TW200528717A - A method, reagent and kit for the quantitative analysis of the cholesterol in the very-low-density lipoprotein remnant(vldl remnant) - Google Patents

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200528717 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域] 本發明爲有關試料中之極低密度脂蛋白殘體（VLDL殘體） 中之膽固醇之定量方法、試藥及套組。 【先前技術】 血液中含有種種脂蛋白。這些脂蛋白依比重之不同而分 類成乳糜微粒（以下簡稱CM)、極低密度脂蛋白（以下簡稱 VLDL)、低密度脂蛋白（以下簡稱LDL)、高密度脂蛋白（以 下簡稱HDL)。各脂蛋白其膽固醇、三酸甘油酯、磷脂質、 蛋白質等之構成成分之比例不同，活體內有不同作用。 除這些脂蛋白以外，有脂蛋白由脂蛋白脂肪酶來代謝·分 解之過程生成之殘體脂蛋白。殘體脂蛋白分類爲乳糜微粒 殘體（以下簡稱CM殘體）及極低密度脂蛋白殘體（以下簡稱 VLDL殘體）。中間密度脂蛋白（以下簡稱IDL)爲包含在 VLDL殘體之比重1·〇06〜ι·019之脂蛋白，稱爲狹義之VLDL 殘體。 殘體脂蛋白爲有豊富之三酸甘油酯（TG)之脂蛋白，係 ApoE及膽固醇比較豊富之脂蛋白。CM殘體以ApoB-48及 ApoE爲主要Apo蛋白，VLDL殘體以ApoB-100及ApoE爲 主要Apo蛋白。 殘體脂蛋白在健常人迅速代謝，迅速被收入肝臓之受體，但 因代謝異常或過食·運動不足等日常之不良生活習慣，而使 停滯在血液中之殘體脂蛋白増加，由於此停滯血液中之殘體 脂蛋白，引起III型高脂血症等，動脈硬化以高比例發症。動 200528717 脈硬化之發症時，血液中停滯之殘體脂蛋白容易吸入動脈壁 之巨噬細胞，形成動脈硬化之初期病變。如此，殘體脂蛋白被 認爲動脈硬化性疾病之危險因子之一。 因CM殘體乃以ΑροΒ-48爲主要Apo蛋白，故仲介肝臓之 LDL 受容體關連蛋白（LDL Receptor-related Protein:LRP)而 吸入，因VLDL殘體乃以ΑροΒ-100爲主要Apo蛋白，故仲介 肝臓之LDL受容體而吸入。最近，作爲新殘體脂蛋白之巨噬 細胞泡沬化經路之一，有VLDL受容體經路之報告。也即從 單球至巨噬細胞之分化過程中，VLDL受容體之表現増大，殘 體脂蛋白仲介VLDL受容體而引起巨噬細胞之泡沬化之報 告。 殘體脂蛋白或殘體脂蛋白中之膽固醇之定量法在以往有 電泳法，超離心法，液體層析（HPLC)法，免疫吸著法等之報告 。電泳法有例如聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE)法及洋菜糖凝 膠電泳法等之報告。聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE)法爲殘體 脂蛋白之定性分析所使用之方法，係將VLDL與LDL之間所 認定之異常帶之中間帶（Mid-band)之檢出方法。洋菜糖凝 膠電泳法也殘體脂蛋白之定性分析所使用之方法，尤其對 III型高脂血症之診斷有效使用。ΙΠ型高脂血症中，確認向 冷位移動之冷-VLDL。 超離心法有將比重在1.006〜1.019之間之脂蛋白之中間 密度脂蛋白（以下簡稱IDL)以超離心分離來分離，所得之 IDL中之膽固醇（以下簡稱IDL-C)予以定量之方法。然而此 超離心法操作非常煩雜。 200528717 HPLC法有將血清中之CM及VLDL以HPLC分離，而將 所分離之CM中之膽固醇量及分離之VLDL中之膽固醇量 分析而成之血清試料中之殘體樣脂蛋白（以下簡稱RLP)之 分析方法（特開平8- 1 05 876號公報），及將人血清試料中之 RLP以外之脂蛋白以將不認識Ap〇B-48之抗人脫輔基A-I 單株抗體及不認識AP〇B-48之抗人ApoB-100單株抗體在 非多孔性不溶性支持體固定化之脂蛋白分離用充塡劑充塡 而成之脂蛋白分離用抗體柱分離，將不分離之脂蛋白當作 RLP，將該RLP中之膽固醇量分析而成之血清試料中之RLP 之分析方法（特開平8- 1 05 875號公報）。前者之方法爲基於 CM膽固醇及VLDL膽固醇之總和與依免疫吸著法測定之 RLP中之膽固醇有高相關關係之方法。在這些公開專利公 報，所謂RLP之用語乃以CM及VLDL等由脂蛋白脂肪酶分 解之異常脂蛋白之意義使用。 最近開發依免疫吸著法之RLP中之膽固醇之定量法。在 此所謂RLP乃指富於三酸甘油酯之脂蛋白。本定量法中，由 使用含有抗脫輔基A-Ι單株抗體及不認識Ap oB-48之專一 抗ΑροΒ-1 00單株抗體之親和性凝膠之免疫親和性層析來從 血清分離RLP，定量含在此分離之RLP之膽固醇。本定量法 所適用之RLP中之膽固醇定量用試藥由日本抗體硏究所販 賣[製品名：RLP-膽固醇「JIMRO」II](「Clinical Chemistry 」，美國臨床化學會，2002年，第48卷，p.217-219)。 RLP中之膽固醇之定量法有在聚氧伸烷基衍生物及聚氧 乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物之共存下，試料與膽固醇 200528717 酯酶及膽固醇氧化酶或將膽固醇脫氫酶及磷脂質予以水解 之酶作用，而將生成之過氧化氫或還原性輔酶定量爲特徴之 方法之報告（特開200 1 -23 1 597號公報）。用本公開專利公報 之實施例1之定量用試藥所得之試料中之膽固醇定量値，與 用日本抗體硏究所公司製造之定量用試藥RLP-膽固醇「 JIMRO」II所得之試料之RLP中之膽固醇定量値之間有良 好之相關關係。然而也有RLP-膽固醇「JIMRO」II不分類 爲試料中之殘體脂蛋白，而也與VLDL中之膽固醇反應之報 告。 近年有將超離心法與凝膠過濾法組合之殘體脂蛋白之分 析之報告（「動脈硬化」，日本動脈硬化學會，200 1年，第29 卷，P. 2 3 5 (演題編號：98))。 【發明內容】 本發明之目的爲提供將動脈硬化性疾病之危險因子之一 之VLDL殘體中之膽固醇（以下稱VLDL殘體膽固醇，簡稱 VLDL殘體-C)簡便且迅速定量之方法、試藥及套組。 本發明爲有關以下（1)〜（23)。 (1)在含有試料之水性媒體中，有使膽固醇酯水解酶及膽固 醇氧化酶或膽固醇脫氫酶對極低密度脂蛋白殘體中之酯型 及游離型膽固醇（以下總稱極低密度脂蛋白殘體膽固醇）專 一地作用之選自（a)聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚及（b)聚 氧乙烯聚氧丁烯縮合物，聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸 烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑之組合之存在下，將試料 中之極低密度脂蛋白殘體中之膽固醇在（c)膽固醇酯水解酶 200528717 及膽固醇氧化酶或（d)氧化型輔酶之存在下，與膽固醇酯水解 ' 酶及膽固醇脫氫酶作用，而生成過氧化氫或還原型輔酶，將所 生成之過氧化氫或還原型輔酶定量爲特徴之試料中之極低 密度脂蛋白殘體膽固醇之定量方法。 (2) 極低密度脂蛋白殘體爲中間密度脂蛋白之（1)記載之方 法。 (3) 該酶反應更在環糊精或其衍生物及/或蛋白素之存在下 施行之（1)或（2)記載之方法。 • (4)環糊精或其衍生物爲選自α -環糊精、β-環糊精、γ- 環糊精、一'甲基-α-環糊精、二甲基-β-環糊精、二甲基-γ-' 環糊精、二甲基-α-環糊精、二甲基-β_環糊精、三甲基-γ- 環糊精、羥乙基-α-環糊精、羥乙基-β_環糊精、羥乙基-γ-_ 環糊精、趨丙基-^-環糊精、經丙基-β-環糊精、經丙基-γ- 環糊精、羧甲基-α-環糊精、羧甲基-β_環糊精、羧甲基-γ-環糊精、糖基-α-環糊精、糖基-β-環糊精、糖基-γ-環糊精 、麥芽糖基- α-環糊精、麥芽糖基-β-環糊精、麥芽糖基-γ-φ 環糊精、α -環糊精硫酸酯、β-環糊精硫酸酯、γ -環糊精硫 酸酯、β -環糊精聚合物之化合物之（3)記載之方法。 (5) 聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚爲聚氧乙烯聚氧丙烯 烷基苯基醚之（1)〜（4)之任一記載之方法。 (6) 過氧化氫之定量乃將過氧化酶之存在下生成之過氧化 氫與色原體反應來生成色素，而將生成之色素定量來行之 (1)〜（5)之任一記載之方法。 (7) 還原型輔酶之定量乃測定反應液之吸光度來施行之 -10- 200528717 (1)〜（5)之任一記載之方法。 (8) 含有使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶對極低密度脂 蛋白殘體膽固醇專一地作用之選自（a)聚氧乙烯聚氧伸烷基 烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯乙 烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑之 組合、膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶之試料中之極低密 度脂蛋白殘體膽固醇定量用試藥。 (9) 該試藥更含有過氧化氫定量用試藥之（8)記載之試藥。 (1 〇)含有使膽固醇酯水解酶及膽固醇脫氫酶對極低密度 脂蛋白殘體膽固醇專一地作用之選自（a)聚氧乙烯聚氧伸烷 基烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯 乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑 之組合、膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶及氧化型輔酶之 極低密度脂蛋白殘體膽固醇定量用試藥。 (11)該試藥更含有還原型輔酶定量用試藥之（10)記載之試 藥° (1 2)極低密度脂蛋白殘體膽固醇爲中間密度脂蛋白之 (8)〜（11)之任一記載之試藥。 (13) 更含有環糊精或其衍生物及/或蛋白素之（8)〜（12)之 任一記載之試藥。 (14) 環糊精或其衍生物爲選自α -環糊精、β-環糊精、7-環糊精、二甲基-α-環糊精、二甲基環糊精、二甲基-γ-環糊精、三甲基-α-環糊精、三甲基-β·環糊精、三甲基-γ-環糊精、羥乙基-α-環糊精、羥乙基-β-環糊精、羥乙基个 -11 - 200528717 環糊精、羥丙基-α-環糊精、羥丙基-β-環糊精、羥丙基_γ_ 糊精、殘甲基- 糊精、竣曱基-β-環糊精、竣甲基 環糊精、糖基-α-環糊精、糖基-β-環糊精、糖基-γ-環糊精 、麥芽糖基-α-環糊精、麥芽糖基-β_環糊精、麥芽糖基个 環糊精、α -環糊精硫酸酯、β-環糊精硫酸酯、γ -環糊精硫 酸酯、β-環糊精聚合物之化合物之（13)記載之試藥。 (15)聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚爲聚氧乙烯聚氧丙燦 院基苯基醚之（8)〜（14)之任一^記載之試藥。 • (16)含有將聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚組合而使膽固 ~ 醇酯水解酶及膽固醇氧化酶對極低密度脂蛋白殘體膽固醇 • 專一地作用之選自聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯 乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑 ’ 之第1試藥，及含有膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶之第2 試藥，且與選自該聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯乙 烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑組 合使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶對極低密度脂蛋白殘 • 體膽固醇專一地作用之聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚在 第1試藥及第2試藥之至少一方含有，而將過氧化氫定量用 試藥在第1試藥及第2試藥之至少一方含有之試料中之極 低密度脂蛋白殘體膽固醇定量用套組。 (1 7)含有使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶對極低密度脂 蛋白殘體膽固醇專一地作用之選自（a)聚氧乙烯聚氧伸烷基 烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯乙 烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑之 -12- 200528717 組合之第1試藥，及含有膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶之 ^ 第2試藥，且將過氧化氫定量用試藥在第1試藥、第2試藥 之至少一方含有之試料中之極低密度脂蛋白殘體膽固醇定 量用套組。 (18)含有與聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚組合而使膽固 醇酯水解酶及膽固醇脫氫酶對極低密度脂蛋白殘體膽固醇 專一地作用之選自聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯 乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑 B 之第1試藥，及含有膽固醇酯水解酶及膽固醇脫氫酶之第2 " 試藥，且將氧化型輔酶在第1試藥、第2試藥之至少一方含 • 有，與選自該聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯乙烯化 ' 苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑組合使 膽固醇酯水解酶及膽固醇脫氫酶對殘體膽固醇專一地作用 之聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚在第1試藥、第2試藥 之至少一方含有之試料中之極低密度脂蛋白殘體膽固醇定 量用套組。 # (19)含有使膽固醇酯水解酶及膽固醇脫氫酶對極低密度脂 蛋白殘體膽固醇專一地作用之選自（a)聚氧乙烯聚氧伸烷基 烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物，聚氧乙烯苯乙烯 化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑之組 合之第1試藥，及含有膽固醇酯水解酶及膽固醇脫氫酶之第 2試藥，且將氧化型輔酶在第1試藥、第2試藥之至少一方 含有之試料中之極低密度脂蛋白殘體膽固醇定量用套組。 (2 0)極低密度脂蛋白殘體爲中間密度脂蛋白之（16)〜（1 9)之 -13 - 200528717 任一記載之套組。 • (2υ在第1試藥、第2試藥之至少一方更含有環糊精或其 衍生物及/或蛋白素之（16)〜（20)之任一記載之套組。 (22) 環糊精或其衍生物爲選自環糊精、β_環糊精、γ_環 糊精、一甲基-α-環糊精、二甲基-β-環糊精、二甲基-γ -環 糊精、三甲基-α-環糊精、三甲基-β-環糊精、三甲基-γ_環 糊精、羥乙基-α-環糊精、羥乙基-β_環糊精、羥乙基-γ-環 糊精、羥丙基-α -環糊精、羥丙基-β-環糊精、羥丙基-γ-環 Ρ 糊精、羧甲基-α-環糊精、羧甲基-β_環糊精、羧甲基-γ-環 ' 糊精、糖基-α-環糊精、糖基-β-環糊精、糖基-γ-環糊精、 麥芽糖基-α-環糊精、麥芽糖基-β-環糊精、麥芽糖基-γ-環 " 糊精、^ -環糊精硫酸酯、β-環糊精硫酸酯、γ -環糊精硫酸 _ 酯、13 -環糊精聚合物之化合物之（21)記載之套組。 (23) 聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚爲聚氧乙烯烷基苯基 醚之（16)〜（22)之任一記載之套組。 次詳細説明本發明方法。

• 本發明之特徴乃作爲使膽固醇定量反應所用之酶對VLDL 殘體-C專一地作用之界面活性劑，用選自（a)聚氧乙烯聚氧 伸烷基烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙 烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活 性劑之組合可奏優異效果。即這些2種界面活性劑乃組合 使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶對 VLDL殘體-C專一地作用。 更在這些酶反應，水性媒體中有環糊精及其衍生物及/或蛋 -14- 200528717 白素存在，則抑制前述酶作用於VLDL殘體-C以外之脂蛋白 ' 中之膽固醇，尤其LDL中之膽固醇爲特徴。 依本發明方法，試料中之VLDL殘體-C乃在水性媒體中，使 膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶對試料中 之VLDL殘體-C專一地作用之選自（a)聚氧乙烯聚氧伸烷基 烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯乙 烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑之 組合之存在下，將試料中之RLP中之酯型膽固醇與膽固醇酯 II 水解酶之作用而變換成游離型膽固醇，由該游離型膽固醇及 ' VLDL殘體中之游離型膽固醇藉（c)膽固醇氧化酶之作用而 〜 生成過氧化氫或（d)氧化型輔酶之存在下膽固醇脫氫酶之作 " 用而生成還原型輔酶，將生成之過氧化氫或還原型輔酶予以 _ 定量來定量。 在此方法，因將酶反應在環糊精及其衍生物及/或蛋白素 之存在下施行來抑制酶作用於VLDL殘體以外之脂蛋白之 膽固醇，故較適宜。 • 以本發明之定量方法可將全血、血漿、血清等，宜血漿、 血清等之試料中之VLDL殘體膽固醇定量。 酶反應乃在使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇 脫氫酶對試料中之VLDL殘體-C專一地作用之選自（a)聚氧 乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物 、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一 種界面活性劑之至少2種類之界面活性劑之組合，膽固醇之 定量所必要之膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫 -15- 200528717 ' 氫酶（若使用膽固醇脫氫酶時，氧化型輔酶爲必須），及必要時 * 在含有環糊精及/或蛋白素之緩衝液等之水溶液中施行。依 反應生成之過氧化氫或還原型輔酶之定量可依其本身公知 之方法施行。 該水溶液必要時在對VLDL殘體-C之定量反應之特異性 無影響之範圍可使用爲使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶或膽 固醇脫氫酶活性化而常使用之酶活性化劑、安定化劑、防 腐劑、干渉物抑制劑，將活體試料中之球蛋白等之蛋白質可 | 溶化之種種鹽類。 ' 膽固醇酯水解反應，游離膽固醇之氧化或脫氫反應也可在 - 該2種類之界面活性劑之存在下順次施行。又也可將試料 ' 及界面活性劑在水性液中接觸，次添加酶來反應，通常將必要 • 成分全部或依必要而分爲2〜3組添加在水性媒體來反應。 更方便計，使用後述之VLDL殘體-C之定量用套組。 水性媒體中，膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫 氫酶通常以 0.001〜400U/mL，宜 0 · 0 1〜2 00U/mL，尤宜 _ 〇·〇5〜100U/mL之濃度使用。 水性媒體中，該 2種類之界面活性劑之濃度各宜 0.001 〜5(w/v)%，尤宜 0·005 〜2.5(w/v)%，特宜爲 0.05 〜l(w/v)% 〇 水性媒體中，環糊精或其衍生物之濃度宜0.001〜5 (W/V)%， 尤宜 0.005 〜2.5(w/v)%，特宜爲 0.01 〜l(w/v)%。 水性媒體中，蛋白素之濃度宜 0.001〜5(w/v)%，尤宜 0.005〜2.5(\¥/¥)%，特宜爲0.01〜1(〜~)%。 -16 - 200528717 » 酶反應通常爲10〜5 0°c，宜20〜40 °c之溫度施行，通常在 * 2〜30分完了。 生成之過氧化氫可例如過氧化酶之存在下與過氧化氫來 氧化而變換成色素之色原體之反應來生成色素，將生成之色 素以吸收極大波長測定反應液之吸光度之變化來定量。又 化學發光物質，例如魯米諾、異魯米諾、光澤精、吖錠酯等 與過氧化氫反應而生成光子，而將生成之光子定量來定量過 氧化氫。 • 還原型輔酶可將由酶反應生成之還原型輔酶含有液之吸 光度以3 00〜500nm，宜330〜400nm，尤宜340nm附近測定來 ' 定量。又可將還原型輔酶與色原體反應而生成色素，將所生 成之色素定量來定量。例如還原型輔酶與硫辛醯胺脫氫酶 ' 、電子載體例如1-甲氧基-5-甲基啡畊甲基硫酸鹽及色原體 反應而生成色素，以色素之吸收極大波長測定反應液之吸光 度來定量。色原體可用還原而變換成色素之色原體。 試料中之VLDL殘體-C濃度可用含有預先既知濃度之 ® VLDL殘體-C之試料，作成呈示膽固醇濃度與過氧化氫或還 原型輔酶之量之關係之檢量線，從此檢量線求出。 膽固醇酯水解酶可用能將膽固醇酯水解之酶，例如膽固醇 酯酶、脂蛋白脂肪酶等，可用動物、植物或微生物由來或依 基因工程手法製造之酶、化學修飾之酶等。化學修飾之酶 可爲例如以聚乙二醇或聚丙二醇爲主成分之基、具有聚丙 二醇及聚乙二醇之共聚物之基、含有水溶性多糖類之基、 磺酸丙基、磺酸丁基、聚胺甲酸酯基、有螯合機能之基等 -17- 200528717 之化學修飾基修飾之酶。尤宜以聚乙二醇爲主成分之基修 飾之酶。水溶性多糖類可爲例如聚葡萄糖、三聚葡糖、可 溶性澱粉等。 用以化學修之試藥（化學修飾劑）包括兼具能將上述化學 修飾基與酶之胺基、羧基、氫硫基等反應之官能基或構造 之化合物等。能與酶中之胺基反應之官能基或構造包括例 如羧基、活性酯基（N-羥基丁二醯亞胺基等）、酸酐、醯氯 、醛、環氧化物基、1，3-丙磺內酯、1，4-丁磺內酯等。能與 • 酶中之羧基反應之官能基或構造包括例如胺基。具有與酶 ' 中之氫硫基反應性之基或構造包括例如馬來醯亞胺基、二 〜 硫化物、α -鹵酯（α ·碘酯等）等。 * 化學修飾劑之例包括具有以聚乙二醇爲主成分之基及Ν- ' 羥基丁 二醯亞胺基之 SunbrightVFM-4101 、

SunbrightMEAC-50HS、SunbrightMEC-50HS(皆爲曰本油脂 公司製造）、具有以聚伸烷二醇爲主成分之基及酸酐構造之 SunbrightAKM 系歹[J (例如 SunbrightAKM-1 5 1 0 等）、 # SunbrightADM系列、SunbrightACM系列（皆爲日本油脂公 司製造）、具有以聚乙二醇爲主成分之基及環氧化物基之 EPOX-3400、M-EPOX-5000(皆爲 Sheawater Polymers 公司 製造）、具有螯合機能之基及酸酐構造之二乙三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酐（DTPA anhydride;同仁化學公司製造） 、聚胺甲酸酯修飾用之活性化聚胺甲酸酯P4〇〇〇(百靈佳公 司製造）、聚葡萄糖修飾用之聚葡萄糖T4 0、活性化TCT(百 靈佳公司製造）等。 -18- 200528717 酶之化學修飾可依例如以下之方法施行。 首先將膽固醇酯水解酶溶解在pH 8.0以上之緩衝液，例如 HEPES緩衝液、在〇〜55°C添加0.01〜5 00倍莫耳量之化學 修飾劑，攪拌5分〜5小時。在實際之酶反應，作爲化學修飾 之膽固醇酯水解酶，不僅此反應液本身，也可使用必要時由超 濾膜等來除去未反應之化學修飾劑等者。 膽固醇氧化酶可用動物、植物或微生物由來之酶、依基 因工程手法製造之酶、化學修飾之酶等。 化學修飾酶可依前述化學修飾方法製備。 膽固醇脫氫酶只要爲具有在氧化型輔酶之存在下將膽固 醇氧化而生成還原型輔酶之能力之酶，則可用動物、植物或 微生物由來之酶、以基因工程手法製造之酶、化學修飾之 酶。化學修飾之酶可用例如前述化學修飾劑，以前述化學修 飾方法製備。 使用本發明之膽固醇脫氫酶之定量法所使用之氧化型輔 酶之例可爲NAD、NADP、硫-NAD、硫-NADP。 本發明所使用之聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚與選自 本發明所使用之聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯乙 烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑組 合，具有使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶 對VLDL殘體-C專一地作用之機能，單獨使用時，未必具有 使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶對 VLDL殘體-C專一地作用之機能之必要。以下將本發明所 使用之聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚稱爲「界面活性劑 -19- 200528717 本發明所使用之選自聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙 烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活 性劑可與本發明所使用之聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚 組合，使膽固醇酯界κ蠏鱅极膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶對 VLDL殘體-C專一地作用之機能，單獨使用時，未必具有使膽 固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶對VLDL殘 體-C專一地作用之機能之必要。以下將本發明所使用之選 自聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚及 聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑稱爲「界面活性 劑2」。 聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚之例包括聚氧乙烯烷基 苯基醚、聚氧丙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基苯 基醚，宜聚氧乙烯聚氧丙烯烷基.苯基醚。 聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚中烷基包括直鏈或分岐 狀之碳數6〜15之例如己基、異己基、庚基、異庚基、辛基 、異辛基、壬基、異壬基、癸基、異癸基、十一基、異十 一基、十二基、異十二基、十三基、異十三基、十四基、 異十四基、十五基、異十五基。聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基 芳基醚之具體例包括EmulgenL-40(聚氧乙儲聚氧丙儲院基 苯基醚）、Emulgen911(聚氧乙烯烷基苯基醚）、 Emulgen8 10(聚氧乙烯烷基苯基醚）（以上由花王公司製造）、 1^〇11丨〇11113-210(聚氧乙烯烷基苯基醚）、1^〇11丨〇11113-2 15(聚氧 乙烯烷基苯基醚）、NonionNS-208.5(聚氧乙烯烷基苯基醚） -20- 200528717 、NonionHS-208(聚氧乙烯烷基苯基醚）（以上由日本油脂公 司製造），尤宜EmulgenL-40。 聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物包括聚氧乙烯與聚氧丁烯之無 規聚合物、嵌段聚合物，例如下式（I)化合物[以下稱化合物 ⑴]等 RO-(C2H4〇)a-(C4H8〇)b.(C2H4〇)c-H (I) (式中，A、B及C相同或相異爲^200之整數，R爲氫原子 、直鏈或分岐之烷基）。化合物（I)中烷基爲碳數1〜30之例 如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基 、第三丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、庚 基、異庚基、辛基、異辛基、壬基、異壬基、癸基、異癸 基、十一基、異十一基、十二基、異十二基、十三基、異 十三基、十四基、異十四基、十五基、異十五基、十六基 、異十六基、十七基、異十七基、十八基、異十八基、十 九基、異十九基、二十基、二十一基、二十二基、二十三 基、二十四基、二十五基、二十六基、二十七基、二十八 基、二十九基、三十基等。 化合物⑴之具體例包括PrononB-204、PrononB-208 (以上 爲日本油脂公司製造）。聚氧丁烯部分之分子量宜700以上 ，尤宜1，00以上，尤其1，500以上。 聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚之例包括BLAUNON DSP-9、 BLAUNON DSP-12.5、BLAUNON DSP-20、BLAUNON DSP-10、BLAUNON TSP-5、BLAUNON TSP-7.5、BLAUNON TSP-16、BLAUNON TSP-20、BLAUNON TSP-50(以上爲青 -21 · 200528717 木油脂公司製造）等，有市售。 聚氧伸烷基長鏈分岐烷基醚之例爲Unilo〇bMT-0620B(日 本油脂公司製造），有市售。 環糊精或其衍生物之例可爲環糊精、二甲基環糊精、三 甲基環糊精、羥乙基環糊精、羥丙基環糊精、羧甲基環糊 精、糖基環糊精、麥芽糖基環糊精、環糊精硫酸酯、環糊 精聚合物，尤宜羥乙基環糊精及羥丙基環糊精。環糊精之例 爲α -環糊精、β-環糊精、γ-環糊精。 二甲基環糊精之例爲二甲基-α-環糊精、二甲基環糊精 、二甲基-γ-環糊精。 三甲基環糊精之例爲三甲基-α-環糊精、三甲基-β_環糊精 、三甲基-γ-環糊精。 羥乙基環糊精之例爲羥乙基-(X-環糊精、羥乙基-β-環糊精 、羥乙基-γ-環糊精。 羥丙基環糊精之例爲羥丙基-α -環糊精、羥丙基-(3_環糊 精、羥丙基-γ-環糊精。 羧甲基環糊精之例爲羧甲基-CX-環糊精、羧甲基-ρ_環糊精 、羧甲基-γ-環糊精。 糖基環糊精之例爲糖基-CX-環糊精、糖基-β-環糊精、糖 基-γ_環糊精。 麥芽糖基環糊精之例爲麥芽糖基-α-環糊精、麥芽糖基_ β-環糊精、麥芽糖基-γ-環糊精。 環糊精硫酸酯之例爲環糊精硫酸酯、β-環糊精硫酸酯 、7 -環糊精硫酸酯。 -22- 200528717 環糊精聚合物之例爲/3 -環糊精聚合物。也可將2種類以 上之環糊精或其衍生物組合使用。 蛋白素之例包括牛、馬、綿羊、人由來之蛋白素，尤宜牛 血清蛋白素（BSA)。也可用以基因工程手法製造之蛋白素。 也可將2種類以上蛋白素組合使用。 水性媒體包括例如脫離子水、蒸餾水、緩衝液等，宜緩衝 液。用於緩衝液之緩衝劑之例可爲參（羥甲基）胺基甲烷緩 衝劑、磷酸緩衝劑、硼酸緩衝劑、古德之緩衝劑等。古德 之緩衝劑包括例如2-嗎啉基乙磺酸（MES)、雙（2-羥乙基）亞 胺基參（羥甲基）甲烷（Bis-Tris)、N-(2-乙醯胺基）亞胺基二 乙酸（ADA)、哌畊-N，N，-雙（2-乙磺酸）（PIPES)、N-(2-乙醯 胺基）-2-胺基乙磺酸（ACES)、3-嗎啉基-2-羥基丙磺酸 (MOPSO)、N，N-雙（2-羥乙基）-2-胺基乙磺酸（BES)、3-嗎啉 基丙磺酸（MOPS)、N-〔參（羥甲基）甲基〕-2-胺基乙磺酸 (TES)、2-〔 4-(2-羥乙基）-1-哌阱基〕乙磺酸（HEPES)、3-〔N，N-雙（2-羥乙基）胺基〕-2-羥基丙磺酸（DIPSO)、N-〔參 (羥甲基）曱基〕-2-羥基·3-胺基丙磺酸（TAP SO)、哌畊-Ν,Ν’-雙（2-羥基丙磺酸）（P〇PSO)、3-〔 4-(2-羥乙基）-1-哌阱 基〕-2-羥基丙磺酸（HEPPSO)、3-〔 4-(2-羥乙基）-1-哌阱基 〕丙磺酸〔（H)EPPS〕 、N-〔參（羥甲基）甲基〕甘胺酸 (Tricine)、N，N-雙（2-羥乙基）甘胺酸（Bicine)、N-參（羥甲基 )甲基-3-胺基丙磺酸（TAPS)、N-環己基-2-胺基乙磺酸 (CHES)、N-環己基-3-胺基-2-羥基丙磺酸（CAPSO)、N-環己 基-3-胺基丙磺酸（CAPS)。 -23- 200528717 緩衝液通常爲pH4〜10,宜5〜9,通常以0.001〜〇.5mol/L，宜 ' 0.005 〜0.2mol/L，尤宜 0.01 〜0. lmol/L 之濃度使用。 過氧化氫定量所用之色原體可用能由氧化而變換成色素 之色原體，其例包括無色型色原體、氧化偶合型色原體。無 色型色原體爲在過氧化氫及過氧化酶等過氧化活性物質之 存在下，單獨變換爲色素之物質。無色型色原體之例可爲 1〇_1羧甲基胺甲醯基-3,7-雙（二甲胺基）-1〇11-啡噻阱 (CCAP)、10-(N-甲基胺甲醯基）-3,7-雙（二甲胺基）-1〇Η-啡噻 | 畊（MCDP)、N-(羧甲胺羰基）-4,4’-雙（二甲胺基）二苯胺鈉鹽 (DA-64)、4,4’-雙（二甲胺基）二苯胺、雙〔3-雙（4-氯苯基） 甲基-4-二甲胺基苯基〕胺（BCMA)。 氧化偶合型色原體爲能在過氧化氫及過氧化酶等過氧化 ' 活性物質之存在下，2化合物因氧化偶合而變換成色素之色 原體。2化合物之組合之例包括偶合劑與苯胺類之組合、 偶合劑與酚類之組合。偶合劑之例有4_胺基安替比林（心 AA)、3-甲基-2-苯并噻唑酮胼。苯胺類之例有N-(3_磺酸丙 • 基）苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺酸丙基）-3-曱基苯胺 (TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺酸丙基）-3,5-二甲基苯胺 (MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺酸丙基）-3,5-二甲氧基苯 胺（DAOS)、N-乙基-N-(3-磺酸丙基）-3-甲基苯胺（TOPS)、 Ν·(2-羥基·3-磺酸丙基）-3,5-二甲氧基苯胺（HDAOS)、N，N-二甲基-3 -甲基苯胺、N，N-二（3-磺酸丙基）-3,5-二甲氧基苯 胺、N-乙基-N-(3-磺酸丙基）-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺酸丙基）苯胺、N-乙基-N-(3-磺酸丙基）-3,5-二甲氧基苯胺 -24- 200528717 、N-(3-磺酸丙基）_3,5-二甲氧基苯胺' N-乙基-N-(3-磺酸丙 基）-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺酸丙基）-3-甲 氧基苯胺、N -乙基-N-(2 -經基-3-擴酸丙基）苯胺、N -乙基-N-(3-甲基苯基）-Ν’-丁二醯基乙二胺（EMSE)、N-乙基-Ν·(3· 甲基苯基）-Ν’-乙醯基乙二胺、Ν-乙基-Ν-(2-羥基-3-磺酸丙 基）-4•氟-3,5-二甲氧基苯胺（F-DAOS)。酚類之例有酚、4-氯酚、3-甲基酚、3-羥基-2,4,6-三碘苯甲酸（ΗΤΙΒ)。 過氧化酶以 1〜l〇〇kU/L 之濃度使用。色原體以 0.01 〜10g/L 使用。 還原型輔酶之定量所用色原體之例包括3-(4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2H-四銼溴化物（MTT)、2-(4-碘苯基）-3-(4-硝苯基）-5-(2,4-二磺酸苯基）-2H-四銼單鈉鹽（WST-1) 、2-(4-碗苯基）-3-(2，4 - 一·硝苯基）-5-(2，4 - 一《擴酸本基）-2H-四銼單鈉鹽（WST-3)。 酶活性化劑之例包括膽酸類、烷磺酸鹽等陰離子性界面 活性劑。膽酸類之例包括膽酸、去氧膽酸、牛磺膽酸、鵝 去氧膽酸。烷基磺酸鹽之例包括1-戊磺酸鹽、1-己磺酸鹽 、1 -庚磺酸鹽、卜辛磺酸鹽。烷基磺酸鹽中鹽之例包括銨 鹽、鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽。 安定化劑之例包括乙二胺四乙酸（EDTA)、蔗糖、氯化鈣 〇 防腐劑之例包括疊氮化鈉、抗生物質。 干渉抑制劑之例包括抑制抗壞血酸之影響之抗壞血酸氧 化酶、抑制膽紅素之影響之亞鐵氰化鉀。 -25- 200528717 鹽類之例包括氯化鋰、硫酸鋰、氯化鈉、硫酸鈉、氯化 鉀、硫酸鉀、氯化鎂、硫酸鎂、乙酸鎂、氯化銨、硫酸鎂 、硝酸鎂、硝酸鈣等鹽類。 本發明之VLDL殘體-C之定量方法可例示如下具體態樣 定量方法1 (1) 在水性媒體中，有檢體、膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶 、界面活性劑1及界面活性劑2之存在下，進行酶反應， (2) 測定所生成之過氧化氫， (3) 由（2)測定之値，及預先作成之檢量線決定，檢體中之 VLDL殘體-C濃度之方法。 定量方法2 (1 )在水性媒體中，有檢體、膽固醇酯水解酶、氧化型輔 酶、膽固醇脫氫酶、界面活性劑1及界面活性劑2之 存在下，進行酶反應， (2 )測定所生成之還原型輔酶， (3 )由（2)測定之値，及預先作成之檢量線，決定檢體中t VLDL殘體_c濃度。 定量方法3 (1 )在水性媒體中，有檢體、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧 化酶、界面活性劑1及界面活性劑2、及環糊精衍生 物及/或蛋白素之存在下，進行酶反應， (2 )測定所生成之過氧化氫， (3)由（2)測定之値，及預先作成之檢量線，決:®檢體ψ 2 -26- 200528717 VLDL殘體-C濃度。 定量方法4 (1 )在水性媒體中，有檢體、膽固醇酯水解酶、氧化型輔 酶、膽固醇脫氫酶、界面活性劑1及界面活性劑2、 及環糊精衍生物及/或蛋白素之存在下，進行酶反應， (2 )測定所生成之還原型輔酶， (3 )由（2)測定之値，及預先作成之檢量線，決定檢體中之 VLDL殘體-C濃度。 定量方法5 (1 )在水性媒體中，將檢體及界面活性劑2預先混合後， (2)在（1)之混合物、界面活性劑1、膽固醇酯水解酶及 膽固醇氧化酶之存在下，進行酶反應， (3 )測定所生成之過氧化氫， (4)由（3)測定之値，及預先作成之檢量線，決定檢體中之 VLDL殘體-C濃度。 定量方法 6 (1 )在水性媒體中，將檢體及界面活性劑2預先混合後， (2) (2)在（1)之混合物、界面活性劑1、膽固醇酯水解酶 、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶之存在下，進行酶反應， (3 )測定所生成之還原型輔酶， (4 )由（3)測定之値及預先作成之檢量線，決定檢體中之 VLDL殘體-C濃度。 定量方法7 (1 )在水性媒體中，將檢體與界面活性劑2、及環糊精衍 -27- 200528717 生物及/或蛋白素預先混合後， * ( 2 )在（1)之混合物、界面活性劑1、膽固醇酯水解酶及 膽固醇氧化酶之存在下，進行酶反應， (3 )測定所生成之過氧化氫， (4)由（3)測定之値，及預先作成之檢量線，決定檢體中之 VLDL殘體-C濃度。 定量方法8 (1 )在水性媒體中，將檢體與界面活性劑2、及環糊精衍 φ 生物及/或蛋白素預先混合後， ' (2)在（1)之混合物、界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、 氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶之存在下，進行酶反應， (3 )測定所生成之還原型輔酶， (4 )由（3)測定之値，及預先作成之檢量線，決定檢體中之 VLDL殘體-C濃度。 定量方法9 (Ο在水性媒體中，將檢體與界面活性劑1及界面活性劑 # 2預先混合後， (2 )在（1 )之混合物、膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶之 存在下，進行酶反應， (3 )測定所生成之過氧化氫， (4 )由（3)測定之値，及預先作成之檢量線，決定檢體中之 VLDL殘體-C濃度。 定量方法 10 (1)在水性媒體中，將檢體與界面活性劑1及界面活性劑 -28 - 200528717 2預先混合後， (2 )在（1 )之混合物、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽 固醇脫氫酶之存在下，進行酶反應， (3 )測定所生成之還原型輔酶， (4)由（3)測定之値，及預先作成之檢量線，決定檢體中之 VLDL殘體-C濃度。 定量方法 1 1 (1 )在水性媒體中，將檢體與界面活性劑1及界面活性劑 2、及環糊精衍生物及/或蛋白素預先混合後， (2 )在（1)之混合物、膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶之 存在下，進行酶反應， (3 )測定所生成之過氧化氫， (4)由（3)測定之値，及預先作成之檢量線，決定檢體中之 VLDL殘體-C濃度。 定量方法1 2 (1) 在水性媒體中，將檢體與界面活性劑1及界面活性劑 2、及環糊精衍生物及/或蛋白素預先混合後， (2) 在（1)之混合物、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽 固醇脫氫酶之存在下，進行酶反應， (3 )測定所生成之還原型輔酶， (4)由（3)測定之値，及預先作成之檢量線，決定檢體中之 VLDL殘體-C濃度。 (VLDL殘體-C之定量用試藥） 本發明之VLDL殘體-C之定量用試藥含有膽固醇酯水解 -29- 200528717 酶、膽固醇氧化酶及使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶對 * VLDL殘體中之酯型及游離型膽固醇專一地作用之選自（a) 聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚（界面活性劑1)及（b)聚氧 乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸 烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑（界面活性劑2)。 上述試藥可含有過氧化氫定量用試藥。過氧化氫定量用試 藥之例含有過氧化酶及由氧化而變換成色素之色原體。 本發明之其他VLDL殘體-C之定量用試藥含有膽固醇酯 p 水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶及膽固醇酯水解酶及 ' 使膽固醇脫氫酶對VLDL殘體中之酯型及游離型膽固醇專 一地作用之選自（a)聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚（界面活 ' 性劑1)及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯乙烯化 ' 苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑（界面活 性劑2)。 此試藥可含有還原型輔酶定量用試藥。還原型輔酶定量用 試藥之例含有硫辛醯胺脫氫酶、電子載體及由於還原而變 •換成色素之色原體。 這些試藥皆可含有環糊精或其衍生物及/或蛋白素。 本發明之VLDL殘體-C之定量用試藥可例示如下具體態 樣。 試藥1 含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、界面活性劑i、界 面活性劑2及過氧化氫測定用試藥之試藥。 試藥2 -30- 200528717 含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、界面 ' 活性劑1及界面活性劑2之試藥。 試藥3 含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、界面 活性劑1、界面活性劑2及還原型輔酶測定用試藥之試藥 試藥4 含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、界面活性劑1、界 面活性劑2、過氧化氫測定用試藥、及環糊精衍生物及/或 蛋白素之試藥。 試藥5 含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、界面 活性劑1、界面活性劑2、及環糊精衍生物及/或蛋白素之 試藥。 試藥6 含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、界面 活性劑1、界面活性劑2、還原型輔酶測定用試藥、及環糊 精衍生物及/或蛋白素之試藥。 (VLDL殘體-C之定量用套組） 本發明之VLDL殘體-C定量用試藥乃以套組之形態保存 、流通及使用。套組之形態使用2試藥及3試藥，惟以2試 藥系較適宜。 在第1試藥與第2試藥之2試藥系之套組，膽固醇酯水解 酶與膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶雖可在分別試藥含有，惟 -31 - 200528717 宜在同一試藥含有之套組，尤宜在第2試藥含有之套組。這 些酶在分別之試藥含有時，膽固醇酯水解酶在第1試藥，膽固 醇氧化酶或膽固醇脫氫酶在第2試藥含有。 選自聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物，聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚 及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑可在第1試藥 、第2試藥之任一試藥含有，惟以在第1試藥含有之套組較 適宜。 聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚乃在第1試藥、第2試藥 之任一試藥含有。環糊精或其衍生物及/或蛋白素在第1試 藥、第2試藥之至少一方含有，惟宜在第1試藥含有。氧化 型輔酶在第1試藥、第2試藥之至少一方含有。過氧化氫 定量用試藥在第1試藥、第2試藥之至少一方含有，惟該試 藥含有氧化偶合型色原體時，氧化偶合型色原體之個別化合 物宜在個別試藥含有。還原型輔酶定量用試藥在第1試藥 、第2試藥之至少一方含有。 具體而言，可舉出如下態樣之套組。 套組1 第1試藥 含有界面活性劑2及過氧化氫定量用試藥之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶及過 氧化氫定量用試藥之試藥。 套組2 第1試藥 -32- 200528717 含有界面活性劑2之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固 醇脫氫酶之試藥。 套糸日.3 第1試藥 含有界面活性劑2之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固 醇脫氫酶及還原型輔酶定量用試藥之試藥° 套組4 第1試藥 含有界面活性劑2、過氧化氫定量用試藥、及環糊精或其 衍生物及/或蛋白素之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶及過 氧化氫定量用試藥之試藥。 套組5 第1試藥 含有界面活性劑2、及環糊精或其衍生物及/或蛋白素之 試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固 醇脫氫酶之試藥。 -33- 200528717 套組6 第1試藥 含有界面活性劑2、及環糊精或其衍生物及/或蛋白素之 試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固 醇脫氫酶及還原型輔酶定量用試藥之試藥。 套組7 第1試藥 含有界面活性劑1、界面活性劑2及過氧化氫定量用試藥 之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶及過 氧化氫定量用試藥之試藥。 套組8 第1試藥 含有界面活性劑1及界面活性劑2之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固 醇脫氫酶之試藥。 套組9_ 第1試藥 含有界面活性劑1及界面活性劑2之試藥。 第2試藥 -34- 200528717 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固 醇脫氫酶及還原型輔酶定量用試藥之試藥。 套組1 0 第1試藥 含有界面活性劑1、界面活性劑2、過氧化氫定量用試藥 、及環糊精或其衍生物及/或蛋白素之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶及過 氧化氫定量用試藥之試藥。 套組1 1 第1試藥 含有界面活性劑1、界面活性劑2、及環糊精或其衍生物 及/或蛋白素之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固 醇脫氫酶試藥。 套組12 第1試藥 含有界面活性劑1、界面活性劑2、及環糊精或其衍生物 及/或蛋白素之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑1、膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固 醇脫氫酶及還原型輔酶定量用試樂之試藥。 套絹13 -35- 200528717 第1試藥 含有界面活性劑1、界面活性劑2及過氧化氫定量用試藥 之試藥。 第2試藥 含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶及過氧化氫定量用試 藥之試藥。 套組1 4 第1試藥

含有界面活性劑1及界面活性劑2之試藥。 第2試藥 膽含有固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶之試藥 套組1 5 第1試藥 含有界面活性劑1及界面活性劑2之試藥。 第2試藥 含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶及還原 型輔酶定量用試藥之試藥。 套組1 6 第1試藥 含有界面活性劑1、界面活性劑2、過氧化氫定量用試藥 、及環糊精或其衍生物及/或蛋白素之試藥。 第2試藥 含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶及過氧化氫定量用試 -36- 200528717 藥之試藥。 套組1 7 第1試藥 含有界面活性劑1、界面活性劑2、及環糊精或其衍生物 及/或蛋白素之試藥。 第2試藥 含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶之試藥 套組1 8 第1試藥 含有界面活性劑1、界面活性劑2、及環糊精或其衍生物 及/或蛋白素之試藥。 第2試藥 含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶及還原 型輔酶定量用試藥之試藥。 本發明之VLDL殘體-C定量用試藥及套組可用以VLDL 殘體-C之定量及IDL-C之定量。 本發明之VLDL殘體-C定量用試藥及套組中各成分可用 前述之VLDL殘體-C定量方法或試藥記載之膽固醇酯水解 酶、膽固醇氧化酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、環糊精 或其衍生物、蛋白素、選自聚氧乙烯聚氧伸烷基院基芳基 醚、聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚 及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面活性劑、過氧化氫定 量用試藥及還原型輔酶定量用試藥。 -37- 200528717 本發明之VLDL殘體-C定量用試藥及套組必要時也可含 有前述水性媒體、酶活性化劑、安定化劑、防腐劑、干渉 物抑制劑、用以使活體試料中之球蛋白等之蛋白質可溶化 之種種鹽類。 本發明之VLDL殘體-C定量用試藥及套組中之酶、2種之 界面活性劑、環糊精或其衍生物及/或蛋白素乃以水性媒體 溶解之狀態呈VLDL殘體-C定量方法記載之濃度之含量構 成。 以下舉實施例詳細説明本發明。本實施例中使用下述製造 商之試藥及機器。 MOPS(古德緩衝劑；同仁化學公司製造）、TOOS(多林達試 藥；同仁化學公司製造）、硫酸鈉（和光純藥公司製造）、 EmulgenL-40(聚氧乙烯聚氧丙烯烷基苯基醚；花王公司製造） 、PrononB-208(聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物；日本油脂公司製 造）、過氧化酶（POD)(東洋紡績公司製造）、抗壞血酸氧化 酶（AOD)(旭化成公司製造）、4-胺基安替比林（半井化學公 司製造）、脂蛋白脂肪酶（LPL)(東洋紡績公司製造）、膽固醇 氧化酶（CHOD)(協和發酵工業公司製造）、BLAUNON TSP-50(聚氧乙儲苯乙烯化苯基醚；青木油脂公司製造）、牛血清 蛋白素（BSA)(東洋酵母公司製造）、UniloobMT-0620B(聚氧 伸烷基長鏈分岐烷基醚；日本油脂公司製造）、羥丙基-β-環 糊精（日本食品化工公司製造）。 【實施方式】 寬_施發明之最佳形態 -38- 200528717

實施例1 VLDL殘體-C定量用套組 製備由以下第1試藥及第2試藥而成之 量用套組。•第1試藥 MOPS(pH6.5) 20 mmol/L VLDL殘體-C定

TOOS 0.3 g/L硫酸鈉 1 g/L EmulgenL-40 5 g/L

PrononB-208 6 g/L 過氧化酶（POD) 10 U/mL

抗壞血酸氧化酶（AOD) 2 U/mL•第2試藥 MOP 20 mmol/L

4-胺基安替比林 0.5 g/L EmulgenL-40 2 g/L 過氧化酶（POD) 10 U/mL 脂蛋白脂肪酶（LPL) 2 U/mL 膽固醇氧化酶 2 U/mL

實施例2 VLDL殘體-C定量用套組 製備由以下第1試藥及第2試藥而成之 量用套組。•第1試藥 MOPS(pH6.5) 20 mmol/L VLDL殘體-C定

TOOS

0.3 g/L 39- 200528717

硫酸鈉 1 g/L BLAUNON TSP-50 7 g/L BS A 1 g/L 過氧化酶（POD) 1 0 U/mL 抗壞血酸氧化酶（AOD) 2 U/mL 第2試藥 MOPS(pH6.8) 20 mmol/L 4-胺基安替比林 0 .5 g/L EmulgenL-40 2 g/L 過氧化酶（POD) 1 0 U/mL 脂蛋白脂肪酶（LPL) 2 U/mL 膽固醇氧化酶 2 U/mL

實施例3 VLDL殘體-C定量用套組 製備由以下第1試藥及第2試藥而成之VLDL殘體-C定

量用套組。 •第1試藥 MOPS(pH6.8) 20 mmol/L TOOS 0.3 g/L 硫酸鈉 1 g/L UniloobMT-0620B 6 g/L 過氧化酶（POD) 10 U/mL 抗壞血酸氧化酶（AOD) 2 U/mL •第2試藥 MOPS(pH6.8) 20 mmol/L -40- 200528717

4-胺基安替比林 0.5 g/L EmulgenL-40 2 g/L 過氧化酶（POD) 10 U/mL 脂蛋白脂肪酶（LPL) 2 U/mL 膽固醇氧化酶 2 U/mL VLDL殘體-C定 實施例4 VLDL殘體-C定量用套組 製備由以下第1試藥及第2試藥而成 量用套組。 •第1試藥

MOPS(pH6.5) 20 mmol/L

TOOS 0.3 g/L

硫酸鈉 1 g/L

EmulgenL-40 5 g/L

PrononB-208 6 g/L

羥丙基-β-環糊精 3 g/L

過氧化酶（POD) 10 U/mL 抗壞血酸氧化酶（AOD) 2 U/mL 第2試藥

MOPS(pH6.8) 20 mmol/L 4-胺基安替比林 0.5 g/L EmulgenL-40 2 g/L 過氧化酶（POD) 10 U/mL 脂蛋白脂肪酶（LPL) 2 U/mL 膽固醇氧化酶 2 U/mL -41 - 200528717

實施例5 VLDL殘體-C定量用套組 製備由以下之第1 定量用套組。 •第1試藥 試藥及第2試藥而成之VLDL殘體-C MOPS(pH6.5) 20 mmol/L TOOS 0.3 g/L 硫酸鈉 1 g/L EmulgenL-40 5 g/L PrononB-208 6 g/L BS A 3 g/L 過氧化酶（POD) 10 U/mL

抗壞血酸氧化酶（AOD) 2 U/mL •第2試藥 MOPS(pH6.8) 2 0 mmol/L 4-胺基安替比林 0.5 g/L EmulgenL-40 2 g/L 過氧化酶（POD) 10 U/mL 脂蛋白脂肪酶（LPL) 2 U/mL 膽固醇氧化酶 2 U/mL 實施例6 VLDL殘體 -c之定量 就各新鮮血清40試料，用實施例1之套組以日立7170型 自動分析裝置，將試料中之VLDL殘體-c定量如下。 (1 )檢量線之作成 作爲標準液，使用將生理食鹽水（VLDL殘體-C濃度 -42- 200528717 :0.0mg/dL)，及VLDL殘體-C濃度爲45mg/dL之血清{依山 村等之方法[「動脈硬化」，日本動脈硬化學會，2001年，第 29卷，p.23 5(演題編號：No. 9 8)}決定濃度}及該血清適宜地稀 釋來調製之稀釋血清。 用實施例1之套組，以日立7 1 70型自動分析裝置定量 VLDL殘體-C濃度，作成檢量線。 在反應池添加標準液（6//L)及第1試藥（〇.18mL)，在37°C 加溫5分，將反應液之吸光度（El)以主波長546nm，副波長 § 700nm定量，次在此反應液添加第2試藥（0.05mL)，更在37 °C加溫5分，將反應液之吸光度（E2)以主波長546nm，副波長 700nm測定。 (2 )含在人新鮮血清試料（40試料）之VLDL殘體-C之定 量 標準液代之以人新鮮血清40試料，與（1)同樣之方法，就各 該40試料施行反應，由反應後之反應液之吸光度及（1)作成 之檢量線，定量各含在該40試料之VLDL殘體-C。 B 實施例7 VLDL殘體-C之定量 實施例1之套組代之以實施例2之套組之外，與實施例6 之定量法同樣，用日立7170型自動分析裝置，將各含在實施 例6之定量所使用之人新鮮血清試料（40試料）之VLDL殘 體-C定量。 實施例8 VLDL殘體-C之定量 實施例1之套組代之以實施例3之套組以外，與實施例6 之定量法同樣，用曰立7170型自動分析裝置，將各含在實施 -43- 200528717 例6之定量所使用之人新鮮血清試料（4 〇試料）之v LD L殘 體-C疋量。 實施例9 VLDL殘體-C之定量 實施例1之套組代之以實施例4之套組以外，與實施例6 之定量法同樣，用曰立7170型自動分析裝置，將各含在實施 例6之定量所使用之人新鮮血清試料（4〇試料）之vlDL殘 體-C定量。 實施例10 VLDL殘體-C之定量 | 實施例1之套組代之以實施例5之套組以外，與實施例6 之定量法同樣，用日立7170型自動分析裝置，將各含在實施 例6之定量所使用之人新鮮血清試料（40試料）之VLDL殘 體-C定量。 (參考例1)依山村等之方法定量VLDL殘體-C 各就實施例6之定量所使用之新鮮血清（40試料），依山村 等之方法[「動脈硬化」，日本動脈硬化學會，200 1年，第29 卷，P.2 3 5 (演題編號：No. 98)]，將超離心分離與凝膠過濾組合， • 定量試料中之VLDL殘體-C如下。 首先將各別試料以超離心分離，分離比重比1 .〇 1 9小之上 清劃分。也即在超離心分離用管添加試料2mL，添加比重調 整液[含有KBr(37.9g/L)之生理食鹽水]2mL使比重爲1.019 後，將此管設定在日立轉子50.4 TI轉子，以35,000rpm超離 心分離20小時，離心分離終了後，以管切機取得分離之上清 〇 該上清含有CM，VLDL及VLDL殘體（該VLDL殘體含有 -44- 200528717 IDL)。 將含有上述所得CM，VLDL及VLDL殘體之上清，依如下條 件定量由伴隨發色反應系之凝膠過濾柱層析來分離之膽固 醇。 HPLC系統：東曹之系統 柱：Superose HR6 柱（Pharmacia 公司製造） 溶出溶媒：含有EDTA(lmmol/L)之0.15mol/L氯化鈉水溶 液（ρΗ7·4) 發色試藥：決定劑L TC(R1+R2;協和梅徳庫斯公司製造） 流速：0.5mL/分（溶出溶媒）；0.25mL/分（發色試藥）

發色反應溫度：37°C 檢出波長：550nm

樣品量：3 μ L 該上清中之膽固醇濃度乃用決定劑L TC (總膽固醇定量用 套組；協和梅徳庫斯公司製造）來決定。 本凝膠過濾柱層析中溶出圖形（層析圖）如第1圖所示。如 第1圖所示，最初溶出VLDL及CM，次溶出VLDL殘體。 實施例1 1 由先定量之以超離心分離調製之上清中之膽固醇濃度，乗 以該上清之容量及第1圖之層析圖之VLDL殘體部分之相 對面積比，來算出該上清中之VLDL殘體-C量，而決定最終 試料中之VLDL殘體-C濃度。 由這些試料之超離心分離之比重1.019未満之上清之調製 ，將該試料中之VLDL殘體-C濃度之至決定之一連操作就 -45- 200528717 4 〇試料各別施行。調查參考例1之定量方法與實施例6〜1 〇 之定量法之間之相關關係，則在兩定量法之間得如第1表所 示之相關係數。又在參考例1之定量方法與實施例9之定 量法之間得如第2圖所不相關圖（相關式：Y = 〇 · 8 3 X + 4.7 ;相關 係數：r = 0.91)。如此，兩定量法之間有良好之相關關係，故得 知由本發明之定量法，可定量試料中之VLDL殘體-C。 (參考例2)由超離心法之IDL-C之定量 就實施例6之定量所使用之各新鮮血清（4 0試料），以超離 i 心分離操作，得比重1.006〜1.019之劃分（IDL劃分）〜將所得 之IDL劃分中之膽固醇濃度用決定劑L TC(總膽固醇定量 用套組；協和梅徳庫斯公司製造）來定量。 實施例12 作爲標準液，用比重爲1.006〜1.019之劃分中之膽固〜爲 23mg/dL之血清來作成檢量線以外，與實施例6同樣之方法， 用實施例1〜5之試藥來測定，調查參考例2之定量方法與實 施例6〜10之定量方法之間之相關關係，則得在兩定量法之 § 間如第1表所示相關係數。又在參考例2之定量方法與實 施例9之定量法之間，得如第3圖所示相關圖（相關式 :Υ = 1·20Χ + 5·6;相關係數：r = 〇.83)。如此，兩定量法之間有良 好之相關關係，故得知以本發明之定量法，可定量試料中之 IDL-C。 -46- 200528717 第1表 測定用套組 (測定法） 相關係數 (實施例之測定法與參考例之測定法之相關） 參考例1 (VLDL 殘體，C) 參考例2 (IDL-C) 實施例1(實施例6) 0.87 0.79 實施例2(實施例7) 0.83 0.74 實施例3(實施例8) 0.69 0.64 實施例4(實施例9) 0.91 0.83 實施例5(實施例10) 0.92 0.84 實施例1 1及實施例1 2之結果，得知由本發明之定量法，可 定量試料中之VLDL殘體-C及試料中之IDL-C。 (參考例3)對環糊精或其衍生物，蛋白素之LDL之反應抑制 效果 用實施例1，實施例4,實施例5之套組及超離心分離來調 製之LDL分劃，檢討對各套組中Ldl之反應性。標準液代 之以LDL分劃，第1試藥及第2試藥乃用構成實施例1，實 施例4,實施例5之套組之第1試藥及第2試藥以外，與實施 例6 記載之方法同樣之方法來反應。其結果如第2表。 第2表 測定用套組 添加物及有無 LDL反應率(％) 吸光度(Abs) 實施例1 ΗΡ-β-CD - 6.3 BSA - 0.355 實施例4 ΗΡ-β-CD + 2.1 BSA - 0.360 實施例5 ΗΡ-β-CD BSA + 2.6 0.443 第2表中，LDL反應率乃示對於由LDL分劃與決定劑L T C (總膽固醇定量用套組；協和梅徳庫斯公司製造）之反應定 -47- 200528717 量之LDL分劃中之膽固醇量，與由LDL分劃與各套組之反 應定量之膽固醇量之比例。第2表中，吸光度乃示由既知濃 度之膽固醇標準液與各套組之反應所得反應液之吸光度。 由第2表得知添加，環糊精或其衍生物或蛋白素，則抑制對 LDL中之膽固醇之反應。又添加蛋白素則吸光度上昇，故感 度也增加。 産業上之利用可能忤 本發明提供對動脈硬化性疾病之診斷有用之VLDL殘體-C • 之定量方法，試藥及套組。 【圖式簡單說明】 第1圖乃示將由超離心分離調製之比重1 · 〇 1 9以下之分劃 依凝膠過濾柱層析來分析時之層析圖。 第2圖乃示將超離心分離與凝膠過濾組合之vldL殘體-C 之定量法（參考例1之定量法）與實施例9之定量法之相關 關係之圖。 第3圖乃示用超離心分離之IDL-C之定量法（參考例2之 ® 定量法）與實施例9之定量法之相關關係之圖。 -48-

Claims (1)

1. 200528717 十、申請專利範圍： 1 · 一種試料中之極低密度脂蛋白殘體膽固醇之定量方法， 其特徴爲在含有試料之水性媒體中，有使膽固醇酯水解 酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶對極低密度脂蛋白 殘體中之酯型及游離型膽固醇（以下總稱極低密度脂蛋 白殘體膽固醇）專一地作用之選自（a)聚氧乙烯聚氧伸烷 基烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙 烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界 φ 面活性劑之組合之存在下，於試料中之極低密度脂蛋白 殘體中之膽固醇有（〇膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶 或（d)氧化型輔酶之存在下與膽固醇酯水解酶及膽固醇 脫氫酶作用，來生成過氧化氫或還原型輔酶，而將所生成 之過氧化氫或還原型輔酶定量。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中極低密度脂蛋白殘 體爲中間密度脂蛋白。 3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該酶反應在更 • 有環糊精或其衍生物及/或蛋白素之存在下施行。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中環糊精或其衍生物 爲選自α-環糊精、β-環糊精、γ_環糊精、二甲基- α-環糊精、二甲基-β-環糊精、二甲基-γ-環糊精、三甲 基-α-環糊精、三甲基-β-環糊精、三甲基-γ-環糊精、 羥乙基-α-環糊精、羥乙基-β-環糊精、羥乙基-γ-環糊 精、羥丙基-α-環糊精、羥丙基·β-環糊精、羥丙基-γ-環糊精、羧甲基-α-環糊精、羧甲基-β-環糊精、羧甲 -49 - 200528717 基-γ-環糊精、穩基-α-環糊精、糖基-β-環糊精、糖基-^ γ-環糊精、麥芽糖基-α-環糊精、麥芽糖基-β-環糊精 、麥芽糖基-γ-環糊精、α -環糊精硫酸酯、β-環糊精硫 酸酯、γ -環糊精硫酸酯、/3 -環糊精聚合物之化合物 〇 5. 如申請專利範圍第1〜4項中任一項之方法，其中聚氧乙 嫌聚氧伸院基院基芳基醚爲聚氧乙嫌聚氧丙燃院基苯 基醚。 φ 6. 如申請專利範圍第1〜5項中任一項之方法，其中過氧化 ' 氫之定量乃將過氧化酶之存在下生成之過氧化氫與色 原體反應來生成色素，而定量所生成之色素。 7. 如申請專利範圍第1〜5項中任一項之方法，其中還原型 輔酶之定量乃將反應液之吸光度測定來施行。 8. —種含有膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶之試料中之 極低密度脂蛋白殘體膽固醇定量用試藥，其特徵爲含有 使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶對極低密度脂蛋白 • 殘體膽固醇專一地作用之選自（a)聚氧乙烯聚氧伸烷基 烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合物、聚氧乙烯 苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種界面 活性劑組合。 9. 如申請專利範圍第8項之試藥，其中該試藥更含有過氧 化氫定量用試藥。 10. —種極低密度脂蛋白殘體膽固醇定量用試藥，其特徵爲 含有使膽固醇酯水解酶及膽固醇脫氫酶對極低密度脂 -50- 200528717 蛋白殘體膽固_專一地作用之選自（a)聚氧乙烯聚氧伸 火兀基丨兀基方基醚及（b)聚氧乙嫌聚氧丁儲縮合物、聚氧 乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基醚之一種 界面活性劑組合、膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶及 氧化型輔酶。 1 1 ·如申請專利範圍第1 〇項之試藥，其中該試藥更含有還 原型輔酶定量用試藥。 I2·如申請專利範圍第8〜u項中任一項之試藥，其中極低 密度脂蛋白殘體膽固醇爲中間密度脂蛋白。 1 3 ·如申請專利範圍第8〜1 2項中任一項之試藥，其中更含 有環糊精或其衍生物及/或蛋白素。 1 4 .如申請專利範圍第1 3項之試藥，其中環糊精或其衍生 物爲選自環糊精、β-環糊精、γ-環糊精、二甲基_ 環糊精、二甲基-β-環糊精、二甲基-γ-環糊精、三甲 基-α-環糊精、三甲基-β-環糊精、三甲基-γ-環糊精、 經乙基-α-環糊精、羥乙基_β_環糊精、羥乙基-γ_環糊 精、羥丙基_ α _環糊精、羥丙基_β_環糊精、羥丙基 環糊精、羧甲基-α-環糊精、羧甲基-β_環糊精、羧甲 基-γ-環糊精、糖基-α-環糊精、糖基_β_環糊精、糖基_ [環糊精、麥芽糖基-α-環糊精、麥芽糖基環糊精 、麥芽糖基環糊精、α -環糊精硫酸酯、環糊精硫 酸酯、7 -環糊精硫酸酯、β -環糊精聚合物之化合物 〇 U·如申請專利範圍第8〜：u項中任一項之試藥，其中聚氧 -51 - 200528717 基 烷 烯 丙 氧 聚 烯 乙 氧 聚 爲 醚 基 芳 基 烷 ，基 ，烷 伸 氧 聚 烯 乙 醚 基 苯 組 △口 套組 用醚 量基 定芳 醇基 固烷 膽基 體烷 殘伸 白氧 蛋聚 脂烯 度乙 密氧 低聚 極與 之有 中含 料爲 試徵 種特 1 其 而含有使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶對極低密度 脂蛋白殘體膽固醇專一地作用之選自聚氧乙烯聚氧丁 烯縮合物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長 鏈烷基醚之一種界面活性劑之第1試藥，及含有膽固醇 φ 酯水解酶及膽固醇氧化酶之第2試藥，且在第1試藥及 第2試藥之至少一方含有與選自該聚氧乙烯聚氧丁烯 縮合物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈 烷基醚之一種界面活性劑組合而使膽固醇酯水解酶及 膽固醇氧化酶對極低密度脂蛋白殘體膽固醇專一地作 用之聚氧乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚，在第1試藥及第 2試藥之至少一方含有過氧化氫定量用試藥。 1 7. —種試料中之極低密度脂蛋白殘體膽固醇定量用套組， • 其特徵爲含有與使膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶對 極低密度脂蛋白殘體膽固醇專一地作用之選自（a)聚氧 乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮 合物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷 基醚之一種界面活性劑之組合之第1試藥，及含有膽固 醇酯水解酶及膽固醇氧化酶之第2試藥，且在第1試藥 、第2試藥之至少一方含有過氧化氫定量用試藥。 1 8. —種試料中之極低密度脂蛋白殘體膽固醇定量用套組， -52- 200528717 合密氧基 組低聚烷 醚極烯伸 基對乙氧 芳酶氧聚 基氫聚及 烷脫自醚 基醇選基 烷固之苯 伸膽用化 氧及作烯 聚酶地乙 烯解一苯 乙水專嫌 氧酯醇乙 聚醇固氧 、與固膽聚 有膽體、 含之殘物 爲有白合 徵含蛋縮 特使脂嫌 其而度丁 長鏈烷基醚之一種界面活性劑之第1試藥，及含有膽固 醇酯水解酶及膽固醇脫氫酶之第2試藥，且在第1試藥 、第2試藥之至少一方含有氧化型輔酶，在第1試藥、 第2試藥之至少一方含有與選自該該聚氧乙烯聚氧丁 ® 烯縮合物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長 鏈烷基醚之一種界面活性劑組合而使膽固醇酯水解酶 及膽固醇脫氫酶對殘體膽固醇專一地作用之聚氧乙烯 聚氧伸烷基烷基芳基醚。 19. 一種試料中之極低密度脂蛋白殘體膽固醇定量用套組， 其特徵爲含有使膽固醇酯水解酶及膽固醇脫氫酶對極 低密度脂蛋白殘體膽固醇專一地作用之選自（a)聚氧乙 烯聚氧伸烷基烷基芳基醚及（b)聚氧乙烯聚氧丁烯縮合 ® 物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧伸烷基長鏈烷基 醚之一種界面活性劑之組合之第1試藥，及含有膽固醇 酯水解酶及膽固醇脫氫酶之第2試藥，且在第1試藥、 第2試藥之至少一方含有氧化型輔酶。 20. 如申請專利範圍第16〜19項中任一項之套組，其中極低 密度脂蛋白殘體爲中間密度脂蛋白。 21. 如申請專利範圍第16〜20項中任一項之套組，其中更在 第1試藥、第2試藥之至少一方含有環糊精或其衍生 -53- 200528717 物及/或蛋白素〜 22. 如申請專利範圍第2 1項之套組，其中環糊精或其衍生 物爲選自 α -環糊精、β-環糊精、γ-環糊精、二甲基-α-環糊精、二甲基-β-環糊精、二甲基-γ-環糊精、三甲 基-α-環糊精、三甲基-β-環糊精、三甲基-γ-環糊精、 羥乙基-α-環糊精、羥乙基-β-環糊精、羥乙基-γ-環糊 精、羥丙基-α -環糊精、羥丙基-β-環糊精、羥丙基-γ-環糊精、羧甲基-α-環糊精、羧甲基-β-環糊精、羧甲 基-γ-環糊精、糖基-α-環糊精、糖基-β-環糊精、糖基-γ-環糊精、麥芽糖基-α -環糊精、麥芽糖基-β-環糊精 、麥芽糖基-γ-環糊精、α -環糊精硫酸酯、β-環糊精硫 酸酯、7 -環糊精硫酸酯、/3 -環糊精聚合物之化合物 〇 23. 如申請專利範圍第16〜22項中任一項之套組，其中聚氧 乙烯聚氧伸烷基烷基芳基醚爲聚氧乙烯烷基苯基醚。

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