JP6047778B2 - 測定対象物質の測定方法及び測定試薬、並びにビリルビンに由来する影響の回避方法 - Google Patents
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Description
本発明は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法及び試薬であって、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができる試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬に関するものである。
また、本発明は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定する試料中の測定対象物質の測定における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避する方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
また、本発明は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定する試料中の測定対象物質の測定における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避する方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法及び試薬は、その測定が正確であること等により繁用されている。
しかしながら、これらの測定方法及び測定試薬による試料中の測定対象物質の測定は、試料に含まれる種々の還元物質、薬剤又は色素等により、影響を受け易いことも知られている。
これらの影響を与える物質の中でも、ビリルビンは生体試料中に遊離型又は抱合型として存在しており、試料中の測定対象物質の測定値に誤差を生じさせ、測定に影響を与えることが分かっている。
試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避する方法としては、例えば、過酸化水素に対する親和性が高く、ビリルビンより速く過酸化水素と反応して発色する色原体を使用する方法（非特許文献１参照。）、フェロシアン化カリウム、ヨウ素酸又は過ヨウ素酸などの酸化剤を使用してビリルビンを分解する方法（非特許文献１参照。）、内因性基質を利用する乳酸オキシダーゼ若しくはウリカーゼ反応などの前処理酵素反応により発生させた過酸化水素によりビリルビンを酸化分解する方法（非特許文献１参照。）、ビリルビンオキシダーゼを使用する方法（特許文献１参照。）、２価の銅イオン化合物と界面活性剤及び／又はシアン化合物を使用する方法（特許文献２参照。）、陽イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤を使用する方法（特許文献３参照。）、両性界面活性剤を使用する方法（特許文献４参照。）、フェロシアン化化合物と多糖及びアルキル基等のアグリコンよりなる非イオン性界面活性剤を使用する方法（特許文献５参照。）、鉄錯体とステロイド骨格を有するアルキル基及びポリオキシアルキレン基を含む界面活性剤を使用する方法（特許文献６参照。）、及びｐＨ７以上で亜鉛イオンを使用する方法（特許文献７参照。）等が提案されているが、必ずしも完全とは言えなかった。
すなわち、試料中の測定対象物質の測定においては、正確な測定結果（測定値）を得るため、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避する方法の更なる改善が望まれていた。
臨床検査法提要，第３３版，第３７頁，金井正光監修，金原出版，２０１０年４月１日発行
試料中の測定対象物質の測定においては、試料に含まれるビリルビンにより当該測定が影響を受け、測定結果（測定値）に誤差が生じることがあった。
このため、例えば、医療の場における臨床検査において、試料中の測定対象物質の測定結果（測定値）を診断に利用しようとする場合、疾患等の診断を誤らせる可能性があった。
このため、例えば、医療の場における臨床検査において、試料中の測定対象物質の測定結果（測定値）を診断に利用しようとする場合、疾患等の診断を誤らせる可能性があった。
従って、試料中の測定対象物質の測定においては、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避が更に向上した、測定方法、測定試薬及びビリルビンに由来する測定への影響の回避方法が望まれていた。
これに対して、本発明の課題は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法及び試薬であって、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができる試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬を提供することである。
また、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することによる試料中の測定対象物質の測定における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避する方法を提供することである。
本発明者らは、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避について検討を重ねたところ、特定の化合物を存在させて測定を行うことにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
（１） 酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とする、試料中の測定対象物質の測定方法。
（２） ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避する、前記（１）記載の試料中の測定対象物質の測定方法。
（３） 酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する試薬において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含有させることを特徴とする、試料中の測定対象物質の測定試薬。
（４） ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避剤として含有させる、前記（３）記載の試料中の測定対象物質の測定試薬。
（５） 酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当り、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とする、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法。
（１） 酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とする、試料中の測定対象物質の測定方法。
（２） ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避する、前記（１）記載の試料中の測定対象物質の測定方法。
（３） 酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する試薬において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含有させることを特徴とする、試料中の測定対象物質の測定試薬。
（４） ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避剤として含有させる、前記（３）記載の試料中の測定対象物質の測定試薬。
（５） 酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当り、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とする、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法。
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法、試料中の測定対象物質の測定試薬、及び試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法は、試料に含まれる測定対象物質の測定において、試料に含まれるビリルビンにより当該測定が影響を受けるのを回避し、測定結果（測定値）に誤差が生じるのを防ぐことができるものである。
すなわち、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法、試料中の測定対象物質の測定試薬、及び試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法においては、試料に含まれるビリルビンによる影響を受けない、正確な測定結果（測定値）を得ることができるものである。
これにより、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法、試料中の測定対象物質の測定試薬、及び試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法は、例えば、医療の場において、診断を誤らせることを防ぐことができるものである。
〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法
１．総論
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とするものである。
１．総論
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とするものである。
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができる。
２．ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物
（１）総論
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なう。
（１）総論
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なう。
本発明においては、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物を総称して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物という。
（２）ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物
本発明におけるポリオキシエチレンアルキルアミン化合物であるが、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物であれば特に限定なく用いることができる。
本発明におけるポリオキシエチレンアルキルアミン化合物であるが、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物であれば特に限定なく用いることができる。
本発明において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物としては、一般式（Ｉ）〔式中、Ｒ1は炭素数５〜３０の飽和又は不飽和のアルキル基であり、ｍ及びｎはそれぞれエチレンオキシド付加モル数であって１以上の整数のものであり、ｍとｎの和は２〜３０である〕で表されるポリオキシエチレンアルキルアミン化合物が好ましい。
なお、この一般式（Ｉ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミン化合物のＲ1における飽和又は不飽和のアルキル基の炭素数の下限については、より好ましくは炭素数８以上であり、特に好ましくは炭素数１２以上である。
また、この一般式（Ｉ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミン化合物のＲ1における飽和又は不飽和のアルキル基の炭素数の上限については、より好ましくは炭素数２０以下であり、特に好ましくは炭素数１８以下である。
そして、この一般式（Ｉ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミン化合物におけるｍとｎの和の下限については、より好ましくは５以上であり、特に好ましくは１０以上である。（なお、ｍ及びｎはそれぞれ１以上の整数である。）
また、この一般式（Ｉ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミン化合物におけるｍとｎの和の上限については、より好ましくは２５以下であり、特に好ましくは２０以下である。（なお、ｍ及びｎはそれぞれ１以上の整数である。）
ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物として、より具体的には、例えば、ポリオキシエチレンオレイルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数１８、二重結合数１のオレイル基）、ポリオキシエチレンステアリルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数１８、飽和のステアリル基）、ポリオキシエチレンラウリルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数１２、飽和のラウリル基）、又はポリオキシエチレンオクチルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数８、飽和のオクチル基）等を挙げることができる。
また、本発明において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物として、ポリオキシエチレンヤシ油アルキルアミンをも挙げることができる。
なお、ヤシ油の一般的な脂肪酸組成は、カプリル酸（Ｃ７Ｈ１５ＣＯＯＨ；飽和）８％、カプリン酸（Ｃ９Ｈ１９ＣＯＯＨ；飽和）６％、ラウリン酸（Ｃ１１Ｈ２３ＣＯＯＨ；飽和）４９％、ミリスチン酸（Ｃ１３Ｈ２７ＣＯＯＨ；飽和）１８％、パルミチン酸（Ｃ１５Ｈ３１ＣＯＯＨ；飽和）８％、ステアリン酸（Ｃ１７Ｈ３５ＣＯＯＨ；飽和）３％、及びオレイン酸（Ｃ１７Ｈ３４ＣＯＯＨ；二重結合数１）７％である。
なお、本発明において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物として、ポリオキシエチレン牛脂アルキルアミンをも挙げることができる。
ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物として、更に具体的には、例えば、ポリオキシエチレンオレイルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数１８、二重結合数１のオレイル基）として、「ナイミーン Ｏ」〔日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンステアリルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数１８、飽和のステアリル基）として、例えば、「ナイミーン Ｓ」〔日油株式会社（日本国）〕又は「アミート」〔花王株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンラウリルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数１２、飽和のラウリル基）として、例えば、「ナイミーン Ｌ」〔日油株式会社（日本国）〕、「アミート」〔花王株式会社（日本国）〕、又は「ニッコールＴＡＭＮＤ」〔日光ケミカルズ株式会社（日本国）〕、等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンヤシ油アルキルアミンとして、例えば、「ナイミーン Ｆ」〔日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレン牛脂アルキルアミンとして、例えば、「ナイミーン Ｔ２」〔日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。（なお、「ナイミーン」は登録商標である。）
ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物として、より詳細には、例えば、ポリオキシエチレンオレイルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数１８、二重結合数１のオレイル基）として、「ナイミーン Ｏ−２０５」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：５）〔日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンステアリルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数１８、飽和のステアリル基）として、例えば、「ナイミーン Ｓ−２０２」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：２）若しくは「ナイミーン Ｓ−２０４」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：４）若しくは「ナイミーン Ｓ−２１０」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：１０）若しくは「ナイミーン Ｓ−２１５」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：１５）若しくは「ナイミーン Ｓ−２２０」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：２０）〔いずれも日油株式会社（日本国）〕、又は「アミート ３０２」若しくは「アミート ３０８」若しくは「アミート ３２０」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：２０）〔いずれも花王株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンラウリルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数１２、飽和のラウリル基）として、例えば、「ナイミーン Ｌ−２０２」若しくは「ナイミーン Ｌ−２０７」〔いずれも日油株式会社（日本国）〕、又は「アミート １０２」若しくは「アミート １０５」〔いずれも花王株式会社（日本国）〕、又は「ニッコールＴＡＭＮＤ−１５」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：１５）〔日光ケミカルズ株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンオクチルアミン（アルキル基Ｒ1は炭素数８、飽和のオクチル基）として、例えば、「ポリオキシエチレンオクチルアミン」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：１０）等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンヤシ油アルキルアミンとして、例えば、「ナイミーン Ｆ−２０２」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：２）、「ナイミーン Ｆ−２０３」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：３）、「ナイミーン Ｆ−２０５」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：５）、「ナイミーン Ｆ−２１０」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：１０）、又は「ナイミーン Ｆ−２１５」（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：１５）〔いずれも日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレン牛脂アルキルアミンとして、例えば、「ナイミーン Ｔ２−２０２」、「ナイミーン Ｔ２−２１０」、又は「ナイミーン Ｔ２−２３０」〔いずれも日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
（３）ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物
本発明におけるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物であるが、ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物であれば特に限定なく用いることができる。
本発明におけるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物であるが、ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物であれば特に限定なく用いることができる。
本発明において、ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物としては、一般式（ＩＩ）〔式中、Ｒ2−ＣＯ−Ｎは炭素数５〜３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基であり、ｐ及びｑはそれぞれエチレンオキシド付加モル数であって１以上の整数のものであり、ｐとｑの和は２〜３０である〕で表されるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物が好ましい。
なお、一般式（ＩＩ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物において、Ｒ2−ＣＯ−Ｎにおける飽和又は不飽和の脂肪酸残基の炭素数の下限については、より好ましくは炭素数８以上であり、特に好ましくは炭素数１２以上である。
また、一般式（ＩＩ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物において、Ｒ2−ＣＯ−Ｎにおける飽和又は不飽和の脂肪酸残基の炭素数の上限については、より好ましくは炭素数２０以下であり、特に好ましくは炭素数１８以下である。
そして、この一般式（ＩＩ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物におけるｐとｑの和の下限については、より好ましくは５以上であり、特に好ましくは１０以上である。（なお、ｐ及びｑはそれぞれ１以上の整数である。）
また、この一般式（ＩＩ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物におけるｐとｑの和の上限については、より好ましくは２５以下であり、特に好ましくは２０以下である。（なお、ｐ及びｑはそれぞれ１以上の整数である。）
また、本発明において、ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物としては、一般式（ＩＩＩ）〔式中、Ｒ3−ＣＯ−ＮＨは炭素数５〜３０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基であり、ｒはエチレンオキシド付加モル数であって１〜３０の整数である〕で表されるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物も好ましい。
なお、一般式（ＩＩＩ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物において、Ｒ3−ＣＯ−ＮＨにおける飽和又は不飽和の脂肪酸残基の炭素数の下限については、より好ましくは炭素数８以上であり、特に好ましくは炭素数１２以上である。
また、一般式（ＩＩＩ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物において、Ｒ3−ＣＯ−ＮＨにおける飽和又は不飽和の脂肪酸残基の炭素数の上限については、より好ましくは炭素数２０以下であり、特に好ましくは炭素数１８以下である。
そして、この一般式（ＩＩＩ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物におけるｒの下限については、より好ましくは５以上であり、特に好ましくは１０以上である。（なお、ｒは整数である。）
また、この一般式（ＩＩＩ）で表されるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物におけるｒの上限については、より好ましくは２５以下であり、特に好ましくは２０以下である。（なお、ｒは整数である。）
ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物として、より具体的には、例えば、ポリオキシエチレンオレイン酸アミド（脂肪酸残基の基となる脂肪酸は炭素数１８、二重結合数１のオレイン酸）、又はポリオキシエチレンラウリン酸アミド（脂肪酸残基Ｒ3−ＣＯ−ＮＨの基となる脂肪酸は炭素数１２、飽和のラウリン酸）等を挙げることができる。
また、本発明において、ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物として、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸アミド等をも挙げることができる。
なお、ヤシ油の一般的な脂肪酸組成は、カプリル酸（Ｃ７Ｈ１５ＣＯＯＨ；飽和）８％、カプリン酸（Ｃ９Ｈ１９ＣＯＯＨ；飽和）６％、ラウリン酸（Ｃ１１Ｈ２３ＣＯＯＨ；飽和）４９％、ミリスチン酸（Ｃ１３Ｈ２７ＣＯＯＨ；飽和）１８％、パルミチン酸（Ｃ１５Ｈ３１ＣＯＯＨ；飽和）８％、ステアリン酸（Ｃ１７Ｈ３５ＣＯＯＨ；飽和）３％、及びオレイン酸（Ｃ１７Ｈ３４ＣＯＯＨ；二重結合数１）７％である。
なお、ヤシ油の一般的な脂肪酸組成は、カプリル酸（Ｃ７Ｈ１５ＣＯＯＨ；飽和）８％、カプリン酸（Ｃ９Ｈ１９ＣＯＯＨ；飽和）６％、ラウリン酸（Ｃ１１Ｈ２３ＣＯＯＨ；飽和）４９％、ミリスチン酸（Ｃ１３Ｈ２７ＣＯＯＨ；飽和）１８％、パルミチン酸（Ｃ１５Ｈ３１ＣＯＯＨ；飽和）８％、ステアリン酸（Ｃ１７Ｈ３５ＣＯＯＨ；飽和）３％、及びオレイン酸（Ｃ１７Ｈ３４ＣＯＯＨ；二重結合数１）７％である。
ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物として、更に具体的には、例えば、ポリオキシエチレンオレイン酸アミド（脂肪酸残基の基となる脂肪酸は炭素数１８、二重結合数１のオレイン酸）として、「ＴＡＭＤＯ」〔日光ケミカルズ株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンラウリン酸アミド（脂肪酸残基Ｒ3−ＣＯ−ＮＨの基となる脂肪酸は炭素数１２、飽和のラウリン酸）として、例えば、「ナイミッド ＭＬ」〔日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸アミドとして、例えば、「ナイミッド ＤＦ」〔日油株式会社（日本国）〕、「ナイミッド ＭＦ」〔日油株式会社（日本国）〕、又は「ナイミッド Ｆ」〔日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。（なお、「ナイミッド」は登録商標である。）
ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物として、より詳細には、例えば、ポリオキシエチレンオレイン酸アミド（脂肪酸残基の基となる脂肪酸は炭素数１８、二重結合数１のオレイン酸）として、「ＴＡＭＤＯ−１０」（エチレンオキシド付加モル数：１０）〔日光ケミカルズ株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンラウリン酸アミド（脂肪酸残基Ｒ3−ＣＯ−ＮＨの基となる脂肪酸は炭素数１２、飽和のラウリン酸）として、例えば、「ナイミッド ＭＬ−２０３」（エチレンオキシド付加モル数であるｒの数：３）、又は「ナイミッド ＭＬ−２１１」（エチレンオキシド付加モル数であるｒの数：１１）〔いずれも日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸アミドとして、例えば、「ナイミッド ＤＦ−２０３」（エチレンオキシド付加モル数であるｐとｑの和：３）〔日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸アミドとして、例えば、「ナイミッド ＭＦ−２０３」（エチレンオキシド付加モル数であるｒの数：３）、又は「ナイミッド ＭＦ−２１０」（エチレンオキシド付加モル数であるｒの数：１１）〔いずれも日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
また、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸アミドとして、例えば、「ナイミッド Ｆ−２０５」（エチレンオキシド付加モル数であるｒの数：５）〔日油株式会社（日本国）〕等を挙げることができる。
（４）ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物の濃度等の詳細
本発明においては、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行うものであって、このポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させる濃度は、特に限定されないが、測定反応時において、０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
本発明においては、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行うものであって、このポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させる濃度は、特に限定されないが、測定反応時において、０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
なお、このポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させる好ましい濃度の下限は、測定反応時において、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。
また、このポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させる濃度であるが、測定反応時における濃度に上限は特にはないが、コスト等のことを考えると２％（ｗ／ｖ）迄で十分である。
なお、このポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させる好ましい濃度の上限は、測定反応時において、より好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下である。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬には、測定反応時に前記の濃度となるような濃度のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
なお、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物は、１種類のものを存在させて測定を行ってもよく、又は複数種類のものを存在させて測定を行ってもよい。
そして、本発明においては、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物として、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物だけを存在させて測定を行ってもよく、又はポリオキシエチレンアルキルアミド化合物だけを存在させて測定を行ってもよく、又はポリオキシエチレンアルキルアミン化合物とポリオキシエチレンアルキルアミド化合物の両方を存在させて測定を行ってもよい。
また、本発明において、その測定反応が一つの段階のみよりなる場合は、その段階の測定反応においてポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させる。
また、測定反応が二つ以上の複数の段階よりなる場合は、少なくとも、この測定反応の最終段階の反応時において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させることが好ましい。
そして、本発明においては、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができる。
３．試料中の測定対象物質の測定
（１）総論
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とするものである。
（１）総論
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とするものである。
この酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する方法であるが、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定することができる方法であればよく、特に限定はない。
この方法としては、例えば、酸化酵素を用いて、測定対象物質から直接又は間接的に、過酸化水素を生じさせ、これをペルオキシダーゼ及び色原体と混合、接触させて発色系に導き、酸化反応により色原体から生成した色素を光学的に測定することにより、生成した過酸化水素の測定を行い、これにより試料に含まれる測定対象物質を測定する方法等を挙げることができる。
より具体的には、例えば、酸化酵素を用いて、測定対象物質から直接又は間接的に、過酸化水素を生じさせ、これをペルオキシダーゼ、水素供与体である色原体、及びこの色原体の縮合対象物としてのカップラーと混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により色原体から生成した色素を光学的に測定することにより、生成した過酸化水素の測定を行い、これにより試料に含まれる測定対象物質を測定する方法等を挙げることができる。
また、例えば、酸化酵素を用いて、測定対象物質から直接又は間接的に、過酸化水素を生じさせ、これをペルオキシダーゼ及び色原体と混合、接触させて前記のカップラーを用いることなく発色系に導き、酸化反応により色原体から生成した色素を光学的に測定することにより、生成した過酸化水素の測定を行い、これにより試料に含まれる測定対象物質を測定する方法等をも挙げることができる。
（２）試料
本発明における試料は、測定対象物質を含む可能性がある試料であって、これを測定しようとするものである。
本発明における試料は、測定対象物質を含む可能性がある試料であって、これを測定しようとするものである。
前記の通りのものであれば、試料として特に限定はないが、例えば、試料として、生体試料、食肉、野菜、穀物、果物、水産物、加工食品、飲料、飲料水、井戸水、河川水、湖沼水、海水、土壌、空気、又は医薬品等を挙げることができる。
例えば、生体試料としては、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大便、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水、脳等の臓器、毛髪や皮膚や爪や筋肉若しくは神経等の組織及び細胞等を挙げることができる。
本発明においては、試料は液体であることが好ましい。
もし、測定対象物質を含む試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を公知の方法に従って行ない、測定対象物質を液体中に含有させるようにしてもよい。
もし、測定対象物質を含む試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を公知の方法に従って行ない、測定対象物質を液体中に含有させるようにしてもよい。
なお、本発明において、試料としては生体試料が好ましく、血液、血清、血漿又は尿が試料としてより好ましい。
（３）測定対象物質
本発明における測定対象物質は、試料に含まれ、試料中における存在の有無又は量（若しくは濃度）を測定しようとするものであって、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することによって測定することができる物質である。
前記の通りのものであれば、測定対象物質として特に限定はない
本発明における測定対象物質は、試料に含まれ、試料中における存在の有無又は量（若しくは濃度）を測定しようとするものであって、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することによって測定することができる物質である。
前記の通りのものであれば、測定対象物質として特に限定はない
この測定対象物質の例を表１に示した。
本発明において、測定対象物質としてはクレアチニン、又は尿酸が好ましく、測定対象物質としてクレアチニンがより好ましい。
（４）酸化酵素
本発明において、酸化酵素とは、試料に含まれる測定対象物質から直接又は間接的に、酸化性物質である過酸化水素を生成させる反応を触媒する物質をいい、このような物質であれば特に限定なく用いることができる。
本発明において、酸化酵素とは、試料に含まれる測定対象物質から直接又は間接的に、酸化性物質である過酸化水素を生成させる反応を触媒する物質をいい、このような物質であれば特に限定なく用いることができる。
この試料中の測定対象物質の測定に用いる、「酸化酵素」及び「他の主要な成分」の例をも表１に示した。（なお、酸化酵素による反応によって生じた過酸化水素から色素を生成させるペルオキシダーゼ、色原体、及びカップラーについては、後に詳細に記載するため、この表１の「他の主要な成分」の欄には記載していない。）
すなわち、酸化酵素としては、例えば、ザルコシンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、グルコース酸化酵素、コリン酸化酵素、又はアシルＣｏＡ酸化酵素等を挙げることができる。
本発明において、酸化酵素としてはザルコシンオキシダーゼ、又はウリカーゼが好ましく、酸化酵素としてザルコシンオキシダーゼがより好ましい。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定において、酸化酵素の活性値は、特に限定されないが、測定反応時において、１００単位／Ｌ（Ｕｎｉｔ／Ｌ）以上であることが好ましい。
また、この酸化酵素の活性値の下限は、測定反応時において、より好ましくは１，０００単位／Ｌ以上であり、特に好ましくは５，０００単位／Ｌ以上である。
そして、この酸化酵素の測定反応時の活性値に上限は特にはないが、コスト等のことを考えると１００，０００単位／Ｌ迄で十分である。
また、この酸化酵素の活性値の上限は、測定反応時において、より好ましくは８０，０００単位／Ｌ以下であり、特に好ましくは５０，０００単位／Ｌ以下である。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬には、測定反応時に前記の活性値となるような活性値の酸化酵素を、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
（５）ペルオキシダーゼ
本発明においては、酸化酵素による反応によって生じた過酸化水素から色素を生成させるために、色原体と共に、又は色原体及びカップラーと共に、ペルオキシダーゼ（パーオキシダーゼ、ＰＯＤ）を用いることができる。
本発明においては、酸化酵素による反応によって生じた過酸化水素から色素を生成させるために、色原体と共に、又は色原体及びカップラーと共に、ペルオキシダーゼ（パーオキシダーゼ、ＰＯＤ）を用いることができる。
このペルオキシダーゼとしては、過酸化水素により色原体を酸化し色素を生成する反応を触媒することができるもの、又は過酸化水素により色原体とカップラーを酸化縮合させて色素を生成する反応を触媒することができるもの、であれば特に限定なく用いることができる。
このペルオキシダーゼとしては、いずれの由来のものも使用でき、例えば、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、又は細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの等を挙げることができる。
なお、このペルオキシダーゼとしては、微生物等のペルオキシダーゼの遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は遺伝子の改変等により性質を改良した微生物等から調製したペルオキシダーゼ等であってもよい。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定において、ペルオキシダーゼの活性値は、特に限定されないが、測定反応時において、１０単位／Ｌ（Ｕｎｉｔ／Ｌ）以上であることが好ましい。
また、このペルオキシダーゼの活性値の下限は、測定反応時において、より好ましくは５０単位／Ｌ以上であり、特に好ましくは１００単位／Ｌ以上である。
そして、このペルオキシダーゼの測定反応時の活性値に上限は特にはないが、コスト等のことを考えると５００，０００単位／Ｌ迄で十分である。
また、このペルオキシダーゼの活性値の上限は、測定反応時において、より好ましくは１００，０００単位／Ｌ以下であり、特に好ましくは５０，０００単位／Ｌ以下である。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬には、測定反応時に前記の活性値となるような活性値のペルオキシダーゼを、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
（６）色原体
（ａ） 本発明において、色原体とは、酸化酵素により生じた過酸化水素を当該色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定することができる物質である。このような物質であれば特に限定なく用いることができる。
（ａ） 本発明において、色原体とは、酸化酵素により生じた過酸化水素を当該色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定することができる物質である。このような物質であれば特に限定なく用いることができる。
（ｂ） 本発明において、この色原体は、例えば、測定時、酸化酵素により生じた過酸化水素、ペルオキシダーゼ、及びカップラーと混合、接触させることにより、このカップラーと酸化縮合して色素が生じる物質であってもよい。
なお、この場合、この色原体は、前記の酸化縮合反応時に、水素を放出する水素供与体となる。
なお、この場合、この色原体は、前記の酸化縮合反応時に、水素を放出する水素供与体となる。
また、この場合、この色原体としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、又はアニリン誘導体等を挙げることができる。
このフェノールの誘導体としては、例えば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、若しくは２，４，６−トリクロロフェノール、又はこれらの塩等を挙げることができる。
また、アニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン（ＣＥＭＢ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）、若しくはＮ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシ−５−メチルアニリン（ＨＭＭＰＳ）、又はこれらの塩等を挙げることができる。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定において、前記の色原体の濃度は、特に限定されないが、測定反応時において、０．００５ｍＭ以上であることが好ましい。
また、前記の色原体の濃度の下限は、測定反応時において、より好ましくは０．０５ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．５ｍＭ以上である。
そして、前記の色原体の測定反応時の濃度に上限は特にはないが、コスト等のことを考えると５０ｍＭ迄で十分である。
また、前記の色原体の濃度の上限は、測定反応時において、より好ましくは２０ｍＭ以下であり、特に好ましくは１０ｍＭ以下である。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬には、測定反応時に前記の濃度となるような濃度の前記の色原体を、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
（ｃ） また、本発明において、この色原体は、例えば、測定時、酸化酵素により生じた過酸化水素、及びペルオキシダーゼと混合、接触させることにより（すなわち、カップラーと混合、接触させることなく）、酸化反応によって色素が生じる物質であってもよい。
この場合、この色原体としては、例えば、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）又はこれらの塩等を挙げることができる。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬には、測定反応時に前記の濃度となるような濃度の前記の色原体を、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
（７）カップラー
本発明において、カップラーとは、酸化酵素により生じた過酸化水素を当該カップラー、ペルオキシダーゼ、及び前記の水素供与体としての色原体（フェノール、フェノール誘導体、又はアニリン誘導体等）と混合、接触させることにより、前記色原体と酸化縮合して色素を生成させることができる物質である。このような物質であれば特に限定なく用いることができる。
本発明において、カップラーとは、酸化酵素により生じた過酸化水素を当該カップラー、ペルオキシダーゼ、及び前記の水素供与体としての色原体（フェノール、フェノール誘導体、又はアニリン誘導体等）と混合、接触させることにより、前記色原体と酸化縮合して色素を生成させることができる物質である。このような物質であれば特に限定なく用いることができる。
このカップラーとしては、例えば、４−アミノアンチピリン若しくはその誘導体、フェニレンジアミン、又は３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等を挙げることができる。
なお、本発明においては、このカップラーが４−アミノアンチピリンであることが好ましい。
なお、本発明においては、このカップラーが４−アミノアンチピリンであることが好ましい。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定において、前記のカップラーの濃度は、特に限定されないが、測定反応時において、０．００５ｍＭ以上であることが好ましい。
また、前記のカップラーの濃度の下限は、測定反応時において、より好ましくは０．０５ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．５ｍＭ以上である。
そして、前記のカップラーの測定反応時の濃度に上限は特にはないが、コスト等のことを考えると５０ｍＭ迄で十分である。
また、前記のカップラーの濃度の上限は、測定反応時において、より好ましくは２０ｍＭ以下であり、特に好ましくは１０ｍＭ以下である。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬には、測定反応時に前記の濃度となるような濃度の前記のカップラーを、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
（８）ｐＨ
本発明の試料中の測定対象物質の測定において、ｐＨは特に限定されないが、測定反応時のｐＨは、当該測定反応が進むｐＨ域にあればよい。
なお、この測定反応時のｐＨは、当該測定反応の至適ｐＨ域又はその近辺にあることが好ましい。
本発明の試料中の測定対象物質の測定において、ｐＨは特に限定されないが、測定反応時のｐＨは、当該測定反応が進むｐＨ域にあればよい。
なお、この測定反応時のｐＨは、当該測定反応の至適ｐＨ域又はその近辺にあることが好ましい。
例えば、測定反応時のｐＨは、ｐＨ６．０（２０℃）以上であることが好ましい。
また、この測定反応時のｐＨの下限は、より好ましくはｐＨ６．５（２０℃）以上であり、特に好ましくはｐＨ７．０（２０℃）以上である。
そして、この測定反応時のｐＨは、ｐＨ９．０（２０℃）以下であることが好ましい。
また、この測定反応時のｐＨの上限は、測定反応時において、より好ましくはｐＨ８．５（２０℃）以下であり、特に好ましくはｐＨ８．０（２０℃）以下である。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定反応時に前記のｐＨ域のｐＨとなるように、当該測定試薬のｐＨを設定することが好ましい。
（９）緩衝剤
本発明においては、測定反応時に、緩衝剤を適宜必要に応じて存在させることができる。
本発明においては、測定反応時に、緩衝剤を適宜必要に応じて存在させることができる。
例えば、前記の「（８）ｐＨ」に記載のｐＨ域等において緩衝能を有する緩衝剤を、緩衝能を有する濃度において、測定反応時に存在させることができる。
このような緩衝剤としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、リン酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定反応時に前記の「（８）ｐＨ」に記載のｐＨ域のｐＨとなるように、当該測定試薬のｐＨを設定することが好ましい。
このため、前記の「（８）ｐＨ」に記載のｐＨ域等において緩衝能を有する緩衝剤を、測定反応時に緩衝能を有する濃度において、この測定試薬に含有させることが好ましい。
このため、前記の「（８）ｐＨ」に記載のｐＨ域等において緩衝能を有する緩衝剤を、測定反応時に緩衝能を有する濃度において、この測定試薬に含有させることが好ましい。
（１０）他の成分
本発明においては、測定反応時に、酵素の基質、共役酵素、補酵素、金属イオン若しくはこれを含む金属塩、キレート剤、アルブミンなどのタンパク質、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの防腐剤、他の試料に含まれる測定妨害物質の消去剤若しくは影響抑制剤（例えば、ビリルビンに対するフェロシアン化カリウムなど、若しくはアスコルビン酸に対するアスコルビン酸オキシダーゼなど等）、界面活性剤、又は活性化剤等を適宜必要に応じて存在させることができる。
本発明においては、測定反応時に、酵素の基質、共役酵素、補酵素、金属イオン若しくはこれを含む金属塩、キレート剤、アルブミンなどのタンパク質、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの防腐剤、他の試料に含まれる測定妨害物質の消去剤若しくは影響抑制剤（例えば、ビリルビンに対するフェロシアン化カリウムなど、若しくはアスコルビン酸に対するアスコルビン酸オキシダーゼなど等）、界面活性剤、又は活性化剤等を適宜必要に応じて存在させることができる。
なお、これらを存在させる際の濃度は特に限定されるものではないが、測定反応時において、０．００１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
また、これらを存在させる際の濃度の下限は、測定反応時において、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。
そして、これらを存在させる際の濃度に上限は特にはないが、コスト等のことを考えると１０％（ｗ／ｖ）迄で十分である。
また、これらを存在させる際の濃度の上限は、測定反応時において、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは２．５％（ｗ／ｖ）以下である。
なお、前記の各界面活性剤の具体例としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬には、測定反応時に前記の濃度となるような濃度の前記の成分を、当該測定試薬に含有させることが好ましい。
（１１）測定
本発明により試料中の測定対象物質の測定を行う場合、測定は終点法（エンドポイント法）又は反応速度法（レート法）等の方法を適宜選択して測定を行えばよい。
本発明により試料中の測定対象物質の測定を行う場合、測定は終点法（エンドポイント法）又は反応速度法（レート法）等の方法を適宜選択して測定を行えばよい。
また、この測定は、一段階のステップにより行う１ステップ法（１試薬法）、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより行う多ステップ法（多試薬法）を適宜選択して測定を行えばよい。
また、この測定において、生成した色素を光学的に測定する際の測定波長は、可視部の適当な波長を適宜選択して使用することができる。なお、この場合、一波長法でもよく、又は二波長法でもよい。
また、この測定において、測定反応時の温度は、３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、変性又は変質しない範囲内の温度を設定すればよい。
また、この測定において、測定反応の開始方法は、基質等を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法でもよい。
また、この測定において、その測定は、用手法により行ってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
（１２）試料中の測定対象物質の測定の具体例
本発明における試料中の測定対象物質の測定の具体例として、酸化酵素であるザルコシンオキシダーゼを用いて試料中のクレアチニンを測定する方法を以下記載する。
本発明における試料中の測定対象物質の測定の具体例として、酸化酵素であるザルコシンオキシダーゼを用いて試料中のクレアチニンを測定する方法を以下記載する。
（ａ）測定試薬の調製
下記の各成分の一定量をそれぞれ純水に溶解し、ｐＨを一定のｐＨに調整することにより、クレアチニン測定試薬の第１試薬及び第２試薬を各々調製した。
下記の各成分の一定量をそれぞれ純水に溶解し、ｐＨを一定のｐＨに調整することにより、クレアチニン測定試薬の第１試薬及び第２試薬を各々調製した。
（ｉ）第１試薬
ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物又はポリオキシエチレンアルキルアミド化合物
ザルコシンオキシダーゼ
クレアチナーゼ
カタラーゼ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞
緩衝剤
ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物又はポリオキシエチレンアルキルアミド化合物
ザルコシンオキシダーゼ
クレアチナーゼ
カタラーゼ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞
緩衝剤
（ｉｉ）第２試薬
クレアチニナーゼ
４−アミノアンチピリン
ペルオキシダーゼ
アジ化ナトリウム
緩衝剤
クレアチニナーゼ
４−アミノアンチピリン
ペルオキシダーゼ
アジ化ナトリウム
緩衝剤
（ｂ）試料
ヒトの血清を試料として用いた。
ヒトの血清を試料として用いた。
（ｃ）測定
（ｉ）第１段階
前記の試料と前記の第１試薬を混合して、混合液を調製する。
（ｉ）第１段階
前記の試料と前記の第１試薬を混合して、混合液を調製する。
この混合する試料及び第１試薬それぞれの量は、第２試薬の量、試料に含まれる測定対象物質（クレアチニン）の濃度、色原体及びカップラーに由来する色素の吸光係数、測定波長、使用する分析装置の仕様等、並びに他の条件に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、例えば、試料の量は０．５〜１００μＬ、第１試薬の量は２０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
なお、一般的には、例えば、試料の量は０．５〜１００μＬ、第１試薬の量は２０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
この混合液の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。
また、インキュベートする際の温度は、前記の混合液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると反応に係わる酵素が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素が耐熱性酵素であれば更に高温でもよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると反応に係わる酵素が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素が耐熱性酵素であれば更に高温でもよい。
この試料と第１試薬の混合液の調製及びインキュベートにより、試料に含まれていたクレアチンと、第１試薬に含まれる試薬成分とが接触し、これらの成分による試料に含まれていたクレアチンの消去反応が始まる。
すなわち、まず、試料に含まれていたクレアチンと水が、クレアチナーゼによりザルコシンと尿素になる。
次に、このザルコシンと酸素と水が、ザルコシンオキシダーゼ（酸化酵素）によりグリシンとホルムアルデヒドと過酸化水素になる。
次に、この過酸化水素２分子が、カタラーゼにより分解されて水と酸素となる。
以上の反応により、試料に含まれていたクレアチンが消去される。
次に、このザルコシンと酸素と水が、ザルコシンオキシダーゼ（酸化酵素）によりグリシンとホルムアルデヒドと過酸化水素になる。
次に、この過酸化水素２分子が、カタラーゼにより分解されて水と酸素となる。
以上の反応により、試料に含まれていたクレアチンが消去される。
（ｉｉ）第２段階
前記の第１段階で調製した「試料と第１試薬の混合液」に、第２試薬を混合する。これを最終反応液とする。
前記の第１段階で調製した「試料と第１試薬の混合液」に、第２試薬を混合する。これを最終反応液とする。
この混合する第２試薬の量は、試料の量、第１試薬の量、試料に含まれる測定対象物質（クレアチニン）の濃度、色原体及びカップラーに由来する色素の吸光係数、測定波長、使用する分析装置の仕様等、並びに他の条件に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、例えば、第２試薬の量は１０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
なお、一般的には、例えば、第２試薬の量は１０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
この最終反応液の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。
また、インキュベートする際の温度は、前記の最終反応液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素が耐熱性酵素であれば更に高温でも良い。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素が耐熱性酵素であれば更に高温でも良い。
この最終反応液の調製及びインキュベートにより、前記の第１段階における測定反応に引き続き、この第２段階における測定反応が開始し、試料に含まれていたクレアチニンの測定反応が進められる。
すなわち、まず、第１段階において試料に含まれていたクレアチンの消去反応に用いられたカタラーゼが、第２試薬に含まれていたアジ化ナトリウムによってその活性を阻害され、過酸化水素を水と酸素に分解することが出来なくなる。
そして、試料に含まれていたクレアチニンと水が、クレアチニナーゼによりクレアチンになる。
そして、試料に含まれていたクレアチニンと水が、クレアチニナーゼによりクレアチンになる。
次に、このクレアチンと水が、クレアチナーゼによりザルコシンと尿素になる。
次に、このザルコシンと酸素と水が、ザルコシンオキシダーゼ（酸化酵素）によりグリシンとホルムアルデヒドと過酸化水素になる。
次に、このザルコシンと酸素と水が、ザルコシンオキシダーゼ（酸化酵素）によりグリシンとホルムアルデヒドと過酸化水素になる。
次に、この過酸化水素２分子と色原体（ＡＤＯＳ）とカップラー（４−アミノアンチピリン）が、ペルオキシダーゼにより色素と水４分子になる。〔色原体とカップラーが酸化縮合して色素が生じた。〕
次に、この生成した色素に由来する最終反応液の吸光度（又は透過率）を測定する。
なお、この吸光度（又は透過率）の測定は、一つの波長においてのみ行う一波長法でもよく、又は二つの波長においてそれぞれ行う二波長法でもよく、適宜選択して行えばよい。
また、吸光度（又は透過率）の測定を行う波長についても、その色素の吸収波長に応じて、適宜選択すればよい。
なお、この吸光度（又は透過率）の測定は、一つの波長においてのみ行う一波長法でもよく、又は二つの波長においてそれぞれ行う二波長法でもよく、適宜選択して行えばよい。
また、吸光度（又は透過率）の測定を行う波長についても、その色素の吸収波長に応じて、適宜選択すればよい。
そして、吸光度（若しくは透過率）の測定は、終点法（エンドポイント法）又は反応速度法（レート法）等の方法を適宜選択して行えばよい。
なお、測定した吸光度（若しくは透過率）又は吸光度（若しくは透過率）の変化量より、試料に含まれていた測定対象物質の濃度又は活性値を算出することは、色素のモル吸光係数を基に測定した吸光度（若しくは透過率）より算出する方法、又は濃度若しくは活性値が分かっている測定対象物質（標準物質）の吸光度（若しくは透過率）と対比して算出する方法等の方法を適宜選択して行えばよい。
また、本発明においては、試料を測定して得た吸光度（若しくは透過率）より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて、試料に含まれていた測定対象物質の濃度又は活性値を算出することが好ましい。
なお、試料中の測定対象物質の測定の操作は、測定者自身が用手法により行ってもよいし、又は自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。
また、試料中の測定対象物質の測定に使用する測定試薬が、第１試薬、第２試薬、及び他の試薬（一つ又は二つ以上の試薬）よりなる場合、すなわち３以上の試薬よりなる場合は、これらの試薬を使用して測定を行うのに必要な数の段階（必要に応じ２段階又は３段階以上の段階）を経て測定反応を行わせ、試料中の測定対象物質の測定を行えばよい。
〔２〕試料中の測定対象物質の測定試薬
１．総論
本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する試薬において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含有させることを特徴とするものである。
１．総論
本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する試薬において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含有させることを特徴とするものである。
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含有させることにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができる。
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避剤として、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含有させることが好適である。
２．ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物
ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「２．ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物」に記載した通りである。
ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「２．ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物」に記載した通りである。
３．試料中の測定対象物質の測定試薬
（１）総論
本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する試薬において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含有させることを特徴とするものである。
（１）総論
本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する試薬において、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含有させることを特徴とするものである。
この酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定する試薬であるが、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定することができる試薬であればよく、特に限定はない。
この測定試薬としては、例えば、酸化酵素を用いて、測定対象物質から直接又は間接的に、過酸化水素を生じさせ、これをペルオキシダーゼ及び色原体と混合、接触させて発色系に導き、酸化反応により色原体から生成した色素を光学的に測定することにより、生成した過酸化水素の測定を行い、これにより試料に含まれる測定対象物質を測定する試薬等を挙げることができる。
より具体的には、例えば、酸化酵素を用いて、測定対象物質から直接又は間接的に、過酸化水素を生じさせ、これをペルオキシダーゼ、水素供与体である色原体、及びこの色原体の縮合対象物としてのカップラーと混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により色原体から生成した色素を光学的に測定することにより、生成した過酸化水素の測定を行い、これにより試料に含まれる測定対象物質を測定する試薬等を挙げることができる。
また、例えば、酸化酵素を用いて、測定対象物質から直接又は間接的に、過酸化水素を生じさせ、これをペルオキシダーゼ及び色原体と混合、接触させて前記のカップラーを用いることなく発色系に導き、酸化反応により色原体から生成した色素を光学的に測定することにより、生成した過酸化水素の測定を行い、これにより試料に含まれる測定対象物質を測定する試薬等をも挙げることができる。
（２）試料
試料については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（２）試料」に記載した通りである。
試料については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（２）試料」に記載した通りである。
（３）測定対象物質
測定対象物質については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（３）測定対象物質」に記載した通りである。
測定対象物質については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（３）測定対象物質」に記載した通りである。
（４）酸化酵素
酸化酵素については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（４）酸化酵素」に記載した通りである。
酸化酵素については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（４）酸化酵素」に記載した通りである。
（５）ペルオキシダーゼ
ペルオキシダーゼについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（５）ペルオキシダーゼ」に記載した通りである。
ペルオキシダーゼについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（５）ペルオキシダーゼ」に記載した通りである。
（６）色原体
色原体については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（６）色原体」に記載した通りである。
色原体については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（６）色原体」に記載した通りである。
（７）カップラー
カップラーについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（７）カップラー」に記載した通りである。
カップラーについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（７）カップラー」に記載した通りである。
（８）ｐＨ
ｐＨについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（８）ｐＨ」に記載した通りである。
ｐＨについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（８）ｐＨ」に記載した通りである。
（９）緩衝剤
緩衝剤については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（９）緩衝剤」に記載した通りである。
緩衝剤については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（９）緩衝剤」に記載した通りである。
（１０）他の成分
他の成分については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（１０）他の成分」に記載した通りである。
他の成分については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（１０）他の成分」に記載した通りである。
（１１）測定試薬
本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよい。
本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよい。
また、この本発明の測定試薬は、一段階のステップにより測定を行う１ステップ法（１試薬法）のものであってもよく、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより測定を行う多ステップ法（多試薬法）のものであってもよく、適宜選択すればよい。
また、この本発明の測定試薬において、生成した色素を光学的に測定する際の測定波長は、可視部の適当な波長を適宜選択することができる。なお、この場合、一波長法でもよく、又は二波長法でもよい。
また、この本発明の測定試薬において、測定反応時の温度は、３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、変性又は変質しない範囲内の温度を設定すればよい。
また、この本発明の測定試薬において、測定反応の開始方法は、基質等を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法のものでもよい。
また、この本発明の測定試薬において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。
また、この本発明の測定試薬は、その構成試薬の全て又は一部が液状試薬であってよい。
また、この本発明の測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中の測定対象物質の測定に使用することができる。
また、この本発明の測定試薬は、前記した測定試薬以外のその他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の測定対象物質の測定に使用することもできる。
前記した測定試薬以外のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
前記した測定試薬以外のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
また、この本発明の測定試薬は、第１試薬及び第２試薬、又はその他の試薬等の複数の構成試薬からなる測定試薬キットであってもよい。
〔３〕試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避方法
１．総論
本発明の試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避方法は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当り、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とするものである。
１．総論
本発明の試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避方法は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当り、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とするものである。
本発明の試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避方法は、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができるものである。
２．ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物
ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「２．ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物」に記載した通りである。
ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「２．ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物」に記載した通りである。
３．試料中の測定対象物質の測定
（１）総論
本発明の試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避方法は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当り、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とするものである。
（１）総論
本発明の試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避方法は、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当り、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とするものである。
この酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定することであるが、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定することができるものであればよく、特に限定はない。
この測定としては、例えば、酸化酵素を用いて、測定対象物質から直接又は間接的に、過酸化水素を生じさせ、これをペルオキシダーゼ及び色原体と混合、接触させて発色系に導き、酸化反応により色原体から生成した色素を光学的に測定することにより、生成した過酸化水素の測定を行い、これにより試料に含まれる測定対象物質を測定する方法等を挙げることができる。
より具体的には、例えば、酸化酵素を用いて、測定対象物質から直接又は間接的に、過酸化水素を生じさせ、これをペルオキシダーゼ、水素供与体である色原体、及びこの色原体の縮合対象物としてのカップラーと混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により色原体から生成した色素を光学的に測定することにより、生成した過酸化水素の測定を行い、これにより試料に含まれる測定対象物質を測定する方法等を挙げることができる。
また、例えば、酸化酵素を用いて、測定対象物質から直接又は間接的に、過酸化水素を生じさせ、これをペルオキシダーゼ及び色原体と混合、接触させて前記のカップラーを用いることなく発色系に導き、酸化反応により色原体から生成した色素を光学的に測定することにより、生成した過酸化水素の測定を行い、これにより試料に含まれる測定対象物質を測定する方法等をも挙げることができる。
（２）試料
試料については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（２）試料」に記載した通りである。
試料については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（２）試料」に記載した通りである。
（３）測定対象物質
測定対象物質については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（３）測定対象物質」に記載した通りである。
測定対象物質については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（３）測定対象物質」に記載した通りである。
（４）酸化酵素
酸化酵素については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（４）酸化酵素」に記載した通りである。
酸化酵素については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（４）酸化酵素」に記載した通りである。
（５）ペルオキシダーゼ
ペルオキシダーゼについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（５）ペルオキシダーゼ」に記載した通りである。
ペルオキシダーゼについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（５）ペルオキシダーゼ」に記載した通りである。
（６）色原体
色原体については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（６）色原体」に記載した通りである。
色原体については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（６）色原体」に記載した通りである。
（７）カップラー
カップラーについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（７）カップラー」に記載した通りである。
カップラーについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（７）カップラー」に記載した通りである。
（８）ｐＨ
ｐＨについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（８）ｐＨ」に記載した通りである。
ｐＨについては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（８）ｐＨ」に記載した通りである。
（９）緩衝剤
緩衝剤については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（９）緩衝剤」に記載した通りである。
緩衝剤については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（９）緩衝剤」に記載した通りである。
（１０）他の成分
他の成分については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（１０）他の成分」に記載した通りである。
他の成分については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（１０）他の成分」に記載した通りである。
（１１）測定
その他測定に関しては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（１１）測定」に記載した通りである。
その他測定に関しては、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（１１）測定」に記載した通りである。
（１２）試料中の測定対象物質の測定の具体例
本発明における試料中の測定対象物質の測定の具体例については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（１２）試料中の測定対象物質の測定の具体例」に記載した通りである。
本発明における試料中の測定対象物質の測定の具体例については、前記「〔１〕試料中の測定対象物質の測定方法」の「３．試料中の測定対象物質の測定」の「（１２）試料中の測定対象物質の測定の具体例」に記載した通りである。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕（試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避の効果の確認−１）
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬並びに試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避の効果を確認した。
具体的には、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物としてポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を用いた場合の、試料に含まれるビリルビンに由来する試料中のクレアチニン測定への影響の回避の効果を確認した。
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬並びに試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避の効果を確認した。
具体的には、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物としてポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を用いた場合の、試料に含まれるビリルビンに由来する試料中のクレアチニン測定への影響の回避の効果を確認した。
１．クレアチニン測定試薬
（１）第１試薬
（１）第１試薬
（ａ）第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１０）〕を調製した。
ナイミーン Ｓ−２１０ 〔日油株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．０５％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｂ）第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｏ−２０５）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｏ−２０５）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｏ−２０５）〕を調製した。
ナイミーン Ｏ−２０５ 〔日油株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．０５％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｃ）第１試薬〔従来発明（０％）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（濃度０％の）、第１試薬〔従来発明（０％）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（濃度０％の）、第１試薬〔従来発明（０％）〕を調製した。
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（２）第２試薬
第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．８（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．８（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
クレアチニナーゼ ４００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ １５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１５％（ｗ／ｖ）
フェロシアン化カリウム ０．２ｍＭ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ １５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１５％（ｗ／ｖ）
フェロシアン化カリウム ０．２ｍＭ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
２．試料
（１） 市販の干渉物質検討用コントロール物質である「干渉チェック・Ａプラス」〔シスメックス株式会社（日本国）〕の「ビリルビン・Ｃ（抱合型）」を、ビリルビン（抱合型）濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように純水で溶解し、ビリルビン溶液を調製した。
（１） 市販の干渉物質検討用コントロール物質である「干渉チェック・Ａプラス」〔シスメックス株式会社（日本国）〕の「ビリルビン・Ｃ（抱合型）」を、ビリルビン（抱合型）濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように純水で溶解し、ビリルビン溶液を調製した。
（２） 前記（１）で調製したビリルビン溶液の１容量に対して、ヒト血清の９容量を添加、混合し、ビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの血清試料を調製した。
（３） 前記の「干渉チェック・Ａプラス」の『ビリルビン・Ｃ「ブランク」』を、前記（１）における溶解に用いた量と同量の純水で溶解し、ブランク溶液を調製した。
（４） 前記（３）で調製した溶液（ブランク溶液）の１容量に対して、前記（２）で用いたヒト血清の９容量を添加、混合し、ブランク溶液を前記ヒト血清で１／１０に希釈したブランク試料を調製した。
（５） 前記（２）で調製した血清試料を、前記（４）で調製したブランク試料で希釈して、ビリルビン（抱合型）濃度が、４０ｍｇ／ｄＬの血清試料、３０ｍｇ／ｄＬの血清試料、２０ｍｇ／ｄＬの血清試料、及び１０ｍｇ／ｄＬの血清試料をそれぞれ調製した。
なお、この希釈に用いたブランク試料を、ビリルビン（抱合型）濃度が０ｍｇ／ｄＬの血清試料とした。
なお、この希釈に用いたブランク試料を、ビリルビン（抱合型）濃度が０ｍｇ／ｄＬの血清試料とした。
すなわち、次の（ａ）〜（ｆ）の６種類の血清試料をそれぞれ試料とした。
（ａ） 血清試料−１ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｂ） 血清試料−２ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 １０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｃ） 血清試料−３ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ２０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｄ） 血清試料−４ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ３０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｅ） 血清試料−５ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ４０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｆ） 血清試料−６ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ５０ｍｇ／ｄＬ〕
（ａ） 血清試料−１ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｂ） 血清試料−２ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 １０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｃ） 血清試料−３ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ２０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｄ） 血清試料−４ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ３０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｅ） 血清試料−５ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ４０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｆ） 血清試料−６ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ５０ｍｇ／ｄＬ〕
３．試料中のクレアチニンの測定
前記２の各試料のクレアチニンの測定は、７１８０形日立自動分析装置〔株式会社日立ハイテクノロジーズ（日本国）〕を使用して行った。
前記２の各試料のクレアチニンの測定は、７１８０形日立自動分析装置〔株式会社日立ハイテクノロジーズ（日本国）〕を使用して行った。
（１） 前記２の（ａ）〜（ｆ）の血清試料の各々において、当該試料の６．０μＬに、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１０）〕の１５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（２） 次に、１５ポイント（第１試薬添加後２５４．１９３秒）の吸光度及び１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）の吸光度それぞれを主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定して、この１５ポイントの吸光度及び１６ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光１」〕。（試料ブランクの吸光度の測定）
（３） 次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８６．９７７秒）の間に、前記１の（２）の第２試薬の５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（４） 次に、３３ポイント（第１試薬添加後５６９．５８２秒）の吸光度及び３４ポイント（第１試薬添加後５８７．４２６秒）の吸光度それぞれを主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定して、この３３ポイントの吸光度及び３４ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていたクレアチニンの濃度に応じた吸光度の測定）
（５） 次に、試料中に含まれていたクレアチニンの濃度の測定値を次の通り求めた。
すなわち、前記２の（５）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
次に、そのクレアチニンの濃度が分かっている標準試料について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて得た吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、各試料のクレアチニン濃度の測定値を得た。
すなわち、前記２の（５）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
次に、そのクレアチニンの濃度が分かっている標準試料について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて得た吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、各試料のクレアチニン濃度の測定値を得た。
（６） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１０）〕に替えて、前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｏ−２０５）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（７） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１０）〕に替えて、前記１の（１）の（ｃ）の第１試薬〔従来発明（０％）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
４．測定結果
前記３において各試料のクレアチニン濃度の測定を行って得られた結果を、表２に示した。
前記３において各試料のクレアチニン濃度の測定を行って得られた結果を、表２に示した。
なお、この表において、横の欄は、第１試薬に含有させたポリオキシエチレンアルキルアミン化合物の種類及びその濃度を表す。〔ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない第１試薬を「０％」と表した。〕
また、この表において、縦の欄は、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度を表す。
そして、この表の各欄において示した値は、当該試料中のクレアチニンの濃度の測定値〔ｍｇ／ｄＬ〕を示す。
なお、（カッコ）の中の数値は、各測定値を、同一の第１試薬を用いた場合の試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が０ｍｇ／ｄＬのときの測定値で除した値をパーセント表示で表したものである。
５．考察
（１） この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まないもの（０％）である場合、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が増すにつれ、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は減少してゆき、試料中のビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの場合には、本来の値の７９％にまで測定値が減少してしまっていることが分かる。
（１） この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まないもの（０％）である場合、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が増すにつれ、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は減少してゆき、試料中のビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの場合には、本来の値の７９％にまで測定値が減少してしまっていることが分かる。
すなわち、試料に含まれるビリルビンの存在により、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は影響を受け、大きく負の誤差が生じていることが分かる。
（２） そして、この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を含む場合の試料中のクレアチニンの濃度の測定値は、前記のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（０％）第１試薬における測定値に対して、試料に含まれるビリルビンに由来する測定値の減少が抑制されていることが分かる。
（３） すなわち、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当たり、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができ、測定結果（測定値）に誤差が生じるのを防ぐことができることが確かめられた。
〔実施例２〕（試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避の効果の確認−２）
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬並びに試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避の効果を更に確認した。
具体的には、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物としてポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を用いた場合の、試料に含まれるビリルビンに由来する試料中のクレアチニン測定への影響の回避の効果を確認した。
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬並びに試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避の効果を更に確認した。
具体的には、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物としてポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を用いた場合の、試料に含まれるビリルビンに由来する試料中のクレアチニン測定への影響の回避の効果を確認した。
１．クレアチニン測定試薬
（１）第１試薬
（１）第１試薬
（ａ）第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕を調製した。
ナイミーン Ｓ−２１５ 〔日油株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．０５％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｂ）第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕を調製した。
ナイミーン Ｓ−２１５ 〔日油株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．１０％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｃ）第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕を調製した。
ナイミーン Ｓ−２２０ 〔日油株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．０５％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｄ）第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕を調製した。
ナイミーン Ｓ−２２０ 〔日油株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．１０％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｅ）第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｆ−２１５）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｆ−２１５）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｆ−２１５）〕を調製した。
ナイミーン Ｆ−２１５ 〔日油株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．０５％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｆ）第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｆ−２１５）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｆ−２１５）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｆ−２１５）〕を調製した。
ナイミーン Ｆ−２１５ 〔日油株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．１０％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｇ）第１試薬〔従来発明（０％）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（濃度０％の）、第１試薬〔従来発明（０％）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（濃度０％の）、第１試薬〔従来発明（０％）〕を調製した。
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（２）第２試薬
第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．８（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．８（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
クレアチニナーゼ ４００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ １５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１５％（ｗ／ｖ）
フェロシアン化カリウム ０．２ｍＭ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ １５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１５％（ｗ／ｖ）
フェロシアン化カリウム ０．２ｍＭ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
２．試料
（１） 市販の干渉物質検討用コントロール物質である「干渉チェック・Ａプラス」〔シスメックス株式会社（日本国）〕の「ビリルビン・Ｃ（抱合型）」を、ビリルビン（抱合型）濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように純水で溶解し、ビリルビン溶液を調製した。
（１） 市販の干渉物質検討用コントロール物質である「干渉チェック・Ａプラス」〔シスメックス株式会社（日本国）〕の「ビリルビン・Ｃ（抱合型）」を、ビリルビン（抱合型）濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように純水で溶解し、ビリルビン溶液を調製した。
（２） 前記（１）で調製したビリルビン溶液の１容量に対して、ヒト血清の９容量を添加、混合し、ビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの血清試料を調製した。
（３） 前記の「干渉チェック・Ａプラス」の『ビリルビン・Ｃ「ブランク」』を、前記（１）における溶解に用いた量と同量の純水で溶解し、ブランク溶液を調製した。
（４） 前記（３）で調製した溶液（ブランク溶液）の１容量に対して、前記（２）で用いたヒト血清の９容量を添加、混合し、ブランク溶液を前記ヒト血清で１／１０に希釈したブランク試料を調製した。
（５） 前記（２）で調製した血清試料を、前記（４）で調製したブランク試料で希釈して、ビリルビン（抱合型）濃度が、４０ｍｇ／ｄＬの血清試料、３０ｍｇ／ｄＬの血清試料、２０ｍｇ／ｄＬの血清試料、及び１０ｍｇ／ｄＬの血清試料をそれぞれ調製した。
なお、この希釈に用いたブランク試料を、ビリルビン（抱合型）濃度が０ｍｇ／ｄＬの血清試料とした。
なお、この希釈に用いたブランク試料を、ビリルビン（抱合型）濃度が０ｍｇ／ｄＬの血清試料とした。
すなわち、次の（ａ）〜（ｆ）の６種類の血清試料をそれぞれ試料とした。
（ａ） 血清試料−１ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｂ） 血清試料−２ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 １０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｃ） 血清試料−３ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ２０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｄ） 血清試料−４ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ３０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｅ） 血清試料−５ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ４０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｆ） 血清試料−６ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ５０ｍｇ／ｄＬ〕
（ａ） 血清試料−１ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｂ） 血清試料−２ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 １０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｃ） 血清試料−３ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ２０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｄ） 血清試料−４ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ３０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｅ） 血清試料−５ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ４０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｆ） 血清試料−６ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ５０ｍｇ／ｄＬ〕
３．試料中のクレアチニンの測定
前記２の各試料のクレアチニンの測定は、７１８０形日立自動分析装置〔株式会社日立ハイテクノロジーズ（日本国）〕を使用して行った。
前記２の各試料のクレアチニンの測定は、７１８０形日立自動分析装置〔株式会社日立ハイテクノロジーズ（日本国）〕を使用して行った。
（１） 前記２の（ａ）〜（ｆ）の血清試料の各々において、当該試料の６．０μＬに、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕の１５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（２） 次に、１５ポイント（第１試薬添加後２５４．１９３秒）の吸光度及び１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）の吸光度それぞれを主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定して、この１５ポイントの吸光度及び１６ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光１」〕。（試料ブランクの吸光度の測定）
（３） 次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８６．９７７秒）の間に、前記１の（２）の第２試薬の５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（４） 次に、３３ポイント（第１試薬添加後５６９．５８２秒）の吸光度及び３４ポイント（第１試薬添加後５８７．４２６秒）の吸光度それぞれを主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定して、この３３ポイントの吸光度及び３４ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていたクレアチニンの濃度に応じた吸光度の測定）
（５） 次に、試料中に含まれていたクレアチニンの濃度の測定値を次の通り求めた。
すなわち、前記２の（５）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
次に、そのクレアチニンの濃度が分かっている標準試料について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて得た吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、各試料のクレアチニン濃度の測定値を得た。
すなわち、前記２の（５）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
次に、そのクレアチニンの濃度が分かっている標準試料について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて得た吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、各試料のクレアチニン濃度の測定値を得た。
（６） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕に替えて、前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（７） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕に替えて、前記１の（１）の（ｃ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（８） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕に替えて、前記１の（１）の（ｄ）の第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（９） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕に替えて、前記１の（１）の（ｅ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｆ−２１５）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（１０） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕に替えて、前記１の（１）の（ｆ）の第１試薬〔本発明（０．１０％ ナイミーン Ｆ−２１５）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（１１） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ナイミーン Ｓ−２１５）〕に替えて、前記１の（１）の（ｇ）の第１試薬〔従来発明（０％）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
４．測定結果
前記３において各試料のクレアチニン濃度の測定を行って得られた結果を、表３に示した。
前記３において各試料のクレアチニン濃度の測定を行って得られた結果を、表３に示した。
なお、この表において、横の欄は、第１試薬に含有させたポリオキシエチレンアルキルアミン化合物の種類及びその濃度を表す。〔ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない第１試薬を「０％」と表した。〕
また、この表において、縦の欄は、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度を表す。
そして、この表の各欄において示した値は、当該試料中のクレアチニンの濃度の測定値〔ｍｇ／ｄＬ〕を示す。
なお、（カッコ）の中の数値は、各測定値を、同一の第１試薬を用いた場合の試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が０ｍｇ／ｄＬのときの測定値で除した値をパーセント表示で表したものである。
５．考察
（１） この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まないもの（０％）である場合、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が増すにつれ、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は減少してゆき、試料中のビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの場合には、本来の値の７９％にまで測定値が減少してしまっていることが分かる。
（１） この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まないもの（０％）である場合、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が増すにつれ、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は減少してゆき、試料中のビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの場合には、本来の値の７９％にまで測定値が減少してしまっていることが分かる。
すなわち、試料に含まれるビリルビンの存在により、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は影響を受け、大きく負の誤差が生じていることが分かる。
（２） そして、この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を含む場合の試料中のクレアチニンの濃度の測定値は、前記のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（０％）第１試薬における測定値に対して、試料に含まれるビリルビンに由来する測定値の減少が抑制されていることが分かる。
また、この表より、第１試薬に含まれるポリオキシエチレンアルキルアミン化合物の濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）の場合よりも０．１０％（ｗ／ｖ）の場合の方が、このビリルビンに由来する測定値の減少が、より抑制されていることが分かる。
（３） すなわち、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当たり、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができ、測定結果（測定値）に誤差が生じるのを防ぐことができることが確かめられた。
〔実施例３〕（試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避の効果の確認−３）
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬並びに試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避の効果を更に確認した。
具体的には、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物としてポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を用いた場合の、試料に含まれるビリルビンに由来する試料中のクレアチニン測定への影響の回避の効果を確認した。
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬並びに試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避の効果を更に確認した。
具体的には、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物としてポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を用いた場合の、試料に含まれるビリルビンに由来する試料中のクレアチニン測定への影響の回避の効果を確認した。
１．クレアチニン測定試薬
（１）第１試薬
（１）第１試薬
（ａ）第１試薬〔本発明（０．０４％ アミート ３２０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０４％ アミート ３２０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０４％ アミート ３２０）〕を調製した。
アミート ３２０ 〔花王株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．０４％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｂ）第１試薬〔本発明（０．０８％ アミート ３２０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０８％ アミート ３２０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０８％ アミート ３２０）〕を調製した。
アミート ３２０ 〔花王株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．０８％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｃ）第１試薬〔本発明（０．１２％ アミート ３２０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１２％ アミート ３２０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１２％ アミート ３２０）〕を調製した。
アミート ３２０ 〔花王株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．１２％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｄ）第１試薬〔本発明（０．１６％ アミート ３２０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１６％ アミート ３２０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１６％ アミート ３２０）〕を調製した。
アミート ３２０ 〔花王株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．１６％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｅ）第１試薬〔従来発明（０％）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（濃度０％の）、第１試薬〔従来発明（０％）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（濃度０％の）、第１試薬〔従来発明（０％）〕を調製した。
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（２）第２試薬
第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．８（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．８（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
クレアチニナーゼ ４００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ １５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１５％（ｗ／ｖ）
フェロシアン化カリウム ０．２ｍＭ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ １５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１５％（ｗ／ｖ）
フェロシアン化カリウム ０．２ｍＭ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
２．試料
（１） 市販の干渉物質検討用コントロール物質である「干渉チェック・Ａプラス」〔シスメックス株式会社（日本国）〕の「ビリルビン・Ｃ（抱合型）」を、ビリルビン（抱合型）濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように純水で溶解し、ビリルビン溶液を調製した。
（１） 市販の干渉物質検討用コントロール物質である「干渉チェック・Ａプラス」〔シスメックス株式会社（日本国）〕の「ビリルビン・Ｃ（抱合型）」を、ビリルビン（抱合型）濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように純水で溶解し、ビリルビン溶液を調製した。
（２） 前記（１）で調製したビリルビン溶液の１容量に対して、ヒト血清の９容量を添加、混合し、ビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの血清試料を調製した。
（３） 前記の「干渉チェック・Ａプラス」の『ビリルビン・Ｃ「ブランク」』を、前記（１）における溶解に用いた量と同量の純水で溶解し、ブランク溶液を調製した。
（４） 前記（３）で調製した溶液（ブランク溶液）の１容量に対して、前記（２）で用いたヒト血清の９容量を添加、混合し、ブランク溶液を前記ヒト血清で１／１０に希釈したブランク試料を調製した。
（５） 前記（２）で調製した血清試料を、前記（４）で調製したブランク試料で希釈して、ビリルビン（抱合型）濃度が２５ｍｇ／ｄＬの血清試料を調製した。
なお、この希釈に用いたブランク試料を、ビリルビン（抱合型）濃度が０ｍｇ／ｄＬの血清試料とした。
なお、この希釈に用いたブランク試料を、ビリルビン（抱合型）濃度が０ｍｇ／ｄＬの血清試料とした。
すなわち、次の（ａ）〜（ｃ）の３種類の血清試料をそれぞれ試料とした。
（ａ） 血清試料−１ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｂ） 血清試料−２ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ２５ｍｇ／ｄＬ〕
（ｃ） 血清試料−３ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ５０ｍｇ／ｄＬ〕
（ａ） 血清試料−１ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｂ） 血清試料−２ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ２５ｍｇ／ｄＬ〕
（ｃ） 血清試料−３ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ５０ｍｇ／ｄＬ〕
３．試料中のクレアチニンの測定
前記２の各試料のクレアチニンの測定は、７１８０形日立自動分析装置〔株式会社日立ハイテクノロジーズ（日本国）〕を使用して行った。
前記２の各試料のクレアチニンの測定は、７１８０形日立自動分析装置〔株式会社日立ハイテクノロジーズ（日本国）〕を使用して行った。
（１） 前記２の（ａ）〜（ｃ）の血清試料の各々において、当該試料の６．０μＬに、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０４％ アミート ３２０）〕の１５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（２） 次に、１５ポイント（第１試薬添加後２５４．１９３秒）の吸光度及び１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）の吸光度それぞれを主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定して、この１５ポイントの吸光度及び１６ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光１」〕。（試料ブランクの吸光度の測定）
（３） 次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８６．９７７秒）の間に、前記１の（２）の第２試薬の５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（４） 次に、３３ポイント（第１試薬添加後５６９．５８２秒）の吸光度及び３４ポイント（第１試薬添加後５８７．４２６秒）の吸光度それぞれを主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定して、この３３ポイントの吸光度及び３４ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていたクレアチニンの濃度に応じた吸光度の測定）
（５） 次に、試料中に含まれていたクレアチニンの濃度の測定値を次の通り求めた。
すなわち、前記２の（５）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
次に、そのクレアチニンの濃度が分かっている標準試料について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて得た吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、各試料のクレアチニン濃度の測定値を得た。
すなわち、前記２の（５）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
次に、そのクレアチニンの濃度が分かっている標準試料について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて得た吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、各試料のクレアチニン濃度の測定値を得た。
（６） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０４％ アミート ３２０）〕に替えて、前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔本発明（０．０８％ アミート ３２０）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、及び「血清試料−３」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（７） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０４％ アミート ３２０）〕に替えて、前記１の（１）の（ｃ）の第１試薬〔本発明（０．１２％ アミート ３２０）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、及び「血清試料−３」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（８） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０４％ アミート ３２０）〕に替えて、前記１の（１）の（ｄ）の第１試薬〔本発明（０．１６％ アミート ３２０）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、及び「血清試料−３」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（９） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０４％ アミート ３２０）〕に替えて、前記１の（１）の（ｅ）の第１試薬〔従来発明（０％）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、及び「血清試料−３」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
４．測定結果
前記３において各試料のクレアチニン濃度の測定を行って得られた結果を、表４に示した。
前記３において各試料のクレアチニン濃度の測定を行って得られた結果を、表４に示した。
なお、この表において、横の欄は、第１試薬に含有させたポリオキシエチレンアルキルアミン化合物の種類及びその濃度を表す。〔ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない第１試薬を「０％」と表した。〕
また、この表において、縦の欄は、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度を表す。
そして、この表の各欄において示した値は、当該試料中のクレアチニンの濃度の測定値〔ｍｇ／ｄＬ〕を示す。
なお、（カッコ）の中の数値は、各測定値を、同一の第１試薬を用いた場合の試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が０ｍｇ／ｄＬのときの測定値で除した値をパーセント表示で表したものである。
５．考察
（１） この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まないもの（０％）である場合、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が増すにつれ、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は減少してゆき、試料中のビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの場合には、本来の値の７３％にまで測定値が減少してしまっていることが分かる。
（１） この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まないもの（０％）である場合、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が増すにつれ、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は減少してゆき、試料中のビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの場合には、本来の値の７３％にまで測定値が減少してしまっていることが分かる。
すなわち、試料に含まれるビリルビンの存在により、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は影響を受け、大きく負の誤差が生じていることが分かる。
（２） そして、この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を含む場合の試料中のクレアチニンの濃度の測定値は、前記のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（０％）第１試薬における測定値に対して、試料に含まれるビリルビンに由来する測定値の減少が抑制されていることが分かる。
また、この表より、第１試薬に含まれるポリオキシエチレンアルキルアミン化合物の濃度が０．０４％（ｗ／ｖ）の場合に対して、０．０８％（ｗ／ｖ）以上の場合は、このビリルビンに由来する測定値の減少が、より抑制されていることが分かる。
（３） すなわち、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当たり、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができ、測定結果（測定値）に誤差が生じるのを防ぐことができることが、この実験からも確かめられた。
〔実施例４〕（試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避の効果の確認−４）
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬並びに試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避の効果を更に確認した。
具体的には、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物としてポリオキシエチレンアルキルアミド化合物を用いた場合の、試料に含まれるビリルビンに由来する試料中のクレアチニン測定への影響の回避の効果を確認した。
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬並びに試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避の効果を更に確認した。
具体的には、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物としてポリオキシエチレンアルキルアミド化合物を用いた場合の、試料に含まれるビリルビンに由来する試料中のクレアチニン測定への影響の回避の効果を確認した。
１．クレアチニン測定試薬
（１）第１試薬
（１）第１試薬
（ａ）第１試薬〔本発明（０．０５％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．０５％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を調製した。
ＴＡＭＤＯ−１０ 〔日光ケミカルズ株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物＞ ０．０５％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｂ）第１試薬〔本発明（０．１０％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１０％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１０％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を調製した。
ＴＡＭＤＯ−１０ 〔日光ケミカルズ株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物＞ ０．１０％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｃ）第１試薬〔本発明（０．５０％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．５０％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．５０％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を調製した。
ＴＡＭＤＯ−１０ 〔日光ケミカルズ株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物＞ ０．５０％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｄ）第１試薬〔本発明（１．００％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（１．００％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（１．００％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を調製した。
ＴＡＭＤＯ−１０ 〔日光ケミカルズ株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミド化合物＞ １．００％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｅ）第１試薬〔従来発明（０％）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（濃度０％の）、第１試薬〔従来発明（０％）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（濃度０％の）、第１試薬〔従来発明（０％）〕を調製した。
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（２）第２試薬
第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．８（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．８（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
クレアチニナーゼ ４００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ １５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１５％（ｗ／ｖ）
フェロシアン化カリウム ０．２ｍＭ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ １５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１５％（ｗ／ｖ）
フェロシアン化カリウム ０．２ｍＭ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
２．試料
（１） 市販の干渉物質検討用コントロール物質である「干渉チェック・Ａプラス」〔シスメックス株式会社（日本国）〕の「ビリルビン・Ｃ（抱合型）」を、ビリルビン（抱合型）濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように純水で溶解し、ビリルビン溶液を調製した。
（１） 市販の干渉物質検討用コントロール物質である「干渉チェック・Ａプラス」〔シスメックス株式会社（日本国）〕の「ビリルビン・Ｃ（抱合型）」を、ビリルビン（抱合型）濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように純水で溶解し、ビリルビン溶液を調製した。
（２） 前記（１）で調製したビリルビン溶液の１容量に対して、ヒト血清の９容量を添加、混合し、ビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの血清試料を調製した。
（３） 前記の「干渉チェック・Ａプラス」の『ビリルビン・Ｃ「ブランク」』を、前記（１）における溶解に用いた量と同量の純水で溶解し、ブランク溶液を調製した。
（４） 前記（３）で調製した溶液（ブランク溶液）の１容量に対して、前記（２）で用いたヒト血清の９容量を添加、混合し、ブランク溶液を前記ヒト血清で１／１０に希釈したブランク試料を調製した。
（５） 前記（２）で調製した血清試料を、前記（４）で調製したブランク試料で希釈して、ビリルビン（抱合型）濃度が２５ｍｇ／ｄＬの血清試料を調製した。
なお、この希釈に用いたブランク試料を、ビリルビン（抱合型）濃度が０ｍｇ／ｄＬの血清試料とした。
なお、この希釈に用いたブランク試料を、ビリルビン（抱合型）濃度が０ｍｇ／ｄＬの血清試料とした。
すなわち、次の（ａ）〜（ｃ）の３種類の血清試料をそれぞれ試料とした。
（ａ） 血清試料−１ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｂ） 血清試料−２ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ２５ｍｇ／ｄＬ〕
（ｃ） 血清試料−３ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ５０ｍｇ／ｄＬ〕
（ａ） 血清試料−１ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｂ） 血清試料−２ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ２５ｍｇ／ｄＬ〕
（ｃ） 血清試料−３ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ５０ｍｇ／ｄＬ〕
３．試料中のクレアチニンの測定
前記２の各試料のクレアチニンの測定は、７１８０形日立自動分析装置〔株式会社日立ハイテクノロジーズ（日本国）〕を使用して行った。
前記２の各試料のクレアチニンの測定は、７１８０形日立自動分析装置〔株式会社日立ハイテクノロジーズ（日本国）〕を使用して行った。
（１） 前記２の（ａ）〜（ｃ）の血清試料の各々において、当該試料の６．０μＬに、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕の１５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（２） 次に、１５ポイント（第１試薬添加後２５４．１９３秒）の吸光度及び１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）の吸光度それぞれを主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定して、この１５ポイントの吸光度及び１６ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光１」〕。（試料ブランクの吸光度の測定）
（３） 次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８６．９７７秒）の間に、前記１の（２）の第２試薬の５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（４） 次に、３３ポイント（第１試薬添加後５６９．５８２秒）の吸光度及び３４ポイント（第１試薬添加後５８７．４２６秒）の吸光度それぞれを主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定して、この３３ポイントの吸光度及び３４ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていたクレアチニンの濃度に応じた吸光度の測定）
（５） 次に、試料中に含まれていたクレアチニンの濃度の測定値を次の通り求めた。
すなわち、前記２の（５）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
次に、そのクレアチニンの濃度が分かっている標準試料について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて得た吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、各試料のクレアチニン濃度の測定値を得た。
すなわち、前記２の（５）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
次に、そのクレアチニンの濃度が分かっている標準試料について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて得た吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、各試料のクレアチニン濃度の測定値を得た。
（６） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕に替えて、前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔本発明（０．１０％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、及び「血清試料−３」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（７） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕に替えて、前記１の（１）の（ｃ）の第１試薬〔本発明（０．５０％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、及び「血清試料−３」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（８） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕に替えて、前記１の（１）の（ｄ）の第１試薬〔本発明（１．００％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、及び「血清試料−３」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（９） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（０．０５％ ＴＡＭＤＯ−１０）〕に替えて、前記１の（１）の（ｅ）の第１試薬〔従来発明（０％）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、及び「血清試料−３」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
４．測定結果
前記３において各試料のクレアチニン濃度の測定を行って得られた結果を、表５に示した。
前記３において各試料のクレアチニン濃度の測定を行って得られた結果を、表５に示した。
なお、この表において、横の欄は、第１試薬に含有させたポリオキシエチレンアルキルアミド化合物の種類及びその濃度を表す。〔ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない第１試薬を「０％」と表した。〕
また、この表において、縦の欄は、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度を表す。
そして、この表の各欄において示した値は、当該試料中のクレアチニンの濃度の測定値〔ｍｇ／ｄＬ〕を示す。
なお、（カッコ）の中の数値は、各測定値を、同一の第１試薬を用いた場合の試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が０ｍｇ／ｄＬのときの測定値で除した値をパーセント表示で表したものである。
５．考察
（１） この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まないもの（０％）である場合、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が増すにつれ、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は減少してゆき、試料中のビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの場合には、本来の値の７１％にまで測定値が減少してしまっていることが分かる。
（１） この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まないもの（０％）である場合、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が増すにつれ、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は減少してゆき、試料中のビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの場合には、本来の値の７１％にまで測定値が減少してしまっていることが分かる。
すなわち、試料に含まれるビリルビンの存在により、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は影響を受け、大きく負の誤差が生じていることが分かる。
（２） そして、この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキルアミド化合物を含む場合の試料中のクレアチニンの濃度の測定値は、前記のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含まない（０％）第１試薬における測定値に対して、試料に含まれるビリルビンに由来する測定値の減少が抑制されていることが分かる。
また、この表より、第１試薬に含まれるポリオキシエチレンアルキルアミド化合物の濃度が高い場合の方が、このビリルビンに由来する測定値の減少が、より抑制されていることが分かる。
（３） すなわち、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当たり、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができ、測定結果（測定値）に誤差が生じるのを防ぐことができることが、この実験からも確かめられた。
〔実施例５〕（試料に含まれるビリルビンに由来する影響の回避の効果の確認−５）
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬並びに試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避の効果を更に確認した。
具体的には、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物としてポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を用いた場合の、試料に含まれるビリルビンに由来する試料中のクレアチニン測定への影響の回避の効果を確認した。
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬並びに試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避方法における、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避の効果を更に確認した。
具体的には、本発明において、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物としてポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を用いた場合の、試料に含まれるビリルビンに由来する試料中のクレアチニン測定への影響の回避の効果を確認した。
１．クレアチニン測定試薬
（１）第１試薬
（１）第１試薬
（ａ）第１試薬〔本発明（３．５０％ ポリオキシエチレン（１０）オクチルアミン）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（３．５０％ ポリオキシエチレン（１０）オクチルアミン）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（３．５０％ ポリオキシエチレン（１０）オクチルアミン）〕を調製した。
ポリオキシエチレンオクチルアミン（エチレンオキシド付加モル数であるｍとｎの和：１０） ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ３．５０％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｂ）第１試薬〔本発明（０．１５％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１５％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔本発明（０．１５％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕を調製した。
ナイミーン Ｓ−２２０ 〔日油株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物＞ ０．１５％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｃ）第１試薬〔従来発明（０．１０％ ＢＴ−９）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔従来発明（０．１０％ ＢＴ−９）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔従来発明（０．１０％ ＢＴ−９）〕を調製した。
ＢＴ−９ 〔日光ケミカルズ株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレン（９）２級アルキルエーテル＞ ０．１０％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｄ）第１試薬〔従来発明（１．００％ ＢＴ−９）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔従来発明（１．００％ ＢＴ−９）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔従来発明（１．００％ ＢＴ−９）〕を調製した。
ＢＴ−９ 〔日光ケミカルズ株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシエチレン（９）２級アルキルエーテル＞ １．００％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｅ）第１試薬〔従来発明（０．１０％ サンニックス ＧＰ−４００）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔従来発明（０．１０％ サンニックス ＧＰ−４００）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔従来発明（０．１０％ サンニックス ＧＰ−４００）〕を調製した。
サンニックス ＧＰ−４００ 〔三洋化成工業株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシプロピレングリセリルエーテル＞ ０．１０％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｆ）第１試薬〔従来発明（１．００％ サンニックス ＧＰ−４００）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔従来発明（１．００％ サンニックス ＧＰ−４００）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、第１試薬〔従来発明（１．００％ サンニックス ＧＰ−４００）〕を調製した。
サンニックス ＧＰ−４００ 〔三洋化成工業株式会社（日本国）〕 ＜ポリオキシプロピレングリセリルエーテル＞ １．００％（ｗ／ｖ）
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（ｇ）第１試薬〔従来発明（０％）〕の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物も他の界面活性剤（ＢＴ−９及びサンニックス ＧＰ−４００等）も含まない（濃度０％の）、第１試薬〔従来発明（０％）〕を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．４（２０℃）に調整して、ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物も他の界面活性剤（ＢＴ−９及びサンニックス ＧＰ−４００等）も含まない（濃度０％の）、第１試薬〔従来発明（０％）〕を調製した。
ザルコシンオキシダーゼ １３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
クレアチナーゼ ４０，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
カタラーゼ ２００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン，ナトリウム塩，２水和物 〔ＡＤＯＳ〕 ＜色原体（水素供与体）＞ ２ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ ３，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
（２）第２試薬
第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．８（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．８（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
クレアチニナーゼ ４００，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ １５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１５％（ｗ／ｖ）
フェロシアン化カリウム ０．２ｍＭ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
４−アミノアンチピリン ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ １５，０００Ｕｎｉｔ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１５％（ｗ／ｖ）
フェロシアン化カリウム ０．２ｍＭ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸〕 ＜緩衝剤＞ ２０ｍＭ
２．試料
（１） 市販の干渉物質検討用コントロール物質である「干渉チェック・Ａプラス」〔シスメックス株式会社（日本国）〕の「ビリルビン・Ｃ（抱合型）」を、ビリルビン（抱合型）濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように純水で溶解し、ビリルビン溶液を調製した。
（１） 市販の干渉物質検討用コントロール物質である「干渉チェック・Ａプラス」〔シスメックス株式会社（日本国）〕の「ビリルビン・Ｃ（抱合型）」を、ビリルビン（抱合型）濃度が５００ｍｇ／ｄＬとなるように純水で溶解し、ビリルビン溶液を調製した。
（２） 前記（１）で調製したビリルビン溶液の１容量に対して、ヒト血清の９容量を添加、混合し、ビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの血清試料を調製した。
（３） 前記の「干渉チェック・Ａプラス」の『ビリルビン・Ｃ「ブランク」』を、前記（１）における溶解に用いた量と同量の純水で溶解し、ブランク溶液を調製した。
（４） 前記（３）で調製した溶液（ブランク溶液）の１容量に対して、前記（２）で用いたヒト血清の９容量を添加、混合し、ブランク溶液を前記ヒト血清で１／１０に希釈したブランク試料を調製した。
（５） 前記（２）で調製した血清試料を、前記（４）で調製したブランク試料で希釈して、ビリルビン（抱合型）濃度が、４０ｍｇ／ｄＬの血清試料、３０ｍｇ／ｄＬの血清試料、２０ｍｇ／ｄＬの血清試料、及び１０ｍｇ／ｄＬの血清試料をそれぞれ調製した。
なお、この希釈に用いたブランク試料を、ビリルビン（抱合型）濃度が０ｍｇ／ｄＬの血清試料とした。
なお、この希釈に用いたブランク試料を、ビリルビン（抱合型）濃度が０ｍｇ／ｄＬの血清試料とした。
すなわち、次の（ａ）〜（ｆ）の６種類の血清試料をそれぞれ試料とした。
（ａ） 血清試料−１ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｂ） 血清試料−２ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 １０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｃ） 血清試料−３ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ２０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｄ） 血清試料−４ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ３０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｅ） 血清試料−５ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ４０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｆ） 血清試料−６ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ５０ｍｇ／ｄＬ〕
（ａ） 血清試料−１ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｂ） 血清試料−２ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 １０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｃ） 血清試料−３ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ２０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｄ） 血清試料−４ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ３０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｅ） 血清試料−５ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ４０ｍｇ／ｄＬ〕
（ｆ） 血清試料−６ 〔ビリルビン（抱合型）濃度 ５０ｍｇ／ｄＬ〕
３．試料中のクレアチニンの測定
前記２の各試料のクレアチニンの測定は、７１８０形日立自動分析装置〔株式会社日立ハイテクノロジーズ（日本国）〕を使用して行った。
前記２の各試料のクレアチニンの測定は、７１８０形日立自動分析装置〔株式会社日立ハイテクノロジーズ（日本国）〕を使用して行った。
（１） 前記２の（ａ）〜（ｆ）の血清試料の各々において、当該試料の６．０μＬに、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（３．５０％ ポリオキシエチレン（１０）オクチルアミン）〕の１５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（２） 次に、１５ポイント（第１試薬添加後２５４．１９３秒）の吸光度及び１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）の吸光度それぞれを主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定して、この１５ポイントの吸光度及び１６ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光１」〕。（試料ブランクの吸光度の測定）
（３） 次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８６．９７７秒）の間に、前記１の（２）の第２試薬の５０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
（４） 次に、３３ポイント（第１試薬添加後５６９．５８２秒）の吸光度及び３４ポイント（第１試薬添加後５８７．４２６秒）の吸光度それぞれを主波長６００ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定して、この３３ポイントの吸光度及び３４ポイントの吸光度の平均値を算出した〔「測光２」〕。（試料中に含まれていたクレアチニンの濃度に応じた吸光度の測定）
（５） 次に、試料中に含まれていたクレアチニンの濃度の測定値を次の通り求めた。
すなわち、前記２の（５）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
次に、そのクレアチニンの濃度が分かっている標準試料について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて得た吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、各試料のクレアチニン濃度の測定値を得た。
すなわち、前記２の（５）の各試料毎に、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から、前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて、吸光度差の値を求めた。
次に、そのクレアチニンの濃度が分かっている標準試料について、前記の（１）〜（４）の通りに測定を行い、前記（４）において測定した吸光度の平均値（「測光２」）から前記（２）において測定した吸光度の平均値（「測光１」）を差し引いて得た吸光度差の値と前記の各試料における吸光度差の値とを対比し、比例計算を行うことにより、各試料のクレアチニン濃度の測定値を得た。
（６） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（３．５０％ ポリオキシエチレン（１０）オクチルアミン）〕に替えて、前記１の（１）の（ｂ）の第１試薬〔本発明（０．１５％ ナイミーン Ｓ−２２０）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（７） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（３．５０％ ポリオキシエチレン（１０）オクチルアミン）〕に替えて、前記１の（１）の（ｃ）の第１試薬〔従来発明（０．１０％ ＢＴ−９）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（８） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（３．５０％ ポリオキシエチレン（１０）オクチルアミン）〕に替えて、前記１の（１）の（ｄ）の第１試薬〔従来発明（１．００％ ＢＴ−９）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（９） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（３．５０％ ポリオキシエチレン（１０）オクチルアミン）〕に替えて、前記１の（１）の（ｅ）の第１試薬〔従来発明（０．１０％ サンニックス ＧＰ−４００）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（１０） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（３．５０％ ポリオキシエチレン（１０）オクチルアミン）〕に替えて、前記１の（１）の（ｆ）の第１試薬〔従来発明（１．００％ サンニックス ＧＰ−４００）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
（１１） また、前記（１）において、前記１の（１）の（ａ）の第１試薬〔本発明（３．５０％ ポリオキシエチレン（１０）オクチルアミン）〕に替えて、前記１の（１）の（ｇ）の第１試薬〔従来発明（０％）〕を用いること以外は、前記（１）〜（５）の通りに操作を行い、「血清試料−１」、「血清試料−２」、「血清試料−３」、「血清試料−４」、「血清試料−５」、及び「血清試料−６」のそれぞれのクレアチニン濃度の最終的な測定値を求めた。
４．測定結果
前記３において各試料のクレアチニン濃度の測定を行って得られた結果を、表６に示した。
前記３において各試料のクレアチニン濃度の測定を行って得られた結果を、表６に示した。
なお、この表において、横の欄は、第１試薬に含有させたポリオキシエチレンアルキルアミン化合物又は他の界面活性剤（ＢＴ−９若しくはサンニックス ＧＰ−４００）の種類及びその濃度を表す。〔ポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物も他の界面活性剤（ＢＴ−９及びサンニックス ＧＰ−４００等）も含まない第１試薬を「０％」と表した。〕
また、この表において、縦の欄は、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度を表す。
そして、この表の各欄において示した値は、当該試料中のクレアチニンの濃度の測定値〔ｍｇ／ｄＬ〕を示す。
なお、（カッコ）の中の数値は、各測定値を、同一の第１試薬を用いた場合の試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が０ｍｇ／ｄＬのときの測定値で除した値をパーセント表示で表したものである。
５．考察
（１） この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物も他の界面活性剤（ＢＴ−９及びサンニックス ＧＰ−４００等）も含まないもの（０％）である場合、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が増すにつれ、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は減少してゆき、試料中のビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの場合には、本来の値の７３％にまで測定値が減少してしまっていることが分かる。
（１） この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物も他の界面活性剤（ＢＴ−９及びサンニックス ＧＰ−４００等）も含まないもの（０％）である場合、試料中のビリルビン（抱合型）の濃度が増すにつれ、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は減少してゆき、試料中のビリルビン（抱合型）濃度が５０ｍｇ／ｄＬの場合には、本来の値の７３％にまで測定値が減少してしまっていることが分かる。
すなわち、試料に含まれるビリルビンの存在により、試料中のクレアチニンの濃度の測定値は影響を受け、大きく負の誤差が生じていることが分かる。
（２） そして、この表より、第１試薬がポリオキシエチレンアルキルアミン化合物を含む場合の試料中のクレアチニンの濃度の測定値は、前記のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物も他の界面活性剤（ＢＴ−９及びサンニックス ＧＰ−４００等）も含まない（０％）第１試薬における測定値に対して、試料に含まれるビリルビンに由来する測定値の減少が抑制されていることが分かる。
（３） これに対して、第１試薬が他の界面活性剤（ＢＴ−９又はサンニックス ＧＰ−４００）を含む場合の試料中のクレアチニンの濃度の測定値は、前記のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物も他の界面活性剤（ＢＴ−９及びサンニックス ＧＰ−４００等）も含まない（０％）第１試薬における測定値に対して、試料に含まれるビリルビンに由来する測定値の減少度が同等であるか又はそれ以上であることが分かる。つまり、この場合、試料に含まれるビリルビンに由来する測定値の減少を抑制できていないことが分かる。
（４） すなわち、酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中の測定対象物質を測定するに当たり、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことにより、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができ、測定結果（測定値）に誤差が生じるのを防ぐことができることが確かめられた。
そして、このポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物以外の他の界面活性剤（ＢＴ−９又はサンニックス ＧＰ−４００）を存在させて測定を行っても、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避することができず、測定結果（測定値）に誤差が生じるのを防ぐことができないことが確かめられた。
Claims (3)
- 酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中のクレアチニンを測定する方法において、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響を回避するため、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とする、試料中のクレアチニンの測定方法。
- 酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中のクレアチニンを測定する試薬において、試料に含まれるビリルビンに由来する測定への影響の回避剤として、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を含有させることを特徴とする、試料中のクレアチニンの測定試薬。
- 酸化酵素により生じた過酸化水素を色原体を用いて光学的に測定することにより試料中のクレアチニンを測定するに当り、ポリオキシエチレンアルキルアミン化合物及びポリオキシエチレンアルキルアミド化合物から選ばれる少なくとも１種のポリオキシエチレンアルキル含窒素化合物を存在させて測定を行なうことを特徴とする、試料に含まれるビリルビンに由来するクレアチニン測定への影響の回避方法。
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