JP2009072105A - コレステロール測定試薬、酵素含有試薬、酵素安定化剤、および酵素安定化方法。 - Google Patents

Abstract

【課題】保存安定性の高いコレステロール測定試薬、酵素含有試薬、酵素安定化剤、および酵素を安定化させる方法を提供すること。
【解決手段】コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）およびコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）からなる群より選択される少なくとも一つと、酵素安定化剤（疎水性部分として分子内にステロールまたはスタノールを有する非イオン性界面活性剤）とを含むコレステロール測定試薬、ＣＤＨおよび／またはＣＥと酵素安定化剤とを含む酵素含有試薬、ＣＤＨおよび／またはＣＥによる酵素反応に使用することを特徴とする酵素安定化剤、およびＣＤＨおよび／またはＣＥと酵素安定化剤とを共存させることにより酵素を安定化する方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、酵素を安定化させる作用を有する酵素安定化剤、この安定化剤を含むコレステロール測定試薬、酵素含有試薬、およびこの安定化剤を用いて酵素を安定化させる方法に関する。

コレステロール脱水素酵素（以下、ＣＤＨとする）やコレステロールエステラーゼ（以下、ＣＥとする）は、ＣＤＨやＣＥに関する研究に用いられる試薬（研究用試薬）やこれらの酵素反応を利用する臨床検査用試薬などに広く用いられている。
ＣＤＨやＣＥを含有する試薬の例としては、たとえばコレステロールを測定するための臨床検査用試薬が挙げられる。臨床検査において生体試料中のコレステロール測定は重要な検査項目であり、病院の検査室等では、高密度リポタンパク質中コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、低密度リポタンパク質中コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）、遊離型コレステロール（Ｆ−Ｃｈｏ）、レムナント様リポタンパクコレステロール（ＲＬＰ−Ｃ）等の検査が日常的に行われている。また、近年、尿に含まれるコレステロールが腎疾患の指標となり得ることが報告され、尿中コレステロールなどの微量のコレステロール（マイクロコレステロール：ｍＣＨＯ）を測定するための試薬の開発が盛んとなってきている。

しかし、液状試薬中ではＣＤＨは非常に不安定で、試薬の保存中にＣＤＨが劣化し、酵素活性が低下する。ＣＥはＣＤＨよりは安定ではあるが、やはり保存中に活性が低下する。これらの酵素を安定化しなければ、試薬自体の保存安定性を向上させるのは困難である。そのため、試薬中に酵素を安定化する作用のある物質（酵素安定化剤）を含有させ、試薬の保存安定性を向上させることが行われる。たとえば、特許文献１では、ＣＤＨを含む試薬にＣＤＨ安定化剤としてグリシン系化合物を含有させ、ＣＤＨを安定化させている。

特開２００５−１７６８３４

本発明は、従来知られている物質とは異なる物質を酵素安定化剤として用いることにより、保存安定性の高いコレステロール測定試薬および酵素含有試薬を提供することを目的とする。また、この安定化剤を用いたＣＤＨあるいはＣＥの安定化方法を提供することもまた本発明の目的である。

本発明は、ＣＤＨおよびＣＥからなる群より選択される少なくとも一つと、疎水性部分として分子内にステロールまたはスタノールを有する非イオン性界面活性剤とを含むコレステロール測定試薬を提供する。

また、本発明は、ＣＤＨおよび／またはＣＥと、疎水性部分として分子内にステロールまたはスタノールを有する非イオン性界面活性剤とを含む酵素含有試薬をも提供する。

また、本発明は、ＣＤＨまたはＣＥによる酵素反応に使用することを特徴とする、分子内にステロールまたはスタノールを有する非イオン性界面活性剤を有効成分とする酵素安定化剤をも提供する。

また、本発明は、ＣＤＨおよび／またはＣＥと、これらの酵素の安定化剤である、疎水性部分としてステロールまたはスタノールを有する非イオン性界面活性剤とを共存させることにより、これらの酵素を安定化させる方法をも提供する。

本発明によると、保存安定性の高いコレステロール測定試薬および酵素含有試薬を提供することができる。また、試薬中でＣＤＨやＣＥを安定化する方法も提供することができる。

本実施形態の酵素含有試薬は、ＣＤＨおよび／またはＣＥと非イオン性界面活性剤とを含有する。非イオン性界面活性剤は、疎水性部分として分子内にステロールまたはスタノールを有し、これらの酵素を安定化させる効果を有する。ステロールは３個の六員環と１個の五員環からなる不飽和脂肪族環を含み、スタノールは３個の六員環と１個の五員環からなる飽和脂肪族環を含む。また、この界面活性剤は、親水性部分としてポリオキシエチレンを有することが好ましい。

ステロールとしては、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、エルゴステロール、フコステロール、ブラシカステロール、フンギステロール等の植物由来のステロール類（フィトステロール）が例示される。また、スタノールとしては、シトスタノール、スチグマスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、フコスタノール、ブラシカスタノール、フンギスタノール等の植物由来のスタノール類（フィトスタノール類）、コレスタノール等の動物由来のスタノール類が例示される。

ステロールまたはスタノールを有するポリオキシエチレン系界面活性剤の具体例としては、下記構造式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の化合物などが挙げられる。

上記式においてｎは２以上の整数であるが、上限は特に限定されない。ポリオキシエチレンは界面活性剤の親水性部分であるため、ｎが大きくなるほどＨＬＢ値（Hydrophile-Lipophile Balance値：界面活性剤の親水性と疎水性の比率を示す値）が上昇する。酵素を含有する試薬が特定の物質の測定等に用いられる場合は、その測定に影響を与えない程度のＨＬＢ値となるようｎの値が選択される。また、ｎが小さくなるほど水溶性が低下するため、ｎは２０以上が好ましい。

上記のような界面活性剤のうち、たとえば、ポリオキシエチレン（５）フィトステロール、ポリオキシエチレン（１０）フィトステロール、ポリオキシエチレン（２０）フィトステロール（ＢＰＳ−２０）、ポリオキシエチレン（３０）フィトステロール（ＢＰＳ−３０）、ポリオキシエチレン（２５）フィトスタノール（ＢＰＳＨ−２５）、ポリオキシエチレン（３０）コレスタノール（ＤＨＣ−３０）等は日光ケミカルズ（株）から購入することができる。

試薬に含まれるＣＤＨやＣＥは、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとする）等を結合させて化学修飾した酵素、あるいは化学修飾していない酵素のいずれを用いてもよい。ＣＤＨの由来は、動物由来、植物由来、真菌由来、原生生物由来、細菌由来のものなど、特に限定されない。また、遺伝子組み換え技術を用いて生成されたものであってもよい。

上述した非イオン性界面活性剤は、単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また、試薬には、非イオン性界面活性剤のほかに、ＣＤＨおよび／またはＣＥを安定化させる作用を有する別の物質をさらに含有させてもよい。このような物質としては、たとえば、グリシン系化合物、コール酸、配糖体、アデノシン一リン酸（以下、ＡＭＰとする）、クリスタリン、キレート剤、これらの誘導体などが挙げられる。

グリシン系化合物は、下記の化学式（ＶＩＩＩ）で示される。

（式中、Ｒ’は水素、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基または置換基を有してもよいカルボニル基を示し、ｎは０〜２を示す）

アルキル基としてはメチル基、エチル基などをあげることができ、フェニル基としてはヒドロキシフェニル基などを挙げることができる。また、置換基としてはヒドロキシメチル基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、ニトロ基、メトキシ基、チオール基などをあげることができる。グリシン系化合物の具体例としては、グリシン、グリシルグリシン、トリシンなどが挙げられる。グリシン系化合物は、ｐＨの緩衝作用も有しているため、緩衝剤としても用いることができる。

コール酸またはその誘導体としては例えばコール酸の塩類（たとえば、ナトリウム塩など）、デオキコール酸又はその塩類（例えば、ナトリウム塩など）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳＯ 、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド（デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ)等が例示することができる。また、配糖体またはその誘導体としては、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ドデシルマルトシド：以下、ＤＭとする）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミドおよびｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド等を例示することができる。さらに、アデノシン一リン酸またはその誘導体としては、例えばアデノシン一リン酸またはその塩（ ナトリウム塩、カリウム塩など）等を例示することができる。また、クリスタリンまたはその誘導体としては、例えばα−クリスタリン、β−クリスタリン、γ−クリスタリン、δ−クリスタリン等を例示することができる。また、キレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ハイドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、ハイドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ニトリロトリスメチレンホスホン酸（ＮＴＰＯ）、ビス（アミノフェニル）エチレングリコール四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）等を例示することができる。

この試薬は、臨床検査用試薬や研究用試薬として用いられる。この試薬は、水や緩衝液等の水性溶媒に酵素および安定化剤を添加して調製することができる。
研究用試薬は、たとえばＣＤＨやＣＥの酵素活性の研究やＣＤＨやＣＥを含む臨床検査用試薬の開発等、ＣＤＨやＣＥに関連する研究開発を行う際に提供される試薬である。
臨床検査用試薬の例としては、生体から採取した試料（生体試料）に含まれるコレステロールを測定するための臨床検査用試薬が挙げられる。生体試料としては、血液、血漿、血清、尿、髄液、唾液、精液などが例示される。測定対象となるコレステロールは、遊離型コレステロール（Ｆ−Ｃｈｏ）および／またはリポタンパク質にエステル型として存在するコレステロール（エステル型コレステロールともいう）であり、Ｔ−Ｃｈｏ、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＲＬＰ−Ｃ、ｍＣＨＯなどが挙げられる。Ｆ−Ｃｈｏとは、リポタンパク質粒子表面に結合したコレステロールであり、エステル型コレステロールは、リポタンパク質中で脂肪酸とエステル結合を形成したコレステロールのことである。

以下、ＣＤＨとコレステロールと酸化型補酵素との反応によって生じる還元型補酵素の定量に基づいて生体試料中のコレステロールを測定する方法について説明する。

Ｆ−Ｃｈｏ測定
Ｆ−Ｃｈｏ測定試薬は、水や緩衝液等の水性溶媒にＣＤＨ、ＣＤＨ安定化物質およびＣＤＨに対応する酸化型補酵素を添加して調製することができる。

コレステロールを含む試料とＦ−Ｃｈｏ測定試薬とを混合すると、下記（ＩＸ）の化学反応式に示されるように、コレステロールを基質とするＣＤＨの酵素反応により、コレステノンおよび還元型補酵素が生成する。試料中に含まれるコレステロールの物質量と、生成する還元型補酵素の物質量とは化学量論的に等しいため、還元型補酵素の濃度を測定することによってＦ−Ｃｈｏの濃度を求めることができる。

酸化型補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ＮＡＤとする）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ＮＡＤＰとする）が挙げられる。ＮＡＤとしては、たとえば、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、βＮＡＤとする）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ｔＮＡＤとする）等が挙げられる。ＮＡＤＰとしては、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、βＮＡＤＰとする）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ｔＮＡＤＰとする）等が挙げられる。

還元型補酵素の濃度は、吸光度測定により測定することができる。βＮＡＤＨやβＮＡＤＰＨは３４０ｎｍの波長の吸光度で測定することができ、ｔＮＡＤＨやｔＮＡＤＰＨは４０５ｎｍの波長の吸光度で測定することができる。

Ｆ−Ｃｈｏを測定する場合は、エステル型コレステロールは測定対象とはならないため、エステル型コレステロールのエステル結合を加水分解してリポタンパク質からコレステロールを遊離させる酵素（以下、コレステロール遊離酵素とする）は含有されない。

Ｔ−Ｃｈｏ測定
Ｔ−Ｃｈｏの測定には、ＣＤＨ、ＣＤＨ安定化剤、および酸化型補酵素に加えて、コレステロール遊離酵素を含有させたＴ−Ｃｈｏ測定試薬を用いることが好ましい。コレステロール遊離酵素としては、ＣＥ、リパーゼ、リポプロテインリパーゼ等が例示される。

コレステロール遊離酵素の作用により、エステル型コレステロールがリポタンパク質から遊離する。遊離したコレステロールは、遊離型コレステロールとともに上記式（ＩＸ）に示されるＣＤＨの酵素反応の基質となり、コレステノンに化学変化する。Ｔ−Ｃｈｏ測定試薬によると、実質的に生体試料中の全コレステロール、すなわち遊離型コレステロールおよびエステル型コレステロールの両方を測定することができる。

Ｔ−Ｃｈｏ測定試薬は、同一容器にＣＤＨ、酵素安定化剤、酸化型補酵素およびコレステロール遊離酵素が収容された一試薬系であってもよいが、第一試薬および第二試薬からなる二試薬系であってもよい。
この場合、好ましくは、ＣＤＨは第二試薬に含まれ、酸化型補酵素は第一試薬および／または第二試薬に含まれ、コレステロール遊離酵素は第一試薬に含まれ、酵素安定化剤は安定化させる酵素と同一の容器に含まれる。測定においては、第一試薬と生体試料とが混合されると、第一試薬中のコレステロール遊離酵素によってリポタンパク質中のコレステロールはリポタンパク質から遊離する。ここにさらに第二試薬が添加され、上記式（ＩＸ）に示されるようにＣＤＨの作用によって生体試料中のコレステロールを基質とする反応が起こり、Ｔ−Ｃｈｏが測定される。

ＨＤＬ−Ｃ測定
ＨＤＬ−Ｃは、Ｔ−Ｃｈｏと同様の組成の試薬（ＣＤＨ、ＣＤＨ安定化剤、酸化型補酵素およびコレステロール遊離酵素を含む試薬）を用いて、沈殿法により測定することができる。沈殿法によると、まずポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとする）等の高分子ポリマーと高密度リポタンパク質（以下、ＨＤＬとする）以外のリポタンパク質とを結合させ、これらを沈殿させる。遠心分離を行い、実質的にＨＤＬのみが残る上清（ＨＤＬ画分）を採取する。以降はＴ−Ｃｈｏ測定と同様に、ＨＤＬ画分中のＨＤＬ−Ｃがコレステロール遊離酵素により遊離され、遊離したコレステロールは上記式（ＩＸ）に示されるように、ＣＤＨの酵素反応の基質となり、ＨＤＬ−Ｃを測定することができる。

また、阻害法によりＨＤＬ−Ｃを測定することもできる。阻害法に用いられる試薬には、ＣＤＨ、ＣＤＨ安定化剤、酸化型補酵素およびコレステロール遊離酵素に加えて、さらに阻害剤が含有される。阻害剤とは、生体試料中のＨＤＬ以外のリポタンパク質と結合する性質を有し、コレステロール遊離酵素の作用を阻害する。阻害法では、試薬と試料とを混合するとＨＤＬ以外のリポタンパク質に阻害剤が結合して複合体あるいは凝集体を形成するため、コレステロール遊離酵素はＨＤＬ以外のリポタンパク質に作用せず、実質的にＨＤＬからのみコレステロールを遊離させる。遊離したコレステロールは上記式（ＩＸ）に示されるＣＤＨの酵素反応の基質となり、ＨＤＬ−Ｃを測定することができる。
この方法は遠心分離等の操作が不要であるため、沈殿法よりも簡便に測定を行うことができる。

阻害剤としては、カリクスアレン、界面活性剤、ポリアニオン、水溶性ポリマー、抗体などが挙げられる。これらの阻害剤のうち一種又は二種以上を組み合わせて用いることができる。

カリクスアレンは、フェノールを基本骨格とし、フェノールの４〜８分子をメチレン基で環状に重合させた環状オリゴマーである。
カリクスアレンは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、カリクス（４）アレン、カリクス（６）アレン、カリクス（８）アレン、硫酸カリクス（４）アレン、硫酸カリクス（６）アレン、硫酸カリクス（８）アレン、酢酸カリクス（４）アレン、酢酸カリクス（６）アレン、酢酸カリクス（８）アレン、カルボキシカリクス（４）アレン、カルボキシカリクス（６）アレン、カルボキシカリクス（８）アレン、カリクス（４）アレンアミン、カリクス（６）アレンアミン、カリクス（８）アレンアミンなどが挙げられる。上述したカリクスアレンの中でも硫酸カリクスアレンが水溶性に優れ取り扱いが容易であるため、好ましい。カリクスアレンの終濃度（試薬と生体試料とを混合した反応液中の濃度）は、好ましくは０．０５〜２０ｍＭ、より好ましくは０．１〜５ｍＭである。これらのカリクスアレンは特にＶＬＤＬおよびＬＤＬに対するコレステロール遊離酵素の反応性を抑制し、ＶＬＤＬ−ＣおよびＬＤＬ−Ｃの遊離を抑制する。

界面活性剤は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。界面活性剤の中でもＨＬＢ値が１６以上のものが好ましく、ＨＬＢ値が１７以上のものがより好ましい。具体的には、ポリオキシエチレンセチルエーテル（Ｃ１６）（ヘキサデシルエーテル）（商品名：ＢＣ−２５ＴＸ、ＢＣ−３０ＴＸ、ＢＣ−４０ＴＸ（日光ケミカルズ（株）））、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｃ１２）（ドデシルエーテル）（商品名：ＢＬ−２１、ＢＬ−２５（日光ケミカルズ（株）））、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（商品名：ＢＯ−５０（日光ケミカルズ（株）））、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル（Ｃ２２）（商品名：ＢＢ−３０（日光ケミカルズ（株）））、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：ノニオンＫ―２３０（日本油脂（株）））、ポリオキシエチレンモノラウレート（商品名：ノニオンＳ−４０（日本油脂（株）））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類（商品名：Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７２１、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９９（シグマ））などが挙げられる。

ポリアニオンは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、デキストラン硫酸、リンタングステン酸、ヘパリンなどが挙げられる。これらの阻害剤は二価カチオンと共に用いられるのが好ましい。二価カチオンとしてはマグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオンなどが挙げられる。

水溶性ポリマーは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ＰＥＧなどが挙げられる。これらの水溶性ポリマーのうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。これらの水溶性ポリマーは二価カチオンと共に用いることもできる。二価カチオンとしてはマグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオンなどが挙げられる。

抗体は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これらを混合して用いてもよい。また、抗体のフラグメント及びその誘導体を用いることもできる。本明細書における「抗体」とは、抗体のフラグメント及びその誘導体をも含む。抗体のフラグメント及びその誘導体としては、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）_２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, J. Immunol., 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなどでもよい。抗体の具体例としては、抗アポリポタンパク抗体類（例えば、抗アポリポタンパクＢ抗体、抗アポリポタンパクＣ抗体、抗アポリポタンパクＥ抗体など）、抗リポタンパク抗体類（例えば、抗βリポタンパク抗体など）などが挙げられる。

上述の阻害剤のうち、本実施形態ではＨＤＬ以外のリポタンパク質と結合して複合体を形成するカリクスアレンを用いることが好ましい。

阻害法に用いられるＨＤＬ−Ｃ測定試薬は、同一容器にＣＤＨ、酵素安定化剤、酸化型補酵素、コレステロール遊離酵素および阻害剤を収容する一試薬系であってもよいが、第一試薬および第二試薬からなる二試薬系であることが好ましい。

この場合、好ましくは、阻害剤は第一試薬に含まれ、コレステロール遊離酵素は第一試薬および／または第二試薬に含まれ、酸化型補酵素は第一試薬および／または第二試薬に含まれ、ＣＤＨは第一試薬および／または第二試薬に含まれ、酵素安定化剤は安定化させる酵素と同一容器に含まれる。

コレステロール遊離酵素、酸化型補酵素および阻害剤を含む第一試薬と、ＣＤＨおよびＣＤＨ安定化剤を含む第二試薬を用いた場合、第一試薬と生体試料が混合されると、生体試料に含まれるＨＤＬ中のコレステロールは第一試薬中のコレステロール遊離酵素によって遊離する。ＨＤＬ以外のリポタンパク質には、コレステロール遊離酵素が作用する前に阻害剤が結合しているため実質的にコレステロール遊離酵素は作用せず、コレステロールは遊離しない。ここにさらに第二試薬が添加され、上記式（ＩＸ）に示されるようにＣＤＨの作用によってＨＤＬから遊離したコレステロールを基質とする酵素反応が起こり、ＨＤＬ−Ｃの測定を行うことができる。

ＬＤＬ−Ｃ測定
ＬＤＬ−Ｃの測定は、以下のように行うことが好ましい。まず低密度リポタンパク質（以下、ＬＤＬとする）と上述の阻害剤とを結合させ、コレステロール遊離酵素およびコレステロールオキシダーゼによりＬＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールを全て反応させる。残ったＬＤＬは阻害剤が結合しているため、この阻害剤をＬＤＬから遊離させた後、ＬＤＬにコレステロール遊離酵素を作用させて実質的にＬＤＬからのみコレステロールを遊離させる。上記式（ＩＸ）に示されるように、ＬＤＬから遊離したコレステロールにＣＤＨが作用することによりＬＤＬ−Ｃの測定を行うことができる。

ＬＤＬとコレステロール遊離酵素との酵素反応は、ＨＬＢ１１〜１３の非イオン性界面活性剤の存在下で行われることが好ましい。このような界面活性剤の例としては、トリトンＸ−１００、ノニオンＨＳ２１０（日本油脂（株））等が挙げられる。

ＬＤＬ−Ｃ測定試薬は、ＣＤＨ、酵素安定化剤、酸化型補酵素、コレステロール遊離酵素、および阻害剤を含み、好ましくはＨＬＢ１１〜１３の界面活性剤を含む。ＨＬＢ１１〜１３の界面活性剤の作用により、ＬＤＬからの阻害剤の遊離が促進され、コレステロール遊離酵素がＬＤＬに作用しやすくなる。この試薬は、第一試薬および第二試薬からなる二試薬系であることが好ましい。好ましくは、ＣＤＨ、酸化型補酵素、コレステロール遊離酵素、阻害剤および酵素安定化剤は第一試薬に含まれ、ＨＬＢ１１〜１３の界面活性剤は第二試薬に含まれることが好ましい。

ＶＬＤＬ−Ｃ測定
ＶＬＤＬ−Ｃの測定には、ＶＬＤＬに優先的に作用するコレステロール遊離酵素を用いることが好ましい。その例としては、たとえばChromobacterium viscosumやPseudomonas sp.由来のコレステロールエステラーゼやリポプロテインリパーゼが挙げられる。さらに、ＶＬＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するために、上述したカリクスアレンを阻害剤として用いることが好ましい。ＶＬＤＬ測定の組成においては、カリクスアレンは特にＬＤＬへのコレステロール遊離酵素の作用を抑制し、ＬＤＬ−Ｃの遊離を抑制する。また、塩基性アミノ酸、アルブミン、あるいはこれらの誘導体を用いると、ＨＤＬへのコレステロール遊離酵素の作用を抑制し、ＨＤＬ−Ｃの遊離を抑制することができる。アルブミンとしては、その由来は特に限定されず、ウシ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン等が好ましく用いられる。塩基性アミノ酸またはその誘導体としては、アルギニン、アルギニン塩酸塩、リジン、リジン塩酸塩、ヒスチジン、ヒスチジン塩酸塩、ヒドロキシリジン、ヒドロキシリジン塩酸塩等が例示される。
コレステロール遊離酵素の作用でＶＬＤＬからコレステロールが遊離され、上記式（ＩＸ）に示されるように遊離したコレステロールにＣＤＨが作用することによりＶＬＤＬ−Ｃの測定を行うことができる。

ＶＬＤＬ−Ｃ測定試薬は、阻害剤、ＣＤＨ、酵素安定化剤、酸化型補酵素、およびコレステロール遊離酵素を含む。ＶＬＤＬ−Ｃ測定試薬は、同一容器に上記の物質を収容する一試薬系であってもよいが、第一試薬および第二試薬からなる二試薬系であってもよい。
この場合、好ましくは、阻害剤は第一試薬に含まれ、ＣＤＨは第一試薬および／または第二試薬に含まれ、酸化型補酵素は第一試薬および／または第二試薬に含まれ、コレステロール遊離酵素は第一試薬に含まれ、酵素安定化剤は安定化させる酵素と同一容器に含まれる。

ＲＬＰ−Ｃ測定
ＲＬＰ−Ｃを測定する際は、コレステロール遊離酵素のレムナント様リポタンパク質（以下、ＲＬＰとする）に対する作用を高める効果のある物質か、コレステロール遊離酵素のＲＬＰ以外のリポタンパク質に対する作用を低減させる効果のある物質を用いることができる。このような物質の例としては、ラウリルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸またはこれらの塩類が挙げられ、塩類としては、たとえばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が例示される。より具体的には、ニューレックスＲ（アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（日本油脂（株））、ポリスチレンスルホン酸カルシウム（三和ケミカル）等が例示される。

この物質の作用によってコレステロール遊離酵素は実質的にＲＬＰにのみ作用し、ＲＬＰからコレステロールを遊離させる。上記式（ＩＸ）に示されるように、ＣＤＨの作用によって遊離したコレステロールを基質とする酵素反応が起こり、ＲＬＰ−Ｃを測定することができる。

ＲＬＰ−Ｃ測定試薬は、ＣＤＨ、酵素安定化剤、酸化型補酵素、コレステロール遊離酵素、コレステロール遊離酵素のＲＬＰに対する作用を高める効果のある物質および／またはコレステロール遊離酵素のＲＬＰ以外のリポタンパク質に対する作用を低減させる効果のある物質を含む。ＲＬＰ−Ｃ測定試薬は、同一容器に上記の物質を収容する一試薬系であってもよいが、第一試薬および第二試薬からなる二試薬系であってもよい。
この場合、好ましくは、コレステロール遊離酵素のＲＬＰに対する作用を高める効果のある物質および／またはコレステロール遊離酵素のＲＬＰ以外のリポタンパク質に対する作用を低減させる効果のある物質は第一試薬に含まれ、ＣＤＨは第一試薬および／または第二試薬に含まれ、酸化型補酵素は第一試薬および／または第二試薬に含まれ、コレステロール遊離酵素は第一試薬および／または第二試薬に含まれ、酵素安定化剤は安定化させる酵素と同一容器に含まれる。

上記式（ＩＸ）に示されるように、コレステロールはＣＤＨの作用によってコレステノンに化学変化する。しかし、上記式（ＩＸ）の反応は可逆反応であり、上記式（ＩＸ）の化学反応の進行と平行してコレステノンからコレステロールへの化学反応も起こるため、コレステノンの生成がある程度まで進むと反応が平衡状態に達する。測定対象となるコレステロールの全てを正確に測定するためには、コレステノンからコレステロールが生成する「逆反応」を抑制することが好ましい。この逆反応を抑制するために、上記式（ＩＸ）の反応をＣＤＨの至適ｐＨであるｐＨ９．０付近で行い、反応の進行を促すことができる。また、コレステノンのケトン基をブロックする化合物（見かけ上、コレステロールからコレステノンへの化学変化が促進されるため、以下反応促進剤とする）の存在下で上記式（ＩＸ）の反応を行うことにより、逆反応を抑制することができ、実質的に全てのコレステロールがコレステノンに化学変化する。

反応促進剤としては、コレステノンのケトン基をブロックできるものであれば特に限定されないが、抱水ヒドラジン、その塩およびその誘導体が特に好ましく用いられる。具体的には、ヒドラジン、二塩化ヒドラジニウム、硫酸ヒドラジニウム、塩化フェニルヒドラジニウム、フェニルヒドラジン−Ｐ−スルホン酸、硫酸フェニルヒドラジニウム、ヒドラジンピリジンなどが挙げられる。
コレステロール測定試薬が二試薬系である場合は、反応促進剤は第二試薬に含まれることが好ましいが、第一試薬に含まれていてもよく、両方の試薬に含まれていてもよい。

ｍＣＨＯ測定
ｍＣＨＯを測定する場合、特開平８−７０８９４に記載されているように、下記化学反応式（Ｘ）の反応を利用することができる。

この反応によると、二種類の補酵素（補酵素ＡおよびＢ）を用いることにより、微量のコレステロールでも高感度に測定を行うことができる。
コレステロールを含む試料、ＣＤＨ、酸化型補酵素Ａ、および還元型補酵素Ｂを混合すると、まずコレステロールおよび酸化型補酵素ＡがＣＤＨによりコレステノンおよび還元型補酵素Ａとなる。生成したコレステノンおよび還元型補酵素Ｂは、ＣＤＨによりコレステロールおよび酸化型補酵素Ｂとなる。このコレステロールはＣＤＨにより再びコレステノンとなる。このように、理論的には酸化型補酵素Ａおよび還元型補酵素Ｂが存在する限り、コレステロールからコレステノンへの反応およびコレステノンからコレステロールへの反応が継続される。反応を十分な時間継続させると、還元型補酵素Ａおよび酸化型補酵素Ｂの分子量が増加するため、これらのうちいずれかを定量することにより、コレステロールの定量を行うことができる。式（ＩＸ）に示される反応では、コレステロール１分子に対して生成する還元型補酵素は１分子である。従って、コレステロールが微量であればあるほど測定値が検出限界を下回る可能性が高くなる。しかし、式（Ｘ）の反応によると、コレステロール１分子が何度もコレステノンへの反応に供されるため、コレステロール１分子に対して還元型補酵素Ａが多量に生成する。従って、コレステロールが微量であっても還元型補酵素Ａが検出限界を下回る可能性は低く、高感度にコレステロールを測定することができる。

補酵素Ａの具体例としては、ＮＡＤ、ｔＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ｔＮＡＤＰ等が挙げられる。補酵素Ｂの具体例としては、補酵素Ａとは異なる種類の補酵素を用いることが好ましい。たとえば、補酵素ＡがｔＮＡＤである場合は、補酵素ＢはＮＡＤを用いることができる。この場合、反応が進むに従ってｔＮＡＤＨが増加するため、４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、コレステロールの定量を行うことができる。

以上、還元型補酵素を４０５ｎｍの吸光度測定により定量し、コレステロールを測定する方法について説明した。この方法以外にも、コレステロール測定方法の一つとして公知の色素法を用いることもできる。色素法によるＴ−Ｃｈｏ、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、またはＲＬＰ−Ｃの測定においては、まず、ＣＥによりエステル型コレステロールを加水分解してコレステロールを遊離させる。このコレステロールにコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）を作用させると、過酸化水素が生成される。この過酸化水素にたとえばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）および色素源（たとえば、フェノール等）を反応させると、色素が生成して反応液が定植する。この反応液の吸光度を測定することにより、コレステロールの定量を行うことができる。

色素法によるｍＣＨＯの測定においては、特開平１１−１８７９８に記載されているように、下記化学反応式（ＸＩ）の反応を利用することができる。

コレステロールを含む試料、ＣＤＨ、還元型補酵素、およびＣＯを混合すると、まずコレステロールおよび反応液中の酸素がＣＯによりコレステノンおよび過酸化水素となる。生成したコレステノンおよび還元型補酵素は、ＣＤＨによりコレステロールおよび酸化型補酵素となる。このコレステロールはＣＯにより再びコレステノンとなる。このように、理論的には還元型補酵素および酸素が存在する限り、コレステロールからコレステノンへの反応およびコレステノンからコレステロールへの反応が継続される。反応を十分な時間継続させると、過酸化水素の分子量が増加する。この過酸化水素にたとえばＰＯＤ、４ＡＡおよび色素源を反応させると、色素が生成して反応液が呈色する。この反応液の吸光度を測定することにより、コレステロールの定量を行うことができる。式（ＸＩ）の反応によると、コレステロール１分子が何度もコレステノンへの反応に供されるため、コレステロールが微量であっても多量に過酸化水素が生成し、高感度にコレステロールを測定することができる。

色素法によるコレステロール測定に用いられる試薬には、ＣＥ、ＣＯ、ＰＯＤ、過酸化水素と反応して色素を生成する物質、および酵素安定化剤が含有される。

式（Ｘ）あるいは式（ＸＩ）の反応系にさらにＣＤＨとは異なる種類の脱水素酵素およびこの脱水素酵素の基質を添加することによって、ＣＤＨの作用で酸化された補酵素を還元型酵素に戻すことができる。これにより、試薬に含有させておく還元型補酵素の質量を低減させることも可能である。

（実施例１）
下記の成分を混合し、ｍＣＨＯ測定試薬（以下、試薬Ａ１とする）を調製した。
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５） １０ｍＭ
ＥＤＤＡ ５ｍＭ
乳酸カルシウム ０．４ｍＭ
コール酸ナトリウム ０．２％
ｔＮＡＤ ０．８５ｍＭ
クリスタリン ０．０５％
ＣＥ ０．４ＫＵ／Ｌ
ＣＤＨ ０．２ＫＵ／Ｌ

上記試薬Ａ１に下記表１に示すような濃度でＤＨＣ−３０（ポリオキシエチレン（３０）コレスタノール：日光ケミカルズ（株））を添加し、ＤＨＣ−３０濃度の異なる８種類の試薬（試薬Ａ２〜Ａ９）を調製した。
さらに、試薬Ａ１に下記表１に示すような濃度でＤＭ（ドデシルマルトシド）とＤＨＣ−３０とを添加し、４５種類の試薬を調製した（試薬Ａ１０〜Ａ５４）。
試薬Ａ１〜Ａ５４を、３７℃の恒温槽内に６日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後の試薬中のＣＤＨの活性を測定し、温度負荷前よりもどの程度活性が残存しているかを下記式の通り算出した。
（温度負荷後のＣＤＨ活性）／（温度負荷前のＣＤＨ活性）×１００＝残存活性（％）
測定結果は下記表１および図１に示される。

なお、ＣＤＨの活性測定は、試薬Ａ１〜５４をサンプルとして、サンプル６μＬに下記の組成のＣＤＨ活性測定試薬１を１８０μＬ添加し、５分後さらに試薬２を９０μＬ添加し、３４０ｎｍの波長の吸光度を測定することによって行われた。測定には、日立７１８０形自動分析装置（日立製作所）が用いられた。

試薬１
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ２０ｇ／Ｌ
コレステロール １ｇ／Ｌ
試薬２
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．５） ３６．４ｇ／Ｌ
βＮＡＤ ３ｇ／Ｌ

表１および図１に示されるとおり、温度負荷後の試薬Ａ中のＣＤＨの残存活性よりも、ＤＨＣ−３０を添加した試薬Ａ２〜Ａ５４中のＣＤＨの残存活性の方が高かった。このことより、ＣＤＨを含む試薬にＣＤＨ安定化剤としてＤＨＣ−３０を添加すると、試薬中のＣＤＨの保存安定性が向上することが分かった。また、ＤＭを併用することで、さらにＣＤＨの保存安定性を高められることが分かった。

（実施例２）
上記試薬Ａ１と同組成の試薬Ｂ１にＤＭ ５ｍＭと下記表２に示すような濃度のＢＰＳＨ−２５（ポリオキシエチレン（２５）フィトスタノール：日光ケミカルズ（株））とを添加し、ＢＰＳＨ−２５濃度の異なる８種類の試薬（試薬Ｂ２〜Ｂ９）を調製した。
また、上記試薬Ａ１と同組成の試薬Ｃ１にＤＭ ５ｍＭと下記表３に示すような濃度のＢＰＳ−３０（ポリオキシエチレン（３０）フィトステロール：日光ケミカルズ（株））を添加し、ＢＰＳ−３０濃度の異なる６種類の試薬（試薬Ｃ２〜Ｃ７）を調製した。
試薬Ｂ１〜Ｂ９およびＣ１〜Ｃ７に対して、実施例１と同様の方法により温度負荷をかけ、ＣＤＨの残存活性を測定した。測定結果は表２および図２に示される。

表２および図２に示されるとおり、温度負荷後の試薬Ｂ１中のＣＤＨの残存活性よりも、ＢＰＳＨ−２５を添加した試薬Ｂ２〜Ｂ９中のＣＤＨの残存活性の方が高かった。このことより、ＣＤＨを含む試薬にＣＤＨ安定化剤としてＢＰＳＨ−２５を添加すると、試薬中のＣＤＨの保存安定性が向上することが分かった。
また、温度負荷後の試薬Ｃ１中のＣＤＨの残存活性よりも、ＢＰＳ−３０を添加した試薬Ｃ２〜Ｃ７中のＣＤＨの残存活性の方が高かった。このことより、ＣＤＨを含む試薬にＣＤＨ安定化剤としてＢＰＳ−３０を添加すると、試薬中のＣＤＨの保存安定性が向上することが分かった。

（実施例３）
上記試薬Ａ１と同組成の試薬Ｄ１に下記表３に示すような濃度のＢＰＳＨ−２５（ポリオキシエチレン（２５）フィトスタノール：日光ケミカルズ（株））を添加し、ＢＰＳＨ−２５濃度の異なる８種類の試薬（試薬Ｄ２〜Ｄ９）を調製した。
また、上記試薬Ａ１と同組成の試薬Ｅ１に下記表３に示すような濃度のＢＰＳ−２０（ポリオキシエチレン（２０）フィトステロール：日光ケミカルズ（株））を添加し、ＢＰＳ−２０濃度の異なる８種類の試薬（試薬Ｅ２〜Ｅ９）を調製した。
また、上記試薬Ａ１と同組成の試薬Ｆ１に下記表３に示すような濃度のＤＨＣ−３０（ポリオキシエチレン（３０）コレスタノール：日光ケミカルズ（株））を添加し、ＤＨＣ−３０濃度の異なる８種類の試薬（試薬Ｆ２〜Ｆ９）を調製した。
また、上記試薬Ａ１と同組成の試薬Ｇ１に下記表３に示すような濃度のＢＰＳ−３０（ポリオキシエチレン（３０）フィトステロール：日光ケミカルズ（株））を添加し、ＢＰＳ−３０濃度の異なる８種類の試薬（試薬Ｇ２〜Ｇ９）を調製した。
これらの試薬にＤＭは添加されていない。
これらの試薬に対して、実施例１と同様の方法により温度負荷をかけ、ＣＤＨおよびＣＥの残存活性を測定した。測定結果は、表３、表４、図３および図４に示される。

なお、ＣＥの活性測定は、上記それぞれの試薬をサンプルとして、サンプル５μＬに下記の組成のＣＥ活性測定試薬１を２２５μＬ添加し、５分後さらに試薬２を２５μＬ添加し、５０５ｎｍの波長の吸光度を測定することによって行われた。測定には、日立７１７０Ｓ形自動分析装置（日立製作所）が用いられた。

試薬１
リン酸水素二ナトリウム（ｐＨ６．８） ５．６ｇ／Ｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ３．４ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．４ｇ／Ｌ
ＰＯＤ １１ＫＵ／Ｌ
５％フェノール ４．５ｍＬ／Ｌ
ＣＯ ２．３ｋＵ／Ｌ
試薬２
リノール酸コレステリル ２ｇ／Ｌ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ４０ｇ／Ｌ

表３および図３に示されるとおり、ＢＰＳＨ−２５、ＢＰＳ−２０、ＤＨＣ−３０、およびＢＰＳ−３０の何れ安定化剤を添加しても、安定化剤無添加の場合に比べてＣＤＨの残存活性が高くなった。このことより、ＣＤＨを含む試薬にこれらのＣＤＨ安定化剤を添加すると、試薬中のＣＤＨの保存安定性が向上することが分かった。

表４および図４に示されるとおり、ＢＰＳＨ−２５、ＢＰＳ−２０、ＤＨＣ−３０、およびＢＰＳ−３０の何れ安定化剤を添加しても、安定化剤無添加の場合に比べて概ねＣＥの残存活性が高くなった。このことより、ＣＥを含む試薬にこれらのＣＥ安定化剤を添加すると、試薬中のＣＥの保存安定性が向上することが分かった。

以上より、上述したような非イオン性界面活性剤をＣＤＨやＣＥを含む酵素含有試薬に含有させることによってこれらの酵素を安定化させることができ、試薬としての保存安定性を向上させることができる。

実施例１の測定結果を示すグラフである。 実施例２の測定結果を示すグラフである。 実施例３のＣＤＨの残存活性の測定結果を示すグラフである。 実施例４のＣＥの残存活性の測定結果を示すグラフである。

Claims (12)

1. 生体試料中のコレステロールを測定するための試薬であって、
   コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）およびコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）からなる群より選択される少なくとも一つと、
   疎水性部分として分子内にステロールまたはスタノールを有する非イオン性界面活性剤と、
   を含むコレステロール測定試薬。
2. コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）と、疎水性部分として分子内にステロールまたはスタノールを有する非イオン性界面活性剤とを含む、酵素含有試薬。
3. コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）と、疎水性部分として分子内にステロールまたはスタノールを有する非イオン性界面活性剤とを含む、酵素含有試薬。
4. 前記界面活性剤が親水性部分として分子内にポリオキシエチレンを有する、請求項１〜３のいずれかに記載の試薬。
5. 前記ステロールがフィトステロールであり、前記スタノールがフィトスタノールである、請求項１〜４のいずれかに記載の試薬。
6. 前記スタノールがコレスタノールである、請求項１〜５のいずれかに記載の試薬。
7. ＣＤＨおよびＣＥの両方を含む、請求項１記載の試薬。
8. 前記ＣＤＨに対応する酸化型補酵素をさらに含む、請求項１または７記載の試薬。
9. コレステロール脱水素酵素を用いた酵素反応に使用することを特徴とする、分子内にステロールまたはスタノールを有する非イオン性界面活性剤を有効成分とする酵素安定化剤。
10. コレステロールエステラーゼを用いた酵素反応に使用することを特徴とする、分子内にステロールまたはスタノールを有する非イオン性界面活性剤を有効成分とする酵素安定化剤。
11. コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）と、前記ＣＤＨの安定化剤である疎水性部分としてステロールまたはスタノールを分子内に有する非イオン性界面活性剤とを共存させることにより、前記ＣＤＨを安定化させる方法。
12. コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）と、前記ＣＥの安定化剤である疎水性部分としてステロールまたはスタノールを分子内に有する非イオン性界面活性剤とを共存させることにより、前記ＣＥを安定化させる方法。

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