WO2019044973A1 - 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット - Google Patents

低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット Download PDF

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瑞季 三浦
知子 荒武
健太 金城
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    • G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring cholesterol (hereinafter abbreviated as LDL-C) in low density lipoprotein (hereinafter referred to as LDL) contained in a sample, a reagent for measurement, and a kit for measurement.
  • LDL-C low density lipoprotein
  • LDL plays a role in supplying cholesterol to peripheral cells and is a direct factor of various arteriosclerosis including coronary artery sclerosis. Increased LDL-C is one of the major risk factors for arteriosclerosis and differential quantification is clinically useful.
  • the ultracentrifugation method is a method of measuring the amount of cholesterol after separating LDL using an ultracentrifuge using the difference in specific gravity of lipoproteins (Non-patent Document 1).
  • the electrophoresis method includes a method of separating an agarose gel or the like as a support by utilizing a difference in charge of lipoproteins, and a method of separating a polyacrylamide gel as a support by utilizing a difference in particle size of lipoproteins. .
  • a surfactant selected from polyoxyethylene alkylene phenyl ether and polyoxyethylene alkylene tribenzyl phenyl ether, and an enzyme reagent for measuring cholesterol are added to the serum, and cholesterol in HDL and in cholesterol in VLDL among lipoproteins is added.
  • a method of quantifying LDL-C which measures the amount of remaining cholesterol after reacting preferentially. Method of selectively measuring LDL-C among cholesterol in lipoproteins by adding polyoxyethylene derivative, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer, and enzyme for measuring cholesterol to a biological sample (patent document) 3).
  • a method for measuring LDL-C which comprises measuring a biological sample in the presence of dimethyl- ⁇ -cyclodextrin and / or poly- ⁇ -cyclodextrin (Patent Document 4).
  • a method for directly and selectively measuring cholesterol in a sample containing any one or more of chylomicron, HDL, LDL and VLDL LDL in the sample in the presence of a compound containing a phospholipid and a phospholipid analog.
  • Method of quantifying -C (Patent Document 5).
  • a sample and a cholesterol measuring enzyme [A] polyoxyethylene / polyoxyalkylene alkyl aryl ether; [B] one or more surfactants selected from the group consisting of polyoxyethylene / polyoxyalkylene condensates, polyoxyethylene alkenyl ethers, polyoxyethylene branched alkyl ethers and polyoxyethylene / polyoxyalkylene branched alkyl ethers; [C] one or more surfactants selected from the group consisting of primary amines, secondary amines, tertiary amines and quaternary ammoniums; [D] A method for measuring cholesterol in low density lipoprotein in a sample, which comprises reacting in the presence of a polyanion and measuring a substance produced or consumed in the reaction (Patent Document 6).
  • alkylphenols such as octylphenol have been reported to have endocrine disrupting activity, and due to environmental considerations, the production and use of surfactants having an alkylphenol structure such as polyoxyethylene alkylphenyl ether are avoided It has come to be done.
  • An object of the present invention is to provide a method and reagent for simply and accurately measuring LDL-C in a sample without using a surfactant having an alkylphenol structure such as polyoxyethylene alkylphenyl ether from the environmental consideration. And providing a kit. Furthermore, it is an object of the present invention to simply and accurately measure LDL-C in a sample without using a surfactant having an alkylphenol structure such as polyoxyethylene alkylphenyl ether and without being affected by turbidity caused by lipids. To provide methods, reagents and kits for measuring.
  • the inventors of the present invention have found that the aqueous solution contains a combination of specific surfactants other than surfactants having an alkylphenol structure and does not contain a surfactant having an alkylphenol structure.
  • Lipoproteins other than LDL can be reacted by reacting the sample with a combination of cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase, or a combination of cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase in a medium.
  • the present inventors have found that it is possible to simply and accurately measure LDL-C in a sample without eliminating cholesterol contained therein and physically fractionating lipoproteins.
  • the present invention relates to the following (1) to (24).
  • a method for measuring LDL-C in a sample which comprises reacting in an aqueous medium containing an alkylphenol structure and not containing a surfactant having an alkylphenol structure, and measuring a substance produced or consumed in the reaction .
  • (9) [a] one or more surfactants selected from the group consisting of POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether; [B] POEPOP condensates; A reagent for measuring LDL-C in a sample, which comprises cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase and does not contain a surfactant having an alkylphenol structure.
  • (11) The reagent according to (10), wherein the substance produced by the reaction of cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase with a sample is hydrogen peroxide.
  • one or more surfactants selected from the group consisting of [a] POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether; [B] POEPOP condensates; A reagent for measuring cholesterol in low density lipoprotein in a sample, which comprises cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase.
  • the reagent according to (12) which further contains a cholesterol esterase, an oxidized coenzyme, and a reagent for measuring a substance produced by the reaction of a cholesterol dehydrogenase with a sample.
  • the reagent according to (16), wherein the polyoxypropylene derivative not containing [c] polyoxyethylene in the molecule is polypropylene glycol or polyoxypropylene glyceryl ether.
  • a first reagent comprising a reagent for measuring hydrogen peroxide, and a second reagent comprising cholesterol oxidase.
  • a second reagent comprising cholesterol oxidase.
  • one or more surfactants selected from the group consisting of POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether;
  • POEPOP condensates Each of the cholesterol ester hydrolases is contained in either or both of the first reagent and the second reagent, and the surfactant having the alkylphenol structure is not contained in any of the first reagent and the second reagent.
  • a kit for measuring LDL-C in a sample (19) The kit according to (18), further comprising a reagent for measuring hydrogen peroxide in the second reagent.
  • the present invention provides methods, reagents and kits for conveniently and accurately measuring LDL-C in a sample without using a surfactant having an alkylphenol structure such as polyoxyethylene alkylphenyl ether. Furthermore, according to the present invention, LDL-C in a sample can be measured simply and accurately without using a surfactant having an alkylphenol structure such as polyoxyethylene alkyl phenyl ether and without being affected by turbidity caused by lipids. Methods, reagents and kits are provided.
  • the method for measuring LDL-C according to the present invention is a method for measuring LDL-C in a sample using an enzyme for measuring cholesterol, wherein a surfactant having an alkylphenol structure is not used. , LDL-C in a sample.
  • the method for measuring LDL-C of the present invention also does not require fractionation of lipoproteins by physical methods such as centrifugation, and cholesterol in lipoproteins other than LDL in the sample prior to measurement of LDL-C. This is a method of measuring LDL-C in a sample without erasing it.
  • the enzyme for measuring cholesterol means cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase.
  • the method for measuring LDL-C comprises the steps of: (i) combining cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase, or (ii) cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase With the combination, [A] one or more surfactants selected from the group consisting of POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether; [B] A method comprising reacting in an aqueous medium containing a POEPOP condensate and not containing a surfactant having an alkylphenol structure, and measuring a substance produced or consumed in the reaction, It is a method including the following steps.
  • [1] A sample and (i) a combination of cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase, or (ii) a combination of cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase, [A] one or more surfactants selected from the group consisting of POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether; [B] reacting in an aqueous medium containing a POEPOP condensate and not containing a surfactant having an alkylphenol structure; [2] measuring the substance produced or consumed in the process of [1] above; [3] LDL-C concentration prepared by performing the above [1] and [2] using a sample of which the LDL-C concentration is known in advance, and the derived substance or the consumed substance derived from Correlating the calibration curve representing the relationship with the information content of the above, and the measured value in the above [2]; [4] A step of determining the LDL-C concentration in the sample.
  • the method for measuring LDL-C is characterized in that the sample and (i) a combination of cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase or (ii) cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenation
  • a combination of enzymes [A] one or more surfactants selected from the group consisting of POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether; [B] POEPOP condensates; [C] Reaction is performed in an aqueous medium containing a polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule and not containing a surfactant having an alkylphenol structure, and measuring the substance produced or consumed in the reaction
  • a method comprising the following steps:
  • [1] A sample and (i) a combination of cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase, or (ii) a combination of cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase, [A] one or more surfactants selected from the group consisting of POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether; [B] POEPOP condensates; [C] reacting in an aqueous medium containing a polyoxypropylene derivative which does not contain polyoxyethylene in the molecule and which does not contain a surfactant having an alkylphenol structure; [2] measuring the substance produced or consumed in the process of [1] above; [3] LDL-C concentration prepared by performing the above [1] and [2] using a sample of which the LDL-C concentration is known in advance, and the derived substance or the consumed substance derived from Correlating the calibration curve representing the relationship with the information content of the above, and the measured value in the above [2]; [4] A step of determining
  • the aqueous medium used in the present invention is not particularly limited as long as it is an aqueous medium that enables the method of measuring LDL-C of the present invention, and examples thereof include deionized water, distilled water, buffer solutions, etc. preferable.
  • the pH in the method for measuring LDL-C of the present invention may be any pH that enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and examples thereof include pH 4 to 10.
  • a buffer as an aqueous medium, it is desirable to use a buffer according to the pH to be set.
  • the buffer used for the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, borate buffer, Good's buffer and the like.
  • Good buffers include, for example, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) Piperazine-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) ), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethanesulfone Acid (TES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethane Sulfonic acid (HEPES
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but 0.001 to 2.0 mol / L is preferable, and 0.005 to 1.0 mol / L is more preferable.
  • examples of the substance produced by the reaction of a sample with (i) a combination of cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase include hydrogen peroxide and the like.
  • examples of the substance produced by the reaction with a combination of cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase include, for example, reduced coenzyme and the like.
  • Examples of the substance consumed in the reaction of the sample and (i) the combination of cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase include, for example, oxygen molecules, and the sample and (ii) cholesterol ester hydrolase, oxidized type
  • Examples of the substance consumed in the reaction with the combination of coenzyme and cholesterol dehydrogenase include oxidized coenzyme and the like.
  • the generated hydrogen peroxide can be measured, for example, using a hydrogen peroxide electrode or a reagent for hydrogen peroxide measurement described later.
  • Examples of the generated reduced coenzyme include a method of measuring the absorbance of reduced coenzyme, a method of using a reagent for measuring reduced coenzyme described later, and the like.
  • the oxygen molecules consumed can be measured, for example, using an oxygen electrode.
  • the oxidized coenzyme consumed can be measured, for example, by the absorbance at the absorption wavelength of oxidized coenzyme.
  • Examples of the sample used in the method of measuring LDL-C of the present invention include whole blood, plasma, serum and the like, and plasma and serum are preferable. Moreover, in the measurement method of the present invention, not only a specimen derived from a healthy person but also a specimen rich in lipids can be used. Examples of lipid-rich samples include high TG samples having high triglyceride (TG), and the like.
  • TG triglyceride
  • the cholesterol ester hydrolase in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme having the ability to hydrolyze cholesterol ester, and, for example, other than animal, plant or microorganism-derived cholesterol esterase, lipoprotein lipase, etc. Cholesterol esterase, lipoprotein lipase and the like produced by the method can also be used.
  • the cholesterol ester hydrolase chemically modified cholesterol ester hydrolase can be used in addition to unmodified cholesterol ester hydrolase.
  • a commercial item can also be used as a cholesterol ester hydrolase.
  • cholesterol ester hydrolases include cholesterol esterase (COE-311; manufactured by Toyobo Co., Ltd.), lipoprotein lipase (LPL-311; manufactured by Toyobo Co., Ltd.), cholesterol esterase "Amano” 2 (CHE-2; manufactured by Amano Enzyme Inc.) Etc.).
  • COE-311 cholesterol esterase
  • LPL-311 lipoprotein lipase
  • CHE-2 cholesterol esterase
  • two or more types of cholesterol ester hydrolases can also be used in combination.
  • a group (chemical modification group) which modifies the enzyme concerned in chemical modification of cholesterol ester hydrolase for example, a group having polyethylene glycol as a main component, a group having polypropylene glycol as a main component, a copolymer of polypropylene glycol and polyethylene glycol
  • examples thereof include groups having unity, a group containing a water-soluble polysaccharide, a sulfopropyl group, a sulfobutyl group, a polyurethane group, a group having a chelating function and the like, and a group containing polyethylene glycol as a main component is preferable.
  • water-soluble polysaccharides include dextran, pullulan, soluble starch and the like.
  • a reagent (chemical modifying agent) for chemically modifying cholesterol ester hydrolase As a reagent (chemical modifying agent) for chemically modifying cholesterol ester hydrolase, the above-mentioned chemical modifying group and a functional group or structure capable of reacting with the amino group, carboxyl group, sulfhydryl group or the like of the enzyme The compound etc. which it has are mentioned.
  • the functional group or structure capable of reacting with the amino group in the enzyme is, for example, carboxyl group, active ester group (N-hydroxysuccinimide group etc.), acid anhydride, acid chloride, aldehyde, epoxide group, 1,3- Propane sultone, 1,4-butane sultone and the like can be mentioned.
  • Examples of functional groups or structures capable of reacting with carboxyl groups in the enzyme include, for example, amino groups.
  • Examples of the group or structure reactive with the sulfhydryl group in the enzyme include maleimide group, disulfide, ⁇ -halo ester ( ⁇ -iodo ester etc.) and the like.
  • a commercial item can also be used as a chemical modifier.
  • Commercially available chemical modifiers include Sunbright VFM-4101, Sunbright ME-050AS, Sunbright DE-030AS (all of which are manufactured by NOF Corporation), which have a polyethylene glycol-based group and an N-hydroxysuccinimide group.
  • Sunlight AKM series for example, Sunbright AKM-1510 etc. having a group mainly composed of polyalkylene glycol and an acid anhydride structure (eg Sunbright AKM-1510 etc.), Sunbright ADM series, Sunbright ACM series (all of which are NOF Corporation) Company), EPOX-3400 having Methylene glycol-based group and epoxide group, M-EPOX-5000 (all are manufactured by Shearwater Polymers), and diethylenetriamine having a group having a chelating function and an acid anhydride structure -N, N, N ', N'',N''-penta Water diacetate (DTPA anhydride; manufactured by Dojindo Laboratories), and the like.
  • DTPA anhydride
  • Chemical modification of cholesterol ester hydrolase can be performed, for example, by the following method, but is not limited to this method.
  • a buffer solution of pH 8.0 or higher for example, HEPES buffer solution
  • Add a 0.01 to 500-fold molar amount of a chemical modifier at 0 to 55 ° C and add 5 to 5 minutes. Stir for hours.
  • the enzyme reaction not only the reaction solution itself but also one from which unreacted chemical modifiers have been removed by an ultrafiltration membrane etc. as necessary is used as the chemically modified cholesterol ester hydrolase You can also
  • the concentration of cholesterol ester hydrolase in the method of measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention, and the concentration in the reaction solution is usually 0. .001 to 800 kU / L, preferably 0.01 to 300 kU / L.
  • the cholesterol oxidase in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of oxidizing cholesterol to generate hydrogen peroxide, and, for example, other than animal, plant or microorganism-derived cholesterol oxidase, genetic engineering techniques Cholesterol oxidase and the like produced by the method can also be used, and commercially available products such as cholesterol oxidase (CHODI; manufactured by Kikkoman Corporation), cholesterol oxidase (CHO-CE; manufactured by Kikkoman Corporation), cholesterol oxidase (COO-321: manufactured by Toyobo Co., Ltd.) Can also be used. In the present invention, two or more types of cholesterol oxidases can be used in combination.
  • the cholesterol oxidase may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme.
  • the chemically modified cholesterol oxidase can be produced, for example, by the above-mentioned chemical modification method using the above-mentioned chemical modifier.
  • the concentration of cholesterol oxidase in the method of measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention, and the concentration in the reaction solution is usually 0.001. It is ⁇ 800 kU / L, preferably 0.01-300 kU / L.
  • the cholesterol dehydrogenase in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme having the ability to oxidize cholesterol in the presence of oxidized coenzyme to produce reduced coenzyme, and is derived from, for example, animal, plant or microorganism. Besides cholesterol dehydrogenase, cholesterol dehydrogenase produced by genetic engineering techniques can also be used. Commercially available products such as cholesterol dehydrogenase "Amano" 5 (CHDH-5; manufactured by Amano Enzyme Inc.) can also be used. In the present invention, two or more types of cholesterol dehydrogenases can be used in combination.
  • the cholesterol dehydrogenase may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme.
  • the chemically modified cholesterol dehydrogenase can be produced by the aforementioned chemical modification method, for example, using the aforementioned chemical modifier.
  • the concentration of cholesterol dehydrogenase in the LDL-C measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it enables the LDL-C measurement method of the present invention, and the concentration in the reaction solution is usually 0.001. It is ⁇ 800 kU / L, preferably 0.01-300 kU / L.
  • oxidized coenzyme In the measurement method using the cholesterol dehydrogenase of the present invention, oxidized coenzyme is used.
  • the oxidized coenzyme include NAD, NADP, thio (thio) -NAD, thio (thio) -NADP and the like.
  • the concentration of oxidized coenzyme is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and 0.01 to 10 g / L is preferable.
  • Examples of surfactants having an alkylphenol structure in the present invention include polyoxyethylene alkylphenyl ether (hereinafter abbreviated as POE alkylphenyl ether) and polyoxyethylene polyoxypropylene alkylphenyl ether (hereinafter abbreviated as POEPOP alkylphenyl ether). Yes, etc.).
  • Examples of the alkyl in POE alkylphenyl ether and POEPOP alkylphenyl ether include octyl, nonyl and the like.
  • POE alkylphenyl ether examples include, for example, Triton X-100 (POE octylphenyl ether; manufactured by Sigma Aldrich) and the like.
  • POEPOP alkyl phenyl ether examples include Emulgen L40 (made by Kao Corporation), Akronecess KP189R (made by NOF Corporation) etc. are mentioned, for example.
  • the alkyl in POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether used in the present invention includes, for example, alkyl having 8 to 20 carbon atoms, preferably alkyl having 9 to 18 carbon atoms, more preferably alkyl having 9 to 16 carbon atoms, carbon Several tens to 13 alkyls are particularly preferred.
  • alkyl having 8 to 20 carbon atoms examples include octyl, isooctyl, nonyl, isononyl, decyl, isodecyl, undecyl, isoundecyl, dodecyl (lauryl), isododecyl, tridecyl, isotridecyl, tetradecyl (myristyl), isotetradecyl, pentadecyl and isodecyl.
  • Pentadecyl Pentadecyl, hexadecyl (cetyl), isohexadecyl, heptadecyl, isoheptadecyl, octadecyl (stearyl), isooctadecyl, nonadecyl, isononadecyl, icosyl, isoicosyl and the like.
  • alkyl having 9 to 18 carbon atoms examples include nonyl, isononyl, decyl, isodecyl, undecyl, isoundecyl, dodecyl (lauryl), isododecyl, tridecyl, isotridecyl, tetradecyl (myristyl), isotetradecyl, pentadecyl, isopentadecyl and hexadecyl (Cetyl), isohexadecyl, heptadecyl, isoheptadecyl, octadecyl (stearyl), isooctadecyl and the like.
  • alkyl having 9 to 16 carbon atoms examples include nonyl, isononyl, decyl, isodecyl, undecyl, isoundecyl, dodecyl (lauryl), isododecyl, tridecyl, isotridecyl, tetradecyl (myristyl), isotetradecyl, pentadecyl, isopentadecyl and hexadecyl (Cetyl), isohexadecyl and the like.
  • Examples of the alkyl having 10 to 13 carbon atoms include decyl, isodecyl, undecyl, isoundecyl, dodecyl (lauryl), isododecyl, tridecyl, isotridecyl and the like.
  • the polymerization mode of POEPOP in the POEPOP alkyl ether is not particularly limited, and examples thereof include block polymerization type and random polymerization type polymerization. Examples of the block polymerization type include diblock copolymers, triblock copolymers, tetrablock copolymers and the like.
  • POE alkyl ether examples include, for example, Finesurf D-35, Finesurf D-45, Finesurf D-60, Finesurf D-65, Finesurf D-85, Safety Cut ID-1033, Safety Cut ID- 1087 (above, POE isodecyl ether; manufactured by Aoki Yushi Kogyo Co., Ltd.), Finesurf TD-30, Finesurf TD-50, Finesurf TD-70, Finesurf TD-80, Finesurf TD-85, Finesurf TD- 90, Finesurf TD-100, Finesurf TD-120, Finesurf TD-150, Finesurf TD-200 (above, POE tridecyl ether; manufactured by Aoki Yushi Kogyo Co., Ltd.), NIKKOL BL-2, NIKKOL BL-4.
  • NIKKOL L-9 EX NIKKOL BL-21, NIKKOL BL-25 (above, POE lauryl ether; manufactured by Nikko Chemicals), NIKKOL BC-2, NIKKOL BC-5.5, NIKKOL BC-7, NIKKOL BC-10, NIKKOL BC -15, NIKKOL BC-20, NIKKOL BC-23, NIKKOL BC-25, NIKKOL BC-30, NIKKOL BC-40 (above, POE cetyl ether; Nikko Chemicals Co., Ltd.), EMALEX 703, EMALEX 705, EMALEX 707, EMALEX 709, EMALEX 710, EMALEX 712, EMALEX 715, EMALEX 720, EMALEX 725, EMALEX 730, EMALEX 750 Above, POE lauryl ether; manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd., EMALEX 102, EMALEX 103, EMALEX
  • POEPOP alkyl ethers include, for example, Wandasurf NDR-800, Wandasurf NDR-1000, Wandasurf NDR-1400 (above, POEPOP decyl ether; Aoki Yushi Kogyo Co., Ltd.), Wandasurf ID-50, Wandasurf ID -70, Wandasurf ID-90, Finesurf IDEP-608, Finesurf IDEP-604, Finesurf IDEP-802 (above, POEPOP isodecyl ether; manufactured by Aoki Yushi Kogyo Co., Ltd.), Wandasurf RL-80, Wandasurf RL -100, Wandasurf RL-140, Wandasurf 80, Wandasurf 100, Wandasurf 140 (or more, POEPOP lauryl ether; Aoki Yushi Industry Co., Ltd.), Wandasurf S-800, One Surf S-1000, Wanda Surf S-1400, Fine Surf TDP-0633 K, Fine Surf
  • the concentration of POE alkyl ether in the method of measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention, and the concentration in the reaction solution is usually 0.0001. It is ⁇ 20% (w / v), preferably 0.001-5% (w / v).
  • the concentration of POEPOP alkyl ether in the method of measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention, and the concentration in the reaction solution is usually 0.0001. It is ⁇ 20% (w / v), preferably 0.001-5% (w / v).
  • polymerization mode of POEPOP in the POEPOP condensate there is no particular limitation on the polymerization mode of POEPOP in the POEPOP condensate, and examples thereof include block polymerization type and random polymerization type polymerization.
  • block polymerization type include diblock copolymers, triblock copolymers, tetrablock copolymers and the like.
  • the molecular weight of the POP is 500 to 7,000, preferably 1,000 to 6,000.
  • the molecular weight of the POEPOP condensate is 600 to 12000, preferably 1500 to 8000.
  • POEPOP condensates include Pluronic L-101, Pluronic L-121, Pluronic P-103, Pluronic F-108 (all manufactured by ADEKA Corporation), Pronon 201, Pronon 204, Pronon 208 (all, NOF Corporation) And the like.
  • the concentration of the POEPOP condensate in the method of measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention, and the concentration in the reaction solution is usually 0.0001. It is ⁇ 20% (w / v), preferably 0.001-5% (w / v).
  • polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule in the present invention especially a polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule, which enables the measurement method of LDL-C of the present invention, is particularly
  • examples thereof include polypropylene glycol, polyoxypropylene glyceryl ether and the like.
  • the molecular weight of the polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule in the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention, and is usually 500 to 4000. 1000 to 3500 are preferable, and 1200 to 3000 are particularly preferable.
  • polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule examples include, for example, Uniol D-700, Uniol D-1000, Uniol D-1200, Uniol D-2000, Uniol D-4000 (or more, polypropylene glycol; NOF Corporation), Uniol TG-1000R, Uniol TG-3000 (all, polyoxypropylene glyceryl ether; NOF Corporation), polypropylene glycol diol type 1,000, polypropylene glycol diol type 2,000, polypropylene glycol diol type 3,000 (above, polypropylene glycol; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like.
  • the concentration of the polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule in the method of measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention.
  • the concentration in the reaction solution is usually 0.0001 to 5% (w / v), preferably 0.001 to 1% (w / v).
  • the reaction temperature in the method of measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention, but 10 to 50 ° C. is preferable, and 30 to 40 ° C. is more preferable. preferable.
  • the reaction temperature set by a general-purpose automatic analyzer is usually 37.degree.
  • the reaction time in the method of measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention, but 1 to 60 minutes is preferable, and 2 to 30 minutes is preferable. More preferable.
  • measurement of LDL-C can be performed, for example, by measuring hydrogen peroxide generated by the reaction or reduced coenzyme. It can also be carried out by measuring the amount of oxygen consumed in the reaction.
  • the amount of hydrogen peroxide generated can be measured, for example, using a hydrogen peroxide electrode or a reagent for hydrogen peroxide measurement.
  • the hydrogen peroxide measuring reagent is a reagent for converting the generated hydrogen peroxide into a detectable substance. Examples of the detectable substance include, for example, dyes and luminescence, and dyes are preferable.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide contains an oxidative coloring type chromogen and a peroxide active substance such as peroxidase.
  • oxidative coloring type chromogens include, for example, oxidative coloring type chromogens described later.
  • the detectable substance is luminescence
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide contains a chemiluminescent substance. Examples of chemiluminescent substances include luminol, isoluminol, lucigenin, acridinium esters and the like.
  • hydrogen peroxide is an oxidative coloring type chromogen in the presence of the peroxide active substance. It can be measured by reacting with the body to form a dye and measuring the produced dye. Further, when using a reagent for measuring hydrogen peroxide containing a chemiluminescent substance, hydrogen peroxide can be measured by reacting with the chemiluminescent substance to generate photons and measuring the produced photons. .
  • oxidative coloring type chromogen examples include leuco type chromogen, oxidative coupling coloring type chromogen, and the like.
  • the leuco-type chromogen is a substance which is converted to a dye alone in the presence of a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • the oxidative coupling chromogenic chromogen is a substance which oxidatively couples two compounds to form a dye in the presence of a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • the combination of the two compounds includes a combination of a coupler and an aniline, a combination of a coupler and a phenol, and the like.
  • the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA), 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone and the like.
  • N- (3-sulfopropyl) aniline N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy) -3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOPS), N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N, N-dimethyl-3-methylaniline, N , N-di (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (HDAOS
  • the concentration of the peroxide active substance is not particularly limited as long as it is a concentration that enables the LDL-C measurement method of the present invention, but when using peroxidase as the peroxide active substance, 1 -100 kU / L is preferred. Further, the concentration of the oxidative coloring type chromogen is not particularly limited as long as it enables the measurement method of LDL-C of the present invention, and 0.01 to 10 g / L is preferable.
  • Examples of the method of measuring reduced coenzyme include a method of measuring the absorbance of the generated reduced coenzyme, a method of using a reagent for measuring reduced coenzyme, and the like.
  • the absorbance in the method of measuring the absorbance of reduced coenzyme is preferably 300 to 500 nm, more preferably 330 to 400 nm, and particularly preferably around 340 nm.
  • the reagent for measurement of reduced coenzyme is a reagent for converting the produced reduced coenzyme into a detectable substance. Examples of the detectable substance include dyes and the like.
  • examples of the reagent for measurement of reduced coenzyme include a reagent containing diaphorase, an electron carrier and a reductive chromogen.
  • the electron carrier includes, for example, 1-methoxy-5-methyl phenadium methyl sulfate and the like.
  • reductive chromogens examples include 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), 2- (4-iodophenyl) -3- ( 4-Nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium monosodium salt (WST-1), 2- (4-iodophenyl) -3- (2,4-dinitrophenyl)- 5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium monosodium salt (WST-3) and the like.
  • concentration of the reductive chromogen is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention, and is preferably 0.01 to 10 g / L.
  • the reagent for measuring LDL-C of the present invention is a reagent used for the method of measuring LDL-C of the present invention.
  • the reagent for measuring LDL-C of the present invention can take the form of a kit suitable for storage, distribution and use.
  • the kit for measuring LDL-C of the present invention is a kit used for the method of measuring LDL-C of the present invention.
  • Examples of the kit for LDL-C measurement of the present invention include a kit of two-reagent system, a kit of three-reagent system, etc., but a kit of two-reagent system consisting of a first reagent and a second reagent is preferable.
  • the sample and the first reagent are added to the reaction cell, and fixed for a fixed time
  • the reaction (primary reaction) is carried out at temperature
  • the second reagent is added, and the reaction (secondary reaction) is carried out at constant temperature for a certain period of time, and the substance produced or consumed by the secondary reaction is By measuring, LDL-C can be measured.
  • the reagent for measuring LDL-C of the present invention may be in a lyophilized state or in a state of being dissolved in an aqueous medium.
  • the reagent is dissolved in an aqueous medium in advance and used for measurement of LDL-C.
  • aqueous medium the above-mentioned aqueous medium etc. are mentioned, for example.
  • Cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase, surfactant having an alkylphenol structure, POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, in the reagent and kit for LDL-C measurement of the present invention As a POEPOP condensate, a polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule, a reagent for measuring hydrogen peroxide, and a reagent for measuring reduced coenzyme, the above-mentioned cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, oxidized coenzyme, or oxidized co Enzyme, cholesterol dehydrogenase, surfactant having alkylphenol structure, POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene not containing polyoxyethylene in the molecule Conductor, reagent for measuring hydrogen peroxide, a reagent for quantitatively determining a reduced
  • a two-reagent LDL-C measurement kit comprising a first reagent and a second reagent
  • the surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent
  • cholesterol ester hydrolysis The enzyme is contained in either or both of the first reagent and the second reagent.
  • cholesterol oxidase is not contained in the first reagent but is contained in the second reagent .
  • cholesterol dehydrogenase is contained in the first reagent.
  • it is contained in the second reagent, and the oxidized coenzyme is contained in at least the first reagent.
  • the POE alkyl ether may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent, but the embodiment contained in the second reagent is preferred.
  • the POEPOP alkyl ether may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent, but the embodiment contained in the second reagent is preferred.
  • numerator may be contained in the 1st reagent, the 2nd reagent, or both, the aspect contained in the 2nd reagent is preferable.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent, but is preferably contained in at least the first reagent.
  • the hydrogen peroxide measuring reagent contains an oxidative coupling type chromogen
  • two compounds of the oxidative coupling type chromogen, ie, a coupler and an aniline, or a coupler and a phenol are separate reagents.
  • the aspect contained in is preferable.
  • the reductive coenzyme measurement reagent may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent, but is preferably contained in both the first reagent and the second reagent.
  • the kit for measuring LDL-C of the present invention is a kit comprising three or more reagents, none of the reagents constituting the kit contains a surfactant having an alkylphenol structure.
  • the reagent for measurement of LDL-C and the kit for measurement according to the present invention may contain, if necessary, an aqueous medium, a stabilizer, a preservative, an agent for avoiding the influence of interfering substances, a reaction accelerator and the like.
  • an aqueous medium the above-mentioned aqueous medium etc. are mentioned, for example.
  • the stabilizer include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride and the like.
  • the preservative include sodium azide, antibiotics and the like.
  • reaction accelerators include enzymes such as colipase and phospholipase, and salts such as sodium sulfate and sodium chloride.
  • Reagent 1 An agent containing POE alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase and containing no surfactant and having an alkylphenol structure.
  • Reagent 2 A reagent containing POE alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase and a reagent for measuring hydrogen peroxide and containing no surfactant having an alkylphenol structure.
  • Reagent 3 A reagent containing POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase and containing no surfactant having an alkylphenol structure.
  • Reagent 4 A reagent which contains POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol esterase, cholesterol oxidase and a reagent for measuring hydrogen peroxide and does not contain a surfactant having an alkylphenol structure.
  • Reagent 5 A reagent containing POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase and containing no surfactant having alkylphenol structure.
  • Reagent 6 A reagent containing POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol esterase, cholesterol oxidase and a reagent for measuring hydrogen peroxide, and containing no surfactant having an alkylphenol structure.
  • Reagent 7 A reagent containing POE alkyl ether, POEPOP condensate, a polyoxypropylene derivative containing no polyoxyethylene in the molecule, a cholesterol ester hydrolase and a cholesterol oxidase and containing no surfactant having an alkylphenol structure.
  • Reagent 8 POE alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol esterase, cholesterol oxidase and reagent for measuring hydrogen peroxide, surfactant having alkylphenol structure Reagent not containing.
  • Reagent 9 POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase, and surfactant containing no alkylphenol structure.
  • Reagent 10 POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol esterase, cholesterol oxidase and reagent for measuring hydrogen peroxide, surfactant having alkylphenol structure Reagent not containing.
  • Reagent 11 POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative containing no polyoxyethylene in the molecule, cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase containing a surfactant and having no alkylphenol structure .
  • Reagent 12 POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase and reagent for hydrogen peroxide measurement, and having alkylphenol structure Surfactant-free reagent.
  • Reagent 13 A reagent containing POE alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase, and containing no surfactant having an alkylphenol structure.
  • Reagent 14 A reagent containing POE alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase, and reagent for measuring reduced coenzyme, and containing no surfactant having an alkylphenol structure.
  • Reagent 15 A reagent containing POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol esterase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase and containing no surfactant having an alkylphenol structure.
  • ⁇ Reagent 16 A reagent which contains POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol esterase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase and a reagent for measuring reduced coenzyme and does not contain a surfactant having an alkylphenol structure.
  • Reagent 17 A reagent containing POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol esterase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase and containing no surfactant having an alkylphenol structure.
  • Reagent 18 Reagent containing POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol esterase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase and reagent for measurement of reduced coenzyme and containing no surfactant having alkylphenol structure .
  • Reagent 19 POE alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase, containing surfactant having alkylphenol structure Not a reagent.
  • Reagent 20 POE alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol esterase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase and reagent for measurement of reduced coenzyme, alkylphenol A reagent that does not contain a surfactant having a structure.
  • Reagent 21 POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase, containing surfactant having alkylphenol structure Not a reagent.
  • Reagent 22 POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol esterase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase and reagent for measuring reduced coenzyme, alkylphenol A reagent that does not contain a surfactant having a structure.
  • Reagent 23 POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase, and an interface having an alkylphenol structure Reagent containing no activator.
  • Reagent 24 POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol esterase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase and reagent for reduced coenzyme measurement
  • the content of cholesterol ester hydrolase in the reagent for measuring LDL-C according to the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C according to the present invention, and when dissolved in an aqueous medium
  • the concentration is usually 0.001 to 800 kU / L, preferably 0.01 to 300 kU / L.
  • the content of cholesterol oxidase in the reagent for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and the concentration when dissolved in an aqueous medium is The content is usually 0.001 to 800 kU / L, and the content of 0.01 to 300 kU / L is preferable.
  • the content of cholesterol dehydrogenase in the reagent for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and the concentration when dissolved in an aqueous medium Is usually from 0.001 to 800 kU / L, preferably from 0.01 to 300 kU / L.
  • the content of POE alkyl ether in the reagent for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and the concentration when dissolved in an aqueous medium is The content is usually 0.0001 to 20% (w / v), preferably 0.001 to 5% (w / v).
  • the content of POEPOP alkyl ether in the reagent for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and the concentration when dissolved in an aqueous medium is The content is usually 0.0001 to 20% (w / v), preferably 0.001 to 5% (w / v).
  • the content of the POEPOP condensate in the reagent for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and the concentration when dissolved in an aqueous medium is The content is usually 0.0001 to 20% (w / v), preferably 0.001 to 5% (w / v).
  • the content of the polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule in the reagent for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention.
  • the content when dissolved in an aqueous medium is usually 0.0001 to 5% (w / v), preferably 0.001 to 1% (w / v).
  • Kit 1 First reagent POE alkyl ether, POEPOP condensate second reagent Cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase Furthermore, a surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent.
  • the surfactant having an alkylphenol structure is the first reagent, Not contained in any of the second reagents ⁇ Kit 4 First reagent POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate second reagent Cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase
  • the surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the
  • the surfactant having an alkylphenol structure is the first reagent, Not contained in any of the second reagents ⁇ Kit 6 First reagent Reagent for measuring hydrogen peroxide Second reagent POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, reagent for measuring hydrogen peroxide
  • the surfactant having an alkylphenol structure is the first reagent, Not contained in any of the second reagents
  • a surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent.
  • Kit 8 First reagent POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, reagent for measuring hydrogen peroxide Second reagent for cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, reagent for measuring hydrogen peroxide Furthermore, a surfactant having an alkylphenol structure is Not contained in any of the first and second reagents ⁇ Kit 9 First reagent Reagent for measuring hydrogen peroxide Second reagent POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, reagent for measuring hydrogen peroxide Furthermore, a surfactant having an alkylphenol structure is Not contained in any of the first and second reagents ⁇ Kit 10 First Reagent POE Alkyl Ether, POEPOP Condensate Second Reagent A polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule, cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase and a surfactant
  • Kit 12 First reagent Reagent for measuring hydrogen peroxide Second reagent POE alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol esterase, cholesterol oxidase, reagent for measuring hydrogen peroxide
  • the surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent.
  • surfactant having an alkylphenol structure is the first reagent, Not contained in any of the second reagents ⁇ Kit 14 First reagent POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, reagent for hydrogen peroxide measurement Second reagent polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, reagent for hydrogen peroxide measurement The surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent.
  • Kit 15 First reagent Reagent for measuring hydrogen peroxide Second reagent POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, reagent for measuring hydrogen peroxide
  • the surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent.
  • Kit 18 First reagent Reagent for measuring hydrogen peroxide Second reagent POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule, cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxidase, peroxide Hydrogen measurement reagent Furthermore, the surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent.
  • a surfactant having an alkylphenol structure is contained in both the first reagent and the second reagent Not done ⁇ Kit 20 First reagent POE alkyl ether, POEPOP condensate, oxidized coenzyme, reagent for measurement of reduced coenzyme Second reagent for cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, reagent for measurement of reduced coenzyme Still having alkylphenol structure
  • Surfactant is not contained in any of the first and second reagents ⁇ Kit 21 First Reagent Oxidized Coenzyme Second Reagent POE Alkyl Ether, POEPOP Condensate, Cholesterol Ester Hydrolase, Cholesterol Dehydrogenase
  • a surfactant having an alkylphenol structure is contained in both the first reagent and the second reagent Not done ⁇ Kit 20 First reagent POE alkyl ether, POEPOP condensate, oxidized coenzyme, reagent for measurement of reduced coen
  • a surfactant having an alkylphenol structure is contained in both the first reagent and the second reagent Not done ⁇ kit 24 First reagent POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, oxidized coenzyme, reagent for measurement of reduced coenzyme Second reagent for cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, reagent for measurement of reduced coenzyme Still having alkylphenol structure
  • Surfactant is not contained in either the first reagent or the second reagent ⁇ Kit 25 First Reagent Oxidized Coenzyme Second Reagent POEPOP Alkyl Ether, POEPOP Condensate, Cholesterol Ester Hydrolase, Cholesterol Dehydrogenase
  • a surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent ⁇ Kit 25 First Reagent Oxidized Coenzyme Second Reagent POEPOP Alkyl Ether, POEPOP Condensate, Cho
  • a surfactant having an alkylphenol structure is a first reagent, a second reagent Not included in any-Kit 28 First reagent POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, oxidized coenzyme, reagent for measurement of reduced coenzyme Second reagent for cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, reagent for measurement of reduced coenzyme, Surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent ⁇ Kit 29 First reagent Oxidized coenzyme second reagent POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, cholesterol esterase, cholesterol
  • Kit 33 First reagent Oxidized coenzyme second reagent POE alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, surface activity with alkylphenol structure Agent is not contained in any of the first and second reagents ⁇ Kit 34 First reagent Oxidized coenzyme, Reagent for measurement of reduced coenzyme Second reagent POE alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase
  • a reagent for measuring reduced coenzyme Furthermore, a surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent.
  • First reagent POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, oxidized coenzyme second reagent Polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, surface activity having alkylphenol structure Agent is not contained in either the first reagent or the second reagent ⁇ Kit 36 First reagent POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, oxidized coenzyme, reagent for measurement of reduced coenzyme Second reagent polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase Reagent for measurement of reduced coenzyme Furthermore, a surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent.
  • Kit 37 First reagent Oxidized coenzyme second reagent POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, surface activity having alkylphenol structure Agent is not contained in either the first reagent or the second reagent ⁇ Kit 38 First reagent Oxidized coenzyme, Reagent for measurement of reduced coenzyme Second reagent POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase A reagent for measuring reduced coenzyme Furthermore, a surfactant having an alkylphenol structure is not contained in either the first reagent or the second reagent.
  • Kit 39 First reagent POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, oxidized coenzyme second reagent Polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, alkylphenol structure
  • the surfactant having a surfactant is not contained in any of the first and second reagents.
  • Kit 40 First reagent POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, oxidized coenzyme, reagent for measurement of reduced coenzyme Second reagent polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, Cholesterol dehydrogenase, reagent for measurement of reduced coenzyme Furthermore, a surfactant having an alkylphenol structure is not contained in any of the first reagent and the second reagent.
  • Kit 41 First reagent Oxidized coenzyme second reagent POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, cholesterol dehydrogenase, alkylphenol structure
  • the surfactant having a surfactant is not contained in either the first reagent or the second reagent.
  • Kit 42 First reagent Oxidized coenzyme, Reagent for measurement of reduced coenzyme Second reagent POE alkyl ether, POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in molecule, cholesterol ester hydrolase, Cholesterol dehydrogenase, reagent for measurement of reduced coenzyme Furthermore, a surfactant having an alkylphenol structure is not contained in any of the first reagent and the second reagent
  • the content of cholesterol ester hydrolase in the first reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and an aqueous medium
  • the concentration is usually 0.002 to 1600 kU / L when dissolved and preferably 0.02 to 600 kU / L.
  • the content of cholesterol ester hydrolase in the second reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and an aqueous medium
  • the concentration is usually 0.004 to 3200 kU / L when dissolved and preferably 0.04 to 1200 kU / L.
  • the content of cholesterol oxidase in the second reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and it is dissolved in an aqueous medium
  • the concentration is usually 0.004 to 3200 kU / L, preferably 0.04 to 1200 kU / L.
  • the content of cholesterol dehydrogenase in the second reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and an aqueous medium is used.
  • the concentration when dissolved is usually 0.004 to 3200 kU / L, preferably 0.04 to 1200 kU / L.
  • the content of POE alkyl ether in the first reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and it is dissolved in an aqueous medium
  • the concentration is usually 0.0002 to 40% (w / v), preferably 0.002 to 10% (w / v).
  • the content of the POE alkyl ether in the second reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and it is dissolved in an aqueous medium
  • the concentration is usually 0.0004 to 40% (w / v), preferably 0.004 to 20% (w / v).
  • the content of POEPOP alkyl ether in the first reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and it is dissolved in an aqueous medium
  • the concentration is usually 0.0002 to 40% (w / v), preferably 0.002 to 10% (w / v).
  • the content of POEPOP alkyl ether in the second reagent constituting the kit for measurement of LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method of measuring LDL-C of the present invention, and it is dissolved in an aqueous medium
  • the concentration is usually 0.0004 to 40% (w / v), preferably 0.004 to 20% (w / v).
  • the content of the POEPOP condensate in the first reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and it is dissolved in an aqueous medium
  • the concentration is usually 0.0002 to 40% (w / v), preferably 0.002 to 10% (w / v).
  • the content of the POEPOP condensate in the second reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is not particularly limited as long as it enables the method for measuring LDL-C of the present invention, and it is dissolved in an aqueous medium
  • the concentration is usually 0.0004 to 40% (w / v), preferably 0.004 to 20% (w / v).
  • the content of the polyoxypropylene derivative which does not contain polyoxyethylene in the molecule in the first reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is a content which enables the method of measuring LDL-C of the present invention.
  • the concentration is usually 0.0002 to 10% (w / v), and the content is 0.002 to 2% (w / v). preferable.
  • the content of the polyoxypropylene derivative which does not contain polyoxyethylene in the molecule in the second reagent constituting the kit for measuring LDL-C of the present invention is a content which enables the method of measuring LDL-C of the present invention.
  • the concentration is usually 0.0004 to 20% (w / v), and the content is 0.004 to 4% (w / v). preferable.
  • PIPES made by Dojin Chemical Research Institute
  • EMSE made by Daitoke Mix
  • ascorbic acid oxidase made by Asahi Kasei Pharma
  • 4-AA made by Actec
  • calcium chloride made by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • potassium ferrocyanide made by Wako Pure Chemical Industries
  • Kanto Chemical Co., Ltd. LPL-311 (cholesterol ester hydrolase; Toyobo Co., Ltd.), CHO-CE (cholesterol oxidase; Kikkoman Co.), peroxidase (Toyobo Co., Ltd.), Pluronic L-121 (POEPOP condensate); Made by Adeka
  • Reodore TW-L120 polyoxyethylene sorbitan monolaurate; manufactured by Kao Corporation
  • Emannone 1112 polyethylene glycol monolaurate; manufactured by Kao Corporation
  • Naimine L-207 polyoxyethylene lauryl amine; manufactured by NOF Corporation
  • Unigri MK-278 polyoxyethylene coconut oil fatty acid glyceryl; manufactured by NOF Corporation
  • Uniox HC-100 polyoxyethylene hardened castor oil
  • Uniol D-1200 polypropylene glycol; manufactured by NOF Corporation
  • Uniol D-2000 polypropylene glycol; manufactured by NOF Corporation
  • polypropylene glycol diol type 3,000 polypropylene glycol; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Uniol TG- 3000 polyoxypropylene glyceryl ether; manufactured by NOF Corporation
  • PEG # 2000 polyethylene glycol; manufactured by NOF Corporation
  • Physiological saline manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory
  • Intralipos infusion 10% refined soybean oil; manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory
  • Determiner L TCII a kit for measuring cholesterol; manufactured by Kyowa Medex Co., Ltd.
  • metabolead LDL-C LDL- C kit for measuring C
  • Kyowa Medex Co., Ltd. Determiner standard serum lipid assay
  • Steandard product to be used in combination with Determiner L TCII; Kyowa Medex Co., Ltd., hereinafter abbreviated as cholesterol standard product Metabolite standard serum HDL ⁇ LDL- For C measurement (standard product used in combination with metabolead LDL-C; manufactured by Kyowa Medex Co., Ltd., hereinafter abbreviated as LDL-C standard product)
  • Example 1 An LDL-C measurement kit (kits 1A to 1E) consisting of the following first and second reagents was prepared.
  • First reagent PIPES (pH 7.0) 50 mmol / L EMSE 0.3g / L Ascorbic acid oxidase 4 kU / L
  • Second reagent PIPES (pH 7.0) 50 mmol / L 4-AA 0.5 g / L Calcium chloride 0.1 g / L Potassium ferrocyanide 0.02 g / L LPL-311 3kU / L CHO-CE 2kU / L Peroxidase 20kU / L Pluronic L-121 7g / L Surfactants A to E (see Table 1)
  • Example 2 Using Kit 1A of Example 1 as a kit for measuring LDL-C, using each of the lipoprotein fractions prepared in (1) of Reference Example 1 as a sample, following the procedure described below, of cholesterol in each of the lipoprotein fractions The reaction rate was determined.
  • the kit 1A of Example 1 and metabole lead LDL-C as a kit for measurement of LDL-C and the 20 human sera prepared in (4) described later as a sample and the kit of Example 1 according to the following procedure
  • the correlation between the measurement method using 1A and the measurement method using Metabolite LDL-C was verified, and the correlation coefficient was determined.
  • Kit 1A of Example 1 As a kit for measuring LDL-C, using an LDL-C standard product in which the concentration of LDL-C is determined as a sample, The absorbance to the LDL-C standard was measured according to the following procedure.
  • the standard product (2.5 ⁇ L) and the first reagent (150 ⁇ L) of the kit 1A of Example 1 are added to a reaction cell, reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and the absorbance (E1) of the reaction solution is the main wavelength 600 nm. , Measured at a secondary wavelength of 700 nm.
  • the second reagent (50 ⁇ L) of the kit 1A of Example 1 was added to this reaction solution, and the reaction was further allowed to react at 37 ° C. for 5 minutes, and the absorbance (E2) of the reaction solution was measured at a main wavelength of 600 nm and a sub wavelength 700 nm. .
  • E1 was subtracted from E2 to calculate the absorbance difference ⁇ E standard product .
  • Absorbance difference ⁇ E blank was calculated by the same method except using physiological saline instead of the standard product.
  • a calibration curve showing the relationship between the LDL-C concentration (mg / dL) and the absorbance was prepared from the absorbance difference ⁇ E for the standard product and the absorbance difference ⁇ E blank for saline.
  • Example 3 Each of the kits 1B, 1C, 1D, and 1E of Example 1 is used as a kit for measuring LDL-C in place of the kit 1A of Example 1 according to the same procedure as in Example 2 except for using each kit
  • the correlation coefficient between the reaction rate to cholesterol in the lipoprotein fraction and the measurement method using the respective kits and the measurement method using Metabolite LDL-C was determined. The results are shown in Table 1.
  • each lipoprotein fraction used in the measurement is prepared by separating VLDL, LDL and HDL by ultracentrifugation. Therefore, the LDL-C measurement kit with a lower reaction rate of cholesterol in the VLDL fraction and cholesterol in the HDL fraction and a higher reaction rate of cholesterol in the LDL fraction accurately measures LDL-C in the sample. It means that you can.
  • the VLDL fraction and the HDL fraction are compared with the measurement using each of the kits 1a to 1e of Comparative Example 1. It was found that the reaction rate of the fraction was low and the reaction rate of the LDL fraction was high.
  • the kit for LDL-C measurement of the present invention which comprises one or more surfactants selected from the group consisting of POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether and POEPOP condensate. It became clear that LDL-C in the sample could be accurately measured.
  • the correlation coefficient between the measurement method using each kit of the kits 1A to 1E of Example 1 and the measurement method using Metabolite LDL-C is 0.95 or more, Good correlation was observed between the two measurements. On the other hand, a good correlation was not observed between the measurement method using each kit of the kits 1a to 1e of Comparative Example 1 and the measurement method using Metaboleed LDL-C. Therefore, according to the method of measuring LDL-C of the present invention using the kit for LDL-C measurement of the present invention, which comprises one or more surfactants selected from the group consisting of POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether and POEPOP condensate. It became clear that LDL-C in the sample could be accurately measured.
  • Example 4 Whole blood collected from healthy persons belonging to Kyowa Medex Co., Ltd. was centrifuged at 3,000 rpm and 25 ° C. for 20 minutes to prepare 5 human serum samples. Then, using the kit 1E and metabolead LDL-C of Example 1 as a kit for measuring LDL-C, and using the five human serum samples as samples, the procedure is the same as (1) and (2) of Example 2. The LDL-C concentration (mg / dL) in each human serum was determined. The results are shown in Table 2.
  • the LDL-C concentration (mg / dL) determined in the measurement using Kit 1E of Example 1 as a kit for LDL-C measurement was metaboleed LDL-C as a kit for LDL-C measurement. It was almost the same as the LDL-C concentration (mg / dL) determined by the measurement used. Therefore, according to the method of measuring LDL-C of the present invention using the kit for LDL-C measurement of the present invention, which comprises one or more surfactants selected from the group consisting of POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether and POEPOP condensate. It became clear that LDL-C in the sample could be accurately measured.
  • Example 5 An LDL-C measurement kit (kits 2A to 2D) consisting of the following first and second reagents was prepared.
  • First reagent PIPES (pH 7.0) 50 mmol / L EMSE 0.3g / L Ascorbic acid oxidase 4 kU / L
  • Second reagent PIPES (pH 7.0) 50 mmol / L 4-AA 0.5 g / L Calcium chloride 0.1 g / L Potassium ferrocyanide 0.02 g / L LPL-311 3kU / L CHO-CE 2kU / L Peroxidase 20kU / L Pluronic L-121 7g / L Wanda Surf S-1400 4g / L Polyoxypropylene derivatives A to D which do not contain polyoxyethylene in the molecule (see Table 3)
  • the LDL-C measurement kit of Comparative Example 3 is the LDL-C measurement of Example 5, except that PEG # 2000 is used instead of the polyoxypropylene derivative in which the polyoxyethylene in the second reagent is not contained in the molecule. Kit (kits 2A to 2D).
  • Intralipos-added serum prepared by adding Intralipos to serum as a sample using kit 2A of Example 5 as a kit for measuring LDL-C, and saline-added serum prepared by adding saline to serum
  • the LDL-C concentration in intraliposed serum and LDL-C concentration in saline-added serum were determined using the following procedure to evaluate the effect of intraliposis.
  • Example 7 Using each kit according to the same procedure as in Example 6, except that each kit of the kits 2B, 2C, 2D and 1E of Example 5 is used as a kit for measuring LDL-C instead of the kit 2A of Example 5. The influence of intralipos in LDL-C measurement was evaluated. The results are shown in Table 3.
  • Comparative Example 4 The same procedure as in Example 6 except that the kit 2a of Comparative Example 3 is used as a kit for measuring LDL-C instead of the kit 2A of Example 5, and the influence of intraliposis in the measurement of LDL-C using the respective kits was evaluated. The results are shown in Table 3.
  • Intralipos is a soybean oil-based triglyceride of triglyceride, and is often used to evaluate the effect of turbidity of lipids in samples in clinical test reagents.
  • the ratio of LDL-C concentration in intraliposed serum to LDL-C concentration in saline-added serum is closer to 100%, accurate LDL-C can be obtained without being affected by intraliposis. It means that measurement is possible.
  • kit 1E containing no polyoxypropylene derivative containing no polyoxyethylene in the molecule, and polyoxyethylene glycol instead of the polyoxypropylene derivative containing no polyoxyethylene in the molecule
  • kit of kits 2A to 2D of Example 5 containing a polyoxypropylene derivative containing no polyoxyethylene molecule in comparison with kit 2a of Comparative Example 3 containing LDL-
  • the ratio of C concentration to LDL-C concentration in saline-supplemented serum was all as high as 70% or more.
  • the LDL- of the present invention comprising one or more surfactants selected from the group consisting of POE alkyl ether and POEPOP alkyl ether, POEPOP condensate, and a polyoxypropylene derivative not containing polyoxyethylene in the molecule
  • the present invention provides a method for measuring LDL-C, a reagent for measurement, and a kit for measurement which are useful for diagnosis of metabolic syndrome, arteriosclerosis and the like.

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Abstract

環境への配慮から、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を用いることなく、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）を簡便かつ正確に測定するための方法を提供する。　検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、 ［a］ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；並びに、 ［b］ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物 を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない水性媒体中で反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中のＬＤＬ－Ｃの測定方法とする。

Description

低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
　本発明は、検体中に含まれる低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬという）中のコレステロール（以下、ＬＤＬ－Ｃと略記する。）の測定方法、測定用試薬及び測定用キットに関する。
　本願は、２０１７年９月１日に、日本に出願された特願２０１７－１６８２３５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ＬＤＬは、末梢細胞にコレステロールを供給する役割を有し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の直接的因子である。ＬＤＬ－Ｃの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、分別定量することは臨床上有用である。
　従来からのＬＤＬ－Ｃの定量方法は、超遠心法、電気泳動法、フリードワルド（Friedewald）式による演算方法などが挙げられる。超遠心法は、リポ蛋白の比重の差を利用し、超遠心分離機を用いてＬＤＬを分離したのち、そのコレステロール量を測定する方法である（非特許文献１）。しかしながら、超遠心法による分離操作は煩雑で、迅速性、簡便性などの面で欠点がある。電気泳動法は、リポ蛋白の電荷の差を利用し、アガロースゲルなどを支持体として分離する方法やリポ蛋白の粒子サイズの差を利用し、ポリアクリルアミドゲルを支持体として分離する方法などがある。しかしながら、電気泳動法は定量性に乏しく、簡便性、経済性などの面で問題がある。フリードワルド式による演算方法では、総コレステロール（以下、Ｔ－Ｃと略記する。）、高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬという）中のコレステロール（以下、ＨＤＬ－Ｃと略記する。）及び総トリグリセライド（以下、Ｔ－ＴＧと略記する。）の測定値から、次の計算式に従いＬＤＬ－Ｃ量を算出するが（非特許文献２）、この方法は、血清中のＴ－ＴＧの含有量や食事の影響を受けるため、正確性に問題がある。
　　　（ＬＤＬ－Ｃ)＝(Ｔ－Ｃ)－（ＨＤＬ－Ｃ)－(Ｔ－ＴＧ)／５
　また近年、超遠心法などの分離操作を必要とせず、汎用の自動分析機装置に搭載可能なＬＤＬ－Ｃの定量方法も報告されている。
　それらの中でＬＤＬ－Ｃを定量する方法としては、以下の方法が知られている。
　ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、被検試料中のＨＤＬ、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬという）及びカイロミクロンの各リポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工程とからなる被検試料中のＬＤＬ－Ｃの定量方法（特許文献１）。
　血清に対し、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、並びにコレステロール測定用酵素試薬を添加し、リポ蛋白中のコレステロールのうちＨＤＬ中及びＶＬＤＬ中のコレステロールを優先的に反応させた後に、残りのコレステロールの反応量を測定するＬＤＬ－Ｃの定量方法（特許文献２）。
　生体試料に対し、ポリオキシエチレン誘導体とポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体、並びにコレステロール測定用酵素を添加し、リポ蛋白中のコレステロールのうちＬＤＬ－Ｃを選択的に測定する方法（特許文献３）。
　生体試料に対し、ジメチル－α－シクロデキストリン又は／及びポリ－β－シクロデキストリンの存在下で測定を行うことを特徴とする、ＬＤＬ－Ｃの測定法（特許文献４）。
　カイロミクロン、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬのいずれか１種以上を含む試料中のコレステロールを直接、選択的に測定する方法において、リン脂質、リン脂質類似基を含有する化合物の存在下、試料中のＬＤＬ－Ｃを定量する方法（特許文献５）。
　検体と、コレステロール測定酵素とを、
［a］ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル；
［b］ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
［c］第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；並びに、
［d］ポリアニオン
の存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法（特許文献６）。
　近年、オクチルフェノール等のアルキルフェノール類が内分泌攪乱作用を有することが報告されており、環境への配慮から、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のアルキルフェノール構造を有する界面活性剤の製造や試薬への使用が回避される様になってきた。
　また、臨床検査において、正常検体のみならず、種々の異常検体がしばしば検体として用いられる。その様な異常検体の１つに、脂質が豊富な検体があり、脂質による濁りが測定に影響を及ぼすことが問題となっている。
特開平１０－３８８８８号公報 特開平９－３１３２００号公報 ＷＯ２０００／１７３８８パンフレット 特開平１１－３０６１７号公報 特開２００２－２０２３１４号公報 ＷＯ２０１０／５５９１６パンフレット
アドバンスド・リピッド・リサーチ（Adv. Lipid Res.）、第６巻、１頁、１９６８年 クリニカル・ケミストリー（Clin. Chem.）、第１８巻、４９９頁、１９７２年
　本発明の課題は、環境への配慮から、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のアルキルフェノール構造を有する界面活性剤を用いることなく、検体中のＬＤＬ－Ｃを簡便かつ正確に測定するための方法、試薬及びキットを提供することにある。
　さらに、本発明の課題は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のアルキルフェノール構造を有する界面活性剤を用いることなく、かつ、脂質による濁りの影響を受けることなく、検体中のＬＤＬ－Ｃを簡便かつ正確に測定するための方法、試薬及びキットを提供することにある。
　本発明者らはＬＤＬ－Ｃの測定方法について鋭意検討を重ねた結果、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤以外の特定の界面活性剤の組み合わせを含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない水性媒体中で、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを反応させることにより、ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの消去、及び、リポ蛋白の物理的な分画操作を行うことなく、検体中のＬＤＬ－Ｃを簡便かつ正確に測定できることを見いだし、本発明を完成させた。
　さらに、本発明者らはＬＤＬ－Ｃの測定方法について鋭意検討を重ねた結果、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤以外の特定の界面活性剤の組み合わせ、及びポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない水性媒体中で、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを反応させることで、ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの消去、及び、リポ蛋白の物理的な分画操作を行うことなく、さらに、脂質による濁りの影響を受けることなく、検体中のＬＤＬ－Ｃを簡便かつ正確に測定できることを見いだし、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記（１）～（２４）に関する。
（１）検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
［a］ポリオキシエチレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＥアルキルエーテルと略記する）及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルと略記する）からなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；並びに、
［b］ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物（以下、ＰＯＥＰＯＰ縮合物と略記する）
を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない水性媒体中で反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中のＬＤＬ－Ｃの測定方法。
（２）［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルにおけるアルキルが、炭素数８～２０のアルキルである、（１）記載の方法。
（３）水性媒体が、さらに、［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体を含有する、（１）又は（２）記載の方法。
（４）［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体が、ポリプロピレングリコール又はポリオキシプロピレングリセリルエーテルである、（３）記載の方法。
（５）生成する物質が、過酸化水素である（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）過酸化水素の測定が、過酸化水素測定用試薬を用いて行われる（５）記載の方法。
（７）生成する物質が、還元型補酵素である（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（８）還元型補酵素の測定が、還元型補酵素測定用試薬を用いて行われる（７）記載の方法。
（９）［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
［b］ＰＯＥＰＯＰ縮合物；並びに、
コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しないことを特徴とする、検体中のＬＤＬ－Ｃの測定用試薬。
（１０）さらに、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素と検体との反応で生成する物質を測定するための試薬を含有する、（９）記載の試薬。
（１１）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素と検体との反応で生成する物質が、過酸化水素である、（１０）記載の試薬。
（１２）［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
［b］ＰＯＥＰＯＰ縮合物；並びに、
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
（１３）さらに、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素と検体との反応で生成する物質を測定するための試薬を含有する、（１２）記載の試薬。
（１４）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素と検体との反応で生成する物質が、還元型補酵素である、（１３）記載の試薬。
（１５）［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルにおけるアルキルが、炭素数８～２０のアルキルである、（９）～（１４）のいずれかに記載の試薬。
（１６）さらに、［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体を含有する、（９）～（１５）のいずれかに記載の試薬。
（１７）［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体が、ポリプロピレングリコール又はポリオキシプロピレングリセリルエーテルである、（１６）記載の試薬。
（１８）過酸化水素測定用試薬を含む第一試薬、及び、コレステロール酸化酵素を含む第二試薬を含有し、
［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
［b］ＰＯＥＰＯＰ縮合物；並びに、
コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を第一試薬、第二試薬のいずれの試薬にも含有しないことを特徴とする、検体中のＬＤＬ－Ｃの測定用キット。
（１９）さらに、過酸化水素測定用試薬を第二試薬に含有する（１８）記載のキット。
（２０）酸化型補酵素を含む第一試薬、及び、コレステロール脱水素酵素を含む第二試薬を含有し、
［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
［b］ＰＯＥＰＯＰ縮合物；並びに、
コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を第一試薬、第二試薬のいずれの試薬にも含有しないことを特徴とする、検体中のＬＤＬ－Ｃの測定用キット。
（２１）さらに、還元型補酵素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、（２０）記載のキット。
（２２）［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルにおけるアルキルが、炭素数８～２０のアルキルである、（１８）～（２１）のいずれかに記載のキット。
（２３）さらに、［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する、（１８）～（２２）のいずれかに記載のキット。
（２４）［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体が、ポリプロピレングリコール又はポリオキシプロピレングリセリルエーテルである、（２３）記載のキット。
　本発明により、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のアルキルフェノール構造を有する界面活性剤を用いることなく、検体中のＬＤＬ－Ｃを簡便かつ正確に測定するための方法、試薬及びキットが提供される。
　さらに、本発明により、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のアルキルフェノール構造を有する界面活性剤を用いることなく、かつ、脂質による濁りの影響を受けることなく、検体中のＬＤＬ－Ｃを簡便かつ正確に測定するための方法、試薬及びキットが提供される。
１．ＬＤＬ－Ｃの測定方法
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法は、コレステロール測定用酵素を用いて、検体中のＬＤＬ－Ｃを測定する方法であって、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を用いることなく、検体中のＬＤＬ－Ｃを測定する方法である。本発明のＬＤＬ－Ｃ測定方法はまた、遠心分離などの物理的方法によるリポ蛋白の分画操作を必要とせず、ＬＤＬ－Ｃの測定に先立って検体中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、検体中のＬＤＬ－Ｃを測定する方法である。ここで、コレステロール測定用酵素とは、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素を意味する。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法は、検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；並びに、
［b］ＰＯＥＰＯＰ縮合物
を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない水性媒体中で反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする方法であり、以下の工程を含む方法である。
［１］検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；並びに、
［b］ＰＯＥＰＯＰ縮合物
を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない水性媒体中で反応させる工程；
［２］上記［１］の工程で生成する物質又は消費される物質を測定する工程；
［３］予め、ＬＤＬ－Ｃ濃度が既知である検体を用いて前記［１］及び［２］を行うことにより作成された、ＬＤＬ－Ｃ濃度と、該生成する物質又は該消費される物質由来の情報量との関係を表す検量線と、上記［２］での測定値とを相関付ける工程；及び、
［４］検体中のＬＤＬ－Ｃ濃度を決定する工程。
　さらに、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法は、検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
［b］ＰＯＥＰＯＰ縮合物；並びに、
［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体
を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない水性媒体中で反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする方法であり、以下の工程を含む方法である。
［１］検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
［a］ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
［b］ＰＯＥＰＯＰ縮合物；並びに、
［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体
を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない水性媒体中で反応させる工程；
［２］上記［１］の工程で生成する物質又は消費される物質を測定する工程；
［３］予め、ＬＤＬ－Ｃ濃度が既知である検体を用いて前記［１］及び［２］を行うことにより作成された、ＬＤＬ－Ｃ濃度と、該生成する物質又は該消費される物質由来の情報量との関係を表す検量線と、上記［２］での測定値とを相関付ける工程；及び、
［４］検体中のＬＤＬ－Ｃ濃度を決定する工程。
　本発明において用いられる水性媒体は、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法におけるｐＨは、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とするｐＨであればいずれでもよいが、例えばｐＨ４～１０が挙げられる。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
　グッドの緩衝剤としては、例えば２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－〔Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
　緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１～２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５～１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法において、検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせとの反応で生成する物質としては、例えば過酸化水素等が挙げられ、検体と、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとの反応で生成する物質としては、例えば還元型補酵素等が挙げられる。検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせとの反応で消費される物質としては、例えば酸素分子等が挙げられ、検体と、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとの反応で消費される物質としては、例えば酸化型補酵素等が挙げられる。生成した過酸化水素は、例えば過酸化水素電極や後述の過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。生成した還元型補酵素は、例えば還元型補酵素の吸光度を測定する方法や後述の還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。消費される酸素分子は、例えば酸素電極を用いて測定することができる。消費される酸化型補酵素は、例えば酸化型補酵素の吸収波長での吸光度で測定することができる。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清等が挙げられ、血漿及び血清が好ましい。また、本発明の測定方法においては、健常人由来の検体のみならず、脂質が豊富な検体も使用することができる。脂質が豊富な検体としては、例えばトリグリセライド（ＴＧ）が高い高ＴＧ検体等が挙げられる。
　本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
　コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素の他、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
　市販のコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ（ＣＯＥ－３１１；東洋紡社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ－３１１；東洋紡社製）、コレステロールエステラーゼ“Amano”２（ＣＨＥ－２；天野エンザイム社製）等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
　コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。
　コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ－ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３－プロパンスルトン、１，４－ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α－ハロエステル（α－ヨードエステル等）等が挙げられる。
　化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ－ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ－４１０１、サンブライトＭＥ－０５０ＡＳ、サンブライトＤＥ－０３０ＡＳ（いずれも日油社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ－１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日油社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ－３４００、Ｍ－ＥＰＯＸ－５０００（いずれもShearwater Polymers社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタ無水二酢酸（DTPA anhydride；同仁化学研究所社製）等が挙げられる。
　コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝液）に溶解し、０～５５℃で０．０１～５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間～５時間攪拌する。酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法におけるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．００１～８００ｋＵ／Ｌであり、０．０１～３００ｋＵ／Ｌが好ましい。
　本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤＩ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ－ＣＥ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ－３２１；東洋紡社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
　コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法におけるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．００１～８００ｋＵ／Ｌであり、０．０１～３００ｋＵ／Ｌが好ましい。
　本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Amano” ５ （ＣＨＤＨ―５；天野エンザイム社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定方法におけるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．００１～８００ｋＵ／Ｌであり、０．０１～３００ｋＵ／Ｌが好ましい。
　本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオ（thio）－ＮＡＤ、チオ（thio）－ＮＡＤＰ等が挙げられる。また、酸化型補酵素の濃度は、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１～１０ｇ／Ｌが好ましい。
　本発明におけるアルキルフェノール構造を有する界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＰＯＥＰＯＰアルキルフェニルエーテルと略記する）等が挙げられる。ＰＯＥアルキルフェニルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル等が挙げられる。
　ＰＯＥアルキルフェニルエーテルの具体例としては、例えばトリトンＸ－１００（ＰＯＥオクチルフェニルエーテル；シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
　ＰＯＥＰＯＰアルキルフェニルエーテルの具体例としては、例えばエマルゲンＬ４０（花王社製）、アクロネセスＫＰ１８９Ｒ（日油社製)等が挙げられる。
　本発明において用いられるＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルにおけるアルキルとしては例えば炭素数８～２０のアルキルが挙げられ、炭素数９～１８のアルキルが好ましく、炭素数９～１６のアルキルがより好ましく、炭素数１０～１３のアルキルが特に好ましい。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えばオクチル、イソオクチル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル（ラウリル）、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、イソヘキサデシル、ヘプタデシル、イソヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、イソオクタデシル、ノナデシル、イソノナデシル、イコシル、イソイコシル等が挙げられる。炭素数９～１８のアルキルとしては、例えばノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル（ラウリル）、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、イソヘキサデシル、ヘプタデシル、イソヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、イソオクタデシル等が挙げられる。炭素数９～１６のアルキルとしては、例えばノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル（ラウリル）、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、イソヘキサデシル等が挙げられる。炭素数１０～１３のアルキルとしては、例えばデシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル（ラウリル）、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル等が挙げられる。ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルにおけるＰＯＥＰＯＰの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。
　ＰＯＥアルキルエーテルの具体例としては、例えばファインサーフＤ－３５、ファインサーフＤ－４５、ファインサーフＤ－６０、ファインサーフＤ－６５、ファインサーフＤ－８５、セフティカットＩＤ－１０３３、セフティカットＩＤ－１０８７（以上、ＰＯＥイソデシルエーテル；青木油脂工業社製）、ファインサーフＴＤ－３０、ファインサーフＴＤ－５０、ファインサーフＴＤ－７０、ファインサーフＴＤ－８０、ファインサーフＴＤ－８５、ファインサーフＴＤ－９０、ファインサーフＴＤ－１００、ファインサーフＴＤ－１２０、ファインサーフＴＤ－１５０、ファインサーフＴＤ－２００（以上、ＰＯＥトリデシルエーテル；青木油脂工業社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＬ－２、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＬ－４．２、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＬ－９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＬ－２１、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＬ－２５（以上、ＰＯＥラウリルエーテル；日光ケミカルズ社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＣ－２、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＣ－５．５、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＣ－７、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＣ－１０、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＣ－１５、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＣ－２０、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＣ－２３、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＣ－２５、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＣ－３０、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＣ－４０（以上、ＰＯＥセチルエーテル；日光ケミカルズ社製）、ＥＭＡＬＥＸ　７０３、ＥＭＡＬＥＸ　７０５、ＥＭＡＬＥＸ　７０７、ＥＭＡＬＥＸ　７０９、ＥＭＡＬＥＸ　７１０、ＥＭＡＬＥＸ　７１２、ＥＭＡＬＥＸ　７１５、ＥＭＡＬＥＸ　７２０、ＥＭＡＬＥＸ　７２５、ＥＭＡＬＥＸ　７３０、ＥＭＡＬＥＸ　７５０（以上、ＰＯＥラウリルエーテル；日本エマルジョン社製）、ＥＭＡＬＥＸ　１０２、ＥＭＡＬＥＸ　１０３、ＥＭＡＬＥＸ　１０４、ＥＭＡＬＥＸ　１０５、ＥＭＡＬＥＸ　１０７、ＥＭＡＬＥＸ　１１２、ＥＭＡＬＥＸ　１１５、ＥＭＡＬＥＸ　１１７、ＥＭＡＬＥＸ　１２０、ＥＭＡＬＥＸ　１２５、ＥＭＡＬＥＸ　１３０（以上、ＰＯＥセチルエーテル；日本エマルジョン社製）、ノニオン　ＩＤ－２０３、ノニオン　ＩＤ－２０６、ノニオン　ＩＤ－２０９（以上、ＰＯＥイソデシルエーテル；日油社製）、ノニオン　Ｋ－２０４、ノニオン　Ｋ－２２０、ノニオン　Ｋ－２３０（以上、ＰＯＥラウリルエーテル；日油社製）、ノニオン　Ｐ－２０８、ノニオン　Ｐ－２１０、ノニオン　Ｐ－２１３（以上、ＰＯＥセチルエーテル；日油社製）等が挙げられる。
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルの具体例としては、例えばワンダサーフ　ＮＤＲ－８００、ワンダサーフ　ＮＤＲ－１０００、ワンダサーフ　ＮＤＲ－１４００（以上、ＰＯＥＰＯＰデシルエーテル；青木油脂工業社製）、ワンダサーフ　ＩＤ－５０、ワンダサーフ　ＩＤ－７０、ワンダサーフ　ＩＤ－９０、ファインサーフＩＤＥＰ－６０８、ファインサーフＩＤＥＰ－６０４、ファインサーフＩＤＥＰ－８０２（以上、ＰＯＥＰＯＰイソデシルエーテル；青木油脂工業社製）、ワンダサーフ　ＲＬ－８０、ワンダサーフ　ＲＬ－１００、ワンダサーフ　ＲＬ－１４０、ワンダサーフ　８０、ワンダサーフ　１００、ワンダサーフ　１４０（以上、ＰＯＥＰＯＰラウリルエーテル；青木油脂工業社製）、ワンダサーフ　Ｓ－８００、ワンダサーフ　Ｓ－１０００、ワンダサーフ　Ｓ－１４００、ファインサーフＴＤＰ－０６３３Ｋ、ファインサーフＴＤＥ－１０３３、ファインサーフＴＤＥ－１０５５（以上、ＰＯＥＰＯＰトリデシルエーテル；青木油脂工業社製）、ＮＩＫＫＯＬ　ＰＢＣ－３１、ＮＩＫＫＯＬ　ＰＢＣ－３３、ＮＩＫＫＯＬ　ＰＢＣ－３４、ＮＩＫＫＯＬ　ＰＢＣ－４４（以上、ＰＯＥＰＯＰセチルエーテル；日光ケミカルズ社製）、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ－０２０３、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ－０２０５、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ－０２０７、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ－０２１０、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ－０２１２、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ－０２１５、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ－０２２０、ＥＭＡＬＥＸ　ＤＡＰＥ－０２３０（以上、ＰＯＥＰＯＰデシルエーテル；日本エマルジョン社製）等が挙げられる。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法におけるＰＯＥアルキルエーテルの濃度としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．０００１～２０％（ｗ／ｖ）であり、０．００１～５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法におけるＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルの濃度としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．０００１～２０％（ｗ／ｖ）であり、０．００１～５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
　ＰＯＥＰＯＰ縮合物におけるＰＯＥＰＯＰの重合様式としては特に制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。ＰＯＰの分子量としては、５００～７０００であり、好ましくは１０００～６０００である。ＰＯＥＰＯＰ縮合物の分子量としては、６００～１２０００であり、好ましくは１５００～８０００である。
　ＰＯＥＰＯＰ縮合物の具体例としては、プルロニックＬ－１０１、プルロニックＬ－１２１、プルロニックＰ－１０３、プルロニックＦ－１０８（以上、ＡＤＥＫＡ社製）、プロノン２０１、プロノン２０４、プロノン２０８（以上、日油社製）等が挙げられる。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法におけるＰＯＥＰＯＰ縮合物の濃度としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．０００１～２０％（ｗ／ｖ）であり、０．００１～５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
　本発明におけるポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体であれば特に制限はなく、例えばポリプロピレングリコール、ポリオキシプロピレングリセリルエーテル等が挙げられる。本発明におけるポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体の分子量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする分子量であれば特に制限はなく、通常５００～４０００であり、１０００～３５００が好ましく、１２００～３０００が特に好ましい。
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体の具体例としては、例えばユニオールＤ－７００、ユニオールＤ－１０００、ユニオールＤ－１２００、ユニオールＤ－２０００、ユニオールＤ－４０００（以上、ポリプロピレングリコール；日油社製）、ユニオールＴＧ－１０００Ｒ、ユニオールＴＧ－３０００（以上、ポリオキシプロピレングリセリルエーテル；日油社製）、ポリプロピレングリコール　ジオール型　１，０００、ポリプロピレングリコール　ジオール型　２，０００、ポリプロピレングリコール　ジオール型　３，０００（以上、ポリプロピレングリコール；和光純薬工業社製）等が挙げられる。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法における、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体の濃度としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、反応液中の濃度は通常０．０００１～５％（ｗ／ｖ）であり、０．００１～１％（ｗ／ｖ）が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法における反応温度は、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はないが、１０～５０℃が好ましく、３０～４０℃がより好ましい。汎用の自動分析装置で設定される反応温度は通常３７℃である。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法における反応時間は、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はないが、１～６０分間が好ましく、２～３０分間がより好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法において、ＬＤＬ－Ｃの測定は、例えば反応により生成した過酸化水素や還元型補酵素を測定することにより行うことができる。また、反応において消費される酸素量を測定することにより行うこともできる。
　生成した過酸化水素の量は、例えば過酸化水素電極や過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
　過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を測定することにより、測定することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、測定することができる。
　酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。
　ロイコ型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ－フェニレンジアミン、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ－６４）、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
　酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
　カプラーとしては、例えば４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、３－メチル－２－ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
　アニリン類としては、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－メチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ジ（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－４－フルオロ－３，５－ジメトキシアニリン（Ｆ－ＤＡＯＳ）、Ｎ－［２－（サクシニルアミノ）エチル］－２－メトキシ－５－メチルアニリン（ＭＡＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－［２－（サクシニルアミノ）エチル］－２－メトキシ－５－メチルアニリン（Ｅｔ－ＭＡＳＥ）等が挙げられる。
　フェノール類としては、フェノール、４－クロロフェノール、３－メチルフェノール、３－ヒドロキシ－２，４，６－トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
　過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、１～１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１～１０ｇ／Ｌが好ましい。
　還元型補酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸光度を測定する方法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。還元型補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、３００～５００ｎｍが好ましく、３３０～４００ｎｍがより好ましく、３４０ｎｍ付近が特に好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合の還元型補酵素測定用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電子キャリアー及び還元発色型色原体を含有する試薬が挙げられる。電子キャリアーとしては、例えば１－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェート等が挙げられる。還元型補酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子キャリアー及び還元発色型色原体を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量することにより、還元型補酵素を定量することができる。
　還元発色型色原体としては、例えば３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）、２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ－１）、２－（４－ヨードフェニル）－３－（２，４－ジニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ－３）等が挙げられる。また、還元発色型色原体の濃度は、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、０．０１～１０ｇ／Ｌが好ましい。
２．ＬＤＬ－Ｃ測定用試薬及びＬＤＬ－Ｃ測定用キット
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬は、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法に用いられる試薬である。本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬は、保存、流通及び使用に適したキットの形態を取ることができる。本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットは、本発明のＬＤＬ－Ｃ測定方法に使用されるキットである。本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットの形態としては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられるが、第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のキットが好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして、２試薬系キットを用いて検体中のＬＤＬ－Ｃを測定する場合は、先ず、反応セルに、検体と第１試薬とを添加し、一定時間、一定温度で反応（１次反応）を行った後、第２試薬を添加し、さらに、一定時間、一定温度で反応（２次反応）を行い、２次反応により生成した物質又は消費される物質を測定することにより、ＬＤＬ－Ｃを測定することができる。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬は、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬を用いて検体中のＬＤＬ－Ｃを測定する場合には、事前に当該試薬を水性媒体に溶解して、ＬＤＬ－Ｃの測定に使用される。該水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬及び測定用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、過酸化水素測定用試薬、還元型補酵素測定用試薬としては、前述のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、過酸化水素測定用試薬、還元型補酵素測定用試薬がそれぞれ挙げられる。
　第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のＬＤＬ－Ｃ測定用キットにおいては、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されず、コレステロールエステル加水分解酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を用いるＬＤＬ－Ｃ測定に用いられる２試薬系のＬＤＬ－Ｃ測定用キットにおいては、コレステロール酸化酵素は第一試薬に含有されず、第二試薬に含有される。また、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を用いるＬＤＬ－Ｃ測定に用いられる２試薬系のＬＤＬ－Ｃ測定用キットにおいては、コレステロール脱水素酵素は第一試薬に含有されず、第二試薬に含有され、酸化型補酵素は少なくとも第一試薬に含有される。
　ＰＯＥアルキルエーテルは、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第二試薬に含有される態様が好ましい。
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルは、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第二試薬に含有される態様が好ましい。
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第二試薬に含有される態様が好ましい。
　過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、少なくとも第一試薬に含有されることが望ましい。過酸化水素測定試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体の２つの化合物、すなわち、カプラーとアニリン類、又は、カプラーとフェノール類はそれぞれ別々の試薬に含有される態様が好ましい。還元性補酵素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第一試薬、第二試薬の両方に含有されることが好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットが、３試薬以上の試薬からなるキットの場合、当該キットを構成するいずれの試薬にも、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は含まれない。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、妨害物質の影響回避剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。妨害物質の影響回避剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を回避するためのアスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンの影響を回避するためのフェロシアン化カリウム等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。
　以下に、本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬の具体的態様を記すが、本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬はこれらに限定されない。
・試薬１
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬２
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬３
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬４
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬５
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬６
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬７
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬８
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬９
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬１０
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬１１
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬１２
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬１３
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬１４
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬１５
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬１６
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬１７
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬１８
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬１９
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬２０
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬２１
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬２２
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬２３
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
・試薬２４
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない試薬。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬におけるコレステロールエステル加水分解酵素の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．００１～８００ｋＵ／Ｌとなる含量であり、０．０１～３００ｋＵ／Ｌとなる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬におけるコレステロール酸化酵素の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．００１～８００ｋＵ／Ｌとなる含量であり、０．０１～３００ｋＵ／Ｌとなる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬におけるコレステロール脱水素酵素の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．００１～８００ｋＵ／Ｌとなる含量であり、０．０１～３００ｋＵ／Ｌとなる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬におけるＰＯＥアルキルエーテルの含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００１～２０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００１～５％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬におけるＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルの含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００１～２０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００１～５％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬におけるＰＯＥＰＯＰ縮合物の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００１～２０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００１～５％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用試薬における、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００１～５％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００１～１％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　以下に、本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットの具体的態様を記すが、本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットはこれらに限定されない。
・キット１
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３
第一試薬
　過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット４
第一試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット５
第一試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット６
第一試薬
　過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット７
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット８
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット９
第一試薬
　過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット１０
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット１１
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット１２
第一試薬
　過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット１３
第一試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット１４
第一試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット１５
第一試薬
　過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット１６
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット１７
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット１８
第一試薬
　過酸化水素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット１９
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２０
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２１
第一試薬
　酸化型補酵素
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２２
第一試薬
　酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２３
第一試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２４
第一試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２５
第一試薬
　酸化型補酵素
第二試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２６
第一試薬
　酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２７
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２８
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット２９
第一試薬
　酸化型補酵素
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３０
第一試薬
　酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３１
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３２
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３３
第一試薬
　酸化型補酵素
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３４
第一試薬
　酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３５
第一試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３６
第一試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３７
第一試薬
　酸化型補酵素
第二試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３８
第一試薬
　酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット３９
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット４０
第一試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット４１
第一試薬
　酸化型補酵素
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
・キット４２
第一試薬
　酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
　ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定用試薬
なお、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤は第一試薬、第二試薬のいずれにも含有されない
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第一試薬におけるコレステロールエステル加水分解酵素の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．００２～１６００ｋＵ／Ｌとなる含量であり、０．０２～６００ｋＵ／Ｌとなる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第二試薬におけるコレステロールエステル加水分解酵素の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．００４～３２００ｋＵ／Ｌとなる含量であり、０．０４～１２００ｋＵ／Ｌとなる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第二試薬におけるコレステロール酸化酵素の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．００４～３２００ｋＵ／Ｌとなる含量であり、０．０４～１２００ｋＵ／Ｌとなる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第二試薬におけるコレステロール脱水素酵素の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．００４～３２００ｋＵ／Ｌとなる含量であり、０．０４～１２００ｋＵ／Ｌとなる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第一試薬におけるＰＯＥアルキルエーテルの含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００２～４０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００２～１０％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第二試薬におけるＰＯＥアルキルエーテルの含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００４～４０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００４～２０％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第一試薬におけるＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルの含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００２～４０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００２～１０％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第二試薬におけるＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルの含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００４～４０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００４～２０％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第一試薬におけるＰＯＥＰＯＰ縮合物の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００２～４０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００２～１０％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第二試薬におけるＰＯＥＰＯＰ縮合物の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００４～４０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００４～２０％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第一試薬における、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００２～１０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００２～２％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを構成する第二試薬における、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体の含量としては、本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法を可能とする含量であれば特に制限はなく、水性媒体で溶解されたときの濃度が通常０．０００４～２０％（ｗ／ｖ）となる含量であり、０．００４～４％（ｗ／ｖ）となる含量が好ましい。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、本実施例、比較例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
　ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、アスコルビン酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ社製）、４－ＡＡ（アクテック社製）、塩化カルシウム（和光純薬工業社製）、フェロシアン化カリウム（関東化学社製）、ＬＰＬ－３１１（コレステロールエステル加水分解酵素；東洋紡社製）、ＣＨＯ－ＣＥ（コレステロール酸化酵素；キッコーマン社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）、プルロニックＬ―１２１（ＰＯＥＰＯＰ縮合物；ＡＤＥＫＡ社製）
　セフティカットＩＤ－１０８７（ＰＯＥイソデシルエーテル；青木油脂工業社製）、ファインサーフＴＤ－２００（ＰＯＥトリデシルエーテル；青木油脂工業社製）、ワンダサーフＩＤ－７０（ＰＯＥＰＯＰイソデシルエーテル；青木油脂工業社製）、ワンダサーフＩＤ－９０（ＰＯＥＰＯＰイソデシルエーテル；青木油脂工業社製）、ワンダサーフＳ－１４００（ＰＯＥＰＯＰトリデシルエーテル；青木油脂工業社製）
　レオドールＴＷ－Ｌ１２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート；花王社製）、エマノーン１１１２（ポリエチレングリコールモノラウレート；花王社製）、ナイミーンＬ―２０７（ポリオキシエチレンラウリルアミン；日油社製）、ユニグリＭＫ－２７８（ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸グリセリル；日油社製）、ユニオックスＨＣ－１００（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；日油社製）
　ユニオールＤ－１２００（ポリプロピレングリコール；日油社製）、ユニオールＤ－２０００（ポリプロピレングリコール；日油社製）、ポリプロピレングリコール　ジオール型　３，０００（ポリプロピレングリコール；和光純薬工業社製）、ユニオールＴＧ－３０００（ポリオキシプロピレングリセリルエーテル；日油社製）、ＰＥＧ＃２０００（ポリエチレングリコール；日油社製）
　生理食塩水（大塚製薬工場社製）、イントラリポス輸液１０％（精製大豆油；大塚製薬工場社製）、デタミナーＬ　ＴＣＩＩ（コレステロール測定用キット；協和メデックス社製）、メタボリードＬＤＬ－Ｃ（ＬＤＬ－Ｃ測定用キット；協和メデックス社製）、デタミナー標準血清脂質測定用（デタミナーＬ　ＴＣＩＩと組み合わせて使用する標準品；協和メデックス社製、以下コレステロール標準品と略記する）、メタボリード標準血清ＨＤＬ・ＬＤＬ－Ｃ測定用（メタボリードＬＤＬ－Ｃと組み合わせて使用する標準品；協和メデックス社製、以下ＬＤＬ－Ｃ標準品と略記する）
［参考例１］リポ蛋白分画の調製とコレステロール濃度の決定
（１）リポ蛋白分画の調製
　協和メデックス株式会社所属の健常人より採取した全血を、３，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分間遠心分離し、ヒト血清を調製した。次いで、“新生化学実験講座４　脂質Ｉ　中性脂肪とリポタンパク質”（東京化学同人、ＩＳＢＮ：４－８０７９－１０８０－９）に記載された超遠心分離操作に従い、当該ヒト血清よりＶＬＤＬ（比重１．００６以下）、ＬＤＬ（比重１．００６～１．０６３）、ＨＤＬ（比重１．０６３以上）をそれぞれ分離し、各リポ蛋白分画を調製した。
（２）コレステロール濃度決定のための検量線の作成
　コレステロール測定用キットとしてデタミナーＬ　ＴＣＩＩを用い、試料としてコレステロール濃度が決定されているコレステロール標準品を用い、以下の手順より、コレステロール標準品に対する吸光度を測定した。反応セルへ、当該標準品（２μＬ）とデタミナーＬ　ＴＣＩＩの第１試薬（１５０μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。次いで、この反応液にデタミナーＬ　ＴＣＩＩの第２試薬（５０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差ΔＥ標準品を算出した。
　当該標準品の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により、吸光度差ΔＥブランクを算出した。
　当該標準品に対する吸光度差ΔＥ標準品と、生理食塩水に対する吸光度差ΔＥブランクとから、コレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
（３）各リポ蛋白分画におけるコレステロール濃度の決定
　コレステロール測定用キットとしてデタミナーＬ　ＴＣＩＩを用い、試料として（１）で調製した各リポ蛋白分画を用い、（２）と同様の手順により、各リポ蛋白分画に対する吸光度差を算出した。算出した吸光度差と（２）の検量線とから、各リポ蛋白分画におけるコレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）を決定した。
［実施例１］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＬＤＬ－Ｃ測定用キット（キット１Ａ～１Ｅ）を調製した。
第１試薬
　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＥＭＳＥ　　　　　　　　　　　　　　０．３ｇ／Ｌ
　アスコルビン酸オキシダーゼ　　　　　４ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　４－ＡＡ　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム　　　　　　　　　　　０．１ｇ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　　　　　　　０．０２ｇ／Ｌ
　ＬＰＬ－３１１　　　　　　　　　　　３ｋＵ／Ｌ
　ＣＨＯ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　２０ｋＵ／Ｌ
　プルロニックＬ－１２１　　　　　　　７ｇ／Ｌ
　界面活性剤Ａ～Ｅ（第１表参照）
［比較例１］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＬＤＬ－Ｃ測定用キット（キット１ａ～１ｅ）を調製した。
第１試薬
　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＥＭＳＥ　　　　　　　　　　　　　　０．３ｇ／Ｌ
　アスコルビン酸オキシダーゼ　　　　　４ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　４－ＡＡ　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム　　　　　　　　　　　０．１ｇ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　　　　　　　０．０２ｇ／Ｌ
　ＬＰＬ－３１１　　　　　　　　　　　３ｋＵ／Ｌ
　ＣＨＯ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　２０ｋＵ／Ｌ
　プルロニックＬ－１２１　　７ｇ／Ｌ
　界面活性剤ａ～ｅ（第１表参照）
［実施例２］
　ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして実施例１のキット１Ａを用い、試料として参考例１の（１）で調製した各リポ蛋白分画を用い、以下の手順により、各リポ蛋白分画中のコレステロールの反応率を決定した。また、ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして実施例１のキット１Ａ及びメタボリードＬＤＬ－Ｃを用い、試料として後述の（４）で調製したヒト血清２０本を用い、以下の手順により、実施例１のキット１Ａを用いた測定方法及びメタボリードＬＤＬ－Ｃを用いた測定方法の間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
（１）ＬＤＬ－Ｃ濃度決定のための検量線の作成
　ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして実施例１のキット１Ａを用い、試料としてＬＤＬ－Ｃ濃度が決定されているＬＤＬ－Ｃ標準品を用い、以下の手順より、ＬＤＬ－Ｃ標準品に対する吸光度を測定した。反応セルへ、当該標準品（２．５μＬ）と実施例１のキット１Ａの第１試薬（１５０μＬ）とを添加し、３７℃で５分間反応させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。次いで、この反応液に実施例１のキット１Ａの第２試薬（５０μＬ）を添加し、さらに３７℃で５分間反応させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差ΔＥ標準品を算出した。
　当該標準品の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により、吸光度差ΔＥブランクを算出した。
　当該標準品に対する吸光度差ΔＥ標準品と、生理食塩水に対する吸光度差ΔＥブランクとから、ＬＤＬ－Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
（２）各リポ蛋白分画におけるコレステロール濃度の決定
　実施例１のキット１Ａを用い、試料として参考例１の（１）で調製した各リポ蛋白分画を用い、（１）と同様の手順により、各リポ蛋白分画中のコレステロールに対する吸光度差を算出した。算出した吸光度差と（１）の検量線とから、各リポ蛋白分画におけるコレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）を決定した。
（３）各リポ蛋白分画中のコレステロールの反応率の決定
　参考例１の（３）で決定した各リポ蛋白分画におけるコレステロール濃度と、上記（２）で決定した各リポ蛋白分画におけるコレステロール濃度とから、以下の式（Ｉ）により、実施例１のキット１Ａにおける各リポ蛋白分画中のコレステロールの反応率を決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　決定した各リポ蛋白分画中のコレステロールの反応率について、０％～１０％未満を“－”、１０％以上～２０％未満を“±”、２０％以上～４０％未満を“＋”及び４０％以上を“＋＋”として表し、その結果を第１表に示す。
（４）ヒト血清におけるＬＤＬ－Ｃ濃度の決定
　協和メデックス株式会社所属の健常人より採取した全血を、３，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分間遠心分離し、ヒト血清２０検体を調製した。次いで、ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして実施例１のキット１Ａ及びメタボリードＬＤＬ－Ｃを用い、試料として当該ヒト血清２０検体を用い、（１）と同様の手順により、各ヒト血清に対する吸光度差を算出した。算出した吸光度差と（１）の検量線とから、各ヒト血清におけるＬＤＬ－Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を決定した。
（５）本発明の測定キットを用いた測定方法及びメタボリードＬＤＬ－Ｃを用いた測定方法の間の相関係数の決定
　ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして実施例１のキット１Ａを用いて（４）で決定した各ヒト血清におけるＬＤＬ－Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）と、ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとしてメタボリードＬＤＬ－Ｃを用いて（４）で決定した各ヒト血清におけるＬＤＬ－Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）とから、実施例１のキット１Ａを用いた測定方法及びメタボリードＬＤＬ－Ｃを用いた測定方法の間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果を第１表に示す。
［実施例３］
　実施例１のキット１Ａの代わりに実施例１のキット１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅの各キットをＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして用いる以外は、実施例２と同様の手順により、当該各キットの各リポ蛋白分画中のコレステロールへの反応率及び当該各キットを用いた測定方法とメタボリードＬＤＬ－Ｃを用いた測定方法の間の相関係数を決定した。その結果を第１表に示す。
［比較例２］
　実施例１のキット１Ａの代わりに比較例１のキット１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ及び１ｅの各キットをＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして用いる以外は、実施例２と同様の手順により、当該各キットにおける各リポ蛋白分画中のコレステロールの反応率及び当該各キットを用いた測定方法とメタボリードＬＤＬ－Ｃを用いた測定方法の間の相関係数を決定した。その結果を第１表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　参考例１の（１）に記載のとおり、測定に用いた各リポ蛋白分画は、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬを超遠心法によりそれぞれ分離して調製したものである。よって、ＶＬＤＬ分画中のコレステロール及びＨＤＬ分画のコレステロールの反応率が低く、かつ、ＬＤＬ分画中のコレステロールの反応率が高いＬＤＬ－Ｃ測定キットほど、検体中のＬＤＬ－Ｃを正確に測定できることを意味する。第１表から明らかなとおり、実施例１のキット１Ａ～１Ｅの各キットを用いる測定においては、比較例１のキット１ａ～１ｅの各キットを用いる測定と比較して、ＶＬＤＬ分画及びＨＤＬ分画の反応率が低く、かつＬＤＬ分画の反応率が高いことが判明した。したがって、ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤及びＰＯＥＰＯＰ縮合物を含む、本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを用いる本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法により、検体中のＬＤＬ－Ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
　また、第１表から明らかなとおり、実施例１のキット１Ａ～１Ｅの各キットを用いた測定方法とメタボリードＬＤＬ－Ｃを用いた測定方法との間の相関係数が０．９５以上となり、両測定間に良好な相関関係が認められた。一方、比較例１のキット１ａ～１ｅの各キットを用いた測定方法とメタボリードＬＤＬ－Ｃを用いた測定方法との間においては、良好な相関関係が認められなかった。したがって、ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤及びＰＯＥＰＯＰ縮合物を含む、本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを用いる本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法により、検体中のＬＤＬ－Ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
［実施例４］
　協和メデックス株式会社所属の健常人より採取した全血を、３，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分間遠心分離し、ヒト血清５検体を調製した。次いで、ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして実施例１のキット１Ｅ及びメタボリードＬＤＬ－Ｃを用い、試料として当該ヒト血清５検体を用い、実施例２の（１）及び（２）と同様の手順により、各ヒト血清におけるＬＤＬ－Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を決定した。その結果を第２表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　第２表から明らかなとおり、ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして実施例１のキット１Ｅを用いる測定において決定したＬＤＬ－Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）は、ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとしてメタボリードＬＤＬ－Ｃを用いる測定により決定したＬＤＬ－Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）とほぼ同じであった。したがって、ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤及びＰＯＥＰＯＰ縮合物を含む、本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを用いる本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法により、検体中のＬＤＬ－Ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
［実施例５］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＬＤＬ－Ｃ測定用キット（キット２Ａ～２Ｄ）を調製した。
第１試薬
　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＥＭＳＥ　　　　　　　　　　　　　　０．３ｇ／Ｌ
　アスコルビン酸オキシダーゼ　　　　　４ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　４－ＡＡ　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム　　　　　　　　　　　０．１ｇ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　　　　　　　０．０２ｇ／Ｌ
　ＬＰＬ－３１１　　　　　　　　　　　３ｋＵ／Ｌ
　ＣＨＯ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　２０ｋＵ／Ｌ
　プルロニックＬ－１２１　　　　　　　７ｇ／Ｌ
　ワンダサーフＳ－１４００　　　　　　４ｇ／Ｌ
　ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体Ａ～Ｄ（第３表参照）
［比較例３］
　以下の第１試薬及び第２試薬からなるＬＤＬ－Ｃ測定用キット２ａを調製した。
第１試薬
　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＥＭＳＥ　　　　　　　　　　　　　　０．３ｇ／Ｌ
　アスコルビン酸オキシダーゼ　　　　　４ｋＵ／Ｌ
第２試薬
　ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　４－ＡＡ　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム　　　　　　　　　　　０．１ｇ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム　　　　　　　０．０２ｇ／Ｌ
　ＬＰＬ－３１１　　　　　　　　　　　３ｋＵ／Ｌ
　ＣＨＯ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　２０ｋＵ／Ｌ
　プルロニックＬ－１２１　　　　　　　７ｇ／Ｌ
　ワンダサーフＳ－１４００　　　　　　４ｇ／Ｌ
　ＰＥＧ＃２０００　　　　　　　　　　３．６ｇ／Ｌ
　比較例３のＬＤＬ－Ｃ測定用キット２ａは、第２試薬中のポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体の代わりにＰＥＧ＃２０００を用いる以外は、実施例５のＬＤＬ－Ｃ測定用キット（キット２Ａ～２Ｄ）と同じである。
［実施例６］
　ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして実施例５のキット２Ａを用い、試料としてイントラリポスを血清に添加して調製したイントラリポス添加血清、及び生理食塩水を血清に添加して調製した生理食塩水添加血清を用い、以下の手順により、イントラリポス添加血清中のＬＤＬ－Ｃ濃度及び生理食塩水添加血清中のＬＤＬ－Ｃ濃度を決定し、イントラリポスの影響を評価した。
（１）イントラリポス添加血清及び生理食塩水添加血清の調製
　ヒト血清とイントラリポス輸液１０％とを、９：１の比率で混合し、イントラリポス添加血清を調製した。同様に、ヒト血清と生理食塩水とを、９：１の比率で混合し、生理食塩水添加血清を調製した。
（２）イントラリポス添加血清中及び生理食塩水添加血清中のＬＤＬ－Ｃ濃度の決定
　ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして実施例５のキット２Ａを用い、検体として（１）で調製したイントラリポス添加血清及び生理食塩水添加血清を用い、実施例２の（１）及び（２）と同様の手順により、当該血清中のＬＤＬ－Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）を決定した。
（３）ＬＤＬ－Ｃ測定におけるイントラリポスの影響の評価
　ＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして実施例５のキット２Ａを用いて（２）で決定したイントラリポス添加血清中のＬＤＬ－Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）と、生理食塩水添加血清におけるＬＤＬ－Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）とから、以下の式（ＩＩ）により、実施例５のキット２Ａを用いるＬＤＬ－Ｃ測定におけるイントラリポスの影響を評価した。その結果を第３表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
［実施例７］
　実施例５のキット２Ａの代わりに実施例５のキット２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ及び１Ｅの各キットをＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして用いる以外は、実施例６と同様の手順により、当該各キットを用いるＬＤＬ－Ｃ測定におけるイントラリポスの影響を評価した。その結果を第３表に示す。
［比較例４］
　実施例５のキット２Ａの代わりに比較例３のキット２ａをＬＤＬ－Ｃ測定用キットとして用いる以外は、実施例６と同様の手順により、当該各キットを用いるＬＤＬ－Ｃ測定におけるイントラリポスの影響を評価した。その結果を第３表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　イントラリポスは大豆油によるトリグリセライドを主成分とする脂肪乳剤であり、臨床検査用試薬における検体中の脂質の濁りによる影響の評価にしばしば用いられる。ここで、イントラリポス添加血清中のＬＤＬ－Ｃ濃度の、生理食塩水添加血清中のＬＤＬ－Ｃ濃度に対する割合が１００％に近いほど、イントラリポスの影響を受けることなく、正確なＬＤＬ－Ｃの測定が可能となることを意味する。
　第３表から明らかなとおり、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体を含まないキット１Ｅ、及び、ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体の代わりにポリオキシエチレングリコールを含む比較例３のキット２ａと比較して、ポリオキシエチエンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体を含む、実施例５のキット２Ａ～２Ｄの各キットにおける、イントラリポス添加血清中のＬＤＬ－Ｃ濃度の、生理食塩水添加血清中のＬＤＬ－Ｃ濃度に対する割合はいずれも７０％以上と高かった。したがって、ＰＯＥアルキルエーテル及びＰＯＥＰＯＰアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤、ＰＯＥＰＯＰ縮合物、及び、分子内にポリオキシエチレンを含まないポリオキシプロピレン誘導体を含む、本発明のＬＤＬ－Ｃ測定用キットを用いる本発明のＬＤＬ－Ｃの測定方法により、脂質による濁りの影響を受けることなく、検体中のＬＤＬ－Ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
　本発明により、メタボリックシンドロームや動脈硬化等の診断に有用なＬＤＬ－Ｃの測定方法、測定用試薬及び測定用キットが提供される。

Claims (24)

  1. 　検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
    ［a］ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；並びに、
    ［b］ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物
    を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しない水性媒体中で反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
  2. 　［a］ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルにおけるアルキルが、炭素数８～２０のアルキルである、請求項１記載の方法。
  3. 　水性媒体が、さらに、［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体を含有する、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体が、ポリプロピレングリコール又はポリオキシプロピレングリセリルエーテルである、請求項３記載の方法。
  5. 　生成する物質が、過酸化水素である請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　過酸化水素の測定が、過酸化水素測定用試薬を用いて行われる請求項５記載の方法。
  7. 　生成する物質が、還元型補酵素である請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  8. 　還元型補酵素の測定が、還元型補酵素測定用試薬を用いて行われる請求項７記載の方法。
  9. ［a］ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
    ［b］ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物；並びに、
    コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しないことを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
  10. 　さらに、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素と検体との反応で生成する物質を測定するための試薬を含有する、請求項９記載の試薬。
  11. 　コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素と検体との反応で生成する物質が、過酸化水素である、請求項１０記載の試薬。
  12. ［a］ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
    ［b］ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物；並びに、
    コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を含有しないことを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
  13. 　さらに、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素と検体との反応で生成する物質を測定するための試薬を含有する、請求項１２記載の試薬。
  14. 　コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素と検体との反応で生成する物質が、還元型補酵素である、請求項１３記載の試薬。
  15. 　［a］ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルにおけるアルキルが、炭素数８～２０のアルキルである、請求項９～１４のいずれかに記載の試薬。
  16. 　さらに、［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体を含有する、請求項９～１５のいずれかに記載の試薬。
  17. 　［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体が、ポリプロピレングリコール又はポリオキシプロピレングリセリルエーテルである、請求項１６記載の試薬。
  18. 　過酸化水素測定用試薬を含む第一試薬、及び、コレステロール酸化酵素を含む第二試薬を含有し、
    ［a］ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
    ［b］ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物；並びに、
    コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を第一試薬、第二試薬のいずれの試薬にも含有しないことを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
  19. 　さらに、過酸化水素測定用試薬を第二試薬に含有する請求項１８記載のキット。
  20. 　酸化型補酵素を含む第一試薬、及び、コレステロール脱水素酵素を含む第二試薬を含有し、
    ［a］ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルからなる群より選ばれる１つ以上の界面活性剤；
    ［b］ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物；並びに、
    コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、アルキルフェノール構造を有する界面活性剤を第一試薬、第二試薬のいずれの試薬にも含有しないことを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
  21. 　さらに、還元型補酵素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、請求項２０記載のキット。
  22. 　［a］ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルにおけるアルキルが、炭素数８～２０のアルキルである、請求項１８～２１のいずれかに記載のキット。
  23. 　さらに、［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する、請求項１８～２２のいずれかに記載のキット。
  24. 　［c］ポリオキシエチレンを分子内に含まないポリオキシプロピレン誘導体が、ポリプロピレングリコール又はポリオキシプロピレングリセリルエーテルである、請求項２３記載のキット。
     
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