JP2005137229A - 低密度リポ蛋白中コレステロール測定方法およびその試薬 - Google Patents
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Landscapes
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
【解決手段】 酵素反応による低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法において、第一反応で、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を含む反応液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で、第一反応における上記両酵素の低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を、反応液中に加えることを特徴とする方法。
Description
(1)試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、第一反応で化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を添加し、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を加えることを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(2)化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である(1)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(3)コール酸誘導体が、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミド、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩より選択される1種または複数である(2)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(4)コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、0.01〜0.2%である(2)、(3)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(5)第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される1種または複数である(1)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(6)第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン(2モル)ポリオキシエチレンデシルエーテルである(5)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(7)少なくとも第一反応中に2価金属イオンを含有する(1)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(8)2価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである(7)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(9)ポリアニオンを含有しない(1)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(10)ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である(9)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
(11)試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、第一反応で化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を添加し、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を加えることを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(12)化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である(11)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(13)コール酸誘導体が、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミド、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩より選択される1種または複数である(12)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(14)コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、0.01〜0.2%である(12)、(13)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(15)第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される1種または複数である(11)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(16)第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン(2モル)ポリオキシエチレンデシルエーテルである(11)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(17)少なくとも第一反応中に2価金属イオンを含有する(11)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(18)2価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである(17)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(19)ポリアニオンを含有しない(11)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
(20)ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である(19)の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
本発明においては、HDL、VLDL、CM中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がLDL−Cに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のHDL、VLDL、CM中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
酵素の使用量下限は、第一試薬中で通常0.5U/mL、好ましくは1U/mLである。使用量上限は、10U/mL、好ましくは5U/mLである。
本発明においては、HDL、VLDL、CM中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がLDL−Cに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のHDL、VLDL、CM中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
酵素の使用量下限は、第一試薬中で通常0.01U/mL、好ましくは0.05U/mLである。使用量上限は、10U/mL、好ましくは5U/mLである。
このような物質として例えばコール酸誘導体がある。コール酸誘導体としては、特に限定されないが、好ましくは3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミド、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩が適切であるが、少ない添加量でLDL−Cに対する反応性を低下させ得ることから、更に好ましくはN−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミド、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミドおよびその塩が良い。また、これらのコール酸誘導体より選択される1種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。これらの使用量としてはコール酸誘導体の総量として第一試薬中で通常0.001〜5%の範囲で用いられ得るが、好ましくは限界ミセル濃度(c.m.c)付近かそれ以下で使用するのがよい。これは、これらコール酸誘導体の本来ある界面活性剤としての作用が反って本発明の期待するコレステロールエステラーゼおよび/またはコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応阻害効果を弱めることに起因する。
限界ミセル濃度の測定は電気伝導度、浸透圧、氷点降下、蒸気圧、粘度、密度、可溶化能、洗浄力、光散乱、色素の変化などの物理性質の急変点を測定することで測定が可能である。例えば、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸の限界ミセル濃度は、0.50%(w/v)であり、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸は0.51%(w/v)であり、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)コラミドは0.26%(w/v)であり、N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミドは0.12%(w/v)であることが知られている。したがって、これらの好ましい使用量としては0.01〜0.6%である。また、その他のコール酸誘導体についても同じく限界ミセル濃度を知ることで使用量の最適化が可能である。
これらの使用量としては、反応終濃度として0〜1%(w/v)、好ましくは0〜0.5%(w/v)である。
(実施例1)
下記組成1〜3のLDL−C測定試薬を調製し下記測定条件で、試料としてヒト血清より精製したHDL、LDL、VLDL、CMを測定し、各測定値より各々のリポ蛋白中のコレステロール濃度を100%ととして相対%を求めた。また、比較例として下記組成4〜6のLDL−C測定試薬を調製し実施例と同様の検討を行なった。尚、精製リポ蛋白画分の調製はHatch and Leesの方法の、3種の密度液を用い超遠心分離にて分離・分取した。
下記組成1〜3のLDL−C測定試薬をそれぞれ調製した。
組成1
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミド(同仁化学社製) 0.05%
化学修飾コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−313) 0.5U/mL
未修飾コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテル(エマレックスDAPE0207:日本エマルジョン社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸(同仁化学社製) 0.2%
化学修飾コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−313) 0.5U/mL
未修飾コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテル(エマレックスDAPE0207:日本エマルジョン社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミド(同仁化学社製) 0.05%
化学修飾コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−313) 0.5U/mL
未修飾コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類(エマルゲンB66;花王社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミド(同仁化学社製) 0.05%
未修飾コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−311) 0.5U/mL
未修飾コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテル(エマレックスDAPE0207:日本エマルジョン社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
化学修飾コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−313) 0.5U/mL
未修飾コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシプロピレン(2)ポリオキシエチレンデシルエーテル(エマレックスDAPE0207:日本エマルジョン社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
N,N−ビス(3−D−グルコンアミドプロピル)デオキシコラミド(同仁化学社製) 0.05%
化学修飾コレステロールエステラーゼ(東洋紡社製COE−313) 0.5U/mL
未修飾コレステロールオキシダーゼ(東洋紡社製COO−321) 3U/mL
カタラーゼ(ロッシュ社製 微生物由来) 100U/mL
4−アミノアンチピリン 0.1g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 0.2mmol/L
塩化マグネシウム 10mmol/L
塩化カルシウム 0.1mmol/L
ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(和光純薬社製) 0.3%
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 8U/mL
N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(同仁化学社製) 0.4g/L
日立7170形自動分析機を用いた。試料2.4μLに第一試薬 180μL添加し37℃にて5分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を90μL添加し5分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる2ポイントエンド法で600nm主波長、800nm副波長で吸光度を測定した。LDL−C濃度未知試料のLDL−C濃度の算出は、精製水および110mg/dL LDL−C標準血清の測定吸光度より算出して求めた。
実施例1に示す組成1〜3のLDL−C測定試薬にて実施例1に示す測定条件で、試料として健常人血清20検体を測定した。また、比較例として下記組成4〜6のLDL−C測定試薬を調製し実施例と同様の測定を行なった。各試薬における測定値は、当該検体の総コレステロール値(東洋紡社製 コレスカラー・リキッド使用)、HDL−C値(第一化学社製 分画剤試液により分画した試料を東洋紡社製 コレスカラー・リキッドで測定)及び中性脂肪値(東洋紡社製 リピドス・リキッド)を測定し、フリーデワルド(Friedewald)の計算式を用いて算出したLDL−C値を対照として相対%を求めた。
表2に測定値を示し、表3に対照の測定値に対する相対%を示す。各組成の相対%は、実施例の組成1で95.7〜106.5%、組成2で93.1〜108.9%、組成3で92.5〜105.6%と良好であった。一方、比較例では、組成4で−58.8〜105.3%、組成5で79.8〜104.9%、組成6では87.3〜114.9%と特異性または精密性に問題があった。
Claims (6)
- 試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する手段において、第一反応で、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を含む反応液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で、第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を、反応液中に加えることを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
- 化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である請求項1項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
- 第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される1種または複数である請求項1項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
- 少なくとも第一反応中に2価金属イオンを含有する請求項1項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
- ポリアニオンを含有しない請求項1項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
- 試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、第一反応で化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を添加し、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を加えることを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
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