ES2335658T3 - Metodo y reactivo que permite medir el colesterol en la lipo proteina de alta densidad. - Google Patents

Metodo y reactivo que permite medir el colesterol en la lipo proteina de alta densidad. Download PDF

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Abstract

Un método para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad en una muestra, que consiste en: reacción de una muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, una coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que contiene un surfactante no iónico, polianión y albúmina, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo, y medición del peróxido de hidrógeno formado o una coenzima reducida.

Description

Método y reactivo que permite medir el colesterol en la lipoproteína de alta densidad.
La presente invención se relaciona con un método para determinar cuantitativamente el colesterol en la lipoproteína de alta densidad (a continuación, abreviada como HDL) en una muestra, un reactivo para el mismo y un kit para el mismo.
Dependiendo de su densidad, las lipoproteínas en los organismos vivos se clasifican en lipoproteína de alta densidad, lipoproteína de baja densidad (a continuación, abreviada como LDL), lipoproteína de muy baja densidad (a continuación, abreviada como VLDL) y quilomicrón (a continuación, abreviada como QM). Sus funciones en el organismo vivo difieren mucho, dependiendo mayormente de la diferencia en el tipo de apoproteína, y sus composiciones lipídicas también varían. Entre ellas, la HDL se relaciona con la eliminación del colesterol acumulado en las células al recibir el colesterol de diversos tejidos, incluyendo la pared arterial, y es un factor para la prevención del riesgo de varias enfermedades arterioscleróticas, tales como la arteriosclerosis coronaria. Se sabe que el nivel de HDL en la sangre es útil para predecir la aparición de enfermedades arterioscleróticas.
El método convencional para determinar cuantitativamente el colesterol en HDL (a continuación, abreviado como HDL-colesterol) consiste en dos etapas: una etapa de fraccionación por un método de ultracentrifugación, un método inmunoquímico, un método electroforético, un método de precipitación y similares, y una etapa de determinación cuantitativa del colesterol. Sin embargo, la etapa de fraccionación es complicada y su operación lleva mucho tiempo y, más aún, existe un problema en términos de seguridad. Por lo tanto, los métodos de medición que incluyen dicha etapa de fraccionación no son adecuados para el uso práctico, ya que son demasiado ineficientes.
En los últimos años, se han descrito varios métodos de medición para resolver los problemas anteriores. Por ejemplo, se conoce un método consistente en mezclar suero o plasma en un tampón que contiene colesterol esterasa y colesterol oxidasa y una sal de ácido biliar, un derivado de ácido biliar o sulfosuccinato de dioctilo con las enzimas para que reaccione el colesterol de la VLDL y la LDL antes que el HDL-colesterol, medir el peróxido de hidrógeno formado, añadir un surfactante no iónico que tiene un grupo óxido de polioxietileno a la solución de reacción para que el HDL-colesterol reaccione con las enzimas y medir el HDL-colesterol fraccionadamente (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 69999/1987); y un método de medición para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol, consistente en hacer reaccionar suero, en un tampón que contiene colesterol esterasa derivada de páncreas, colesterol oxidasa, un surfactante de tipo ácido biliar y un surfactante no iónico con las enzimas a un pH especifico y una temperatura especifica (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 12 6498/1988). En un método de medición mencionado en el documento de la Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 126498/1988, a medida que procede primeramente la reacción de LDL colesterol con las enzimas y que procede luego la reacción de HDL-colesterol con las enzimas, se puede realizar la determinación de HDL-colesterol. Sin embargo, esos métodos tardan mucho en ser operados y, más aún, no siempre son específicos para el HDL-colesterol.
Con respecto a un método para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol donde se agregan lipoproteínas distintas de la HDL, se conoce, por ejemplo, un método de medición que utiliza un reactivo que agrega lipoproteínas distintas de la HDL, tal como el sulfato de dextrano, una sal de metal divalente y una enzima químicamente modificada (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 131197/1996); un método de medición que utiliza un reactivo que forma un complejo con lipoproteínas distintas de la HDL, tal como un polianión, y un surfactante que no disuelve la lipoproteína, tal como un copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 201393/1996); un método de medición que utiliza un polianión, tal como el sulfato de dextrano, una sal de metal divalente, un surfactante no iónico específico y albúmina, que se suplementa a la albúmina contenida en la muestra (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 285298/1997); un método para medir el HDL-colesterol en suero o plasma consistente en tratar el suero o el plasma con una solución que contiene un agente fraccionador de lipoproteínas (una combinación de polianión, tal como el sulfato de dextrano, con un catión divalente, tal como el ion magnesio), sin separar la solución de la mezcla resultante en sólido y líquido, tratar la solución con colesterol esterasa y colesterol oxidasa en presencia de surfactante aniónico (sulfonato de alquilo, ácido biliar o sus derivados) y medir el peróxido de hidrógeno formado (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 116996/1996); un método consistente en añadir una substancia que forma un complejo con lipoproteínas distintas de la HDL, tal como un polianión, y un surfactante específico que no disuelve la lipoproteína a una muestra biológica y medir enzimáticamente el HDL-colesterol (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 201393/1996), y similares.
Aquellos métodos para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol donde se agregan lipoproteínas distintas de la HDL tienen una buena correlación con el método estándar convencional. Sin embargo, existen problemas, tales como la inexactitud debida a la turbidez producida por los agregados formados en la reacción y una excesiva carga en el autoanalizador debido a la deposición de hidróxido metálico producido en las células de reacción por reacción de la sal metálica en la solución de reacción con un álcali usado para lavar las células de reacción.
Con respecto a un método para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol sin agregación de lipoproteínas distintas de la HDL, se conoce, por ejemplo, un método de medición del HDL-colesterol consistente en poner en contacto una muestra biológica con colesterol esterasa derivada del páncreas y colesterol oxidasa en presencia de ácido biliar o de una sal del mismo y de albúmina, y medir el compuesto que se consume o produce por la reacción enzimática del HDL-colesterol (Publicación Internacional WO 97/40376); un método de medición del HDL-colesterol en una muestra consistente en la reacción de una muestra con colesterol esterasa y/o lipoproteína lipasa, que actúan sobre la fracción de HDL preferentemente, y colesterol oxidasa en presencia de un surfactante no iónico que tiene un valor HLB de más de 16, así como una selectividad de reacción para la fracción de HDL (Publicación Internacional WO 00/52840), y similares. Además, se conoce también un método en el que el colesterol en lipoproteínas distintas de la HDL se convierte selectivamente un peróxido de hidrógeno usando éster acilpolioxietilensorbitán, se elimina el peróxido de hidrógeno resultante y se mide enzimáticamente el HDL-colesterol añadiendo polioxietilén alquil éter (Solicitud de Patente Japonesa No Examinada Publicada Nº 299/1997).
Sin embargo, en aquellos métodos para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol en los que no se agregan lipoproteínas distintas de la HDL, puede existir un problema de inexactitud de valor medido causada por una incompleta eliminación del colesterol en lipoproteínas distintas de la HDL o por una reacción no específica con el colesterol en lipoproteínas distintas de la HDL.
Además, cuando se mide una substancia específica en una muestra por un medio óptico, es un grave problema que la turbidez causada por la proteína insoluble en agua dé un efecto óptico a la determinación en el caso de muestras que derivan de pacientes que sufren de proteinemia M, mieloma y similares. Para evitar el efecto óptico, se conoce comúnmente un método que resuelve que resuelve la turbidez causada por la proteína insoluble en agua ajustando la sal en la solución de reacción a una alta concentración. Sin embargo, en la determinación cuantitativa del HDL-colesterol, existen algunos casos en que la presencia de sal a una elevada concentración puede inducir un descenso en la especificidad. Por lo tanto, la determinación cuantitativa del HDL-colesterol en presencia de una sal a alta concentración es con frecuencia muy difícil.
WO-A-02/40707 se relaciona con un método de estudio de un lípido en donde se estudia el lípido en los componentes de la sangre en presencia de un compuesto de silicio orgánico.
EP-A-1.197.564 se refiere a un método para pretratar una muestra que contiene varias lipoproteínas antes de medir el colesterol existente en una específica de dichas lipoproteínas en dicha muestra, que consiste en hacer que una enzima, que actúa sobre el colesterol libre como substrato, actúe sobre dicha muestra.
JP-A-9285298 describe un método para medir una lipoproteína de alta densidad (HDL) en una muestra tratando la muestra que contiene HDL con un polianión tal como un polisacárido sulfatado, una sal de metal bivalente, un surfactante no iónico tal como n-octil-beta-glucósido, colesterol esterasa, colesterol oxidasa o colesterol deshidrogenasa y detectando una substancia consumida o formada. Se lleva a cabo la reacción enzimática añadiendo una albúmina diferente de una derivada de la muestra al sistema de reacción para medir para medir el HDL-colesterol en la muestra de suero o plasma.
Se describe en EP-A-698.791 un método de determinación de la cantidad de colesterol en lipoproteínas de alta densidad (HDL), que consiste en medir la cantidad de colesterol en lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y quilomicrones (QM) en una muestra en presencia de un compuesto azucarado y/o un agente solubilizador de proteínas y calcular la diferencia entre la cantidad de colesterol en LDL, VLDL y QM y la cantidad total de colesterol en la muestra.
US-A-4.521.519 se relaciona con un reactivo para la precipitación de lipoproteínas que contienen apo-B, que incluye de 0,2 a 3 gramos por litro de ácido fosfotúngstico y más de 2 mmoles por litro de iones magnesio en solución acuosa.
US-A-4.851.335 se refiere a un procedimiento para la determinación especifica de HDL-colesterol en suero o plasma por incubación con un sistema de detección del colesterol, que contiene colesterol oxidasa y colesterol esterasa en un medio acuoso tamponado, y medición del producto de la reacción de la colesterol oxidasa o del consumo de oxigeno, donde se incuba una muestra de ensayo en presencia de una sal de un ácido biliar o de un derivado de ácido biliar o de sulfosuccinato de dioctilo, se realiza entonces una primera medición, se añade a continuación un detergente no iónico que contiene un grupo óxido de polietileno o un sulfonato de alcano secundario, se incuba de nuevo y se realiza una segunda medición, determinándose la cantidad de HDL-colesterol a partir de la diferencia entre la primera y la segunda medición.
US-A-4.892.815 describe un procedimiento para la determinación específica del colesterol de la fracción de HDL en presencia de la fracción LDL de las lipoproteínas del suero por acción de la colesterol esterasa para la liberación del colesterol y oxidación del colesterol liberado con colesterol oxidasa y oxígeno, con formación de peróxido de hidrógeno y medición cinética de la formación de peróxido de hidrógeno o del consumo de oxígeno, donde la medición es llevada a cabo en 2 a 15 minutos tras iniciarse la reacción de la oxidasa a una temperatura de 20 a 40ºC. Durante un intervalo de tiempo predeterminado y durante la medición, se mantiene en la solución de reacción una concentración de colesterol esterasa de 0,05 a 30 U/ml, una concentración de colesterol oxidasa de 0,1 a 50 U/ml, una concentración de un ténsido del grupo ácido biliar de 1,0 a 20 mmol/l, una concentración de un detergente no iónico de 0,1 a 10 g/l y un valor de pH de 5 a 9.
Se describe un método para determinar cuantitativamente el colesterol en las lipoproteínas de alta densidad en EP-A-753.583. En este método, antes de la determinación del colesterol por un método enzimático, se añaden un surfactante y una substancia que forma un complejo con lipoproteínas distintas de las lipoproteínas de alta densidad a una muestra que contiene lipoproteínas.
EP-A-754.948 se relaciona con un método para medir la cantidad del constituyente objeto de la medición contenido en la lipoproteína específica entre las lipoproteínas contenidas en una muestra viva, que consiste en mezclar una muestra viva con un anticuerpo reactivo con lipoproteína(s) distinta(s) de dicha lipoproteína específica y medir a continuación la absorbancia (OD1) de la mezcla de reacción, y mezclar luego la mezcla de reacción con un reactivo para la medición del constituyente objeto de la medición contenido en la lipoproteína y medir a continuación de nuevo la absorbancia (OD2) de la última mezcla de reacción y calcular la cantidad del constituyente objeto de la medición contenido en la lipoproteína especifica en base a la diferencia entre OD1 y OD2.
EP-A-887.422 se refiere a un método para cuantificar el colesterol en lipoproteínas de alta densidad, consistente en una primera etapa de eliminar el colesterol en lipoproteínas distintas de las lipoproteínas de alta densidad en una muestra de ensayo y una segunda etapa de adición de un surfactante que actúa especificamente sobre las lipoproteínas de alta densidad al producto de dicha primera etapa y cuantificación enzimática del colesterol en las lipoproteínas de alta densidad.
EP-A-1.046.716 describe un método para la cuantificación del colesterol en lipoproteínas de alta densidad. El método consiste en añadir un surfactante, seleccionado entre éteres alquilenfenílicos de polioxietileno y éteres alquilentribencilfenílicos de polioxietileno, y un reactivo enzimático cuantificador del colesterol al suero y medir luego la cantidad reaccionada del colesterol de las lipoproteínas de alta densidad en un tiempo en el que el colesterol de las lipoproteínas de alta densidad reacciona preferentemente con el reactivo enzimático cuantificador del colesterol.
EP-A-1.114.870 se relaciona con un método para determinar cuantitativamente el LDL-colesterol en una muestra biológica. Consiste en llevar a cabo la reacción del colesterol en presencia de: a) una muestra biológica, b) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o colesterol deshidrogenasa (a las que en adelante se hará aquí referencia de forma colectiva como enzimas CH) y c) un reactivo que permite a las enzimas CH de b) actuar sólo sobre el LDL-colesterol, y medir la cantidad del peróxido de hidrógeno o de la coenzima reducida formados por la reacción para determinar cuantitativamente la concentración de LDL-colesterol.
Se describe en EP-A-1.158.299 un método para estudiar un componente específico en una fracción de lipoproteínas en un suero mediante una reacción enzimática, que consiste en introducir un medio controlador para permitir una reacción enzimática preferentemente con respecto a un componente objeto en la fracción de lipoproteína específica sin formar complejos ni agregados, estudiando así específicamente el componente.
EP-A-1.164.376 se refiere a un método de cuantificación selectiva de colesteroles consistente en determinar la cantidad de colesteroles en una fracción de lipoproteínas de medición en una muestra en presencia de un compuesto que tiene una afinidad relativamente fuerte por las lipoproteínas de no medición en la muestra, un surfactante que exhibe una acción relativamente potente sobre las lipoproteínas de medición y un reactivo de determinación del
colesterol.
WO 02/38800 describe una pieza de ensayo para medir el colesterol en lipoproteínas de alta densidad (HDL) consistente en: un reactivo enzimático para medir el colesterol; un primer surfactante que hace que la solubilidad de la HDL sea mayor que la de una lipoproteína distinta de la HDL; y un segundo surfactante que inhibe la disolución de las lipoproteínas distintas de la HDL.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un método simple y preciso para determinar cuantitativamente el colesterol en las lipoproteínas de alta densidad en una muestra y proporcionar un reactivo y un kit usados para el mismo.
La presente invención se relaciona con los siguientes puntos [1] a [13].
[1]
Un método para determinar cuantitativamente el colesterol en lipoproteínas de alta densidad en una muestra, que consiste en:
\quad
hacer reaccionar una muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, una coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que contiene un surfactante no iónico polianión y albúmina, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina, y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo, y medir el peróxido de hidrógeno formado o la coenzima reducida formados.
[2]
El método según [1], donde el medio acuoso contiene además un derivado de ácido biliar.
[3]
El método según [2], donde el derivado de ácido biliar es un derivado aniónico de ácido biliar.
[4]
Un reactivo para determinar cuantitativamente el colesterol en lipoproteínas de alta densidad, consistente en un surfactante no iónico, polianión, albúmina, colesterol esterasa, colesterol oxidasa y un reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.
[5]
Un reactivo para determinar cuantitativamente el colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que consiste en un surfactante no iónico, polianión, albúmina, colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa y una coenzima oxidada, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina, y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.
[6]
El reactivo según [5], que incluye además un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
[7]
El reactivo según cualquiera de [4] a [6], que incluye además un derivado de ácido biliar.
[8]
El reactivo según [7], donde el derivado de ácido biliar es un derivado aniónico de ácido biliar.
[9]
Un kit para determinar cuantitativamente el colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que incluye un primer reactivo y un segundo reactivo, donde la colesterol esterasa, el polianión, el surfactante no iónico, la albúmina y el reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno están incluidos en cualquiera o ambos del primer reactivo y/o el segundo reactivo y la colesterol oxidasa está incluida en el segundo reactivo, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.
[10]
Un kit para determinar cuantitativamente el colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que incluye un primer reactivo y un segundo reactivo, donde la colesterol esterasa, el polianión, el surfactante no iónico, la albúmina y la coenzima oxidada están incluidos en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o el segundo reactivo y la colesterol deshidrogenasa está incluida en el segundo reactivo, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.
[11]
El kit según [10], que además incluye un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o el segundo reactivo.
[12]
El kit según cualquiera de [9] a [11], que además incluye un derivado de ácido biliar en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o el segundo reactivo.
[13]
El kit según [12], donde el derivado de ácido biliar es un derivado aniónico de ácido biliar.
El método para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol según la presente invención es un método para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol sin eliminar el colesterol de las lipoproteínas distintas de la HDL.
Son ejemplos de la muestra usada en el método según la presente invención sangre entera, plasma, suero, liquido espinal, saliva, liquido amniótico, orina, sudor, liquido pancreático y similares y son preferidos el plasma y el
suero.
No existe ninguna limitación particular sobre la colesterol esterasa en la presente invención en la medida en que sea una enzima que tenga la capacidad de hidrolizar el éster de colesterol, y es posible usar, por ejemplo, colesterol esterasa y lipoproteína lipasa derivadas de animales, plantas y microorganismos, así como colesterol esterasa y lipoproteína lipasa fabricadas por ingeniería genética.
Con respecto a la colesterol esterasa, se pueden usar tanto colesterol esterasa no modificada como colesterol esterasa químicamente modificada. Es también posible usar colesterol esterasa comercial.
Son ejemplos de la colesterol esterasa comercial la colesterol esterasa "Amano" 2 (CHE2; fabricada por Amano Enzyme), la colesterol esterasa "Amano" 3 (CHE3; fabricada por Amano Enzyme), la lipoproteína lipasa (LPL311; fabricada por Toyobo), la lipoproteína lipasa "Amano" 6 (LPL6; fabricada por Amano Enzyme), la colesterol esterasa [COE313 (colesterol esterasa químicamente modificada); fabricada por Toyobo] y similares. Es también posible en la presente invención usar dos o más tipos de colesterol esterasas en combinación.
Como ejemplos del grupo que modifica la enzima (grupo químicamente modificador) en una modificación química de la colesterol esterasa, se incluyen un grupo que tiene poli(etilenglicol) como componente principal, un grupo que tiene poli(propilenglicol) como componente principal, un grupo que tiene un copolímero de poli(propilenglicol) con poli(etilenglicol), un grupo que tiene un polisacárido hidrosoluble, un grupo sulfopropilo, un grupo sulfobutilo, un grupo poliuretano, un grupo que tiene una función quelante y similares. Entre ellos, el preferido es un grupo que tiene poli(etilenglicol) como componente principal. Son ejemplos del polisacárido hidrosoluble dextrano, pululano, almidón soluble y similares.
Son ejemplos del reactivo (agente modificador químico) que modifica químicamente la colesterol esterasa compuestos que tienen tanto el grupo químicamente modificador anterior como un grupo funcional o una estructura reactiva con un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, etc. de la enzima. Son ejemplos del grupo funcional o de la estructura reactiva con un grupo amino de la enzima un grupo carboxilo, un grupo éster activado (tal como un grupo N-hidroxisuccinimida), anhídrido de ácido, cloruro de ácido, aldehído, un grupo epóxido, 1,3-propanosultona, 1,4-butanosultona y similares. Son ejemplos del grupo funcional o de la estructura reactiva con un grupo carboxilo de la enzima un grupo amino y similares. Son ejemplos del grupo o de la estructura reactiva con un grupo sulfhidrilo de la enzima un grupo maleimida, disulfuro, \alpha-haloéster (tal como \alpha-yodoéster) y simila-
res.
Con respecto al modificador químico, se puede usar un modificador comercial. Son ejemplos del modificador químico comercial Sunbright® VFM-4101, Sunbright® ME-AC-50HS y Sunbright® MEC-50HS, que tienen tanto un grupo N-hidroxilsuccinimida como un grupo con poli(etilen-glicol) como componente principal (todos fabricados por NOF), la serie Sunbright® AKM (tal como Sunbright® AKM-1510), la serie Sunbright® ADM, la serie Sunbright® ACM, que tiene tanto una estructura de anhídrido de ácido como un grupo con poli(alquilenglicol) como componente principal (todos fabricados por NOF), EP0X-3400 y M-EP0X-5000, que tienen tanto un grupo epóxido como un grupo con poli(etilenglicol) como componente principal (todos fabricados por Shearwater Polymers) y anhídrido del ácido dietilentriamino-N,N,N',N'',N''-pentaacético (anhídrido DTPA), que tiene tanto una estructura de anhídrido de ácido como un grupo con una función quelante (fabricado por Dojindo Laboratories).
Se puede realizar la modificación química de la colesterol esterasa, por ejemplo, mediante el método siguiente, aunque no existe ninguna limitación para ello. En primer lugar, se disuelve la colesterol esterasa en un tampón de pH 8,0 o superior (tal como el tampón HEPES) y se añade modificador químico en una cantidad de 0,01 a 500 veces la cantidad molar de la enzima a 0 a 55ºC, seguido de agitación durante 5 minutos a 5 horas. Como colesterol esterasa químicamente modificada usada en la reacción enzimática real, se puede usar no sólo la solución de reacción como tal, sino también un producto en el que se eliminan el modificador químico no reaccionado y similares, por ejemplo, por una membrana de ultrafiltración, si es necesario.
No hay ninguna limitación en particular sobre la concentración de la colesterol esterasa usada en el método de la presente reacción, en la medida en que permita la determinación cuantitativa del HDL-colesterol según la presente invención, y la concentración en la solución de reacción es preferiblemente de 0,01 a 200 U/mL o, más preferiblemente, de 0,02 a 100 U/mL.
No hay ninguna limitación en particular sobre la colesterol oxidasa en la presente invención, en la medida en que sea una enzima que tenga la capacidad de producir peróxido de hidrógeno por oxidación del colesterol. Por ejemplo, además de la colesterol oxidasa derivada de animales, plantas o microorganismos, es posible usar colesterol oxidasa fabricada por ingeniería genética. Se pueden usar también algunas comerciales, tales como la colesterol oxidasa "Amano" 1 (CHOD1; fabricada por Amano Enzyme), la colesterol oxidasa (CO-PE; fabricada por Kikkoman) y la colesterol oxidasa (COO321; fabricada por Toyobo). En la presente invención, se pueden usar en combinación dos o más tipos de colesterol oxidasas.
La colesterol oxidasa puede ser o bien una enzima no modificada o bien una enzima químicamente modificada. La colesterol oxidasa químicamente modificada puede ser preparada, por ejemplo, por el método de modificación química antes mencionado usando el modificador químico citado anteriormente.
No hay ninguna limitación en particular sobre la concentración de la colesterol oxidasa usada en el método de la presente reacción, en la medida en que permita la determinación cuantitativa del HDL-colesterol según la presente invención. Se prefiere que la concentración en la solución de reacción sea de 0,01 a 200 U/mL o, más preferiblemente, de 0,02 a 100 U/mL.
No existe ninguna limitación en particular sobre la colesterol deshidrogenasa en la presente invención, en la medida en que sea una enzima que tenga la capacidad de producir una coenzima reducida por oxidación del colesterol en presencia de una coenzima oxidada. Por ejemplo, además de la colesterol deshidrogenasa derivada de animales, plantas y microorganismos, es también posible usar colesterol deshidrogenasa fabricada por ingeniería genética. Se pueden usar también algunas comerciales, tales como la colesterol deshidrogenasa "Amano" 5 (CHDH5; fabricada por Amano) y similares. En la presente invención, se pueden usar en combinación dos o más tipos de colesterol deshidroge-
nasas.
La colesterol deshidrogenasa puede ser una enzima no modificada o una enzima químicamente modificada. Se puede preparar colesterol deshidrogenasa químicamente modificada, por ejemplo, por el método de modificación química antes mencionado usando el modificador químico citado anteriormente.
No hay ninguna limitación en particular sobre la concentración de la colesterol deshidrogenasa usada en el método de la presente reacción, en la medida en que permita la determinación cuantitativa del HDL-colesterol según la presente invención. Se prefiere que la concentración en la solución de reacción sea de 0,01 a 200 U/mL o, más preferiblemente, de 0,02 a 100 U/mL.
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En un método de medición que utiliza la colesterol deshidrogenasa según la presente invención, se usa una coenzima oxidada. Son ejemplos de la coenzima oxidada NAD, NADP, tio-NAD, tio-NADP y similares.
No hay ninguna limitación en particular sobre la albúmina usada en la presente invención, en la medida en que sea albúmina que permita la determinación cuantitativa del HDL-colesterol según la presente invención. Son ejemplos de la albúmina las derivadas de vacas, caballos, ovejas, seres humanos y similares, y, entre ellas, se prefiere la seroalbúmina bovina (BSA). Es también posible utilizar albúmina fabricada por ingeniería genética. En la presente invención, se pueden usar en combinación dos o más tipos de albúminas de diferentes orígenes. No hay limitación particular sobre la concentración de albúmina en la determinación cuantitativa del HDL-colesterol, en la medida en que permita la determinación cuantitativa del HDL-colesterol según la presente invención. Se prefiere que la concentración en la solución de reacción sea de un 0,001 a un 10% o, más preferiblemente, de un 0,01 a un 1%.
El polianión usado en la presente invención es el sulfato de dextrano o una sal del mismo. En la presente invención, se pueden usar en combinación dos o más tipos de polianión. Son ejemplos de polianiones que se pueden usar en combinación con sulfato de dextrano o una sal del mismo heparina o una sal de la misma, ácido fosfotúngstico o una sal del mismo, ciclodextrina sulfatada o una sal de la misma, oligosacárido sulfatado o una sal del mismo, carragenina y similares. Son ejemplos de sulfato de dextrano el sulfato de dextrano con un peso molecular de 40.000, 80.000, 200.000, 500.000, 1.000.000, 2.000.000 y similares. Son ejemplos del oligosacárido sulfatado agarosa sulfatada, trehalosa sulfatada y sulfato de condroitina. Son ejemplos de la sal una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de litio, una sal de amonio y una sal de magnesio.
No hay ninguna limitación particular sobre la concentración del polianión usado para la determinación cuantitativa del HDL-colesterol, en la medida en que permita la determinación cuantitativa del HDL-colesterol según la presente invención. Se prefiere que la concentración en la solución de reacción sea del 0,001 al 10% o, más preferiblemente, del 0,01 al 1%.
El surfactante no iónico usado en la presente invención es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina. En la presente invención, se pueden usar en combinación dos o más surfactante no iónicos. Son ejemplos de surfactantes no iónicos que pueden ser usados en combinación con polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina polioxietilén alquil éter, polioxietilén alquenil éter, derivado de polioxietilén aril éter, etilendiaminotetrapolioxialquileno y similares.
Son ejemplos de la polioxietilenalquilamina o de la polioxietilenalquenilamina un compuesto representado por la fórmula (I) [al que en adelante, se hará aquí referencia como Compuesto (I)]
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1 
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[donde R es un grupo alquilo o grupo alquenilo de cadena lineal o ramificado; X es un átomo de hidrógeno o (CH_{2}CH_{2}O)_{n}H; m y n son iguales o diferentes, y cada uno es un número entero de 1 a 100; y m+n es un número entero de 2 a 200].
Como ejemplos de un grupo alquilo en la polioxietilenalquilamina, el Compuesto (I) y el polioxietilén alquil éter, se incluyen alquilos de cadena lineal o ramificados de 6 a 30 átomos de carbono, tales como hexilo, heptilo, octilo, isooctilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo (laurilo), tridecilo, tetradecilo (miristilo), pentadecilo, hexadecilo (cetilo), heptadecilo, octadecilo (estearilo), nonadecilo, icosilo, henicosilo y docosilo (behenilo).
Como ejemplos de un grupo alquenilo en la polioxietilenalquenilamina, el Compuesto (I) y el polioxietilén alquenil éter, se incluyen alquenilos de cadena lineal o ramificados de 6 a 30 átomos de carbono, tales como hexenilo, heptenilo, octenilo, nonenilo, decenilo, citronelilo, undecenilo, dodecenilo, tridecenilo, tetradecenilo, pentadecenilo, hexadecenilo, heptadecenilo, oleilo, nonadecenilo, eicosenilo, henicosenilo, docosenilo, tricosenilo, tetracosenilo, pentacosenilo, hexacosenilo, heptacosenilo, octacosenilo, nonacosenilo y triacontenilo.
Son ejemplos específicos (productos comerciales) de polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina
Nymeen® L 201 (oxietilendodecilamina; fabricada por NOF), Nymeen® L207 (polioxietilendodecilamina; fabricada por NOF), Nymeen® S204, Nymeen® S210 (polioxietilenoctadecilamina; fabricada por NOF), Newcol^{TM} OD420 (polioxietilenoctadecilamina; fabricada por Nippon Nyukazai), Pionin^{TM} D3104 (polioxietilenlaurilamina; fabricada por Takemoto Yushi), Pionin^{TM} D3110 (polioxietilenlaurilamina; fabricada por Takemoto Yushi), Pionin^{TM} D3605 [polioxietilenalquil(soja)amina; fabricada por Takemoto Yushi], Pionin^{TM} D3615T [polioxietilenalquil(sebo de vaca)amina; fabricada por Takemoto Yushi], BLAUNON 209 (polioxietilén oleilamino éter; fabricado por Aoki Yushi), y similares.
Son ejemplos específicos (productos comerciales) de polioxietilén alquil éter o polioxietilén alquenil éter
Emulmin® L90S (polioxietilén lauril éter; fabricado por Sanyo Chemical), Newcol^{TM} 1310 (polioxietilén tridecil éter; fabricado por Nippon Nyukazai), BLAUNON-EN 1520 (polioxietilén oleíl éter; fabricado por Aoki Yushi) y simi-
lares.
Son ejemplos del derivado de polioxietilén aril éter polioxietilén fenil estirenado éter, polioxialquilén fenil estirenado éter, polioxietilén metilfenil estirenado éter, condensado de polioxietilén fenil estirenado éter, polioxietilén alquilfenil éter, condensado de polioxietilén alquilfenil éter y formaldehído y similares.
Son ejemplos específicos (productos comerciales) de derivado de polioxietilén aril éter Newcol^{TM} 2604, Newcol^{TM} 710 (ambos son polioxietilén fenil policíclico éter; fabricados por Nippon Nyukazai), Newcol^{TM} 2608F (polioxialquilén fenil policíclico éter; fabricado por Nippon Nyukazai), Pionin^{TM} D6310, Pionin^{TM} D6320 (ambos son un condensado de polioxietilén fenil estirenado éter; fabricados por Takemoto Yushi), Nikkol® R1020 (condensado de polioxietilén nonilfenil éter y formaldehido; fabricado por Nikko Chemicals) y similares.
Son ejemplos de etilendiaminotetrapolioxialquileno un condensado de etilendiamina y polioxietileno-polioxipropileno, etilendiaminotetrapolioxietileno, etilendiaminotetrapolioxipropileno y similares.
Como ejemplos especificos (productos comerciales) de etilendiaminotetrapolioxialquileno, se incluyen Adeka® Pullulonic TR704, Adeka® Pullulonic TR701, Adeka® Pullulonic TR913R (todos ellos son condensados de etilendiamina y polioxietileno-polioxipropileno fabricados por Asahi Denka), Unilube 32TY-65BI (etilendiaminotetrapolioxialquileno, fabricado por NOF) y similares.
El grado de polimerización de la cadena de oxialquileno (cadena de oxietileno o cadena de oxipropileno) en la polioxietilenalquilamina, la polioxietilenalquenilamina, el polioxietilén alquil éter, el polioxietilén alquenil éter, un derivado de polioxietilén aril éter y el etilendiaminotetrapolioxialquileno es preferiblemente de 1 a 100 y más preferiblemente de 1 a 60.
Son ejemplos de sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter el sulfato de polioxietilén fenil estirenado éter, el sulfato de polioxietilén fenil bencilado éter y similares.
Son ejemplos especificos (productos comerciales) de sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter Newcol^{TM} 707SF, 707SN, 714SF, 723SF, 740SF (todos ellos fabricados por Nippon Nyukazai) y similares. El grado de polimerización de la cadena de oxietileno en el sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter es preferiblemente de 1 a 100 y más preferiblemente de 5 a 40.
No hay ninguna limitación particular sobre la concentración del surfactante no iónico en el método para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol de la presente invención, en la medida en que permita la determinación cuantitativa del HDL-colesterol según la presente invención. Se prefiere que la concentración en la solución de reacción sea del 0,0001 al 10% o, más preferiblemente, del 0,001 al 1%.
Son ejemplos del derivado de ácido biliar en la presente invención un derivado aniónico de ácido biliar, un derivado anfotérico de ácido biliar, un derivado no iónico de ácido biliar y similares, y se prefiere un derivado aniónico de ácido biliar.
Como ejemplos del derivado aniónico de ácido biliar, se incluyen ácido cólico o una sal del mismo, ácido taurocólico o una sal del mismo, ácido glicocólico o una sal del mismo, ácido litocólico o una sal del mismo, ácido desoxicólico o una sal del mismo, ácido quenodesoxicólico o una sal del mismo, ácido ursodesoxicólico o una sal del mismo, ácido 7-oxolitocólico o una sal del mismo, ácido 12-oxolitocólico o una sal del mismo, ácido 12-oxoquenodesoxicólico o una sal del mismo, ácido 7-oxodesoxicólico o una sal del mismo, ácido hiocólico o una sal del mismo, ácido hiodesoxicólico o una sal del mismo, ácido deshidrocólico o una sal del mismo y similares. Son ejemplos de la sal la sal de amonio, la sal de litio, la sal de sodio, la sal de potasio, la sal de magnesio, la sal de calcio y
similares.
Son ejemplos del derivado anfotérico de ácido biliar un compuesto representado por la fórmula (II)
(II)R^{1}-CH_{2}-CH(R^{2})-CH_{2}-SO_{3}^{-}
[donde R^{1} es un grupo 3-(3-colamidopropil)dimetilamonio y R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo] [al que en adelante se hará aquí referencia como Compuesto (II)] y similares. En adelante, se hará referencia al Compuesto (II) en el que R^{2} es un átomo de hidrógeno como CHAPS y se hará referencia al Compuesto (II) en el que R^{2} es un grupo hidroxilo como CHAPSO.
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Un ejemplo del derivado no iónico de ácido biliar es un compuesto representado por la fórmula (III)
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2 
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(donde X es un átomo de hidrógeno o un grupo hidroxilo y R^{3} y R^{4} pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa un alquilo substituido o no substituido o un alcanoilo substituido o no substituido) [en adelante, se le hará aquí referencia como Compuesto (III)] y similares. Como ejemplos de restos alquilo en el grupo alquilo y el grupo alcanoilo, se incluyen un alquilo lineal o ramificado de 1 a 10 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, neopentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo y similares. Son ejemplos del substituyente en el grupo alquilo substituido y el grupo alcanoilo substituido en el Compuesto (III) un grupo hidroxilo, un átomo de halógeno y similares. El átomo de halógeno significa cada uno de los átomos de flúor, cloro, bromo y yodo. En el compuesto (III), se prefiere un compuesto en el que tanto R^{3} y R^{4}
son
COCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH_{2}OH
(a los que en adelante se hará aquí referencia como Substituyente A). En adelante, se hará aquí referencia a un compuesto en el que X, R^{3} y R^{4} son un átomo de hidrógeno, Substituyente A y Substituyente A, respectivamente, como desoxi-BIGCHAP, mientras que se hará referencia a un compuesto en el que X, R^{3} y R^{4} son un grupo hidroxilo, Substituyente A y Substituyente A, respectivamente, como BIG-CHAP.
No hay ninguna limitación particular sobre la concentración del derivado de ácido biliar, en la medida en que permita la determinación cuantitativa del HDL-colesterol según la presente invención. Preferiblemente, la concentración en la solución de reacción es del 0,001 al 10% y, más preferiblemente, del 0,01 al 1%.
Son ejemplos del medio acuoso usado en el método para la determinación cuantitativa del HDL-colesterol según la presente invención el agua desionizada, el agua destilada, una solución tampón y similares. Entre ellos, se prefiere una solución tampón. Son ejemplos del tampón utilizado para la solución tampón un tampón tris-(hidroximetil)aminometano, un tampón fosfato, un tampón borato, un tampón de Good y similares. Son ejemplos de un tampón de Good el ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES), el bis-(2-hidroxietil)iminotris(hidroximetil)metano (Bis-Tris), el ácido N-(2-acetamido)iminodiacético (ADA), piperazino-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES), ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES), ácido 3-morfolino-2-hidroxipropanosulfónico (MOPSO), ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES), ácido 3-morfolinopropanosulfónico (MOPS), ácido N-[tris(hidroxi-metil)metil]-2-aminoetanosulfónico (TES), ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanosulfónico (HEPES), ácido 3-[N,N-bis(2-hidroxietil)amino]-2-hidroxipropanosulfónico (DIPSO), ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2-hidroxi-3-aminopropanosulfónico (TAPSO), piperazino-N,N'-bis(ácido 2-hidroxipropanosulfónico) (POPSO), ácido 3-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]-2-hidroxipropanosulfónico (HEPP-SO), ácido 3-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]propanosulfónico [(H)EPPS], N-[tris(hidroximetil)metil]glicina (Tricine), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (Bicine), ácido N-tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), ácido N-ciclohexil-2-aminoetanosulfónico (CHES), ácido N-ciclohexil-3-amino-2-hidroxipropanosulfónico (CAPSO), ácido N-ciclohexil-3-aminopropanosulfónico (CAPS) y similares. No hay ninguna limitación particular sobre la concentración del tampón, en la medida en que sea una concentración adecuada para la medición, y es preferiblemente de 0,001 a 2,0 mol/L y más preferiblemente de 0,005 a 1,0 mol/L.
De aquí en adelante, se describirán con detalle un método para la determinación cuantitativa del HDL-colesterol, un reactivo para la determinación cuantitativa del mismo y un kit para su determinación cuantitativa según la presente invención.
Método para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol
Con respecto a un método para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol según la presente invención, se pueden poner como ejemplos los métodos de las siguientes realizaciones.
Método de medición 1
El HDL-colesterol en una muestra puede ser determinado cuantitativamente por
(1)
reacción de una muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, una coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que contiene un surfactante no iónico, polianión y albúmina y, si es necesario, que además contiene un agente estabilizador, un agente antiséptico, un agente de eliminación de substancias interfirientes, un promotor de reacción y similares;
(2)
medición del peróxido de hidrógeno formado o de una coenzima reducida en presencia, si es necesario, de un reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno o un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida, y
(3)
cálculo de la concentración de HDL-colesterol en la muestra por correlación del valor obtenido en (2) y de una curva de calibración previamente preparada.
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Método de medición 2
El HDL-colesterol en una muestra puede ser determinado cuantitativamente por
(1)
reacción de una muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, una coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que contiene un surfactante no iónico, polianión, albúmina y un derivado de ácido biliar y, si es necesario, que además contiene un agente estabilizador, un agente antiséptico, un agente de eliminación de substancias interfirientes, un promotor de reacción y similares;
(2)
medición del peróxido de hidrógeno formado o de una coenzima reducida en presencia, si es necesario, de un reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno o un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida, y
(3)
cálculo de la concentración de HDL-colesterol en la muestra por correlación del valor obtenido en (2) y de una curva de calibración previamente preparada.
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Método de medición 3 (Referencia)
El HDL-colesterol en una muestra puede ser determinado cuantitativamente por
(1)
reacción de una muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, una coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que contiene polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina y sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter o un derivado aniónico de ácido biliar y, si es necesario, que además contiene polianión, albúmina, un agente estabilizador, un agente antiséptico, un agente de eliminación de substancias interfirientes, un promotor de reacción y similares;
(2)
medición del peróxido de hidrógeno formado o de una coenzima reducida en presencia, si es necesario, de un reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno o un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida, y
(3)
cálculo de la concentración de HDL-colesterol en la muestra por correlación del valor obtenido en (2) y una curva de calibración previamente preparada.
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Método de medición 4 (Referencia)
El HDL-colesterol en una muestra puede ser determinado cuantitativamente por
(1)
reacción de una muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, una coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que contiene polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter o un derivado aniónico de ácido biliar y un derivado aniónico de ácido biliar y, si es necesario, que además contiene polianión, albúmina, un agente estabilizador, un agente antiséptico, un agente de eliminación de substancias interfirientes, un promotor de reacción y similares;
(2)
medición del peróxido de hidrógeno formado o de una coenzima reducida en presencia, si es necesario, de un reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno o un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida, y
(3)
cálculo de la concentración de HDL-colesterol en la muestra por correlación del valor obtenido en (2) y una curva de calibración previamente preparada.
Son ejemplos del medio acuoso el medio acuoso antes mencionado y similares. Son ejemplos del agente estabilizador el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), la sacarosa, el cloruro de calcio y similares. Son ejemplos del agente antiséptico la azida sódica, antibióticos y similares. Son ejemplos del agente de eliminación de substancias interfirientes la ascorbato oxidasa para la eliminación de la interferencia por el ácido ascórbico y similares. Son ejemplos del promotor de reacción enzimas tales como la colipasa y la fosfolipasa y sales tales como el sulfato de sodio y el cloruro de sodio.
En los presentes métodos de medición, las reacciones de (1) y (2) son llevadas a cabo, por ejemplo, a una temperatura de 10 a 50ºC o, preferiblemente, de 20 a 40ºC durante 1 a 60 minutos o, preferiblemente, 2 a 30 minutos.
Se puede medir la cantidad del peróxido de hidrógeno producido, por ejemplo, por un reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno. Un reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno es un reactivo para convertir el peróxido de hidrógeno formado en una substancia detectable. Con respecto a una substancia detectable, se pueden poner como ejemplos un tinte, luminiscencia y similares, y se prefiere un tinte. Cuando la substancia detectable es un tinte, el reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno incluye un tipo de cromógeno de coloración oxidativa y una substancia peroxidativa tal como peroxidasa y similares. Son ejemplos del tipo de cromógeno de coloración oxidativa los tipos de cromógenos de coloración oxidativa que se mencionarán después. Cuando la substancia detectable es luminiscente, el reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno incluye una substancia quimioluminiscente. Son ejemplos de la substancia quimioluminiscente luminol, isoluminol, lucigenina, éster de acridinio y similares.
Cuando se usa un reactivo que contiene un tipo de cromógeno de coloración oxidativa y una substancia peroxidativa tal como peroxidasa como reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno, se puede determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno por reacción del peróxido de hidrógeno con un tipo de cromógeno de coloración oxidativa en presencia de la substancia peroxidativa para formar un tinte y medición del tinte formado. Cuando se usa un reactivo para determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno que contiene una substancia quimioluminiscente, se puede determinar cuantitativamente el peróxido de hidrógeno por reacción del peróxido de hidrógeno con la substancia quimioluminiscente para formar fotones y medición de los fotones formados.
Son ejemplos del tipo de cromógeno de coloración oxidativa un tipo leuco de cromógeno y un tipo de cromógeno de coloración por copulación oxidativa y similares. Un tipo leuco de cromógeno es una substancia que únicamente se convierte en un tinte en presencia de peróxido de hidrógeno y de una substancia peroxidativa, tal como peroxidasa y similares.
Son ejemplos específicos la 10-N-carboximetilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina (CCAP), la 10-N-metilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina (MCDP), la sal sódica de la N-(carboximetil-aminocarbonil)-4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina (DA-64), la 4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina, la bis[3-bis-(4-clorofenil)metil-4-dimetilaminofenil]amina (BCMA) y similares.
Un tipo de cromógeno de coloración por copulación oxidativa es una substancia que da un tinte por copulación oxidativa de dos compuestos en presencia de peróxido de hidrógeno y de una substancia peroxidativa, tal como peroxidasa y similares. Son ejemplos de una combinación de dos compuestos una combinación de un copulante con un compuesto de anilina y una combinación de un copulante con un compuesto fenólico. Son ejemplos del copulante 4-aminoantipirina (4-AA), 3-metil-2-benzotiazolinonohidrazida y similares. Son ejemplos del compuesto de anilina N-3-sulfopropil) anilina, N-etil-N-2-hidroxil-3-sulfopropil)-3-metilanilina (TOOS), N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetilanilina (MAOS), N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina (DAOS), N-etil-N-(3-sulfopropil)-3-metilanilina (TOPS), N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina (HDAOS), N,N-dimetil-3-metilanilina, N,N-di(3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina, N-etil-N-(3-sulfopropil)-3-metoxianilina, N-etil-N-(3-sulfopropil) anilina, N-etil-N-(3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina, N-(3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina, N-etil-N-(3-sulfopropil)-3,5-dimetilanilina, N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3-metoxianilina, N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil) anilina, N-etil-N-(3-metilfenil)-N'-succinil-etilendiamina (EMSE), N-etil-N-(3-metilfenil)-N'-acetil-etilendiamina, N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-4-fluoro-3,5-dimetoxianilina (F-DAOS) y similares. Son ejemplos del compuesto fenólico fenol, 4-clorofenol, 3-metilfenol, ácido 3-hidroxi-2,4,6-triyodobenzoico (HTIB) y similares.
En la determinación cuantitativa del peróxido de hidrógeno, no hay ninguna limitación en particular sobre la concentración de la substancia peroxidativa, en la medida en que sea adecuada para la medición, y, cuando se usa peroxidasa como substancia peroxidativa, es preferiblemente de 1 a 100 kU/L. Aunque no existe ninguna limitación en particular sobre la concentración de un tipo de cromógeno de coloración oxidativa, en la medida en que sea una concentración adecuada para la medición, ésta es preferiblemente de 0,01 a 10 g/L.
Son ejemplos de un método para determinar cuantitativamente una coenzima reducida un método en el que se determina la absorbancia de la coenzima reducida formada y un método que utiliza un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida. Con respecto a la longitud de onda empleada en el método para la medición de la absorbancia de una coenzima reducida, se prefiere de 300 a 500 nm, se prefiere mejor de 330 a 400 nm y se prefiere particularmente alrededor de 340 nm. El reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida es un reactivo que convierte la coenzima reducida formada en una substancia detectable. Son ejemplos de la substancia detectable un tinte y similares. Es un ejemplo del reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida cuando la substancia detectable es un tinte un reactivo que incluye diaforasa, un soporte de electrones y un tipo de cromógeno de coloración reductora. Son ejemplos del soporte de electrones metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazio y similares. Cuando se usa un reactivo que incluye diaforasa, un soporte de electrones y un tipo de cromógeno de coloración reductora como reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida, se puede determinar cuantitativamente la coenzima reducida midiendo el tinte obtenido por conversión del tipo de cromógeno de coloración reductora.
Son ejemplos del tipo de cromógeno de coloración reductora bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT), sal monosódica de 2-(4-yodo-fenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-1), sal monosódica de 2-(4-yodofenil)-3-(2,4-dinitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-3) y similares.
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Reactivo para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol
Son ejemplos del reactivo para la determinación cuantitativa del HDL-colesterol según la presente invención los reactivos de las siguientes realizaciones.
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Reactivo 1
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, un surfactante no iónico, polianión, albúmina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Reactivo 2
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, un surfactante no iónico, polianión, albúmina, un derivado de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Reactivo 3
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, un surfactante no iónico, polianión, albúmina y una coenzima oxidada.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivo 4
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, un surfactante no iónico, polianión, albúmina, un derivado de ácido biliar y una coenzima oxidada.
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Reactivo 5
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, un surfactante no iónico, polianión, albúmina, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
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Reactivo 6
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, un surfactante no iónico, polianión, albúmina, un derivado de ácido biliar, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
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Reactivo 7 (Referencia)
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Reactivo 8
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, un derivado aniónico de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivo 9 (Referencia)
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter, un derivado aniónico de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Reactivo 10 (Referencia)
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter y una coenzima oxidada.
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Reactivo 11 (Referencia)
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, un derivado aniónico de ácido biliar y una coenzima oxidada.
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Reactivo 12 (Referencia)
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter, un derivado aniónico de ácido biliar y una coenzima oxidada.
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Reactivo 13 (Referencia)
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
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Reactivo 14 (Referencia)
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, un derivado aniónico de ácido biliar, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
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Reactivo 15 (Referencia)
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter, un derivado aniónico de ácido biliar, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
En los reactivos antes mencionados para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol, se pueden usar colesterol esterasa, colesterol oxidasa, colesterol deshidrogenasa, un surfactante no iónico, polianión, albúmina, un derivado de ácido biliar, un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida, que se mencionan en el método antes citado para la determinación cuantitativa del HDL-colesterol.
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Kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol
El reactivo para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol según la presente invención puede ser conservado, circulado y utilizado en forma de kit. No existe ninguna limitación en particular sobre la forma del kit. Son ejemplos de la forma del kit un sistema de dos reactivos, un sistema de tres reactivos y similares, y se prefiere un sistema de dos reactivos.
En un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol en forma de un sistema de dos reactivos que incluye un primer reactivo y un segundo reactivo, se pueden incluir colesterol esterasa y colesterol oxidasa o colesterol deshidrogenasa en el primer reactivo y en el segundo reactivo por separado, o se pueden incluir conjuntamente en el segundo reactivo. En caso de que estén incluidas en el primer reactivo y el segundo reactivo por separado, se prefiere un kit donde la colesterol esterasa esté incluida en el primer reactivo, mientras que la colesterol oxidasa o colesterol deshidrogenasa esté incluida en el segundo reactivo. El polianión puede estar incluido en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo y está preferiblemente incluido en el primer reactivo. El surfactante no iónico y la albúmina pueden estar incluidos en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo. La coenzima oxidada usada en un método de medición que utiliza colesterol deshidrogenasa puede estar incluida en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo.
El reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno puede estar incluido en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo. Cuando el reactivo contiene un tipo de cromógeno de coloración por copulación oxidativa, se prefiere un kit en el que cada uno de los dos componentes del tipo de cromógeno de coloración por copulación oxidativa está incluido en el primer o segundo reactivo por separado. El reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida puede estar incluido en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo. El derivado de ácido biliar puede estar incluido en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo.
Se describen a continuación ejemplos de kits.
Un kit para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que incluye un primer reactivo y un segundo reactivo, donde se incluyen colesterol esterasa, polianión, un surfactante no iónico, albúmina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo y se incluye colesterol oxidasa en el segundo reactivo, y, más aún, si es necesario, se incluyen un derivado de ácido biliar, un agente estabilizador, un agente antiséptico, un agente de eliminación de substancias interfirientes y un promotor de reacción en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo
reactivo.
Un kit para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que incluye un primer reactivo y un segundo reactivo, donde se incluye polianión en el primer reactivo y se incluye colesterol oxidasa en el segundo reactivo y se incluyen colesterol esterasa, un surfactante no iónico, albúmina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo, y, más aún, si es necesario, se incluyen un derivado de ácido biliar, un agente estabilizador, un agente antiséptico, un agente de eliminación de substancias interfirientes y un promotor de reacción en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo.
Un kit para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que incluye un primer reactivo y un segundo reactivo, donde se incluyen colesterol esterasa, polianión, un surfactante no iónico, albúmina y una coenzima oxidada en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo y se incluye colesterol deshidrogenasa en el segundo reactivo, y, más aún, si es necesario, se incluyen un derivado de ácido biliar, un agente estabilizador, un agente antiséptico, un agente de eliminación de substancias interfirientes y un promotor de reacción en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo.
Un kit para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que incluye un primer reactivo y un segundo reactivo, donde se incluye polianión en el primer reactivo y se incluye colesterol deshidrogenasa en el segundo reactivo y se incluyen colesterol esterasa, un surfactante no iónico, albúmina y una coenzima oxidada en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo, y, más aún, si es necesario, se incluyen un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida, un derivado de ácido biliar, un agente estabilizador, un agente antiséptico, un agente de eliminación de substancias interfirientes y un promotor de reacción en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo.
También se describe aquí un kit para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que incluye un primer reactivo y un segundo reactivo, donde se incluyen colesterol esterasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter o un derivado aniónico de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo y se incluye colesterol oxidasa en el segundo reactivo, y, más aún, si es necesario, se incluyen polianión, albúmina, un agente estabilizador, un agente antiséptico, un agente de eliminación de substancias interfirientes y un promotor de reacción en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo
reactivo.
También se describe aquí un kit para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que incluye un primer reactivo y un segundo reactivo, donde se incluyen colesterol esterasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina, sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter o un derivado aniónico de ácido biliar y una coenzima oxidada en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo y se incluye colesterol deshidrogenasa en el segundo reactivo, y, más aún, si es necesario, se incluyen un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida, polianión, albúmina, un agente estabilizador, un agente antiséptico, un agente de eliminación de substancias interfirientes y un promotor de reacción en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo
reactivo.
Para ser más específicos, se describirán los siguientes kits.
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Kit 1
Primer reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, polianión, albúmina, un surfactante no iónico y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol oxidasa y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 2
Primer reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, polianión, albúmina, un surfactante no iónico, un derivado de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol oxidasa y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 3
Primer reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, polianión, albúmina, un surfactante no iónico y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol oxidasa, un derivado de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 4
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina, un surfactante no iónico y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 5
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina, un surfactante no iónico, un derivado de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
\newpage
Kit 6
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina, un surfactante no iónico y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, un derivado de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Kit 7
Primer reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, polianión, albúmina y un surfactante no iónico.
Segundo reactivo.
Un reactivo consistente en colesterol deshidrogenasa y una coenzima oxidada.
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Kit 8
Primer reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, polianión, albúmina, un surfactante no iónico y un derivado de ácido biliar.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol deshidrogenasa y una coenzima oxidada.
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Kit 9
Primer reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, polianión, albúmina y un surfactante no iónico.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol deshidrogenasa, un derivado de ácido biliar y una coenzima oxidada.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 10
Primer reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, polianión, albúmina y un surfactante no iónico.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol deshidrogenasa, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 11
Primer reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, polianión, albúmina, un surfactante no iónico y un derivado de ácido biliar.
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol deshidrogenasa, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 12
Primer reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, polianión, albúmina y un surfactante no iónico.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol deshidrogenasa, una coenzima oxidada, un derivado de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 13
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina y un surfactante no iónico.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa y una coenzima oxidada.
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Kit 14
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina y un surfactante no iónico.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, una coenzima oxidada y un derivado de ácido biliar.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 15
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina, un surfactante no iónico y un derivado de ácido biliar.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa y una coenzima oxidada.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 16
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina y un surfactante no iónico.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 17
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina y un surfactante no iónico.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, una coenzima oxidada, un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida y un derivado de ácido biliar.
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Kit 18
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina, un surfactante no iónico y un derivado de ácido biliar.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
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Kit 19
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, un surfactante no iónico y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 20
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina, un derivado de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, un surfactante no iónico y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 21
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, albúmina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, un surfactante no iónico, un derivado de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Kit 22
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, albúmina, un surfactante no iónico y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Kit 23
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión, un derivado de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, albúmina, un surfactante no iónico y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Kit 24
Primer reactivo
Un reactivo consistente en polianión y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, albúmina, un surfactante no iónico, un derivado de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Kit 25
Primer reactivo
Un reactivo consistente en un derivado aniónico de ácido biliar y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Kit 26 (Referencia)
Primer reactivo
Un reactivo consistente en un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, un derivado aniónico de ácido biliar, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Kit 27 (Referencia)
Primer reactivo
Un reactivo consistente en sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
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Kit 28 (Referencia)
Primer reactivo
Un reactivo consistente en un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
Segundo reactivo
Un reactivo consistente en colesterol esterasa, colesterol oxidasa, sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter, polioxietilenalquilamina o polioxietilenalquenilamina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno.
En el kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol según la presente invención, se pueden usar colesterol esterasa, colesterol oxidasa, colesterol deshidrogenasa, un surfactante no iónico, polianión, albúmina, un derivado de ácido biliar, un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno, una coenzima oxidada y un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida, los cuales han sido citados en el método antes mencionado para determinar cuantitativamente HDL-colesterol según la presente invención.
Si es necesario, el reactivo y el kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol según la presente invención pueden incluir además el medio acuoso, el agente estabilizador, el agente antiséptico, el agente de eliminación de substancias interfirientes, el promotor de reacción y similares antes mencionados.
El reactivo y el kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol según la presente invención pueden estar en forma liofilizada o en forma de disolución en un medio acuoso. Cuando se mide el HDL-colesterol en una muestra usando un reactivo en forma liofilizada, se disuelve el reactivo en un medio acuoso antes de su uso y se usa el reactivo disuelto para la medición.
Con respecto a la cantidad de colesterol esterasa, colesterol oxidasa y colesterol deshidrogenasa en el reactivo y el kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol según la presente invención, se prefiere una cantidad que dé una concentración de enzimas de 0,01 a 800 U/mL y más preferiblemente de 0,02 a 400 U/mL cuando se disuelven en un medio acuoso. Con respecto a la cantidad de surfactante no iónico en el reactivo y el kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol según la presente invención, se prefiere una cantidad que dé una concentración de surfactante no iónico del 0,0001 al 10% y más preferiblemente del 0,001 al 5% cuando se disuelve en un medio acuoso. Con respecto a la cantidad de polianión en el reactivo y el kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol según la presente invención, se prefiere una cantidad que dé una concentración de polianión del 0,001 al 10% y más preferiblemente del 0,01 al 5% cuando se disuelve en un medio acuoso.
Con respecto a la cantidad de albúmina en el reactivo y el kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol según la presente invención, se prefiere una cantidad que dé una concentración de albúmina del 0,001 al 10% y más preferiblemente del 0,01 al 5% cuando se disuelve en un medio acuoso. Con respecto a la cantidad de derivado de ácido biliar en el reactivo y el kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol según la presente invención, se prefiere una cantidad que dé una concentración de derivado de ácido biliar del 0,001 al 10% y más preferiblemente del 0,01 al 5% cuando se disuelve en un medio acuoso.
La presente invención será ahora ilustrada con más detalle en los siguientes Ejemplos, aunque no pretenden limitar en modo alguno el alcance de la presente invención. Incidentalmente, en los presentes Ejemplos se usaron los siguientes reactivos y enzimas.
HEPES (fabricado por BDH Laboratory), EMSE (fabricado por Daito Chemix Corporation), sulfato de dextrano y sodio (peso molecular: 500.000) (fabricado por Pharmacia), sulfato de dextrano y sodio (peso molecular: 80.000) (fabricado por ICN), \iota-carragenina (fabricada por Junsei Chemical), heparina litica (fabricada por Wako Pure Chemical), fosfotungstato de sodio (fabricado por Kanto Kagaku), seroalbúmina bovina (BSA; fabricada por Oriental Yeast), 4-aminoantipirina (fabricada por Saikyo Kasei), peroxidasa (fabricada por Toyobo), LPL311 (colesterol esterasa; fabricada por Toyobo), COO321 (colesterol oxidasa; fabricada por Toyobo), LPL6 (colesterol esterasa; Amano Enzyme), Nymeen® L207 (polioxietilendodecilamina; fabricada por NOF), Nymeen® S204 (polioxietilenocta-decil-amina; fabricada por NOF), Nymeen® S210 (polioxietilenoctadecilamina; fabricada por NOF), Newcol^{TM} 0D420 (polioxietilenoctadecilamina; fabricada por Nippon Nyukazai), Pionin^{TM} D3104 (polioxietilenlaurilamina; fabricada por Takemoto Yushi), Pionin^{TM} D3110 (polioxietilenlaurilamina; fabricada por Takemoto Yushi), Pionin^{TM} D3605 [polioxietilenalquil(soja)amina; fabricada por Takemoto Yushi], Newcol^{TM} 2608F (polioxialquilén fenil policíclico éter; fabricado por Nippon Nyukazai), Nikkol® R1020 (condensado de polioxietilén nonilfenil éter y formaldehído; fabricado por Nikko Chemicals), Adeka® Pullulonic TR704 (condensado de etilendiamina y polioxietileno-polioxipropileno, Asahi Denka), Emulmin® L90S (polioxietilén lauril éter; fabricado por Sanyo Chemical Industries), colato de sodio (fabricado por Acros), taurocolato de sodio (fabricado por Tokyo Kasei), glicocolato de sodio (fabricado por Tokyo Kasei), Newcol^{TM} 740-SF y Newcol^{TM} 707-SF (ambos sulfato de polioxietilén fenil policíclico éter; fabricados por Nippon Nyukazai).
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Ejemplo de referencia 1
Preparación de LPL311 químicamente modificada
Después de añadir LPL311 a un tampón HEPES (pH 8,5; 0,15 mol/L) para obtener 33 g/L y de enfriar a 5ºC, se añadió Sunbright® VFM-4101, Sunbright® AKM-1510 o Sunbright® MEAC-50HS (todos fabricados por NOF) para obtener 330 g/L y se dejó que reaccionaran durante 3 horas. No se purificó/separó la solución de enzima modificada resultante, sino que se usó como LPL311 químicamente modificada tal cual.
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Ejemplo 1
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
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Primer reactivo (reactivo A) 
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3 
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\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo a) 
\vskip1.000000\baselineskip
4 
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Ejemplo 2
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo A) 
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5
6 
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\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo b) 
\vskip1.000000\baselineskip
7 
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Ejemplo 3
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo A) 
\vskip1.000000\baselineskip
8 
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\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo c) 
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\newpage
Ejemplo 4
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
Primer reactivo (reactivo A)
10 
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo d)
11 
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Ejemplo comparativo 1
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
Primer reactivo (reactivo B)
12 
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Segundo reactivo (reactivo a)
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 2
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo C)
15 
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo a)
16 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 3
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo D)
17 
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo a)
18
19 
\vskip1.000000\baselineskip
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Ejemplo comparativo 4
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo E)
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo a)
21 
\vskip1.000000\baselineskip
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Ejemplo comparativo 5
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo F)
22
Segundo reactivo (reactivo a)
23 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 6
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
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Primer reactivo (reactivo G)
24 
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo a)
25 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se midió el HDL-colesterol en 30 muestras de suero humanas con un autoanalizador Hitachi 7170, utilizando el kit del Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) Preparación de la curva de calibración
Se preparó una curva de calibración que mostraba la relación entre la concentración de HDL-colesterol y la "absorbancia" mediante un autoanalizador Hitachi 7170, usando una solución salina fisiológica (concentración de HDL-colesterol: 0,0 mg/dL) y suero (concentración de HDL-colesterol: 60,0 mg/dL) como soluciones estándar y el kit del Ejemplo 1 como kit.
"Absorbancia", tal como se usa aquí, significa un valor obtenido restando E1 de E2 en base a las dos absorbancias (El y E2) medidas en la reacción siguiente.
Se añadieron una solución estándar (3 \muL) y el primer reactivo (0,24 mL) a una célula de reacción y se calentó a 37ºC durante 5 minutos. Después de medir la absorbancia (E1) de la solución de reacción a una longitud de onda principal de 600 nm y una sublongitud de onda de 700 nm, se añadió el segundo reactivo (0,08 mL) a la solución de reacción y se calentó la mezcla a 37ºC durante 5 minutos. Se midió la absorbancia (E2) de la solución de reacción a una longitud de onda principal de 600 nm y una sublongitud de onda de 700 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) Cálculo de la "absorbancia" para una muestra de suero humana por reacción de la muestra con el kit del Ejemplo 1
Se utilizó el mismo método que en el cálculo de la "absorbancia" en (1), excepto por la utilización de una muestra de suero humana en lugar de la solución estándar usada en la preparación de la curva de calibración en (1), calculándose así la "absorbancia" para la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
(3) Determinación cuantitativa de la concentración de HDL-colesterol en una muestra de suero humana
Se determinó la concentración de HDL-colesterol en cada muestra por correlación de la "absorbancia" calculada en (2) y la curva de calibración preparada en (1).
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Ejemplo 6
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 2 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
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Ejemplo 7
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del Ejemplo 3 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
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Ejemplo 8
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 4 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
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Ejemplo comparativo 7
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 1 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
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Ejemplo comparativo 8
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del Ejemplo comparativo 2 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\newpage
Ejemplo comparativo 9
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 3 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
Ejemplo comparativo 10
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 4 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
Ejemplo comparativo 11
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 5 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
Ejemplo comparativo 12
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 6 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
Mientras tanto, se determinó cuantitativamente el HDL-colesterol en las 40 muestras de suero humanas usadas en los Ejemplos 5 a 8 y en los Ejemplos comparativos 7 a 12 según un "DCM" (Designated Comparison Method) mencionado en Kimberly M.M., Leary E.T., Cole T.G., Waymack P.P., Clinical Chemistry, vol. 45, nº 10 (1999), 1803-1812, y se comparó con cada método.
En la Tabla 1 se muestran los coeficientes de correlación entre los métodos de los Ejemplos 5 a 8 o de los Ejemplos comparativos 7 a 12 y el DCM.
TABLA 1
26
Por comparación entre el Ejemplo 5 y los Ejemplos comparativos 7 a 12, se ve que se obtiene un buen coeficiente de correlación con la medición mediante el DCM sólo en el caso de la medición utilizando un kit que contiene a la vez BSA, sulfato de dextrano y de sodio y polioxietilenalquilamina además de enzimas para la medición del colesterol. Por comparación entre el Ejemplo 5 y el Ejemplo 6, se ve también que se obtiene un buen coeficiente de correlación con la medición mediante un DCM en el caso de la medición utilizando una colesterol esterasa químicamente modificada. Por comparación entre el Ejemplo 5 y el Ejemplo 7 y el Ejemplo 6 y el Ejemplo 8, se ve también que se obtiene una buena correlación con la medición mediante un DCM en el caso de la medición utilizando colato de sodio, un tipo de derivado de ácido biliar, además de enzimas para la medición del colesterol, BSA, sulfato de dextrano y de sodio y polioxietilenalquilamina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
Primer reactivo (reactivo H)
27
Segundo reactivo (reactivo a)
28
Ejemplo 10
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
Primer reactivo (reactivo I)
29
Segundo reactivo (reactivo a)
30 
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Ejemplo 11
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo J)
31 
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo a)
32 
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Ejemplo 12
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo K)
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo a)
35 
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Ejemplo 13
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 9 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un antoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 14
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 10 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 15
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 11 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
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Ejemplo 16
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 12 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\newpage
En la Tabla 2 se muestran los coeficientes de correlación entre el DCM y los métodos de medición de los Ejemplos 13 a 16.
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TABLA 2
36 
\vskip1.000000\baselineskip
Por comparación entre el Ejemplo 5 y los Ejemplos 13 a 16, se ve también que se obtiene un buen coeficiente de correlación con la medición mediante un DCM en el caso de las mediciones que emplean un polianión distinto del sulfato de dextrano y de sodio (peso molecular: 500.000).
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Ejemplo 17
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo L)
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo a)
38 
\newpage
Ejemplo 18
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo M)
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo a)
40 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 19
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo N)
41
Segundo reactivo (reactivo a) 
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 20
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo O) 
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
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Segundo reactivo (reactivo a) 
\vskip1.000000\baselineskip
44 
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Ejemplo 21
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
Primer reactivo (reactivo P) 
\vskip1.000000\baselineskip
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo a) 
\vskip1.000000\baselineskip
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 22
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo Q) 
\vskip1.000000\baselineskip
48
49
Segundo reactivo (reactivo a) 
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 23
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo Q) 
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo b) 
\vskip1.000000\baselineskip
52 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 24
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 17 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 25
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 18 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 26
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 19 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 27
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 20 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 28
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 21 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 29
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 22 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 30
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 23 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\newpage
En la Tabla 3 se muestran los coeficientes de correlación entre el DCM y los métodos de medición de los Ejemplos 24 a 30.
TABLA 3
53
Al igual que en el Ejemplo 5, se ve también que se obtiene un buen coeficiente de correlación con la medición mediante un DCM en el caso de las mediciones que utilizan surfactantes no iónicos distintos del Nymeen® L207 (polioxietilendodecilamina). Además, por comparación entre el Ejemplo 29 y el Ejemplo 30, se ve que se obtiene un buen coeficiente de correlación con la medición mediante un DCM en el caso de la medición que utiliza una colesterol esterasa químicamente modificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 31
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
Primer reactivo (reactivo R)
54 
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo e)
55
Ejemplo 32
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo R) 
\vskip1.000000\baselineskip
56 
\vskip1.000000\baselineskip
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Segundo reactivo (reactivo f) 
\vskip1.000000\baselineskip
57
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 33
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo R) 
\vskip1.000000\baselineskip
59
Segundo reactivo (reactivo g) 
\vskip1.000000\baselineskip
60 
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Ejemplo 34
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo S) 
\vskip1.000000\baselineskip
61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo g) 
\vskip1.000000\baselineskip
62
63 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 35
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
Primer reactivo (reactivo T) 
\vskip1.000000\baselineskip
64 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo g)
65 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 36
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo D) 
\vskip1.000000\baselineskip
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo d) 
\vskip1.000000\baselineskip
67
Ejemplo 37
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo F) 
\vskip1.000000\baselineskip
68 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo d) 
\vskip1.000000\baselineskip
69 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 38
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo G) 
\vskip1.000000\baselineskip
70
Segundo reactivo (reactivo d)
71 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 13
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo R)
72 
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo b)
73 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 14
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo S)
74
Segundo reactivo (reactivo b)
75 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 15
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo T)
76 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo b)
77
78 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 16
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo U)
79
Segundo reactivo (reactivo e)
80 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 17
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo U)
81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo f)
82
83 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 18
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo U)
84 
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo g)
85
Ejemplo 39
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 31 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 40
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 32 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 41
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 33 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 42
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 34 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 43
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 35 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 44
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 36 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 45
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 37 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 46
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 38 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 19
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 13 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 20
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 14 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 21
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 15 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 22
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 16 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 23
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 17 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 24
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Se realizó la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 18 en lugar del kit del Ejemplo 1, midiéndose así el HDL-colesterol en 40 muestras de suero humanas mediante un autoanalizador Hitachi 7170.
En la Tabla 4 se muestran los coeficientes de correlación entre el DCM y los métodos de medición de los Ejemplos 39 a 46 o de los Ejemplos comparativos 19 a 24.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4
86 
\vskip1.000000\baselineskip
Por comparación entre los Ejemplos 39 a 43 y los Ejemplos comparativos 19 a 24, se ve que la medición usando kits que incluyen tanto un derivado aniónico de ácido biliar y polioxietilenalquilamina guarda una mejor correlación con la medición mediante un DCM que la medición usando kits que incluyen sólo uno entre un derivado aniónico de ácido biliar y polioxietilenalquilamina. Más aún, por comparación entre el Ejemplo 44 y los Ejemplos 45 a 46, se ve también que se observa un buen coeficiente de correlación con la medición mediante un DCM en el caso de la medición que utiliza kits que incluyen sulfato de dextrano o albúmina además de enzimas para la medición del colesterol, un derivado aniónico de ácido biliar y polioxietilenalquilamina.
\newpage
Ejemplo 47
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo V) 
\vskip1.000000\baselineskip
88 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo h) 
\vskip1.000000\baselineskip
89
90 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 48
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo W) 
\vskip1.000000\baselineskip
91
Segundo reactivo (reactivo i) 
\vskip1.000000\baselineskip
92 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 49
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo W) 
\vskip1.000000\baselineskip
93 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo h) 
\vskip1.000000\baselineskip
94 
\newpage
Ejemplo 50
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo X) 
\vskip1.000000\baselineskip
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo h) 
\vskip1.000000\baselineskip
96 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 51
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo Y) 
\vskip1.000000\baselineskip
97
Segundo reactivo (reactivo h) 
\vskip1.000000\baselineskip
98 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 52
(Referencia)
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo Z) 
\vskip1.000000\baselineskip
99 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo h) 
\vskip1.000000\baselineskip
100
101 
\newpage
Ejemplo comparativo 25
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo V)
102 
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo b)
103 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 26
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Primer reactivo (reactivo W)
104 
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo b)
105
106 
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo comparativo 27
Kit para determinar cuantitativamente HDL-colesterol
Se preparó un kit para determinar cuantitativamente el HDL-colesterol que incluía el primer reactivo y el segundo reactivo siguientes.
Primer reactivo (reactivo U)
107 
\vskip1.000000\baselineskip
Segundo reactivo (reactivo h)
108
Ejemplo 53
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Mediante la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 47 en lugar del kit del Ejemplo 1, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas en un autoanalizador Hitachi 7170.
Ejemplo 54
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Mediante la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 48 en lugar del kit del Ejemplo 1, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas en un autoanalizador Hitachi 7170.
Ejemplo 55
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Mediante la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 49 en lugar del kit del Ejemplo 1, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas en un autoanalizador Hitachi 7170.
Ejemplo 56
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Mediante la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 50 en lugar del kit del Ejemplo 1, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas en un autoanalizador Hitachi 7170.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 57
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Mediante la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 51 en lugar del kit del Ejemplo 1, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas en un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 58
(Referencia)
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Mediante la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo 52 en lugar del kit del Ejemplo 1, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas en un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 28
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Mediante la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 25 en lugar del kit del Ejemplo 1, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas en un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 29
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Mediante la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 2 6 en lugar del kit del Ejemplo 1, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas en un autoanalizador Hitachi 7170.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo 30
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol
Mediante la misma operación que en el método de medición del Ejemplo 5, excepto por la utilización del kit del Ejemplo comparativo 27 en lugar del kit del Ejemplo 1, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de 40 muestras de suero humanas en un autoanalizador Hitachi 7170.
En la Tabla 5 se muestran los coeficientes de correlación entre un DCM y los métodos de medición de los Ejemplos 53 a 58 o de los Ejemplos comparativos 28 a 30.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5
109 
\newpage
\global\parskip0.920000\baselineskip
110
Por comparación entre los Ejemplos 53 a 55 y los Ejemplos comparativos 28 a 30, se ve que la medición usando kits que incluyen tanto un sulfato de polioxietilenfenilo policíclico aniónico como polioxietilenalquilamina guarda una mejor correlación con la medición mediante un DCM que la medición usando kits que contienen sólo uno entre sulfato de polioxietilenfenilo policíclico y polioxietilenalquilamina. Más aún, por comparación entre el Ejemplo 55 y los Ejemplos 56 a 58, se ve también que se observa una buena correlación con la medición mediante un DCM en el caso de la medición que utiliza kits que incluyen sulfato de dextrano y/o albúmina además de enzimas para la medición del colesterol, sulfato de polioxietilenfenilo policíclico y polioxietilenalquilamina.
Ejemplo 59
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol en suero de pacientes que sufren de proteinemia M
Mediante una operación similar al método de medición del Ejemplo 5, usando sueros de pacientes que sufren de proteinemia M como muestra y el kit del Ejemplo 1 como kit, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de las muestras de suero en un autoanalizador Hitachi 7170. Para cada muestra de suero, se muestra en la Tabla 6 la absorbancia 5 minutos después de la adición del primer reactivo a cada muestra, es decir, la absorbancia (E1) de la solución de reacción justo antes de la adición del segundo reactivo, y se muestra en la Tabla 7 el valor medido del HDL-colesterol para cada muestra de suero. Por razones de comparación, se da también en la Tabla 7 el valor medido obtenido en la medición de cada uno de los sueros de pacientes que sufren de M proteinemia M mediante un DCM.
Ejemplo comparativo 31
Determinación cuantitativa del HDL-colesterol en suero derivado de pacientes que sufren de proteinemia M
Mediante una operación similar al método de medición del Ejemplo 5, usando sueros de pacientes que sufren de proteinemia M como muestra y el kit del Ejemplo comparativo 5 como kit, se midió la concentración de HDL-colesterol en cada una de las muestras de suero en un autoanalizador Hitachi 7170. Para cada muestra de suero, se muestra en la Tabla 6 la absorbancia 5 minutos después de la adición del primer reactivo a cada muestra, es decir, la absorbancia (E1) de la solución de reacción justo antes de la adición del segundo reactivo, y se muestra en la Tabla 7 el valor medido del HDL-colesterol para cada muestra de suero.
TABLA 6
111 
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Como muestra la Tabla 6, se ve que la turbidez causada por la proteína insoluble en agua no desaparece en la medición que utiliza el kit del Ejemplo comparativo 5 incluso antes de la adición del segundo reactivo, mientras que la turbidez causada por la proteína insoluble en agua desaparece antes de la adición del segundo reactivo en la medición que utiliza el kit del Ejemplo 1 que incluye sulfato de dextrano.
TABLA 7
112
Como muestra la Tabla 7, los valores medidos obtenidos mediante la medición (Ejemplo 59) que utiliza un kit del Ejemplo 1 eran prácticamente iguales a los valores medidos obtenidos mediante un DCM, pero los valores medidos obtenidos mediante la medición (Ejemplo comparativo 31) que utiliza un kit del Ejemplo comparativo 5 diferían mucho de los valores medidos obtenidos mediante el Ejemplo 59 u obtenidos mediante un DCM y no reflejaban una medición precisa. Por consiguiente, se ve también que el kit de la presente invención permite una determinación cuantitativa precisa del HDL-colesterol incluso en muestras procedentes de pacientes que sufren de proteinemia M.
Según la presente invención, se proporciona un método simple y preciso para la determinación cuantitativa del HDL-colesterol en una muestra, así como un reactivo y un kit utilizados para el mismo.

Claims (13)

1. Un método para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad en una muestra, que consiste en:
\quad
reacción de una muestra con i) colesterol esterasa y colesterol oxidasa o ii) colesterol esterasa, una coenzima oxidada y colesterol deshidrogenasa en un medio acuoso que contiene un surfactante no iónico, polianión y albúmina, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo, y medición del peróxido de hidrógeno formado o una coenzima reducida.
2. El método según la reivindicación 1, donde el medio acuoso contiene además un derivado de ácido biliar.
3. El método según la reivindicación 2, donde el derivado de ácido biliar es un derivado aniónico de ácido biliar.
4. Un reactivo para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que consiste en un surfactante no iónico, polianión, albúmina, colesterol esterasa, colesterol oxidasa y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina, y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.
5. Un reactivo para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que consiste en un surfactante no iónico, polianión, albúmina, colesterol esterasa, colesterol deshidrogenasa y una coenzima oxidada, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.
6. El reactivo según la reivindicación 5, que además incluye un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida.
7. El reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que además incluye un derivado de ácido biliar.
8. El reactivo según la reivindicación 7, donde el derivado de ácido biliar es un derivado aniónico de ácido biliar.
9. Un kit para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que consiste en un primer reactivo y un segundo reactivo, donde se incluyen colesterol esterasa, polianión, un surfactante no iónico, albúmina y un reactivo para determinar cuantitativamente peróxido de hidrógeno en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo y se incluye colesterol oxidasa en el segundo reactivo, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.
10. Un kit para determinar cuantitativamente colesterol en lipoproteínas de alta densidad, que consiste en un primer reactivo y un segundo reactivo, donde se incluyen colesterol esterasa, polianión, un surfactante no iónico, albúmina y una coenzima oxidada en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo y se incluye colesterol deshidrogenasa en el segundo reactivo, donde el surfactante no iónico es seleccionado entre el grupo consistente en polioxietilenalquilamina y polioxietilenalquenilamina y donde el polianión es sulfato de dextrano o una sal del mismo.
11. El kit según la reivindicación 10, que además incluye un reactivo para determinar cuantitativamente una coenzima reducida en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo.
12. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que además incluye un derivado de ácido biliar en cualquiera o en ambos del primer reactivo y/o del segundo reactivo.
13. El kit según la reivindicación 12, donde el derivado de ácido biliar es un derivado aniónico de ácido biliar.
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