳動法（臨床検査、第29巻、1344頁、1985年）と
を、実施例１と同様の操作を行うことにより比較した。
本法の試薬組成 第一試薬 ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン５
mM ポリオキシエチレンラウリルエーテル ５ g/l EMSE 1.1mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM 第二試薬 修飾コレステロールエステラーゼ 1.0U/ml 修飾コレステロールオキシダーゼ 5.0U/ml パーオキシダーゼ 25 U/ml ４−アミノアンチピリン 2.2mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM なお、修飾コレステロールエステラーゼおよび修飾コ
レステロールオキシダーゼは、20mMリン酸緩衝液（pH
8）にコレステロールエステラーゼまたはコレステロー
ルオキシダーゼを溶解させて（10mg/ml）５℃に冷却
後、これに20倍モルのサンブライト4001（日本油脂）を
添加して溶解させ、５℃で４時間反応させてポリエチレ
ングリコールで修飾することにより調製し、この反応液
のまま使用した（ポリエチレングリコール部分の分子量
6000）。
mM ポリオキシエチレンラウリルエーテル ５ g/l EMSE 1.1mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM 第二試薬 修飾コレステロールエステラーゼ 1.0U/ml 修飾コレステロールオキシダーゼ 5.0U/ml パーオキシダーゼ 25 U/ml ４−アミノアンチピリン 2.2mM トリス緩衝液（pH7.0） 30 mM なお、修飾コレステロールエステラーゼおよび修飾コ
レステロールオキシダーゼは、20mMリン酸緩衝液（pH
8）にコレステロールエステラーゼまたはコレステロー
ルオキシダーゼを溶解させて（10mg/ml）５℃に冷却
後、これに20倍モルのサンブライト4001（日本油脂）を
添加して溶解させ、５℃で４時間反応させてポリエチレ
ングリコールで修飾することにより調製し、この反応液
のまま使用した（ポリエチレングリコール部分の分子量
6000）。
結果を第６表に示す。
第６表に示すように、本発明の方法による結果は、電
気泳動法による結果と良好な相関を示した。
気泳動法による結果と良好な相関を示した。
産業上の利用可能性 本発明によれば、煩雑な分画分離操作の不要な簡便で
かつ自動分析装置に適用可能なLDLコレステロールまた
はVLDLコレステロールの定量法を提供することができ
る。
かつ自動分析装置に適用可能なLDLコレステロールまた
はVLDLコレステロールの定量法を提供することができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 入江 徹美 熊本県熊本市健軍町2484−17 (72)発明者 上釜 兼人 熊本県熊本市長嶺町1716−80 (56)参考文献 特開 昭57−163500（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−162454（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−501945（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/92 C12Q 1/26 C12Q 1/32 C12Q 1/44 C12Q 1/60 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (11)
- 【請求項１】シクロデキストリン誘導体および蛋白可溶
化剤存在下、造核粒子を用いる低密度リポ蛋白（LDL）
の集塊状の沈殿形成および当該沈殿の解離を行うことな
く、試料中のLDLまたは超低密度リポ蛋白（VLDL）中の
コレステロール量を測定することを特徴とするLDLまた
はVLDL中のコレステロールの定量法。 - 【請求項２】シクロデキストリン誘導体および蛋白可溶
化剤存在下、造核粒子を用いる低密度リポ蛋白（LDL）
の集塊状の沈殿形成および当該沈殿の解離を行うことな
く、試料中のLDLまたは超低密度リポ蛋白（VLDL）中の
コレステロール量を測定することを特徴とするLDL中の
コレステロールの定量法。 - 【請求項３】シクロデキストリン誘導体および蛋白可溶
化剤存在下、造核粒子を用いる低密度リポ蛋白（LDL）
の集塊状の沈殿形成および当該沈殿の解離を行うことな
く、試料中のLDLまたは超低密度リポ蛋白（VLDL）中の
コレステロール量を測定することを特徴とするVLDL中の
コレステロールの定量法。 - 【請求項４】シクロデキストリン誘導体が、α−シクロ
デキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデ
キストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリ
メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−
β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−α
−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−
シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデ
キストリン、グルコシル−β−シクロデキストリン、マ
ルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−
シクロデキストリン、パーシャリーメチル−β−シクロ
デキストリン、α−シクロデキストリンスルフェートお
よびβ−シクロデキストリンスルフェートから選ばれる
シクロデキストリン誘導体である請求の範囲１〜３記載
の定量法。 - 【請求項５】一般式（Ｉ） 〔式中、R1、R2およびR3は同一または異なって水素、置
換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のア
ルカノイル、SO3M2（式中、M2は水素または金属を表
す）、−（グルコシル）ｐ−Ｈ（式中、ｐは１または２
を表す）または−（マルトシル）ｑ−Ｈ（式中、ｑは１
または２を表す）を表し、R4およびR5は同一または異な
って水素、金属またはSO3M3（式中、M3は水素または金
属を表す）を表し、ｍは６〜８の整数を表す〕で表され
る化合物［以下、化合物（Ｉ）という。他の式番号の化
合物についても同様である］または一般式（II） 〔式中、R6、R7およびR8は同一または異なって水素また
はSO3M4（式中、M4は水素または金属を表す）を表し、R
9は水素、OM5（式中、M5は水素または金属を表す）また
はOSO3M6（式中、M6は水素または金属を表す）を表し、
R10は水素、金属またはSO3M7（式中、M7は水素または金
属を表す）を表し、ｎは４〜8000の整数を表す〕で表さ
れる糖化合物および蛋白可溶化剤存在下、造核粒子を用
いる低密度リポ蛋白（LDL）の集塊状の沈殿形成および
当該沈殿の解離を行うことなく、試料中のLDLまたは超
低密度リポ蛋白（VLDL）中のコレステロール量を測定す
ることを特徴とするLDLまたはVLDL中のコレステロール
の定量法。 - 【請求項６】一般式（Ｉ） 〔式中、R1、R2およびR3は同一または異なって水素、置
換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のア
ルカノイル、SO3M2（式中、M2は水素または金属を表
す）、−（グルコシル）ｐ−Ｈ（式中、ｐは１または２
を表す）または−（マルトシル）ｑ−Ｈ（式中、ｑは１
または２を表す）を表し、R4およびR5は同一または異な
って水素、金属またはSO3M3（式中、M3は水素または金
属を表す）を表し、ｍは６〜８の整数を表す〕で表され
る化合物［以下、化合物（Ｉ）という。他の式番号の化
合物についても同様である］または一般式（II） 〔式中、R6、R7およびR8は同一または異なって水素また
はSO3M4（式中、M4は水素または金属を表す）を表し、R
9は水素、OM5（式中、M5は水素または金属を表す）また
はOSO3M6（式中、M6は水素または金属を表す）を表し、
R10は水素、金属またはSO3M7（式中、M7は水素または金
属を表す）を表し、ｎは４〜8000の整数を表す〕で表さ
れる糖化合物および蛋白可溶化剤存在下、造核粒子を用
いる低密度リポ蛋白（LDL）の集塊状の沈殿形成および
当該沈殿の解離を行うことなく、試料中のLDL中のコレ
ステロール量を測定することを特徴とするLDL中のコレ
ステロールの定量法。 - 【請求項７】一般式（Ｉ） 〔式中、R1、R2およびR3は同一または異なって水素、置
換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のア
ルカノイル、SO3M2（式中、M2は水素または金属を表
す）、−（グルコシル）ｐ−Ｈ（式中、ｐは１または２
を表す）または−（マルトシル）ｑ−Ｈ（式中、ｑは１
または２を表す）を表し、R4およびR5は同一または異な
って水素、金属またはSO3M3（式中、M3は水素または金
属を表す）を表し、ｍは６〜８の整数を表す〕で表され
る化合物［以下、化合物（Ｉ）という。他の式番号の化
合物についても同様である］または一般式（II） 〔式中、R6、R7およびR8は同一または異なって水素また
はSO3M4（式中、M4は水素または金属を表す）を表し、R
9は水素、OM5（式中、M5は水素または金属を表す）また
はOSO3M6（式中、M6は水素または金属を表す）を表し、
R10は水素、金属またはSO3M7（式中、M7は水素または金
属を表す）を表し、ｎは４〜8000の整数を表す〕で表さ
れる糖化合物および蛋白可溶化剤存在下、造核粒子を用
いる低密度リポ蛋白（LDL）の集塊状の沈殿形成および
当該沈殿の解離を行うことなく、試料中のVLDL中のコレ
ステロール量を測定することを特徴とするVLDL中のコレ
ステロールの定量法。 - 【請求項８】蛋白可溶化剤が一般式（III） R11（C2H4O）ａ−（（C3H6O）bR12 （III） 〔式中、ａおよびｂは０〜200の整数を表し、R11はR20
−Ｘ−Ｏ−（式中、R20はアルキルまたはアルケニルを
表し、Ｘは単結合またはCOを表す）またはＨ−（CH2CH2
O）ｃ−Ｎ（R21）−（式中、ｃは１〜200の整数を表
し、R21はアルキルまたはアルケニルを表す）を表し、R
12はC2H4COOR22、C3H6COOR23、C2H4CH（COOR24）２また
はC2H4CH（COOR25）（COOR26）（式中、R22、R23、
R24、R25およびR26は同一または異なって水素、金属、
アルキルまたはアルケニルを表す）を表す。ただし、ａ
およびｂは同時には０を表さず、両成分はランダムに存
在することができる〕で表される化合物、一般式（IV） （式中、R13、R14、R15、R16、R17およびR18は同一また
は異なってアルカノイルを表す）で表される化合物また
は一般式（Ｖ） R19−Ｙ−SO3M1 （Ｖ） 〔式中、R19はアルキル、アルケニルまたは置換もしく
は非置換のアリールを表し、Ｙは単結合、 −Ｏ−、−CH（R27）−（式中、R27はアルキルまたはア
ルケニルを表す）、−CH2CH（OH）（CH2）ｄ−（式中、
ｄは１〜22の整数を表す）、−CH＝CH（CH2）ｅ−（式
中、ｅは１〜22の整数を表す）、−OCOCH（CH2COOR28）
−（式中、R28はアルキルまたはアルケニルを表す）ま
たはこれらの混合物を表し、M1は水素または金属を表
す〕で表される化合物である請求の範囲１〜７記載の定
量法。 - 【請求項９】蛋白可溶化剤がノニオン系界面活性剤また
はアニオン系界面活性剤である請求の範囲８記載の定量
法。 - 【請求項１０】コレステロール量を測定する際に２価の
金属塩を存在させることを特徴とする請求の範囲１〜９
記載の定量法。 - 【請求項１１】試料中にコレステロールエステル加水分
解酵素およびコレステロール酸化酵素またはコレステロ
ール脱水素酵素を作用させ生成する過酸化水素または還
元型補酵素を定量することからなるコレステロール量を
測定する方法において、使用するコレステロールエステ
ル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素またはコレス
テロール脱水素酵素が化学修飾されたもしくは未修飾の
コレステロールエステラーゼ、化学修飾されたもしくは
未修飾のコレステロールオキシダーゼまたは化学修飾さ
れたもしくは未修飾のコレステロールデヒドロゲナーゼ
である請求の範囲１〜10記載の定量法。
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