JP4690200B2 - 超低密度リポ蛋白レムナント（ｖｌｄｌレムナント）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット - Google Patents
超低密度リポ蛋白レムナント（ｖｌｄｌレムナント）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【技術分野】
本発明は、試料中の超低密度リポ蛋白レムナント（ＶＬＤＬレムナント）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中には、種々のリポ蛋白が含有されている。これらのリポ蛋白は比重の違いにより、カイロミクロン（以下、ＣＭと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）に分類されている。各リポ蛋白は、コレステロール、トリグリセライド、リン脂質、蛋白質等の構成成分の割合が異なっており、生体内で異なる作用を有する。
【０００３】
これらのリポ蛋白以外に、リポ蛋白がリポ蛋白リパーゼによって代謝・分解される過程で生じるレムナントリポ蛋白がある。レムナントリポ蛋白は、カイロミクロンレムナント（以下、ＣＭレムナントと略記する）および超低密度リポ蛋白レムナント（以下、ＶＬＤＬレムナントと略記する）に分類される。中間密度リポ蛋白（以下、ＩＤＬと略記する）は、ＶＬＤＬレムナントに包含される、比重１．００６〜１．０１９のリポ蛋白であり狭義のＶＬＤＬレムナントと呼ばれる。
【０００４】
レムナントリポ蛋白は、トリグリセライド（ＴＧ）が豊富なリポ蛋白であり、アポＥとコレステロールが比較的豊富なリポ蛋白である。ＣＭレムナントはアポＢ−４８とアポＥとを主要アポ蛋白として有し、ＶＬＤＬレムナントはアポＢ−１００とアポＥとを主要アポ蛋白として有する。
【０００５】
レムナントリポ蛋白は、健常人においては速やかに代謝され、速やかに肝臓のレセプターに取り込まれるが、代謝異常や過食・運動不足等の日常の悪い生活習慣により、血液中に停滞するレムナントリポ蛋白が増加し、この血液中に停滞したレムナントリポ蛋白によりＩＩＩ型高脂血症などが引き起こされ、動脈硬化が高い割合で発症する。動脈硬化の発症に際しては、血液中に停滞したレムナントリポ蛋白が動脈壁のマクロファージに容易に取り込まれ、動脈硬化の初期病変を形成すると考えられている。このように、レムナントリポ蛋白は動脈硬化性疾患の危険因子の一つと考えられている。
【０００６】
ＣＭレムナントは、アポＢ−４８を主要アポ蛋白として有するため、肝臓のＬＤＬ受容体関連蛋白（ＬＤＬ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＬＲＰ）を介して取り込まれると考えられており、ＶＬＤＬレムナントは、アポＢ−１００を主要アポ蛋白として有するため、肝臓のＬＤＬ受容体を介して取り込まれると考えられている。また、最近、新しいレムナントリポ蛋白のマクロファージ泡沫化経路の一つとして、ＶＬＤＬ受容体経路が報告されている。すなわち、単球からマクロファージへの分化過程においてＶＬＤＬ受容体の発現が増大し、レムナントリポ蛋白がＶＬＤＬ受容体を介してマクロファージの泡沫化を引き起こすことが報告されている。
【０００７】
レムナントリポ蛋白またはレムナントリポ蛋白中のコレステロールの定量法としては、これまでに、電気泳動法、超遠心法、液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法、免疫吸着法等が報告されている。電気泳動法としては、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）法やアガロースゲル電気泳動法等が報告されている。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）法は、レムナントリポ蛋白の定性分析に使用される方法であり、ＶＬＤＬとＬＤＬとの間に認められる異常バンドである中間帯（Ｍｉｄ−ｂａｎｄ）を検出する方法である。アガロースゲル電気泳動法も、レムナントリポ蛋白の定性分析に使用される方法であり、特にＩＩＩ型高脂血症の診断に有効に使用される。ＩＩＩ型高脂血症においては、β位に移動するβ−ＶＬＤＬが確認される。
【０００８】
超遠心法としては、比重が１．００６から１．０１９の間のリポ蛋白である中間密度リポ蛋白（以下、ＩＤＬと略記する）を超遠心分離により分離し、得られたＩＤＬ中のコレステロールを定量する方法が挙げられる。しかしながら、この超遠心法は操作が非常に煩雑である。
【０００９】
ＨＰＬＣ法としては、血清中のＣＭ及びＶＬＤＬをＨＰＬＣで分離し、分離されたＣＭ中のコレステロール量及び分離されたＶＬＤＬ中のコレステロール量を分析することからなる血清試料中のレムナント様リポ蛋白（以下、ＲＬＰと略記する）の分析方法（特開平８−１０５８７６号公報）や、ヒト血清試料中のＲＬＰ以外のリポ蛋白を、アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクローナル抗体及びアポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−１００モノクローナル抗体を非多孔性不溶性支持体に固定化したリポ蛋白分離用充填剤を充填してなるリポ蛋白分離用抗体カラムで分離し、分離されなかったリポ蛋白をＲＬＰとして、該ＲＬＰ中のコレステロール量を分析することからなる、血清試料中のＲＬＰの分析方法が挙げられる（特開平８−１０５８７５号公報）。前者の方法は、ＣＭコレステロールとＶＬＤＬコレステロールの総和が免疫吸着法によって測定されるＲＬＰ中のコレステロールと高い相関関係にあることに基づく方法である。これらの公開特許公報においては、ＲＬＰという用語は、ＣＭやＶＬＤＬ等がリポ蛋白リパーゼによって分解された異常リポ蛋白という意味で使用されている。
【００１０】
最近、免疫吸着法によるＲＬＰ中のコレステロールの定量法が開発された。ここでいうＲＬＰとは、トリグリセライドに富むリポ蛋白を意味する。本定量法においては、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体およびアポＢ−４８を認識しない特異的抗アポＢ−１００モノクローナル抗体を含有するアフィニティーゲルを用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより血清からＲＬＰを分離し、この分離したＲＬＰに含まれるコレステロールが定量される。本定量法に適用されるＲＬＰ中のコレステロール定量用試薬が、（株）日本抗体研究所から販売されている［製品名：ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ］（「クリニカル ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，アメリカ臨床化学会，２００２年，第４８巻，ｐ．２１７−２１９）。
【００１１】
ＲＬＰ中のコレステロールの定量法としては、ポリオキシアルキレン誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体の共存下、試料にコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロール脱水素酵素ならびにリン脂質を加水分解する酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元性補酵素を定量することを特徴とする方法も報告されている（特開２００１−２３１５９７号公報）。本公開特許公報の実施例１の定量用試薬を用いて得られる試料中のコレステロール定量値と日本抗体研究所社製の定量用試薬であるＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩを用いて得られる試料のＲＬＰ中のコレステロール定量値との間に良好な相関関係が認められる。しかしながら、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩは、試料中の、レムナントリポ蛋白に分類されない、ＶＬＤＬ中のコレステロールにも反応することが報告されている。
【００１２】
近年、超遠心法とゲルろ過法とを組み合わせたレムナントリポ蛋白の分析が報告されている。（「動脈硬化」，日本動脈硬化学会，２００１年，第２９巻，ｐ．２３５（演題番号：９８））。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の目的は、動脈硬化性疾患の危険因子の一つであるＶＬＤＬレムナント中のコレステロール（以下ＶＬＤＬレムナントコレステロールといい、ＶＬＤＬレムナント−Ｃと略記する）を簡便かつ迅速に定量する方法、試薬およびキットを提供することにある。本発明において、ＶＬＤＬレムナント−Ｃとは、ＶＬＤＬレムナント中のエステル型コレステロールと遊離型コレステロールを合わせたものである。
【００１４】
本発明は、以下の（１）〜（２６）に関する。
（１） 試料を含有する水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナント中のエステル型および遊離型コレステロール（ＶＬＤＬレムナント−Ｃ）に特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせの存在下、試料中の超低密度リポ蛋白レムナント中のコレステロールに、（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または（ｄ）酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とする試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールの定量方法。
【００１５】
（２） 超低密度リポ蛋白レムナントが、中間密度リポ蛋白である（１）記載の方法。
（３） 該酵素反応が、さらにシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンの存在下に行われる（１）または（２）記載の方法。
（４） シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である（３）記載の方法。
【００１６】
（５） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 過酸化水素の定量が、ペルオキシダーゼの存在下生成した過酸化水素と色原体とを反応させて色素を生成させ、生成した色素を定量することによって行われる（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） 還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（８） 還元型補酵素の定量が、還元型補酵素定量用試薬を用いて行われる（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（９） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用試薬。
（１０） 該試薬がさらに過酸化水素定量用試薬を含有する（９）記載の試薬。
【００１８】
（１１） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用試薬。
（１２） 該試薬がさらに還元型補酵素定量用試薬を含有する（１１）記載の試薬。
【００１９】
（１３） 超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールが、中間密度リポ蛋白である（９）〜（１２）のいずれかに記載の試薬。
（１４） さらに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する（９）〜（１３）のいずれかに記載の試薬。
（１５） シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である（１４）記載の試薬。
（１６） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルである（９）〜（１５）のいずれかに記載の試薬。
【００２０】
（１７） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２１】
（１８） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有し、過酸化水素定量用試薬を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２２】
（１９） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬を含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２３】
（２０） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬を含有し、かつ、過酸化水素定量用試薬を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２４】
（２１） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有し、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素をレムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２５】
（２２） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２６】
（２３） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有し、還元型補酵素定量用試薬を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２７】
（２４） 超低密度リポ蛋白レムナントが中間密度リポ蛋白である（１７）〜（２３）のいずれかに記載のキット。
（２５） さらに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する（１７）〜（２４）のいずれかに記載のキット。
（２６） シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である（２５）記載のキット。
（２７） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである（１７）〜（２６）のいずれかに記載のキット。
【００２８】
本発明方法を詳細に説明する。
本発明の特徴は、コレステロール定量反応に用いられる酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる界面活性剤として、（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせが優れた効果を奏することにある。即ち、これらの２種の界面活性剤は組み合わさって、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる。
【００２９】
さらにこれらの酵素反応において水性媒体中にシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを存在させることによって、ＶＬＤＬレムナント−Ｃ以外のリポ蛋白中のコレステロール、特にＬＤＬ中のコレステロールに前記酵素が作用するのを抑制することを特徴とする。
【００３０】
本発明の方法によれば試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃは、水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせの存在下、試料中のＶＬＤＬレムナント中のエステル型コレステロールをコレステロールエステル加水分解酵素の作用によって遊離型コレステロールに変換し、該遊離型コレステロールおよびＶＬＤＬレムナント中の遊離型コレステロールから（ｃ）コレステロール酸化酵素の作用によって過酸化水素を生成させまたは（ｄ）酸化型補酵素の存在下コレステロール脱水素酵素の作用によって還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することによって定量できる。
【００３１】
この方法において、酵素反応をシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンの存在下に行うことによってＶＬＤＬレムナント以外のリポ蛋白のコレステロールに酵素が作用するのを抑制することができるので好ましい。
本発明の定量方法によって全血、血漿、血清等、好ましくは、血漿、血清等の試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量できる。
【００３２】
酵素反応は、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の少なくとも２種類の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールの定量に必要なコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素（コレステロール脱水素酵素を用いる場合には酸化型補酵素が必要）、ならびに、要すればシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する緩衝液等の水溶液中で行われる。反応によって生成する過酸化水素または還元型補酵素の定量はそれ自体公知の方法によって行われる。
【００３３】
該水溶液には、必要に応じてＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量反応の特異性に影響を及ぼさない範囲でコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼを活性化するためによく使用される酵素活性化剤、安定化剤、防腐剤、干渉物抑制剤、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類を使用することもできる。
【００３４】
コレステロールエステル加水分解反応、遊離コレステロールの酸化または脱水素反応は該２種類の界面活性剤の存在下に順次行ってもよい。また試料と界面活性剤とを水性液中接触させ、ついで酵素を添加して反応させてもよいが、通常必要な成分を全てまたは必要に応じて２〜３のグループに分けて水性媒体に添加して反応させる。より便利には、後述のＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用キットが用いられる。
【００３５】
水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素は、通常０．００１〜４００Ｕ／ｍＬで、好ましくは０．０１〜２００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは０．０５〜１００Ｕ／ｍＬの濃度で用いられる。
【００３６】
水性媒体中、該２種類の界面活性剤の濃度は、それぞれに、０．００１〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００５〜２．５（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．０５〜１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。
【００３７】
水性媒体中、シクロデキストリンまたはその誘導体の濃度は、０．００１〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００５〜２．５（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。
水性媒体中、アルブミンの濃度は、０．００１〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００５〜２．５（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。
【００３８】
酵素反応は通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、通常２〜３０分間で完了する。
生成した過酸化水素は例えばペルオキシダーゼの存在下過酸化水素と酸化によって色素に変換される色原体との反応によって色素を生成させ、生成した色素の吸収極大波長で反応液の吸光度の変化を測定することによって定量される。また化学発光物質、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等と過酸化水素とを反応させてフォトンを生成させ、生成したフォトンを定量することにより過酸化水素は定量される。
【００３９】
還元型補酵素は酵素反応によって生成した還元型補酵素含有液の吸光度を３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、より好ましくは３４０ｎｍ付近で測定することによって定量できる。また、還元型補酵素と色原体とを反応させて色素を生成させ、生成した色素を定量することによって定量できる。例えば還元型補酵素とジアホラーゼ、電子キャリアー例えば１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェートおよび色原体とを反応させて色素を生成させ、色素の吸収極大波長で反応液の吸光度を測定することによって定量できる。色原体としては還元されて色素に変換される色原体が用いられる。
【００４０】
試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度は、予め既知の濃度のＶＬＤＬレムナント−Ｃを含有する試料を用いて、コレステロール濃度と過酸化水素または還元型補酵素の量との関係を示す検量線を作成し、この検量線から求めることができる。
【００４１】
コレステロールエステル加水分解酵素はコレステロールエステルを加水分解できる酵素、例えばコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等が用いられ、動物、植物または微生物由来または、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素等を使用することができる。化学的に修飾された酵素としては、例えばポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等の化学修飾基で修飾された酵素が含まれる。特にポリエチレングリコールを主成分とする基で修飾された酵素が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が含まれる。
【００４２】
化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）は、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物等が含まれる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造は、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が含まれる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基または構造は、例えばアミノ基を含む。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造は、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等を含む。
【００４３】
化学修飾剤の例は、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥＡＣ−５０ＨＳ、サンブライトＭＥＣ−５０ＨＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもＳｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水酢酸（ＤＴＰＡ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ；同仁化学社製）、ポリウレタン修飾用の活性化ポリウレタンＰ４０００（ベーリンガーマンハイム社製）、デキストラン修飾用のデキストランＴ４０、活性化ＴＣＴ（ベーリンガーマンハイム社製）等を含む。
【００４４】
酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができる。
まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分〜５時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
【００４５】
コレステロール酸化酵素は動物、植物または微生物由来酵素、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素等を用いることができる。
化学修飾酵素は、前述の化学修飾方法により作製することができる。
【００４６】
コレステロール脱水素酵素は、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば、動物、植物または微生物由来の酵素、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素を用いることができる。化学的に修飾された酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
【００４７】
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いる定量法において使用される酸化型補酵素の例は、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオ−ＮＡＤ、チオ−ＮＡＤＰである。
【００４８】
本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルは、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさって、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる機能を有し、単独で使用された場合には、必ずしも、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる機能を有する必要はない。以下、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを、「界面活性剤１」とよぶ。
【００４９】
本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤は、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさって、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる機能を有し、単独で使用された場合には、必ずしも、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる機能を有する必要はない。以下、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を、「界面活性剤２」とよぶ。
【００５０】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルの例はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルを含み、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルが好ましい。
【００５１】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルにおけるアルキルは、直鎖または分岐状の炭素数６〜１５の、例えばヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシルを含む。ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルの具体例は、エマルゲンＬ−４０（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル）、エマルゲン９１１（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、エマルゲン８１０（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（以上、花王社製）、ノニオンＨＳ−２１０（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、ノニオンＨＳ−２１５（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、ノニオンＮＳ−２０８．５（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、ノニオンＨＳ−２０８（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（以上、日本油脂社製）で、中でもエマルゲンＬ−４０が好ましい。
【００５２】
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物は、ポリオキシエチレンとポリオキシブチレンとのランダム重合体、ブロック重合体を含み、例えば一般式（Ｉ）
【００５３】
【化１】
【００５４】
（式中、Ａ、ＢおよびＣは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す）で表される化合物［以下、化合物（Ｉ）と称する］等が挙げられる。化合物（Ｉ）におけるアルキルは、炭素数が１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシル、ヘキサデシル、イソヘキサデシル、ヘプタデシル、イソヘプタデシル、オクタデシル、イソオクタデシル、ノナデシル、イソノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンチル等を含む。
【００５５】
化合物（Ｉ）の具体例は、プロノンＢ−２０４、プロノンＢ−２０８（以上、日本油脂社製）を含む。ポリオキシブチレン部分の分子量としては、７００以上が好ましく、１，０００以上がより好ましく、１，５００以上が特に好ましい。
【００５６】
ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルの例は、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−９、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−１２．５、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−２０、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−１０、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−７．５、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−１６、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−２０、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（以上、青木油脂社製）等であって、市販されている。
【００５７】
ポリオキシアルキレン長鎖分岐アルキルエーテルの例はユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ（日本油脂社製）であり市販されている。
【００５８】
シクロデキストリンまたはその誘導体の例はシクロデキストリン、ジメチルシクロデキストリン、トリメチルシクロデキストリン、ヒドロキシエチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、カルボキシメチルシクロデキストリン、グリコシルシクロデキストリン、マルトシルシクロデキストリン、シクロデキスロリンスルフェート、シクロデキストリンポリマーであり、ヒドロキシエチルシクロデキストリンおよびヒドロキシプロピルシクロデキストリンが好ましい。
【００５９】
シクロデキストリンの例はα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンである。
ジメチルシクロデキストリンの例はジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリンである。
トリメチルシクロデキストリンの例はトリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリンである。
ヒドロキシエチルシクロデキストリンの例はヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリンである。
【００６０】
ヒドロキシプロピルシクロデキストリンの例はヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである。
カルボキシメチルシクロデキストリンの例はカルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリンである。
【００６１】
グリコシルシクロデキストリンの例はグリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリンである。
マルトシルシクロデキストリンの例はマルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリンである。
シクロデキストリンスルフェートの例はα−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェートである。
【００６２】
シクロデキストリンポリマーの例はβ−シクロデキストリンポリマーである。２種類以上のシクロデキストリンまたはその誘導体を組み合わせて使用することもできる。
【００６３】
アルブミンの例はウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミンを含み、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。２種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。
【００６４】
水性媒体は、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等を含み、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤の例はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等があげられる。グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）を含む。
【００６５】
緩衝液は通常ｐＨ４〜１０、好ましくは５〜９で、通常０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００６６】
過酸化水素定量に用いられる色原体として、酸化によって色素に変換される色原体が用いられる、その例はロイコ型色原体、酸化カップリング型色原体を含む。ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。ロイコ型色原体の例は１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）である。
【００６７】
酸化カップリング型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化によってカップリングして色素に変換される色原体である。２つの化合物の組み合わせの例はカプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせを含む。カプラーの例は４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジンである。アニリン類の例はＮ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）を含む。フェノール類の例はフェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）を含む。
【００６８】
ペルオキシダーゼは、１〜１００ｋＵ／Ｌの濃度で用いられる。色原体は、０．０１〜１０ｇ／Ｌで用いられる。
【００６９】
還元型補酵素の定量に用いられる色原体の例は、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）を含む。
【００７０】
酵素活性化剤の例は胆汁酸類、アルキルスルホン酸塩等のアニオン性界面活性剤を含む。胆汁酸類の例はコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸を含む。アルキルスルホン酸塩の例は１−ペンタスルホン酸塩、１−ヘキサスルホン酸塩、１−ヘプタスルホン酸塩、１−オクタスルホン酸塩を含む。アルキルスルホン酸塩における塩の例はアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩を含む。
【００７１】
安定化剤の例はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウムである。
防腐剤の例はアジ化ナトリウム、抗生物質を含む。
干渉抑制剤の例はアスコルビン酸の影響を抑制するためのアスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンの影響を抑制するためのフェロシアン化カリウムを含む。
【００７２】
塩類の例は塩化リチウム、硫酸リチウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムの塩類を含む。
【００７３】
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量方法として、以下の具体的態様を例示することができる。
【００７４】
定量方法１
（１）水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、界面活性剤１および界面活性剤２の存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する過酸化水素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定する方法。
【００７５】
定量方法２
（１）水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１および界面活性剤２の存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００７６】
定量方法３
（１）水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤１および界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンの存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する過酸化水素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００７７】
定量方法４
（１）水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１および界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンの存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００７８】
定量方法５
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤２とを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する過酸化水素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００７９】
定量方法６
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤２とを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する還元型補酵素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８０】
定量方法７
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンとを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する過酸化水素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８１】
定量方法８
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンとを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する還元型補酵素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８２】
定量方法９
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤１および界面活性剤２とを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する過酸化水素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８３】
定量方法１０
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤１および界面活性剤２とを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する還元型補酵素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８４】
定量方法１１
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤１および界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンとを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する過酸化水素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８５】
定量方法１２
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤１および界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンとを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する還元型補酵素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８６】
（ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用試薬）
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用試薬は、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素およびコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素をＶＬＤＬレムナント中のエステル型および遊離型コレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル（界面活性剤１）および（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤（界面活性剤２）を含有する。
【００８７】
上記試薬は、過酸化水素定量用試薬を含有できる。過酸化水素定量用試薬の例はペルオキシダーゼ及び酸化によって色素に変換される色原体を含有する。
また、本発明の他のＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用試薬は、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素およびコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント中のエステル型および遊離型コレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル（界面活性剤１）および（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤（界面活性剤２）を含有する。
【００８８】
この試薬は還元型補酵素定量用試薬を含有できる。還元型補酵素定量用試薬の例はジアホラーゼ、電子キャリヤーおよび還元によって色素に変換される色原体を含有する。
これらの試薬はいずれもシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有することができる。
【００８９】
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用試薬として、以下の具体的態様を例示することができる。
【００９０】
試薬１
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤１、界面活性剤２および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬２
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１および界面活性剤２を含有する試薬。
【００９１】
試薬３
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１、界面活性剤２および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬４
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤１、界面活性剤２、過酸化水素測定用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
【００９２】
試薬５
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１、界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
試薬６
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１、界面活性剤２、還元型補酵素測定用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
【００９３】
（ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用キット）
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用される。キットの形態は、２試薬および３試薬が用いられるが、２試薬系が好ましい。
第１試薬と第２試薬の２試薬系のキットにおいて、コレステロールエステル加水分解酵素と、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素とは別々の試薬に含有されてもよいが、同一試薬に含有されるキットが好ましく、特に、第２試薬に含有されるキットが好ましい。これらの酵素が別々の試薬に含有される場合には、コレステロールエステル加水分解酵素が第１試薬に、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素が第２試薬に含有される。
【００９４】
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤は、第１試薬、第２試薬の何れかの試薬に含有されるが、第１試薬に含有されるキットが好ましい。
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルは、第１試薬、第２試薬の何れかの試薬に含有される。シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンは、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方にに含有されるが、好ましくは第１試薬に含有される。酸化型補酵素は、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有される。過酸化水素定量用試薬は、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有されるが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれの化合物は好ましくは別々の試薬に含有される。還元型補酵素定量用試薬は、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有される。
【００９５】
具体的には、例えば以下の態様のキットがあげられる。
キット１
第１試薬
界面活性剤２および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【００９６】
キット２
第１試薬
界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【００９７】
キット３
第１試薬
界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【００９８】
キット４
第１試薬
界面活性剤２、過酸化水素定量用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【００９９】
キット５
第１試薬
界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【０１００】
キット６
第１試薬
界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０１】
キット７
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０２】
キット８
第１試薬
界面活性剤１および界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【０１０３】
キット９
第１試薬
界面活性剤１および界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０４】
キット１０
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、過酸化水素定量用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０５】
キット１１
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【０１０６】
キット１２
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０７】
キット１３
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０８】
キット１４
第１試薬
界面活性剤１および界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【０１０９】
キット１５
第１試薬
界面活性剤１および界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【０１１０】
キット１６
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、過酸化水素定量用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【０１１１】
キット１７
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【０１１２】
キット１８
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【０１１３】
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用試薬およびキットは、ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量およびＩＤＬ−Ｃの定量に使用することができる。
【０１１４】
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用試薬およびキットにおける各成分は、前述のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量方法または試薬に記載のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、シクロデキストリンまたはその誘導体、アルブミン、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤、過酸化水素定量用試薬および還元型補酵素定量用試薬を用いることができる。
【０１１５】
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用試薬およびキットには、必要に応じて、前述の水性媒体、酵素活性化剤、安定化剤、防腐剤、干渉物抑制剤、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類が含有されてもよい。
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用試薬およびキットにおける酵素、２種の界面活性剤、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンは、水性媒体で溶解された状態でＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量方法の項に記載の濃度となる含量で構成される。
【０１１６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬および機器を使用した。
【０１１７】
ＭＯＰＳ（グッド緩衝剤；同仁化学社製）、ＴＯＯＳ（トリンダー試薬；同仁化学社製）、硫酸ナトリウム（和光純薬社製）、エマルゲンＬ−４０（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル；花王社製）、プロノンＢ−２０８（ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物；日本油脂社製）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（東洋紡績社製）、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）（旭化成社製）、４−アミノアンチピリン（半井化学社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）（東洋紡績社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）（協和発酵工業社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル；青木油脂社製）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（オリエンタル酵母社製）、ユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ（ポリオキシアルキレン長鎖分岐アルキルエーテル；日本油脂社製）、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（日本食品化工社製）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１８】
実施例１
ＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ５ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８ ６ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ２ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ２Ｕ／ｍＬ
【０１１９】
実施例２
ＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０ ７ｇ／Ｌ
ＢＳＡ １ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ２ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ２Ｕ／ｍＬ
【０１２０】
実施例３
ＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ
ユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ ６ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ２ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ２Ｕ／ｍＬ
【０１２１】
実施例４
ＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ５ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８ ６ｇ／Ｌ
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン ３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ２ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ２Ｕ／ｍＬ
【０１２２】
実施例５
ＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ５ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８ ６ｇ／Ｌ
ＢＳＡ ３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ２ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ２Ｕ／ｍＬ
【０１２３】
実施例６
ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
新鮮血清４０試料それぞれについて、実施例１のキットを用いて日立７１７０型自動分析装置により、試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃを以下の様にして定量した。
（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（ＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度：０．０ｍｇ／ｄＬ）、ならびに、ＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度が４５ｍｇ／ｄＬである血清｛山村らの方法［「動脈硬化」，日本動脈硬化学会，２００１年，第２９巻，ｐ．２３５（演題番号：Ｎｏ．９８）］により濃度を決定｝および当該血清を適宜希釈して調製した希釈血清を用いた。
実施例１のキットを用いて、以下の様にして日立７１７０型自動分析装置によりＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を定量し、検量線を作成した。
反応セルへ標準液（６μＬ）と第１試薬（０．１８ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで定量し、次いで、この反応液に第２試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
（２）ヒト新鮮血清試料（４０試料）に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
標準液の代わりにヒト新鮮血清４０試料を用いて、（１）と同様の方法により、当該４０試料各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と（１）で作成した検量線とから、当該４０試料各々に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
【０１２４】
実施例７
ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに実施例２のキットを用いる以外は実施例６の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例６の定量において使用したヒト新鮮血清試料（４０試料）各々に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
【０１２５】
実施例８
ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに実施例３のキットを用いる以外は実施例６の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例６の定量において使用したヒト新鮮血清試料（４０試料）各々に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
【０１２６】
実施例９
ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに実施例４のキットを用いる以外は実施例６の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例６の定量において使用したヒト新鮮血清試料（４０試料）各々に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
【０１２７】
実施例１０
ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに実施例５のキットを用いる以外は実施例６の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例６の定量において使用したヒト新鮮血清試料（４０試料）各々に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
（参考例１） 山村らの方法によるＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
実施例６の定量において使用した新鮮血清（４０試料）それぞれについて、山村らの方法［「動脈硬化」，日本動脈硬化学会，２００１年，第２９巻，ｐ．２３５（演題番号：Ｎｏ．９８）］により、超遠心分離とゲルろ過とを組み合わせて、以下の様に試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
【０１２８】
まず、それぞれの試料を超遠心分離により、比重が１．０１９よりも小さい上清画分を分離した。すなわち、超遠心分離用チューブに試料を２ｍＬ添加し、比重が１．０１９になるように比重調整液［ＫＢｒ（３７．９ｇ／Ｌ）を含有する生理食塩水］を２ｍＬ添加した後、このチューブを日立ローター５０．４ ＴＩローターにセットし、３５，０００ｒｐｍで２０時間、超遠心分離を行い、遠心分離終了後、チューブスライサーを用いて分離した上清を取得した。
【０１２９】
当該上清は、ＣＭ、ＶＬＤＬおよびＶＬＤＬレムナントを含有する（当該ＶＬＤＬレムナントは、ＩＤＬを含有する）。
上記で得たＣＭ、ＶＬＤＬおよびＶＬＤＬレムナントを含有する上清を、以下の条件により、発色反応系を伴うゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより分離しコレステロールを定量した。
【０１３０】
ＨＰＬＣシステム：東ソーのシステム
カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ６カラム（ファルマシア社製）
溶出溶媒：ＥＤＴＡ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有する０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）
発色試薬：デタミナーＬ ＴＣ（Ｒ１＋Ｒ２；協和メデックス社製）
流速：０．５ｍＬ／分（溶出溶媒）；０．２５ｍＬ／分（発色試薬）
発色反応温度：３７℃
検出波長：５５０ｎｍ
サンプル量：３μＬ
当該上清中のコレステロール濃度は、デタミナーＬ ＴＣ（総コレステロール定量用キット；協和メデックス社製）を用いて決定した。
【０１３１】
本ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおける溶出パターン（クロマトグラム）を図１に示す。図１に示されているように、最初にＶＬＤＬおよびＣＭが溶出され、次いでＶＬＤＬレムナントが溶出された。
【０１３２】
実施例１１
先に定量した超遠心分離により調製した上清中のコレステロール濃度に、当該上清の容量および図１のクロマトグラムのＶＬＤＬレムナント部分の相対面積比を乗ずることにより、当該上清中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ量を算出し、最終的に試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定した。
【０１３３】
これらの試料の超遠心分離による比重１．０１９未満の上清の調製から、当該試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度の決定に至る一連の操作を４０試料の各々について行った。参考例１の定量方法と実施例６〜１０の定量法との間の相関関係を調べたところ、両定量法の間に第１表に示すような相関係数が得られた。また、参考例１の定量方法と実施例９の定量法との間には、図２に示すような相関図が得られた（相関式：Ｙ＝０．８３Ｘ＋４．７；相関係数：ｒ＝０．９１）。このように、両定量法の間に良好な相関関係があることから、本発明の定量法により、試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃが定量できることが判明した。
【０１３４】
（参考例２） 超遠心法によるＩＤＬ−Ｃの定量
実施例６の定量において使用した新鮮血清（４０試料）それぞれについて、超遠心分離操作により、比重が１．００６から１．０１９の画分（ＩＤＬ画分）を得た。得られたＩＤＬ画分中のコレステロール濃度をデタミナーＬ ＴＣ（総コレステロール定量用キット；協和メデックス社製）を用いて定量した。
実施例１２
標準液として、比重が１．００６から１．０１９の画分中のコレステロールが２３ｍｇ／ｄＬである血清を用いて検量線を作成する以外は、実施例６と同様の方法により、実施例１〜５の試薬を用いて測定を行い、参考例２の定量方法と実施例６〜１０の定量方法との間の相関関係を調べたところ、両定量法の間に第１表に示すような相関係数が得られた。また、参考例２の定量方法と実施例９の定量法との間には、図３に示すような相関図が得られた（相関式：Ｙ＝１．２０Ｘ＋５．６；相関係数：ｒ＝０．８３）。このように、両定量法の間に良好な相関関係があることから、本発明の定量法により、試料中のＩＤＬ−Ｃが定量され得ることが判明した。
【０１３５】
【表１】
【０１３６】
実施例１１および実施例１２の結果、本発明の定量法により、試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃおよび試料中のＩＤＬ−Ｃが定量できることが判明した。
【０１３７】
（参考例３） シクロデキストリンまたはその誘導体、アルブミンのＬＤＬに対する反応抑制効果
実施例１、実施例４、実施例５のキットおよび超遠心分離により調製したＬＤＬ分画を用いて、各キットにおけるＬＤＬに対する反応性を検討した。標準液の代わりにＬＤＬ分画を、第１試薬および第２試薬として、実施例１、実施例４、実施例５のキットを構成する第１試薬および第２試薬を用いる以外は実施例６に記載の方法と同様の方法より反応を行った。その結果を第２表に示す。
【０１３８】
【表２】
【０１３９】
第２表中、ＬＤＬ反応率とは、ＬＤＬ分画とデタミナーＬ ＴＣ（総コレステロール定量用キット；協和メデックス社製）との反応により定量したＬＤＬ分画中のコレステロール量に対する、ＬＤＬ分画と各キットとの反応により定量したコレステロール量の割合を表す。また、第２表中、吸光度とは、既知濃度のコレステロール標準液と各キットとの反応により得られた反応液の吸光度を表す。第２表から判るように、シクロデキストリンまたはその誘導体またはアルブミンを添加することにより、ＬＤＬ中のコレステロールに対する反応が抑制された。また、アルブミンを添加することにより吸光度が上昇したことから、感度も向上することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明によれば、動脈硬化性疾患の診断に有用なＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量方法、試薬およびキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】 超遠心分離により調製した比重１．０１９以下の分画をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより分析した際のクロマトグラムである。
【図２】 超遠心分離とゲルろ過とを組み合わせたＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量法（参考例１の定量法）と実施例９の定量法との相関関係を表す図である。
【図３】 超遠心分離を用いたＩＤＬ−Ｃの定量法（参考例２の定量法）と実施例９の定量法との相関関係を表す図である。
【技術分野】
本発明は、試料中の超低密度リポ蛋白レムナント（ＶＬＤＬレムナント）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中には、種々のリポ蛋白が含有されている。これらのリポ蛋白は比重の違いにより、カイロミクロン（以下、ＣＭと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）に分類されている。各リポ蛋白は、コレステロール、トリグリセライド、リン脂質、蛋白質等の構成成分の割合が異なっており、生体内で異なる作用を有する。
【０００３】
これらのリポ蛋白以外に、リポ蛋白がリポ蛋白リパーゼによって代謝・分解される過程で生じるレムナントリポ蛋白がある。レムナントリポ蛋白は、カイロミクロンレムナント（以下、ＣＭレムナントと略記する）および超低密度リポ蛋白レムナント（以下、ＶＬＤＬレムナントと略記する）に分類される。中間密度リポ蛋白（以下、ＩＤＬと略記する）は、ＶＬＤＬレムナントに包含される、比重１．００６〜１．０１９のリポ蛋白であり狭義のＶＬＤＬレムナントと呼ばれる。
【０００４】
レムナントリポ蛋白は、トリグリセライド（ＴＧ）が豊富なリポ蛋白であり、アポＥとコレステロールが比較的豊富なリポ蛋白である。ＣＭレムナントはアポＢ−４８とアポＥとを主要アポ蛋白として有し、ＶＬＤＬレムナントはアポＢ−１００とアポＥとを主要アポ蛋白として有する。
【０００５】
レムナントリポ蛋白は、健常人においては速やかに代謝され、速やかに肝臓のレセプターに取り込まれるが、代謝異常や過食・運動不足等の日常の悪い生活習慣により、血液中に停滞するレムナントリポ蛋白が増加し、この血液中に停滞したレムナントリポ蛋白によりＩＩＩ型高脂血症などが引き起こされ、動脈硬化が高い割合で発症する。動脈硬化の発症に際しては、血液中に停滞したレムナントリポ蛋白が動脈壁のマクロファージに容易に取り込まれ、動脈硬化の初期病変を形成すると考えられている。このように、レムナントリポ蛋白は動脈硬化性疾患の危険因子の一つと考えられている。
【０００６】
ＣＭレムナントは、アポＢ−４８を主要アポ蛋白として有するため、肝臓のＬＤＬ受容体関連蛋白（ＬＤＬ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＬＲＰ）を介して取り込まれると考えられており、ＶＬＤＬレムナントは、アポＢ−１００を主要アポ蛋白として有するため、肝臓のＬＤＬ受容体を介して取り込まれると考えられている。また、最近、新しいレムナントリポ蛋白のマクロファージ泡沫化経路の一つとして、ＶＬＤＬ受容体経路が報告されている。すなわち、単球からマクロファージへの分化過程においてＶＬＤＬ受容体の発現が増大し、レムナントリポ蛋白がＶＬＤＬ受容体を介してマクロファージの泡沫化を引き起こすことが報告されている。
【０００７】
レムナントリポ蛋白またはレムナントリポ蛋白中のコレステロールの定量法としては、これまでに、電気泳動法、超遠心法、液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法、免疫吸着法等が報告されている。電気泳動法としては、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）法やアガロースゲル電気泳動法等が報告されている。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）法は、レムナントリポ蛋白の定性分析に使用される方法であり、ＶＬＤＬとＬＤＬとの間に認められる異常バンドである中間帯（Ｍｉｄ−ｂａｎｄ）を検出する方法である。アガロースゲル電気泳動法も、レムナントリポ蛋白の定性分析に使用される方法であり、特にＩＩＩ型高脂血症の診断に有効に使用される。ＩＩＩ型高脂血症においては、β位に移動するβ−ＶＬＤＬが確認される。
【０００８】
超遠心法としては、比重が１．００６から１．０１９の間のリポ蛋白である中間密度リポ蛋白（以下、ＩＤＬと略記する）を超遠心分離により分離し、得られたＩＤＬ中のコレステロールを定量する方法が挙げられる。しかしながら、この超遠心法は操作が非常に煩雑である。
【０００９】
ＨＰＬＣ法としては、血清中のＣＭ及びＶＬＤＬをＨＰＬＣで分離し、分離されたＣＭ中のコレステロール量及び分離されたＶＬＤＬ中のコレステロール量を分析することからなる血清試料中のレムナント様リポ蛋白（以下、ＲＬＰと略記する）の分析方法（特開平８−１０５８７６号公報）や、ヒト血清試料中のＲＬＰ以外のリポ蛋白を、アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクローナル抗体及びアポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−１００モノクローナル抗体を非多孔性不溶性支持体に固定化したリポ蛋白分離用充填剤を充填してなるリポ蛋白分離用抗体カラムで分離し、分離されなかったリポ蛋白をＲＬＰとして、該ＲＬＰ中のコレステロール量を分析することからなる、血清試料中のＲＬＰの分析方法が挙げられる（特開平８−１０５８７５号公報）。前者の方法は、ＣＭコレステロールとＶＬＤＬコレステロールの総和が免疫吸着法によって測定されるＲＬＰ中のコレステロールと高い相関関係にあることに基づく方法である。これらの公開特許公報においては、ＲＬＰという用語は、ＣＭやＶＬＤＬ等がリポ蛋白リパーゼによって分解された異常リポ蛋白という意味で使用されている。
【００１０】
最近、免疫吸着法によるＲＬＰ中のコレステロールの定量法が開発された。ここでいうＲＬＰとは、トリグリセライドに富むリポ蛋白を意味する。本定量法においては、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体およびアポＢ−４８を認識しない特異的抗アポＢ−１００モノクローナル抗体を含有するアフィニティーゲルを用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより血清からＲＬＰを分離し、この分離したＲＬＰに含まれるコレステロールが定量される。本定量法に適用されるＲＬＰ中のコレステロール定量用試薬が、（株）日本抗体研究所から販売されている［製品名：ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩ］（「クリニカル ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，アメリカ臨床化学会，２００２年，第４８巻，ｐ．２１７−２１９）。
【００１１】
ＲＬＰ中のコレステロールの定量法としては、ポリオキシアルキレン誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体の共存下、試料にコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロール脱水素酵素ならびにリン脂質を加水分解する酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元性補酵素を定量することを特徴とする方法も報告されている（特開２００１−２３１５９７号公報）。本公開特許公報の実施例１の定量用試薬を用いて得られる試料中のコレステロール定量値と日本抗体研究所社製の定量用試薬であるＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩを用いて得られる試料のＲＬＰ中のコレステロール定量値との間に良好な相関関係が認められる。しかしながら、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩＭＲＯ」ＩＩは、試料中の、レムナントリポ蛋白に分類されない、ＶＬＤＬ中のコレステロールにも反応することが報告されている。
【００１２】
近年、超遠心法とゲルろ過法とを組み合わせたレムナントリポ蛋白の分析が報告されている。（「動脈硬化」，日本動脈硬化学会，２００１年，第２９巻，ｐ．２３５（演題番号：９８））。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の目的は、動脈硬化性疾患の危険因子の一つであるＶＬＤＬレムナント中のコレステロール（以下ＶＬＤＬレムナントコレステロールといい、ＶＬＤＬレムナント−Ｃと略記する）を簡便かつ迅速に定量する方法、試薬およびキットを提供することにある。本発明において、ＶＬＤＬレムナント−Ｃとは、ＶＬＤＬレムナント中のエステル型コレステロールと遊離型コレステロールを合わせたものである。
【００１４】
本発明は、以下の（１）〜（２６）に関する。
（１） 試料を含有する水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナント中のエステル型および遊離型コレステロール（ＶＬＤＬレムナント−Ｃ）に特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせの存在下、試料中の超低密度リポ蛋白レムナント中のコレステロールに、（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または（ｄ）酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とする試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールの定量方法。
【００１５】
（２） 超低密度リポ蛋白レムナントが、中間密度リポ蛋白である（１）記載の方法。
（３） 該酵素反応が、さらにシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンの存在下に行われる（１）または（２）記載の方法。
（４） シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である（３）記載の方法。
【００１６】
（５） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 過酸化水素の定量が、ペルオキシダーゼの存在下生成した過酸化水素と色原体とを反応させて色素を生成させ、生成した色素を定量することによって行われる（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） 還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（８） 還元型補酵素の定量が、還元型補酵素定量用試薬を用いて行われる（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（９） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用試薬。
（１０） 該試薬がさらに過酸化水素定量用試薬を含有する（９）記載の試薬。
【００１８】
（１１） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用試薬。
（１２） 該試薬がさらに還元型補酵素定量用試薬を含有する（１１）記載の試薬。
【００１９】
（１３） 超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールが、中間密度リポ蛋白である（９）〜（１２）のいずれかに記載の試薬。
（１４） さらに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する（９）〜（１３）のいずれかに記載の試薬。
（１５） シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である（１４）記載の試薬。
（１６） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルである（９）〜（１５）のいずれかに記載の試薬。
【００２０】
（１７） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２１】
（１８） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有し、過酸化水素定量用試薬を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２２】
（１９） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬を含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２３】
（２０） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬を含有し、かつ、過酸化水素定量用試薬を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２４】
（２１） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有し、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素をレムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２５】
（２２） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２６】
（２３） コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有し、還元型補酵素定量用試薬を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【００２７】
（２４） 超低密度リポ蛋白レムナントが中間密度リポ蛋白である（１７）〜（２３）のいずれかに記載のキット。
（２５） さらに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する（１７）〜（２４）のいずれかに記載のキット。
（２６） シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である（２５）記載のキット。
（２７） ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである（１７）〜（２６）のいずれかに記載のキット。
【００２８】
本発明方法を詳細に説明する。
本発明の特徴は、コレステロール定量反応に用いられる酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる界面活性剤として、（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせが優れた効果を奏することにある。即ち、これらの２種の界面活性剤は組み合わさって、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる。
【００２９】
さらにこれらの酵素反応において水性媒体中にシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを存在させることによって、ＶＬＤＬレムナント−Ｃ以外のリポ蛋白中のコレステロール、特にＬＤＬ中のコレステロールに前記酵素が作用するのを抑制することを特徴とする。
【００３０】
本発明の方法によれば試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃは、水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせの存在下、試料中のＶＬＤＬレムナント中のエステル型コレステロールをコレステロールエステル加水分解酵素の作用によって遊離型コレステロールに変換し、該遊離型コレステロールおよびＶＬＤＬレムナント中の遊離型コレステロールから（ｃ）コレステロール酸化酵素の作用によって過酸化水素を生成させまたは（ｄ）酸化型補酵素の存在下コレステロール脱水素酵素の作用によって還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することによって定量できる。
【００３１】
この方法において、酵素反応をシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンの存在下に行うことによってＶＬＤＬレムナント以外のリポ蛋白のコレステロールに酵素が作用するのを抑制することができるので好ましい。
本発明の定量方法によって全血、血漿、血清等、好ましくは、血漿、血清等の試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量できる。
【００３２】
酵素反応は、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の少なくとも２種類の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールの定量に必要なコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素（コレステロール脱水素酵素を用いる場合には酸化型補酵素が必要）、ならびに、要すればシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する緩衝液等の水溶液中で行われる。反応によって生成する過酸化水素または還元型補酵素の定量はそれ自体公知の方法によって行われる。
【００３３】
該水溶液には、必要に応じてＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量反応の特異性に影響を及ぼさない範囲でコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼを活性化するためによく使用される酵素活性化剤、安定化剤、防腐剤、干渉物抑制剤、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類を使用することもできる。
【００３４】
コレステロールエステル加水分解反応、遊離コレステロールの酸化または脱水素反応は該２種類の界面活性剤の存在下に順次行ってもよい。また試料と界面活性剤とを水性液中接触させ、ついで酵素を添加して反応させてもよいが、通常必要な成分を全てまたは必要に応じて２〜３のグループに分けて水性媒体に添加して反応させる。より便利には、後述のＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用キットが用いられる。
【００３５】
水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素は、通常０．００１〜４００Ｕ／ｍＬで、好ましくは０．０１〜２００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは０．０５〜１００Ｕ／ｍＬの濃度で用いられる。
【００３６】
水性媒体中、該２種類の界面活性剤の濃度は、それぞれに、０．００１〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００５〜２．５（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．０５〜１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。
【００３７】
水性媒体中、シクロデキストリンまたはその誘導体の濃度は、０．００１〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００５〜２．５（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。
水性媒体中、アルブミンの濃度は、０．００１〜５（ｗ／ｖ）％が好ましく、０．００５〜２．５（ｗ／ｖ）％がより好ましく、０．０１〜１（ｗ／ｖ）％が特に好ましい。
【００３８】
酵素反応は通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、通常２〜３０分間で完了する。
生成した過酸化水素は例えばペルオキシダーゼの存在下過酸化水素と酸化によって色素に変換される色原体との反応によって色素を生成させ、生成した色素の吸収極大波長で反応液の吸光度の変化を測定することによって定量される。また化学発光物質、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等と過酸化水素とを反応させてフォトンを生成させ、生成したフォトンを定量することにより過酸化水素は定量される。
【００３９】
還元型補酵素は酵素反応によって生成した還元型補酵素含有液の吸光度を３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、より好ましくは３４０ｎｍ付近で測定することによって定量できる。また、還元型補酵素と色原体とを反応させて色素を生成させ、生成した色素を定量することによって定量できる。例えば還元型補酵素とジアホラーゼ、電子キャリアー例えば１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェートおよび色原体とを反応させて色素を生成させ、色素の吸収極大波長で反応液の吸光度を測定することによって定量できる。色原体としては還元されて色素に変換される色原体が用いられる。
【００４０】
試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度は、予め既知の濃度のＶＬＤＬレムナント−Ｃを含有する試料を用いて、コレステロール濃度と過酸化水素または還元型補酵素の量との関係を示す検量線を作成し、この検量線から求めることができる。
【００４１】
コレステロールエステル加水分解酵素はコレステロールエステルを加水分解できる酵素、例えばコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等が用いられ、動物、植物または微生物由来または、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素等を使用することができる。化学的に修飾された酵素としては、例えばポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等の化学修飾基で修飾された酵素が含まれる。特にポリエチレングリコールを主成分とする基で修飾された酵素が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が含まれる。
【００４２】
化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）は、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物等が含まれる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造は、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が含まれる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基または構造は、例えばアミノ基を含む。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造は、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等を含む。
【００４３】
化学修飾剤の例は、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥＡＣ−５０ＨＳ、サンブライトＭＥＣ−５０ＨＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもＳｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水酢酸（ＤＴＰＡ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ；同仁化学社製）、ポリウレタン修飾用の活性化ポリウレタンＰ４０００（ベーリンガーマンハイム社製）、デキストラン修飾用のデキストランＴ４０、活性化ＴＣＴ（ベーリンガーマンハイム社製）等を含む。
【００４４】
酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができる。
まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分〜５時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
【００４５】
コレステロール酸化酵素は動物、植物または微生物由来酵素、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素等を用いることができる。
化学修飾酵素は、前述の化学修飾方法により作製することができる。
【００４６】
コレステロール脱水素酵素は、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば、動物、植物または微生物由来の酵素、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素を用いることができる。化学的に修飾された酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
【００４７】
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いる定量法において使用される酸化型補酵素の例は、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオ−ＮＡＤ、チオ−ＮＡＤＰである。
【００４８】
本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルは、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさって、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる機能を有し、単独で使用された場合には、必ずしも、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる機能を有する必要はない。以下、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを、「界面活性剤１」とよぶ。
【００４９】
本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤は、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさって、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる機能を有し、単独で使用された場合には、必ずしも、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント−Ｃに特異的に作用させる機能を有する必要はない。以下、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を、「界面活性剤２」とよぶ。
【００５０】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルの例はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルを含み、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルが好ましい。
【００５１】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルにおけるアルキルは、直鎖または分岐状の炭素数６〜１５の、例えばヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシルを含む。ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルの具体例は、エマルゲンＬ−４０（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル）、エマルゲン９１１（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、エマルゲン８１０（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（以上、花王社製）、ノニオンＨＳ−２１０（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、ノニオンＨＳ−２１５（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、ノニオンＮＳ−２０８．５（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）、ノニオンＨＳ−２０８（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（以上、日本油脂社製）で、中でもエマルゲンＬ−４０が好ましい。
【００５２】
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物は、ポリオキシエチレンとポリオキシブチレンとのランダム重合体、ブロック重合体を含み、例えば一般式（Ｉ）
【００５３】
【化１】
【００５４】
（式中、Ａ、ＢおよびＣは同一または異なって１〜２００の整数を表し、Ｒは水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す）で表される化合物［以下、化合物（Ｉ）と称する］等が挙げられる。化合物（Ｉ）におけるアルキルは、炭素数が１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシル、ヘキサデシル、イソヘキサデシル、ヘプタデシル、イソヘプタデシル、オクタデシル、イソオクタデシル、ノナデシル、イソノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンチル等を含む。
【００５５】
化合物（Ｉ）の具体例は、プロノンＢ−２０４、プロノンＢ−２０８（以上、日本油脂社製）を含む。ポリオキシブチレン部分の分子量としては、７００以上が好ましく、１，０００以上がより好ましく、１，５００以上が特に好ましい。
【００５６】
ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルの例は、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−９、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−１２．５、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−２０、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−１０、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−７．５、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−１６、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−２０、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（以上、青木油脂社製）等であって、市販されている。
【００５７】
ポリオキシアルキレン長鎖分岐アルキルエーテルの例はユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ（日本油脂社製）であり市販されている。
【００５８】
シクロデキストリンまたはその誘導体の例はシクロデキストリン、ジメチルシクロデキストリン、トリメチルシクロデキストリン、ヒドロキシエチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、カルボキシメチルシクロデキストリン、グリコシルシクロデキストリン、マルトシルシクロデキストリン、シクロデキスロリンスルフェート、シクロデキストリンポリマーであり、ヒドロキシエチルシクロデキストリンおよびヒドロキシプロピルシクロデキストリンが好ましい。
【００５９】
シクロデキストリンの例はα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンである。
ジメチルシクロデキストリンの例はジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリンである。
トリメチルシクロデキストリンの例はトリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリンである。
ヒドロキシエチルシクロデキストリンの例はヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリンである。
【００６０】
ヒドロキシプロピルシクロデキストリンの例はヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである。
カルボキシメチルシクロデキストリンの例はカルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリンである。
【００６１】
グリコシルシクロデキストリンの例はグリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリンである。
マルトシルシクロデキストリンの例はマルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリンである。
シクロデキストリンスルフェートの例はα−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェートである。
【００６２】
シクロデキストリンポリマーの例はβ−シクロデキストリンポリマーである。２種類以上のシクロデキストリンまたはその誘導体を組み合わせて使用することもできる。
【００６３】
アルブミンの例はウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミンを含み、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。２種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。
【００６４】
水性媒体は、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等を含み、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤の例はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等があげられる。グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）を含む。
【００６５】
緩衝液は通常ｐＨ４〜１０、好ましくは５〜９で、通常０．００１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いられる。
【００６６】
過酸化水素定量に用いられる色原体として、酸化によって色素に変換される色原体が用いられる、その例はロイコ型色原体、酸化カップリング型色原体を含む。ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。ロイコ型色原体の例は１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）である。
【００６７】
酸化カップリング型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化によってカップリングして色素に変換される色原体である。２つの化合物の組み合わせの例はカプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせを含む。カプラーの例は４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジンである。アニリン類の例はＮ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）を含む。フェノール類の例はフェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）を含む。
【００６８】
ペルオキシダーゼは、１〜１００ｋＵ／Ｌの濃度で用いられる。色原体は、０．０１〜１０ｇ／Ｌで用いられる。
【００６９】
還元型補酵素の定量に用いられる色原体の例は、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）を含む。
【００７０】
酵素活性化剤の例は胆汁酸類、アルキルスルホン酸塩等のアニオン性界面活性剤を含む。胆汁酸類の例はコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸を含む。アルキルスルホン酸塩の例は１−ペンタスルホン酸塩、１−ヘキサスルホン酸塩、１−ヘプタスルホン酸塩、１−オクタスルホン酸塩を含む。アルキルスルホン酸塩における塩の例はアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩を含む。
【００７１】
安定化剤の例はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウムである。
防腐剤の例はアジ化ナトリウム、抗生物質を含む。
干渉抑制剤の例はアスコルビン酸の影響を抑制するためのアスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンの影響を抑制するためのフェロシアン化カリウムを含む。
【００７２】
塩類の例は塩化リチウム、硫酸リチウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムの塩類を含む。
【００７３】
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量方法として、以下の具体的態様を例示することができる。
【００７４】
定量方法１
（１）水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、界面活性剤１および界面活性剤２の存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する過酸化水素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定する方法。
【００７５】
定量方法２
（１）水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１および界面活性剤２の存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００７６】
定量方法３
（１）水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤１および界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンの存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する過酸化水素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００７７】
定量方法４
（１）水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１および界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンの存在下、酵素反応を行い、
（２）生成する還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００７８】
定量方法５
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤２とを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する過酸化水素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００７９】
定量方法６
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤２とを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する還元型補酵素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８０】
定量方法７
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンとを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する過酸化水素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８１】
定量方法８
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンとを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する還元型補酵素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８２】
定量方法９
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤１および界面活性剤２とを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する過酸化水素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８３】
定量方法１０
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤１および界面活性剤２とを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する還元型補酵素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８４】
定量方法１１
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤１および界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンとを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する過酸化水素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８５】
定量方法１２
（１）水性媒体中、検体と界面活性剤１および界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンとを予め混合した後、
（２）（１）の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
（３）生成する還元型補酵素を測定し、
（４）（３）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定することができる。
【００８６】
（ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用試薬）
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用試薬は、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素およびコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素をＶＬＤＬレムナント中のエステル型および遊離型コレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル（界面活性剤１）および（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤（界面活性剤２）を含有する。
【００８７】
上記試薬は、過酸化水素定量用試薬を含有できる。過酸化水素定量用試薬の例はペルオキシダーゼ及び酸化によって色素に変換される色原体を含有する。
また、本発明の他のＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用試薬は、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素およびコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素をＶＬＤＬレムナント中のエステル型および遊離型コレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル（界面活性剤１）および（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤（界面活性剤２）を含有する。
【００８８】
この試薬は還元型補酵素定量用試薬を含有できる。還元型補酵素定量用試薬の例はジアホラーゼ、電子キャリヤーおよび還元によって色素に変換される色原体を含有する。
これらの試薬はいずれもシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有することができる。
【００８９】
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用試薬として、以下の具体的態様を例示することができる。
【００９０】
試薬１
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤１、界面活性剤２および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬２
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１および界面活性剤２を含有する試薬。
【００９１】
試薬３
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１、界面活性剤２および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬４
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤１、界面活性剤２、過酸化水素測定用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
【００９２】
試薬５
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１、界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
試薬６
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤１、界面活性剤２、還元型補酵素測定用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
【００９３】
（ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量用キット）
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用される。キットの形態は、２試薬および３試薬が用いられるが、２試薬系が好ましい。
第１試薬と第２試薬の２試薬系のキットにおいて、コレステロールエステル加水分解酵素と、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素とは別々の試薬に含有されてもよいが、同一試薬に含有されるキットが好ましく、特に、第２試薬に含有されるキットが好ましい。これらの酵素が別々の試薬に含有される場合には、コレステロールエステル加水分解酵素が第１試薬に、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素が第２試薬に含有される。
【００９４】
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤は、第１試薬、第２試薬の何れかの試薬に含有されるが、第１試薬に含有されるキットが好ましい。
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルは、第１試薬、第２試薬の何れかの試薬に含有される。シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンは、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方にに含有されるが、好ましくは第１試薬に含有される。酸化型補酵素は、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有される。過酸化水素定量用試薬は、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有されるが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれの化合物は好ましくは別々の試薬に含有される。還元型補酵素定量用試薬は、第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有される。
【００９５】
具体的には、例えば以下の態様のキットがあげられる。
キット１
第１試薬
界面活性剤２および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【００９６】
キット２
第１試薬
界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【００９７】
キット３
第１試薬
界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【００９８】
キット４
第１試薬
界面活性剤２、過酸化水素定量用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【００９９】
キット５
第１試薬
界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【０１００】
キット６
第１試薬
界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０１】
キット７
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０２】
キット８
第１試薬
界面活性剤１および界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【０１０３】
キット９
第１試薬
界面活性剤１および界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０４】
キット１０
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、過酸化水素定量用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０５】
キット１１
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【０１０６】
キット１２
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
界面活性剤１、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０７】
キット１３
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【０１０８】
キット１４
第１試薬
界面活性剤１および界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【０１０９】
キット１５
第１試薬
界面活性剤１および界面活性剤２を含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【０１１０】
キット１６
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、過酸化水素定量用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
【０１１１】
キット１７
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【０１１２】
キット１８
第１試薬
界面活性剤１、界面活性剤２、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する試薬。
第２試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
【０１１３】
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用試薬およびキットは、ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量およびＩＤＬ−Ｃの定量に使用することができる。
【０１１４】
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用試薬およびキットにおける各成分は、前述のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量方法または試薬に記載のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、シクロデキストリンまたはその誘導体、アルブミン、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤、過酸化水素定量用試薬および還元型補酵素定量用試薬を用いることができる。
【０１１５】
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用試薬およびキットには、必要に応じて、前述の水性媒体、酵素活性化剤、安定化剤、防腐剤、干渉物抑制剤、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類が含有されてもよい。
本発明のＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用試薬およびキットにおける酵素、２種の界面活性剤、シクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンは、水性媒体で溶解された状態でＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量方法の項に記載の濃度となる含量で構成される。
【０１１６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬および機器を使用した。
【０１１７】
ＭＯＰＳ（グッド緩衝剤；同仁化学社製）、ＴＯＯＳ（トリンダー試薬；同仁化学社製）、硫酸ナトリウム（和光純薬社製）、エマルゲンＬ−４０（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル；花王社製）、プロノンＢ−２０８（ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物；日本油脂社製）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（東洋紡績社製）、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）（旭化成社製）、４−アミノアンチピリン（半井化学社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）（東洋紡績社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）（協和発酵工業社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル；青木油脂社製）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（オリエンタル酵母社製）、ユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ（ポリオキシアルキレン長鎖分岐アルキルエーテル；日本油脂社製）、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（日本食品化工社製）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１８】
実施例１
ＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ５ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８ ６ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ２ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ２Ｕ／ｍＬ
【０１１９】
実施例２
ＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０ ７ｇ／Ｌ
ＢＳＡ １ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ２ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ２Ｕ／ｍＬ
【０１２０】
実施例３
ＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ
ユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ ６ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ２ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ２Ｕ／ｍＬ
【０１２１】
実施例４
ＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ５ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８ ６ｇ／Ｌ
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン ３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ２ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ２Ｕ／ｍＬ
【０１２２】
実施例５
ＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キット
以下の第１試薬および第２試薬からなるＶＬＤＬレムナント−Ｃ定量用キットを作製した。
・第１試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム １ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ５ｇ／Ｌ
プロノンＢ−２０８ ６ｇ／Ｌ
ＢＳＡ ３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ） ２Ｕ／ｍＬ
・第２試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／Ｌ
エマルゲンＬ−４０ ２ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １０Ｕ／ｍＬ
リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ） ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ２Ｕ／ｍＬ
【０１２３】
実施例６
ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
新鮮血清４０試料それぞれについて、実施例１のキットを用いて日立７１７０型自動分析装置により、試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃを以下の様にして定量した。
（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（ＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度：０．０ｍｇ／ｄＬ）、ならびに、ＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度が４５ｍｇ／ｄＬである血清｛山村らの方法［「動脈硬化」，日本動脈硬化学会，２００１年，第２９巻，ｐ．２３５（演題番号：Ｎｏ．９８）］により濃度を決定｝および当該血清を適宜希釈して調製した希釈血清を用いた。
実施例１のキットを用いて、以下の様にして日立７１７０型自動分析装置によりＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を定量し、検量線を作成した。
反応セルへ標準液（６μＬ）と第１試薬（０．１８ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで定量し、次いで、この反応液に第２試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
（２）ヒト新鮮血清試料（４０試料）に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
標準液の代わりにヒト新鮮血清４０試料を用いて、（１）と同様の方法により、当該４０試料各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と（１）で作成した検量線とから、当該４０試料各々に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
【０１２４】
実施例７
ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに実施例２のキットを用いる以外は実施例６の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例６の定量において使用したヒト新鮮血清試料（４０試料）各々に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
【０１２５】
実施例８
ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに実施例３のキットを用いる以外は実施例６の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例６の定量において使用したヒト新鮮血清試料（４０試料）各々に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
【０１２６】
実施例９
ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに実施例４のキットを用いる以外は実施例６の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例６の定量において使用したヒト新鮮血清試料（４０試料）各々に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
【０１２７】
実施例１０
ＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
実施例１のキットの代わりに実施例５のキットを用いる以外は実施例６の定量法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置により、実施例６の定量において使用したヒト新鮮血清試料（４０試料）各々に含まれるＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
（参考例１） 山村らの方法によるＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量
実施例６の定量において使用した新鮮血清（４０試料）それぞれについて、山村らの方法［「動脈硬化」，日本動脈硬化学会，２００１年，第２９巻，ｐ．２３５（演題番号：Ｎｏ．９８）］により、超遠心分離とゲルろ過とを組み合わせて、以下の様に試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃを定量した。
【０１２８】
まず、それぞれの試料を超遠心分離により、比重が１．０１９よりも小さい上清画分を分離した。すなわち、超遠心分離用チューブに試料を２ｍＬ添加し、比重が１．０１９になるように比重調整液［ＫＢｒ（３７．９ｇ／Ｌ）を含有する生理食塩水］を２ｍＬ添加した後、このチューブを日立ローター５０．４ ＴＩローターにセットし、３５，０００ｒｐｍで２０時間、超遠心分離を行い、遠心分離終了後、チューブスライサーを用いて分離した上清を取得した。
【０１２９】
当該上清は、ＣＭ、ＶＬＤＬおよびＶＬＤＬレムナントを含有する（当該ＶＬＤＬレムナントは、ＩＤＬを含有する）。
上記で得たＣＭ、ＶＬＤＬおよびＶＬＤＬレムナントを含有する上清を、以下の条件により、発色反応系を伴うゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより分離しコレステロールを定量した。
【０１３０】
ＨＰＬＣシステム：東ソーのシステム
カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＨＲ６カラム（ファルマシア社製）
溶出溶媒：ＥＤＴＡ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有する０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）
発色試薬：デタミナーＬ ＴＣ（Ｒ１＋Ｒ２；協和メデックス社製）
流速：０．５ｍＬ／分（溶出溶媒）；０．２５ｍＬ／分（発色試薬）
発色反応温度：３７℃
検出波長：５５０ｎｍ
サンプル量：３μＬ
当該上清中のコレステロール濃度は、デタミナーＬ ＴＣ（総コレステロール定量用キット；協和メデックス社製）を用いて決定した。
【０１３１】
本ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおける溶出パターン（クロマトグラム）を図１に示す。図１に示されているように、最初にＶＬＤＬおよびＣＭが溶出され、次いでＶＬＤＬレムナントが溶出された。
【０１３２】
実施例１１
先に定量した超遠心分離により調製した上清中のコレステロール濃度に、当該上清の容量および図１のクロマトグラムのＶＬＤＬレムナント部分の相対面積比を乗ずることにより、当該上清中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ量を算出し、最終的に試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度を決定した。
【０１３３】
これらの試料の超遠心分離による比重１．０１９未満の上清の調製から、当該試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃ濃度の決定に至る一連の操作を４０試料の各々について行った。参考例１の定量方法と実施例６〜１０の定量法との間の相関関係を調べたところ、両定量法の間に第１表に示すような相関係数が得られた。また、参考例１の定量方法と実施例９の定量法との間には、図２に示すような相関図が得られた（相関式：Ｙ＝０．８３Ｘ＋４．７；相関係数：ｒ＝０．９１）。このように、両定量法の間に良好な相関関係があることから、本発明の定量法により、試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃが定量できることが判明した。
【０１３４】
（参考例２） 超遠心法によるＩＤＬ−Ｃの定量
実施例６の定量において使用した新鮮血清（４０試料）それぞれについて、超遠心分離操作により、比重が１．００６から１．０１９の画分（ＩＤＬ画分）を得た。得られたＩＤＬ画分中のコレステロール濃度をデタミナーＬ ＴＣ（総コレステロール定量用キット；協和メデックス社製）を用いて定量した。
実施例１２
標準液として、比重が１．００６から１．０１９の画分中のコレステロールが２３ｍｇ／ｄＬである血清を用いて検量線を作成する以外は、実施例６と同様の方法により、実施例１〜５の試薬を用いて測定を行い、参考例２の定量方法と実施例６〜１０の定量方法との間の相関関係を調べたところ、両定量法の間に第１表に示すような相関係数が得られた。また、参考例２の定量方法と実施例９の定量法との間には、図３に示すような相関図が得られた（相関式：Ｙ＝１．２０Ｘ＋５．６；相関係数：ｒ＝０．８３）。このように、両定量法の間に良好な相関関係があることから、本発明の定量法により、試料中のＩＤＬ−Ｃが定量され得ることが判明した。
【０１３５】
【表１】
【０１３６】
実施例１１および実施例１２の結果、本発明の定量法により、試料中のＶＬＤＬレムナント−Ｃおよび試料中のＩＤＬ−Ｃが定量できることが判明した。
【０１３７】
（参考例３） シクロデキストリンまたはその誘導体、アルブミンのＬＤＬに対する反応抑制効果
実施例１、実施例４、実施例５のキットおよび超遠心分離により調製したＬＤＬ分画を用いて、各キットにおけるＬＤＬに対する反応性を検討した。標準液の代わりにＬＤＬ分画を、第１試薬および第２試薬として、実施例１、実施例４、実施例５のキットを構成する第１試薬および第２試薬を用いる以外は実施例６に記載の方法と同様の方法より反応を行った。その結果を第２表に示す。
【０１３８】
【表２】
【０１３９】
第２表中、ＬＤＬ反応率とは、ＬＤＬ分画とデタミナーＬ ＴＣ（総コレステロール定量用キット；協和メデックス社製）との反応により定量したＬＤＬ分画中のコレステロール量に対する、ＬＤＬ分画と各キットとの反応により定量したコレステロール量の割合を表す。また、第２表中、吸光度とは、既知濃度のコレステロール標準液と各キットとの反応により得られた反応液の吸光度を表す。第２表から判るように、シクロデキストリンまたはその誘導体またはアルブミンを添加することにより、ＬＤＬ中のコレステロールに対する反応が抑制された。また、アルブミンを添加することにより吸光度が上昇したことから、感度も向上することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明によれば、動脈硬化性疾患の診断に有用なＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量方法、試薬およびキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】 超遠心分離により調製した比重１．０１９以下の分画をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより分析した際のクロマトグラムである。
【図２】 超遠心分離とゲルろ過とを組み合わせたＶＬＤＬレムナント−Ｃの定量法（参考例１の定量法）と実施例９の定量法との相関関係を表す図である。
【図３】 超遠心分離を用いたＩＤＬ−Ｃの定量法（参考例２の定量法）と実施例９の定量法との相関関係を表す図である。
Claims (24)
- 試料を含有する水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナント中のエステル型および遊離型コレステロール（以下総称して超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールという）に特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせの存在下、試料中の超低密度リポ蛋白レムナント中のコレステロールに、（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または（ｄ）酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とする試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールの定量方法。
- 超低密度リポ蛋白レムナントが、中間密度リポ蛋白である請求項１記載の方法。
- 該酵素反応が、さらにα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれるシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンの存在下に行われる請求項１または２記載の方法。
- ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 過酸化水素の定量が、ペルオキシダーゼの存在下生成した過酸化水素と色原体とを反応させて色素を生成させ、生成した色素を定量することによって行われる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 還元型補酵素の定量が、還元型補酵素定量用試薬を用いて行われる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用試薬。
- 該試薬がさらに過酸化水素定量用試薬を含有する請求項８記載の試薬。
- コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用試薬。
- 該試薬がさらに還元型補酵素定量用試薬を含有する請求項１０記載の試薬。
- 超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールが、中間密度リポ蛋白である請求項８〜１１のいずれかに記載の試薬。
- さらに、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれるシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを含有する請求項８〜１２のいずれかに記載の試薬。
- ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルである請求項８〜１３のいずれかに記載の試薬。
- ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
- ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有し、過酸化水素定量用試薬を第１試薬および第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
- コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬を含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
- コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第２試薬を含有し、かつ、過酸化水素定量用試薬を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
- ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有し、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素をレムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
- コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
- コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる（ａ）ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび（ｂ）ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第１試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第２試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有し、還元型補酵素定量用試薬を第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
- 超低密度リポ蛋白レムナントが中間密度リポ蛋白である請求項１５〜２１のいずれかに記載のキット。
- さらに、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれるシクロデキストリンまたはその誘導体および／またはアルブミンを第１試薬、第２試薬の少なくとも一方に含有する請求項１５〜２２のいずれかに記載のキット。
- ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである請求項１５〜２３のいずれかに記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005517575A JP4690200B2 (ja) | 2004-01-29 | 2005-01-28 | 超低密度リポ蛋白レムナント（ｖｌｄｌレムナント）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット |
Applications Claiming Priority (4)
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