KR100277379B1 - 저밀도리포단백또는초저밀도리포단백중의콜레스테롤의정량방법 - Google Patents

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데쓰미 이리에
에이꼬 슈또오
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후루야 아끼라
교와 메덱스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 당화합물 및/또는 단백가용화제의 존재하에서, 시료 중의 저밀도 리포단백 (LDL) 중의 콜레스테롤량 또는 초저밀도 리포단백 (VLDL) 중의 콜레스테롤량을 측정하는 것을 특징으로 하는 LDL 중의 콜레스테롤 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.

Description

저밀도 리포단백 또는 초저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 정량방법 {METHOD OF QUANTIFYING CHOLESTEROL IN LOW-DENSITY OR VERY-LOW-DENSITY LIPOPROTEIN}
LDL 은 말초세포로 콜레스테롤을 공급하는 역할을 하는 것으로서, 관동맥 경화증을 비롯한 각종 동맥경화증의 직접적 인자이며, 이의 혈중 레벨은 동맥경화성 질환의 지표가 되는것이 알려져 있다. 또, 트리글리세라이드 (TG) 를 풍부하게 함유하는 VLDL 도 동맥경화와의 관련성이 주목되고 있다. 종래 LDL 콜레스테롤의 정량법으로서는, 초원심법, 전기 영동법, 환산법 등이 있고, VLDL 콜레스테롤의 정량법으로서는, 초원심법, 전기 영동법 등이 있다. 초원심법은 기본적 정량법으로서 이용되고 있으며, 분리용 초원심기로 비중차에 의하여 LDL 혹은 VLDL 를 분리함으로써, 그 콜레스테롤량을 측정한다 [어드밴스드·리피드·리서치 (Adv. Lipid Res.), 제 6 권, 1페이지, 1968년]. 그러나 정량성, 간편성, 경제성 등의 면에서 결점이 있다. 전기 영동법을 이용하는 경우에는, 셀룰로오스 아세테이트막이나 아가로스 겔 (agarose gel) 등을 지지체로 하여 분리하고 효소법에 의해 콜레스테롤을 정량한다 (임상검사, 제 29 권, 1344페이지, 1985년). 이 방법은 간편성, 경제성 등의 면에서 문제가 있다. 환산법에서는 다음 계산식에 따라 LDL 콜레스테롤량을 산출한다 [클리니컬·케미스트리 (Clin. Chem.), 제 18 권, 499페이지, 1972년].
(LDL 콜레스테롤량)＝(총콜레스테롤량)
－(HDL 콜레스테롤량)－(트리글리세라이드량)/5
그러나, 이 방법은 혈청 중의 TG 함유량 및 고지혈증 (高脂血症) 의 형(型) 등에 의하여 제한을 받기 때문에, 간편성, 정확성, 다수검체 처리 등의 면에서 문제가 있다. 이상과 같이 종래의 LDL 콜레스테롤 또는 VLDL 콜레스테롤의 정량법은 다수검체 처리, 신속측정 및 임상검사의 분야에서 많이 사용되고 있는 자동분석장치에는 부적당하다. 또한, 종래의 정량법에서는 분리한 LDL 분획을 정량 피펫으로 계량할 경우 등의 인적 오차도 발생하기 쉽다. 그러나, 단순히 LDL 또는 VLDL을 분획하지 않고 혈청검체를 콜레스테롤 에스테라아제와 콜레스테롤 옥시다아제가 함유된 시약에 직접 첨가하여도, 총콜레스테롤을 정량하는 계 (系) 와 마찬가지로 LDL 콜레스테롤 또는 VLDL 콜레스테롤을 특이적으로 정량할 수 없다.
본 발명은 임상진단 분야에 있어서 지질대사의 면에서 중요한 저밀도 리포단백 (LDL) 또는 초저밀도 리포단백 (VLDL) 중의 콜레스테롤 (이하, LDL 콜레스테롤 및 VLDL 콜레스테롤이라 함) 의 정량법에 관한 것이다.
발명의 개시
본 발명자들은, 당화합물 및/또는 단백가용화제를 존재시킨 콜레스테롤 측정시약의 계에 의하여 초원심으로 분획된 고밀도 리포단백 (HDL), LDL, VLDL 및 카이로미크론 (CM) 의 각 리포단백을 이용하여 측정한 바, 당화합물 및/또는 단백가용화제의 조합에 의하여 각 리포단백과의 반응성이 상이하고, 그 결과 HDL 중의 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, VLDL 콜레스테롤, CM 중의 콜레스테롤의 반응성이 상이함을 발견하여 본 발명에 이른 것이다.
본 발명은 당화합물 및/또는 단백가용화제의 존재하에서, 시료 중의 LDL 콜레스테롤량 또는 VLDL 콜레스테롤량을 측정하는 것을 특징으로 하는 LDL 콜레스테롤 또는 VLDL 콜레스테롤의 정량법에 관한 것이다. 상기 측정시에는 특이성을 더욱 높이기 위하여 2가 금속염을 병용하여 첨가할 수도 있다.
또, 본 발명에 의하여 당화합물 및/또는 단백가용화제를 성분으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량시약 혹은 당화합물과 단백가용화제를 조합하여 이루어진 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량시약을 제공할 수 있다.
당화합물로서는 글루코오스 유도체가 바람직하게 사용되며, 글루코오스 유도체로서는, 예를 들면 하기 화학식 1 :
[식중, R1, R2및 R3은 동일하거나 또는 상이하며 수소, 치환 또는 비치환의 알킬, 치환 또는 비치환의 알카노일, SO3M2(식중, M2는 수소 또는 금속을 나타낸다),－(글루코실)p-H (식중, p 는 1 또는 2 를 나타낸다) 또는－(말토실)q-H (식중, q 는 1 또는 2 를 나타낸다) 를 나타내고, R4및 R5는 동일하거나 또는 상이하며 수소, 금속 또는 SO3M3(식중, M3은 수소 또는 금속을 나타낸다) 을 나타내고, m 은 6∼8 의 정수를 나타낸다] 로 나타내는 화합물, 하기 화학식 2 :
[식중, R6, R7및 R8은 동일하거나 또는 상이하며 수소 또는 SO3M4(식중, M4는 수소 또는 금속을 나타낸다) 를 나타내고, R9는 수소, OM5(식중, M5는 수소 또는 금속을 나타낸다) 또는 OSO3M6(식중, M6은 수소 또는 금속을 나타낸다) 을 나타내고, R10은 수소, 금속 또는 SO3M7(식중, M7은 수소 또는 금속을 나타낸다) 을 나타내고, n 은 4∼8000 의 정수를 나타낸다] 로 나타내는 화합물 등을 들 수 있다.
단백가용화제로서는, 하기 화학식 3 :
R11(C2H4O)a－(C3H6O)bR12
[식중, a 및 b 는 0∼200 의 정수를 나타내고, R11은 R20－X－O－(식중, R20은 알킬 또는 알케닐을 나타내고, X 는 단결합 또는 CO 를 나타낸다) 또는 H－(CH2CH2O)C-N(R21)－(식중, c 는 1∼200 의 정수를 나타내고, R21은 알킬 또는 알케닐을 나타낸다) 을 나타내고, R12는 C2H4COOR22, C3H6COOR23, C2H4CH(COOR24)2또는 C2H4CH(COOR25)(COOR26) (식중, R22, R23, R24, R25및 R26은 동일하거나 또는 상이하며 수소, 금속, 알킬 또는 알케닐을 나타낸다) 을 나타낸다. 단, a 및 b 는 동시에 0을 나타내지는 않고, 양성분은 랜덤하게 존재할 수 있다] 으로 나타내는 화합물, 하기 화학식 4 :
(식중, R13, R14, R15, R16, R17및 R18은 동일하거나 또는 상이하며 알카노일을 나타낸다) 로 나타내는 화합물 또는 하기 화학식 5 :
R19－Y－SO3M1
[식중, R19는 알킬, 알케닐 또는 치환 또는 비치환의 아릴을 나타내고, Y 는 단결합,, －O－, －CH(R27)－ (식중, R27은 알킬 또는 알케닐을 나타낸다), －CH2CH(OH)(CH2)d－ (식중, d 는 1∼22 의 정수를 나타낸다), －CH＝CH(CH2)e－ (식중, e 는 1∼22 의 정수를 나타낸다), －OCOCH(CH2COOR28)－ (식중, R28은 알킬 또는 알케닐을 나타낸다) 또는 이들의 혼합물을 나타내고, M1은 수소 또는 금속을 나타낸다] 로 나타내는 화합물이 바람직하게 사용된다.
이하, 화학식 1 내지 화학식 5 로 나타나는 화합물을 각각 화합물 1 내지 화합물 5 라 한다.
화학식 1 내지 화학식 5 의 각 기의 정의에 있어서, 알킬 및 알카노일의 알킬부분으로서는 직쇄 또는 분기상의 탄소수 1∼22 의, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 데실, 펜타데실, 이코사닐, 도코사닐 등을 들 수 있고, 알케닐로서는 직쇄 또는 분기상의 탄소수 2∼22 의, 예를 들면 비닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐, 데세닐, 펜타데세닐, 이코세닐, 도코세닐 등을 들 수 있다. 아릴은 페닐 또는 나프틸을 나타내고, 금속으로서는 리튬, 나트륨, 칼륨 등을 들 수 있다.
치환 알킬 및 치환 알카노일의 치환기로서는, 예를 들면 히드록시, 카르복시, 술포 등을 들 수 있다. 치환 아릴의 치환기로서는, 예를 들면 알킬 등을 들 수 있으며, 알킬은 상기 알킬과 동일한 의의를 나타낸다.
당화합물로서는, 화합물 1 또는 화합물 2 중에서도 시클로덱스트린 유도체가, 특히 메틸화 시클로덱스트린 등이 바람직하게 사용된다. 예를 들면, α－시클로덱스트린, β－시클로덱스트린, γ－ 시클로덱스트린, 디메틸－β－ 시클로덱스트린, 트리메틸－β－시클로덱스트린, 히드록시에틸－β－ 시클로덱스트린, 2－히드록시프로필－α－시클로덱스트린, 2－히드록시프로필－β－시클로덱스트린, 카르복시메틸－β－시클로덱스트린, 글리코실－β－시클로덱스트린, 말토실－α－시클로덱스트린, 말토실－β－시클로덱스트린, 퍼샤리메틸－β－시클로덱스트린, α－시클로덱스트린 술페이트, β－ 시클로덱스트린 술페이트 등을 들 수 있다.
단백가용화제로서는 화합물 3, 화합물 4 또는 화합물 5 등의 계면활성제 중에서도, 특히 비이온계 계면활성제, 음이온계 계면활성제 등이 바람직하게 사용된다. 비이온계 계면활성제로서는, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌 세틸에테르, 폴리옥시에틸렌 스테아릴에테르, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 베헤닐에테르, 폴리옥시에틸렌 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 라우릴아민, 폴리옥시에틸렌 스테아릴아민, 자당지방산에스테르 등을 들 수 있고, 음이온계 계면활성제로서는, 예를 들면 도데실벤젠 술폰산나트륨, 노멀도데실벤젠 술폰산나트륨, 라우릴 황산나트륨, 고급알코올 황산에스테르 소다 등을 들 수 있다.
2가 금속염으로서는 0.01∼20 mM 의 마그네슘염, 칼슘염, 망간염, 니켈염, 코발트염 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 0.01∼20 mM 의 마그네슘염이 사용된다.
본 발명은 당화합물 및/또는 단백가용화제를 콜레스테롤 측정시약계와 공존시키는 점에 특징을 가지는 것으로서, 콜레스테롤 측정계 자체는 하기의 반응원리에 의거하는 일반법에 따르는 것이다. 단, 색소원 및 측정파장은 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 색소원으로서는 일반적으로 사용되는 4－아미노안티피린과 페놀, 4－클로로페놀, m－크레졸, 3－히드록시－2, 4, 6－트리요오드안식향산 (HTIB) 등의 페놀류와의 조합 외에, 4－아미노안티피린과 트린더시약으로 알려져 있는 (동인화학연구소 19판 종합카탈로그, 1994년) N－술포프로필아닐린, N－에틸－N－(2－히드록시－3－술포프로필)－m－톨루이딘 (TOOS), N－에틸－N－(2－히드록시－3－술포프로필)－3, 5－디메틸아닐린 (MAOS), N－에틸－N－(2－히드록시－3－술포프로필)－3, 5－디메톡시아닐린 (DAOS), N－에틸－N－술포프로필－m－톨루이딘 (TOPS), N－(2－히드록시－3－술포프로필)－3, 5－디메톡시아닐린 (HDAOS), N, N－디메틸－m－톨루이딘, N, N－디술포프로필－3, 5－디메톡시아닐린, N－에틸－N－술포프로필－m－아니시딘, N－에틸－N－술포프로필아닐린, N－에틸－N－술포프로필－3, 5－디메톡시아닐린, N－술포프로필－3, 5－디메톡시아닐린, N－에틸－N－술포프로필－3, 5－디메틸아닐린, N－에틸 － N－(2－히드록시－3－술포프로필)－m－아니시딘, N－에틸－N－(2－히드록시－3－술포프로필) 아닐린, N－에틸－N－(2－히드록시－3－술포프로필)－3, 5－디메톡시아닐린 등의 아닐린류 또는 N－에틸 － N－(3－메틸페닐)－N’－ 숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N－에틸－N－(3－메틸페닐)－N’－ 아세틸에틸렌디아민 등과의 조합을 사용할 수 있다. 또, 고감도 색소원으로서 일본국 특허공보 소60－33479호에 나타낸 10－(N－메틸카르바모일)－3, 7－비스 (디메틸아미노) 페노티아진 (MCDP), 일본국 특허공보 평4－27839호에 나타낸 비스 [3－비스 (4－클로로페닐) 메틸－4－디메틸아미노페닐] 아민 (BCMA), 일본국 특허공개공보 소62-296호에 나타낸 색소원 등도 사용할 수 있으며, 이들에 4－아미노안티피린 또는 상기한 트린더시약을 조합하여 사용할 수도 있다. 색소원의 농도로서는 0.01∼10 ㎎/㎖ 가 바람직하며, 용해도의 관계에서 제한된다.
콜레스테롤 에스테르 가수분해효소, 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소로서는, 통상 시판되고 있는 콜레스테롤 에스테르를 가수분해하는 능력을 가지는 미생물 또는 동물 유래의 콜레스테롤 에스테라아제나 리포프로테인 리파아제, 콜레스테롤을 산화시켜 과산화수소를 생성하는 미생물 유래의 콜레스테롤 옥시다아제, 미생물 또는 동물 유래의 콜레스테롤 데히드로게나아제 등을 들 수 있으나, 이들 효소의 특이성, 안정성을 더욱 높이기 위하여 폴리에틸렌 글리콜을 주성분으로 하는 기, 수용성 올리고당 잔기, 술포프로필기 등으로 상기한 효소를 화학적으로 수식한 것도 사용할 수 있다. 또, 유전자 조작에 의하여 이들의 유전자를 얻어 별도의 미생물로 도입하여 발현시킨 효소 또는 이들을 화학적으로 수식한 수식체 또는 이들의 유전자를 도입하여 발현시킨 효소 또는 이들을 화학적으로 수식한 수식체 등도 적절하게 사용할 수 있다.
효소를 수식하기 위한 시약 (화학 수식제) 으로서는, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜에 아미노기와 결합가능한 기를 결합시킨 화합물 {폴리에틸렌 글리콜에 N－히드록시 숙신이미드기 등의 아미노기와 결합가능한 기를 결합시킨 산브라이트 VFM 4101 [닛폰유시주식회사제] 등}, 폴리알킬렌 글리콜 구조 및 산무수물 구조를 가지는 산브라이트 AKM 시리즈, 동 ADM 시리즈, 동 ACM 시리즈 [모두 닛폰유시주식회사제：화학공학 논문집, 제 20 권, 제 3 호, 459페이지, 1994년], 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체에 아미노기와 결합가능한 기를 결합시킨 화합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노메타크릴 모노메틸에테르와 무수말레인산의 공중합체 등을 들 수 있다. 또, 폴리우레탄의 화학 수식제인 폴리우레탄 P4000 activated (베링거만하임사 제 Enzyme modification set 능서), 덱스트란의 화학 수식제인 덱스트란 T40, TCT－activated (동), 1, 3－프로판살톤 등도 사용할 수 있다.
이어서, 효소에 상기 화학 수식제를 반응시키는 방법을 예시하나, 이로 인하여 제약을 받는 것은 아니다. 우선, 효소를 pH 8 이상의 인산 완충액 등의 완충액 중에 용해시키고, 0∼50 ℃ 에서 예를 들면 0.01∼500 배 몰량의 산브라이트를 첨가하여 5 분∼24 시간 동안 교반한다. 이 반응액을 그대로 또는 필요에 따라 한외 여과막으로 저분자물을 제거하여 사용한다. 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소, 콜레스테롤 산화효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소는 0.1∼100 u/㎖ 로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 혈액, 뇨 등의 LDL 또는 VLDL 을 함유하는 체액에 적용할 수 있다.
이어서, 본 발명의 정량법에 관하여 예를 들어 설명한다.
방법 1
본 발명을 실시함에 있어서는, 우선 당화합물 용액 및/또는 단백가용화제 용액을 조제한다. 당화합물 용액은 당화합물을 적당한 완충액, 예를 들면 50 mM Tris－HCl 완충액 (pH 7.4) 에 용해시키고, 반응시에 예를 들면 100 mM 이하, 바람직하게는 3∼80 mM 의 농도로 되도록 조제한다. 그리고, 당화합물은 미리 콜레스테롤 측정시약 중에 공존시켜 두어도 된다. 단백가용화제 용액은 단백가용화제를 적당한 완충액, 예를 들면 50 mM Tris－HCl 완충액 (pH 7.4) 에 용해시키고, 콜레스테롤 측정시약과 공존시켜 반응시에 예를 들면 50 g/ℓ 이하, 바람직하게는 0.1∼20 g/ℓ 의 농도로 되도록 조제한다. 시약은 당화합물 용액 및/또는 콜레스테롤 측정시약이 공존하는 단백가용화제 용액으로부터 조제하고 (단백가용화제 용액을 사용하지 않는 경우에는, 당화합물을 미리 콜레스테롤 측정시약 중에 공존시켜 둠), 20∼50 ℃, 바람직하게는 30∼40 ℃에서 약 5 분 동안 보온한다. 이어서, 상기 시약에 시료 그 자체 또는 필요에 따라서 물 또는 생리식염수로 희석한 시료를 첨가하여 5∼30 분 동안 반응시킨다. 반응 종료후, 반응액의 흡광도를 340∼900 ㎚, 예를 들면 단파장의 경우에는 555 ㎚ 에서, 2파장의 경우에는 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 에서 측정하여 콜레스테롤량을 산출한다 (2파장인 경우에는 양파장에서의 흡광도의 차로부터 산출한다).
혈청으로부터 초원심에 의하여 분획된 HDL, LDL, VLDL 및 CM 의 각 분획을 사용하여 상기 시약으로 콜레스테롤량을 측정하였다. 그 결과, 당화합물 및 단백가용화제의 조합에 의하여 HDL 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, VLDL 콜레스테롤, CM 콜레스테롤의 반응성이 상이하고, 당화합물 및 단백가용화제의 조합에 의하여 각 리포단백과의 반응성이 상이함이 확인되었다.
콜레스테롤 측정시약 (미수식) 에 당화합물 5 mM 및 단백가용화제 폴리옥시에틸렌 모노라우레이트 5 g/ℓ 를 조합하여 공존시켰을 때의 각 리포단백의 반응성의 차를 표 1 에 나타낸다.
당화합물 HDL LDL VLDL CM
α-시클로덱스트린 ＋ ＋＋ ＋ ＋
β-시클로덱스트린 ＋ ＋＋ ＋ ＋
γ-시클로덱스트린 ＋ ＋＋ ＋ ＋＋
디메틸-β-시클로덱스트린 － ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
트리메틸-β-시클로덱스트린 － ＋＋＋ ＋ ＋
히드록시에틸-β-시클로덱스트린 － ＋＋ ＋ ＋
2-히드록시프로필-α-시클로덱스트린 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 － ＋＋ ＋＋ ＋＋
카르복시메틸-β-시클로덱스트린 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
글루코실-β-시클로덱스트린 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
말토실-α-시클로덱스트린 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
말토실-β-시클로덱스트린 ＋ ＋＋ ＋ ＋
퍼샤리메틸-β-시클로덱스트린 ＋ ＋＋ ＋ ＋
α-시클로덱스트린술페이트 ＋ ＋＋ ＋ ＋
β-시클로덱스트린술페이트 ＋ ＋＋ ＋ ＋
－, ＋, ＋＋, ＋＋＋은 각각 반응의 강도를 나타내며, －＜＋＜＋＋＜＋＋＋ 이다.
콜레스테롤 측정시약 (미수식) 에 당화합물 트리메틸－β－시클로덱스트린 5 mM 및 단백가용화제 5 g/ℓ 를 조합하여 공존시켰을 때의 각 리포단백의 반응성의 차를 표 2 에 나타낸다.
단백가용화제 HDL LDL VLDL CM
폴리옥시에틸렌라우릴에테르 － ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
폴리옥시에틸렌세틸에테르 ＋ ＋＋ ＋ ＋
폴리옥시에틸렌스테아릴에테르 ＋ ＋＋ ＋ ＋
폴리옥시에틸렌올레일에테르 ＋ ＋＋ ＋ ＋
폴리옥시에틸렌베헤닐에테르 ＋ ＋＋ ＋ ＋
폴리옥시에틸렌모노라우레이트 － ＋＋＋ ＋ ＋
폴리옥시에틸렌모노스테아레이트 － ＋＋ ＋ ＋
폴리옥시에틸렌모노올레이트 － ＋＋ ＋ ＋
폴리옥시에틸렌라우릴아민 － ＋＋ ＋ ＋
폴리옥시에틸렌스테아릴아민 － ＋＋ ＋ ＋
자당지방산에스테르 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋
도데실벤젠술폰산나트륨 － ＋＋ ＋ ＋
노멀도데실벤젠술폰산나트륨 － ＋＋ ＋＋ ＋＋
라우릴황산나트륨 － ＋＋ ＋＋ ＋＋
고급알코올황산에스테르소다 ＋ ＋＋ ＋ ＋
－, ＋, ＋＋, ＋＋＋은 각각 반응의 강도를 나타내며, －＜＋＜＋＋＜＋＋＋ 이다.
방법 2
당화합물 용액은 당화합물을 적당한 완충액, 예를 들면 50 mM Tris－HCl 완충액 (pH 7.4) 에 용해시키고, 반응시에 예를 들면 100 mM 이하, 바람직하게는 3∼80 mM 의 농도로 되도록 조제한다. 단백가용화제 용액은 단백가용화제를 적당한 완충액, 예를 들면 50 mM Tris－HCl 완충액 (pH 7.4) 에 용해시키고, 반응시에 예를 들면 50 g/ℓ 이하, 바람직하게는 0.1∼20 g/ℓ 의 농도로 되로록 조제한다. 미리 20∼50 ℃, 바람직하게는 30∼40 ℃, 예를 들면 37 ℃ 에서 가온한 당화합물 및/또는 단백가용화제 용액에 시료 그 자체 또는 필요에 따라서 물 또는 생리식염수로 희석한 시료를 첨가하여, 예를 들면 37 ℃ 에서 5 분 동안 가온하고, 5 분 후에 얻어진 용액의 555 ㎚ 에서의 흡광도를 측정한다 (E1). 이어서, 미리 20∼50 ℃, 바람직하게는 30∼40 ℃, 예를 들면 37 ℃ 에서 가온한 콜레스테롤 측정시약을 첨가하여 교반하고, 5 분 후에 동파장에서의 흡광도를 측정한다 [E2 (농도 보정후의 값)]. 콜레스테롤량은 기지(旣知) 농도의 콜레스테롤을 함유하는 표준액을 사용해서 동일한 방법으로 조작하여 (E2-E1) 의 값을 비교함으로써 산출한다.
이어서, 실시예에 의하여 본 발명의 태양을 설명한다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
실시예 1
직접 LDL 콜레스테롤을 정량하는 본법과 아가로스 전기 영동법 (임상검사, 제 29 권, 1344페이지, 1985년) 을 비교한다.
본 법의 시약조성
제 1 시약
트리메틸－β－시클로덱스트린 5 mM
폴리옥시에틸렌 모노라우레이트 5 g/ℓ
EMSE 1.1 mM
트리스 완충액 (pH 7.0) 30 mM
제 2 시약
콜레스테롤 에스테라아제 (미수식) 1.0 U/㎖
콜레스테롤 옥시다아제 (미수식) 5.0 U/㎖
퍼옥시다아제 25 U/㎖
4－아미노안티피린 2.2 mM
트리스 완충액 (pH 7.0) 30 mM
본 법에서는, 우선 혈청샘플 50 ㎕ 를 미리 37 ℃ 에서 가온한 제 1 시약 2.25 ㎖ 에 첨가하여 37 ℃ 에서 5 분 동안 가온하고, 5 분 후에 얻어진 용액의 555 ㎚ 에서의 흡광도를 측정한다 (El). 이어서, 미리 37 ℃ 로 가온한 제 2 시약 0.75 ㎖ 를 첨가하여 교반하고, 5 분 후에 동파장에서의 흡광도를 측정한다 [E2 (농도 보정후의 값)]. LDL 콜레스테롤의 양은 콜레스테롤 농도 200 ㎎/㎗ 의 표준액을 사용해서 동일한 방법으로 조작하여, (E2-E1) 의 값을 비교함으로써 산출한다.
아가로스 전기 영동법에서는, 전기 영동 후의 지지체 위의 리포단백 분획에 대하여 콜레스테롤의 효소염색을 실시하고, 덴시토미터리 (클리니스캔 2；주식회사헤레나연구소) 에 의하여 LDL 콜레스테롤을 정량하였다.
그 결과를 표 3 에 나타낸다.
샘플 LDL 콜레스테롤 농도(㎎/㎗)
본 발명의 방법 전기영동법
12345678910 628577148122156150133133140 558172138116151139121123129
표 3 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의한 결과는 전기 영동법에 의한 결과와 양호한 상관을 나타낸다.
실시예 2
제 1 시약에서 사용하는 당화합물 및 단백가용화제를 재조합하는 것 이외에는 실시예 1 의 본법과 동일한 방법으로 조작하여, 혈청샘플 20 검체에 대해 아가로스 전기 영동법과의 상관을 상관계수로 살펴 보았다.
제 1 시약의 조성
A. 트리메틸－β－시클로덱스트린 5 mM
폴리옥시에틸렌 모노라우레이트 5 g/ℓ
EMSE 1.1 mM
트리스 완충액 (pH 7.0) 30 mM
B. 트리메틸－β－시클로덱스트린 5 mM
도데실벤젠 술폰산나트륨 5 g/ℓ
EMSE 1.1 mM
트리스 완충액 (pH 7.0) 30 mM
C. 디메틸－β－시클로덱스트린 5 mM
폴리옥시에틸렌 모노라우레이트 5 g/ℓ
EMSE 1.1 mM
트리스 완충액 (pH 7.0) 30 mM
D. 디메틸－β－시클로덱스트린 5 mM
도데실벤젠 술폰산나트륨 5 g/ℓ
EMSE 1.1 mM
트리스 완충액 (pH 7.0) 30 mM
본 법에서는 각각 히다치 7070 자동분석장치를 사용하여 측정하였다. 측정조건을 다음에 나타낸다.
샘플량 ： 4 ㎕
제 1 시약 ：300 ㎕
제 2 시약 ：100 ㎕
측정파장 주파장：600 ㎚, 부파장：700 ㎚
결과를 표 4 에 나타낸다
제 1 시약 상관계수
A.B.C.D. 0.93240.82270.85230.7876
표 4 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의한 결과는 전기 영동법에 의한 결과와 양호한 상관을 나타낸다.
실시예 3
실시예 2 의 B. 및 D. 에 있어서 추가로 금속염을 첨가하는 것 이외에는 실시예 2 와 동일한 방법으로 조작하여, 혈청샘플 20 검체에 대해 아가로스 전기 영동법과의 상관을 상관계수로 살펴 보았다.
제 1 시약의 조성
E. 트리메틸－β－시클로덱스트린 5 mM
도데실벤젠 술폰산나트륨 5 g/ℓ
염화Mg·6 수화물 6 ㎎/㎖
EMSE 1.1 mM
트리스 완충액 (pH 7.0) 30 mM
F. 디메틸－β－시클로덱스트린 5 mM
도데실벤젠 술폰산나트륨 5 g/ℓ
염화Mg·6 수화물 6 ㎎/㎖
EMSE 1.1 mM
트리스 완충액 (pH 7.0) 30 mM
결과를 표 5 에 나타낸다.
제 1 시약 상관계수
E.F. 0.93020.9298
표 5 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의한 결과는 전기 영동법에 의한 결과와 양호한 상관을 나타낸다.
실시예 4
직접 VLDL 콜레스테롤을 정량하는 본법과 아가로스 전기 영동법 (임상검사, 제 29 권, 1344페이지, 1985년) 을 실시예 1 과 동일한 방법으로 조작함으로써 비교하였다.
본법의 시약조성
제 1 시약
2－히드록시프로필－β－시클로덱스트린 5 mM
폴리옥시에틸렌 라우릴에테르 5 g/ℓ
EMSE 1.1 mM
트리스 완충액 (pH 7.0) 30 mM
제 2 시약
수식 콜레스테롤 에스테라아제 1.0 U/㎖
수식 콜레스테롤 옥시다아제 5.0 U/㎖
퍼옥시다아제 25 U/㎖
4－아미노 안티피린 2.2 mM
트리스 완충액 (pH 7.0) 30 mM
또한 수식 콜레스테롤 에스테라아제 및 수식 콜레스테롤 옥시다아제는, 20 mM 인산 완충액 (pH 8) 에 콜레스테롤에스테라아제 또는 콜레스테롤옥시다아제를 용해시켜서 (10 ㎎/㎖) 5 ℃ 로 냉각한 후, 이것에 20 배 몰의 산브라이트 4001 (닛폰유지) 을 첨가하여 용해시키고, 5 ℃에서 4 시간 반응시켜 폴리에틸렌 글리콜로 수식함으로써 조제하고, 이 반응액을 그대로 사용한다 (폴리에틸렌 글리콜 부분의 분자량 6000).
결과를 표 6 에 나타낸다.
샘플 VLDL 콜레스테롤 농도(㎎/㎗)
본 발명의 방법 전기 영동법
12345678910 24291719122546443331 19221523152349392734
제 6 표 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의한 결과는 전기 영동법에 의한 결과와 양호한 상관을 나타낸다.
본 발명에 의하면 번잡한 분획 분리조작이 불필요하고 간편하면서 자동분석장치에 적용할 수 있는 LDL 콜레스테롤 또는 VLDL 콜레스테롤의 정량법을 제공할 수 있다.

Claims (35)

  1. 당화합물 및 단백가용화제의 존재하에서, 저밀도 리포단백(LDL) 또는 초저밀도 리포단백(VLDL)을 함유하는 시료를, 시료중에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소를 작용시켜 생성된 과산화수소 또는 환원형 보조효소를 정량하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 측정시약계와 접촉시켜 저밀도 리포단백(LDL) 또는 초저밀도 리포단백(VLDL)중의 콜레스테롤량을 측정하는 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  2. 제 1 항에 있어서, 당화합물이 글루코오스 유도체인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  3. 제 2 항에 있어서, 당화합물이 하기 화학식 1 로 나타내는 화합물:
    [화학식 1]
    [식중, R1, R2및 R3은 동일하거나 또는 상이하며 수소, 치환 또는 비치환의 알킬, 치환 또는 비치환의 알카노일, SO3M2(식중, M2는 수소 또는 금속을 나타낸다),－(글루코실)p-H (식중, p 는 1 또는 2 를 나타낸다) 또는－(말토실)q-H (식중, q 는 1 또는 2 를 나타낸다) 를 나타내고, R4및 R5는 동일하거나 또는 상이하며 수소, 금속 또는 SO3M3(식중, M3은 수소 또는 금속을 나타낸다) 을 나타내고, m 은 6∼8 의 정수를 나타낸다] (이하, 화합물 1 이라 함. 다른 식 번호의 화합물에 대해서도 마찬가지임) 또는
    하기 화학식 2 로 나타내는 화합물:
    [화학식 2]
    [식중, R6, R7및 R8은 동일하거나 또는 상이하며 수소 또는 SO3M4(식중, M4는 수소 또는 금속을 나타낸다) 를 나타내고, R9는 수소, OM5(식중, M5는 수소 또는 금속을 나타낸다) 또는 OSO3M6(식중, M6은 수소 또는 금속을 나타낸다) 을 나타내고, R10은 수소, 금속 또는 SO3M7(식중, M7은 수소 또는 금속을 나타낸다) 을 나타내고, n 은 4∼8000 의 정수를 나타낸다]
    인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  4. 제 3 항에 있어서, 당화합물이 시클로덱스트린 유도체인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  5. 제 1 항에 있어서, 단백가용화제가 하기 화학식 3 으로 나타내는 화합물:
    [화학식 3]
    R11(C2H4O)a－(C3H6O)bR12
    [식중, a 및 b 는 0∼200 의 정수를 나타내고, R11은 R20－X－O－(식중, R20은 알킬 또는 알케닐을 나타내고, X 는 단결합 또는 CO 를 나타낸다) 또는 H－(CH2CH2O)C-N(R21)－(식중, c 는 1∼200 의 정수를 나타내고, R21은 알킬 또는 알케닐을 나타낸다) 을 나타내고, R12는 C2H4COOR22, C3H6COOR23, C2H4CH(COOR24)2또는 C2H4CH(COOR25)(COOR26) (식중, R22, R23, R24, R25및 R26은 동일하거나 또는 상이하며 수소, 금속, 알킬 또는 알케닐을 나타낸다) 을 나타낸다. 단, a 및 b 는 동시에 0 을 나타내지는 않고, 양성분은 랜덤하게 존재할 수 있다],
    하기 화학식 4 로 나타내는 화합물:
    [화학식 4]
    [식중, R13, R14, R15, R16, R17및 R18은 동일하거나 또는 상이하며 알카노일을 나타낸다], 또는
    화학식 5 로 나타나는 화합물:
    [화학식 5]
    R19－Y－SO3M1
    [식중, R19는 알킬, 알케닐 또는 치환 또는 비치환의 아릴을 나타내고, Y 는
    단결합,, －O －,－CH(R27)－(식중, R27은 알킬 또는 알케닐을 나타낸다),－CH2CH(OH)(CH2)d- (식중, d 는 1∼22 의 정수를 나타낸다),－CH ＝ CH(CH2)e- (식중, e 는 1∼22 의 정수를 나타낸다),－OCOCH(CH2COOR28)－(식중, R28은 알킬 또는 알케닐을 나타낸다) 또는 이들의 혼합물을 나타내고, M1은 수소 또는 금속을 나타낸다]
    인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  6. 제 5 항에 있어서, 단백가용화제가 비이온계 계면활성제 또는 음이온계 계면활성제인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  7. 제 1 항에 있어서, 콜레스테롤량을 측정할 때에 2가 금속염을 존재시키는 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  8. 제 1 항에 있어서, 시료 중에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시켜 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보조효소를 정량함으로써 이루어지는 콜레스테롤량 측정 방법에서 사용하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소, 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소가 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 에스테라아제, 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 옥시다아제, 또는 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 데히드로게나아제인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  9. 당화합물, 단백가용화제, 및 저밀도 리포단백(LDL) 또는 초저밀도 리포단백(VLDL)을 함유하는 시료중에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소를 작용시켜 생성된 과산화수소 또는 환원형 보조효소를 정량하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 측정시약계로 구성된 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량시약.
  10. 제 9 항에 있어서, 각각 분리되어 있는 당 화합물과 단백가용화제를 조합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량시약.
  11. 제 9 항에 있어서, 당화합물이 글루코오스 유도체인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  12. 제 11 항에 있어서, 당화합물이 화학식 1로 나타낸 화합물 또는 화학식 2로 나타낸 화합물인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  13. 제 12 항에 있어서, 당화합물이 시클로덱스트린 유도체인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  14. 제 9 항에 있어서, 단백가용화제가 화학식 3으로 나타낸 화합물, 화학식 4로 나타낸 화합물 또는 화학식 5로 나타낸 화합물인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  15. 제 14 항에 있어서, 단백가용화제가 비이온계 계면활성제 또는 음이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  16. 제 2 항에 있어서, 단백가용화제가 하기 화학식 3 으로 나타내는 화합물:
    [화학식 3]
    R11(C2H4O)a－(C3H6O)bR12
    [식중, a 및 b 는 0∼200 의 정수를 나타내고, R11은 R20－X－O－(식중, R20은 알킬 또는 알케닐을 나타내고, X 는 단결합 또는 CO 를 나타낸다) 또는 H－(CH2CH2O)C-N(R21)－(식중, c 는 1∼200 의 정수를 나타내고, R21은 알킬 또는 알케닐을 나타낸다) 을 나타내고, R12는 C2H4COOR22, C3H6COOR23, C2H4CH(COOR24)2또는 C2H4CH(COOR25)(COOR26) (식중, R22, R23, R24, R25및 R26은 동일하거나 또는 상이하며 수소, 금속, 알킬 또는 알케닐을 나타낸다) 을 나타낸다. 단, a 및 b 는 동시에 0 을 나타내지는 않고, 양성분은 랜덤하게 존재할 수 있다],
    하기 화학식 4 로 나타내는 화합물:
    [화학식 4]
    [식중, R13, R14, R15, R16, R17및 R18은 동일하거나 또는 상이하며 알카노일을 나타낸다], 또는
    화학식 5 로 나타나는 화합물:
    [화학식 5]
    R19－Y－SO3M1
    [식중, R19는 알킬, 알케닐 또는 치환 또는 비치환의 아릴을 나타내고, Y 는
    단결합,, －O －,－CH(R27)－(식중, R27은 알킬 또는 알케닐을 나타낸다),－CH2CH(OH)(CH2)d- (식중, d 는 1∼22 의 정수를 나타낸다),－CH ＝ CH(CH2)e- (식중, e 는 1∼22 의 정수를 나타낸다),－OCOCH(CH2COOR28)－(식중, R28은 알킬 또는 알케닐을 나타낸다) 또는 이들의 혼합물을 나타내고, M1은 수소 또는 금속을 나타낸다]
    인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  17. 제 16 항에 있어서, 단백가용화제가 비이온계 계면활성제 또는 음이온계 계면활성제인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  18. 제 2 항에 있어서, 콜레스테롤량을 측정할 때에 2가 금속염을 존재시키는 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  19. 제 5 항에 있어서, 콜레스테롤량을 측정할 때에 2가 금속염을 존재시키는 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  20. 제 16 항에 있어서, 콜레스테롤량을 측정할 때에 2가 금속염을 존재시키는 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  21. 제 2 항에 있어서, 시료 중에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시켜 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보조효소를 정량함으로써 이루어지는 콜레스테롤량 측정 방법에서 사용하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소, 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소가 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 에스테라아제, 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 옥시다아제, 또는 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 데히드로게나아제인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  22. 제 5 항에 있어서, 시료 중에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시켜 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보조효소를 정량함으로써 이루어지는 콜레스테롤량 측정 방법에서 사용하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소, 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소가 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 에스테라아제, 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 옥시다아제, 또는 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 데히드로게나아제인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  23. 제 16 항에 있어서, 시료 중에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시켜 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보조효소를 정량함으로써 이루어지는 콜레스테롤량 측정 방법에서 사용하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소, 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소가 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 에스테라아제, 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 옥시다아제, 또는 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 데히드로게나아제인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  24. 제 18 항에 있어서, 시료 중에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시켜 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보조효소를 정량함으로써 이루어지는 콜레스테롤량 측정 방법에서 사용하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소, 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소가 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 에스테라아제, 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 옥시다아제, 또는 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 데히드로게나아제인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  25. 제 19 항에 있어서, 시료 중에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시켜 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보조효소를 정량함으로써 이루어지는 콜레스테롤량 측정 방법에서 사용하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소, 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소가 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 에스테라아제, 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 옥시다아제, 또는 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 데히드로게나아제인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  26. 제 20 항에 있어서, 시료 중에 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시켜 생성되는 과산화수소 또는 환원형 보조효소를 정량함으로써 이루어지는 콜레스테롤량 측정 방법에서 사용하는 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소, 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소가 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 에스테라아제, 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 옥시다아제, 또는 화학수식된 또는 미수식의 콜레스테롤 데히드로게나아제인 것을 특징으로 하는 LDL 또는 VLDL 중의 콜레스테롤의 정량법.
  27. 제 10 항에 있어서, 당화합물이 글루코오스 유도체인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  28. 제 27 항에 있어서, 당화합물이 화학식 1로 나타낸 화합물 또는 화학식 2로 나타낸 화합물인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  29. 제 28 항에 있어서, 당화합물이 시클로덱스트린 유도체인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  30. 제 10 항에 있어서, 단백가용화제가 화학식 3으로 나타낸 화합물, 화학식 4로 나타낸 화합물 또는 화학식 5로 나타낸 화합물인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  31. 제 11 항에 있어서, 단백가용화제가 화학식 3으로 나타낸 화합물, 화학식 4로 나타낸 화합물 또는 화학식 5로 나타낸 화합물인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  32. 제 27 항에 있어서, 단백가용화제가 화학식 3으로 나타낸 화합물, 화학식 4로 나타낸 화합물 또는 화학식 5로 나타낸 화합물인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  33. 제 30 항에 있어서, 단백가용화제가 비이온계 계면활성제 또는 음이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  34. 제 31 항에 있어서, 단백가용화제가 비이온계 계면활성제 또는 음이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 정량시약.
  35. 제 32 항에 있어서, 단백가용화제가 비이온계 계면활성제 또는 음이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 정량시약.
KR1019960706484A 1994-05-18 1996-03-15 저밀도리포단백또는초저밀도리포단백중의콜레스테롤의정량방법 KR100277379B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
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