JP2020043857A - 生体試料中の亜鉛測定試薬及び測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
それら内在性の酵素の活性は、亜鉛欠乏時には低下することが知られており、内在性のアルカリフォスファターゼやアンジオテンシン変換酵素(ACE)の活性を計測することにより間接的に亜鉛濃度を計測する方法も模索されている(非特許文献4及び5)。しかしながら、この方法は試料中の対象(患者)依存的な元々の酵素の発現存在量、及び採取後の試料内での酵素の自然分解の影響を受け、客観的な基準を決めるのは難しい。
[1](1)生体採取試料に該生体採取試料内に存在しない亜鉛要求性酵素を加えるステップ、
(2)さらに該亜鉛要求性酵素の基質を加え、該亜鉛要求性酵素を反応させるステップ、
(3)該酵素反応物を検出定量するステップ及び
(4)得られた結果から、該生体試料中の亜鉛濃度を決定するステップ
を含む、生体試料中の亜鉛濃度測定方法
<ここでステップ(1)及び(2)は同時または連続してでもよい>;
[2]生体採取試料が血清又は血漿である、上記[1]に記載の測定方法。
[4]前記アミノアシラーゼがD−アミノアシラーゼ(DAA)である上記[3]に記載の方法。
[6]前記N−アシルD−アミノ酸がアセチルD−アミノ酸である、上記[5]に記載の測定方法;
[7]前記アセチルD−アミノ酸が、アセチルD−フェニルアラニン(Ac―D−Phe)、アセチルD−メチオニン(Ac―D−Met)、アセチルD−ロイシン(Ac―D−Leu)、及びアセチルD−バリン(Ac―D−Val)からなる群から選択されるアセチルD−アミノ酸である、上記[6]に記載の測定方法。
[9]前記酵素反応物がD−Phe、D−Met、D−Leu及びD−Valからなる群から選択されるD−アミノ酸である、上記[7]に記載の測定方法。
(3−1)D−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)を加え、D−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ;ならびに
(3−2)得られた過酸化水素の量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、上記[8]または[9]に記載の測定方法;
[11]前記ステップ(3−2)がペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ発色基質(色原体)を用いて、生成する色素の発色の検出を含む、上記[10]に記載の測定方法;
[12]前記ペルオキシダーゼ発色基質(色原体)が、4−アミノアンチピリン(4−AAP)と3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸 (HTIB)とからなる発色基質(色原体)である上記[11]に記載の測定方法;
[13]色素の発色の検出を測定波長545nm〜700nmの吸光度にて行う上記[12]に記載の測定方法。
(3−1)D−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)を加え、D−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ;ならびに
(3−2)得られたα―ケト酸の量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、上記[8]または[9]に記載の測定方法;
[15]前記ステップ(3)が、さらに
(3−1)D−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)を加え、D−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ;ならびに
(3−2)得られたアンモニアの量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、上記[8]または[9]に記載の測定方法。
[17]上記[10]から[15]のいずれか一項に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるD−アミノアシラーゼ、その基質であるN−アシルD−アミノ酸、ならびにD−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)を含むキット;
[18]上記[12]に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるD−アミノアシラーゼ、その基質であるN−アシルD−アミノ酸、D−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)ならびにペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ発色基質を含むキット;
[19]上記[13]又は[14]に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるD−アミノアシラーゼ、その基質であるN−アシルD−アミノ酸、D−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)ならびにペルオキシダーゼと、4−アミノアンチピリン(4−AAP)と3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸 (HTIB)とからなる発色基質(色原体)であるペルオキシダーゼ発色基質を含むキット。
かかる方法で得られた亜鉛濃度を用いて、患者の症状の重篤度の診断及び治療効果の診断を手助けすることが可能である。
末梢血とは採血した状態の血球を分離していない血液であり、採血用の採血管等に含まれるヘパリン、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、モノヨード酢酸等の抗凝固剤や解糖阻止剤等を含んでいてもよい。保存した血液の場合には、エチレンジアミン四酢酸・2カリウム塩(EDTA・2K)、エチレンジアミン四酢酸・2ナトリウム塩(EDTA・2Na)などのキレート剤は含まない方がよい。
又、採血管等を使用せずに、自己血糖測定等に用いられる穿刺器具等により採血した血液でもよい。穿刺による採血部位は、指先の他、前腕外側や腹壁又は上腕外側等特に制限はない。その採血量は、例えば、200μL以下、好ましくは0.1μLから50μL程度、より好ましくは2μLから20μL程度である。
採血した血液を遠心分離して細胞成分(赤血球、白血球、血小板)を除いたものが血漿 (plasma)であり、血液(全血)を凝固させ血小板や凝固因子を除いたものが血清 (serum)である。
界面活性剤としては、亜鉛濃度の測定に影響しなければ特に限定されず、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等の界面活性剤が挙げられるが、中でも、両性イオン性界面活性剤が好ましい。両面界面活性剤としては、ベタイン型(ラウリルジメチルアミノ酢酸、ベタインジメチルアルキルラウリル、ベタインアルキルカルボキシベタインなど)、スルホベタイン型(ラウロアンホ酢酸ナトリウムなど)、アミンオキシド型(ジメチルラウリルアミンオキシド、ラウリルジメチルアミンオキサイドなど)が挙げられる。
L−アミノアシラーゼ(LAA)(N-acyl-L-amino-acid deacylase)とは、以下の化学式の反応によりNアシルLアミノ酸を加水分解する活性を有する酵素をいう:
R’CONH・CH(R)・COOH+H2O
→ NH2・CH(R)・COOH+R’COOH
[ここでNH2・CH(R)・COOHはL−アミノ酸であり、R’CO-はアシル基である]。
D−アミノアシラーゼ(DAA)(N-acyl-D-amino-acid deacylase)とは、以下の化学式の反応によりNアシルDアミノ酸を加水分解する活性を有する酵素をいう:
R’CONH・CH(R)・COOH+H2O
→ NH2・CH(R)・COOH+R’COOH
[ここでNH2・CH(R)・COOHはD−アミノ酸であり、R’CO-はアシル基である]。
EC番号(酵素番号:Enzyme Commission numbers)は酵素を整理すべく反応形式に従ってECに続く4組の数字で表したものであり、国際生化学連合(現在のNC−IUBMB)の酵素委員会によって規定されたものである。D−アミノアシラーゼ1(DAA1)(EC3.5.1.81)は下記のウェブページの記載で規定される:
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/5/1/81.html
特に好ましくは、Alcaligenes denitrificans subsp.xylosoxydans及びAlcaligenes xylosoxydans subsp.Xylosoxydans由来のD−アミノアシラーゼである。
本願におけるD−アミノアシラーゼ(DAA)には、上記N-acyl-D-amino-acid deacylase(EC3.5.1.81)、N-acyl-D-glutamate deacylase(EC3.5.1.82)やN-acyl-D-aspartate deacylase(EC3.5.1.83)が含まれるが、これに限定されない。亜鉛要求性であり、NアシルDアミノ酸を加水分解する活性を有する酵素であれば、他にいかなる活性(たとえばNアシルLアミノ酸を加水分解する活性)を有していてもよい。
Dアミノ酸とはLアミノ酸の光学異性体であり、D−Ala(アラニン)、D−Arg(アルギニン)、D−Asn(アスパラギン)、D−Asp(アスパラギン酸)、D−Cys(システイン)、D−Gln(グルタミン)、D−Glu(グルタミン酸)、D−His(ヒスチジン)、D−Ile(イソロイシン)、D−Leu(ロイシン)、D−Lys(リジン)、D−Met(メチオニン)、D−Phe(フェニルアラニン)、D−Pro(プロリン)、D−Ser(セリン)、D−Thr(トレオニン)、D−Trp(トリプトファン),D−Tyr(チロシン),D−Val(バリン)などが挙げられる。
従ってアセチルD−アミノ酸とはアセチルD−Ala、アセチルD−Arg、アセチルD−Asn、アセチルD−Asp、アセチルD−Cys、アセチルD−Gln、アセチルD−Glu、アセチルD−His、アセチルD−Ile、アセチルD−Leu、アセチルD−Lys、アセチルD−Met、アセチルD−Phe、アセチルD−Pro、アセチルD−Ser、アセチルD−Thr、アセチルD−Trp,アセチルD−Tyr,アセチルD−Valなどが挙げられる。
添加するD−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)の量は、最終濃度で約0.1KU/L〜約100KU/L、より好ましくは約1KU/L〜約10KU/Lである。場合により、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を反応系に加えてもよい。
反応時間は37度で5分以上が好ましい。
α−ケト酸 + NADH → α−ヒドロキシ酸 + NAD
を行い、NADの吸光度変化量からα−ケト酸の量を換算し、その量から前記酵素反応物を検出定量する方法があげられる。
あるいは、α−ケト酸還元酵素とβ-NADPHを用いて、以下の反応:
α−ケト酸 + β-NADPH → α−ヒドロキシ酸 + β-NADP
を行い、β-NADPの吸光度変化量からα−ケト酸の量を換算し、その量から前記酵素反応物を定量する方法があげられる。
NH3 + α-ケトグルタル酸 + β-NADPH → グルタミン酸 + β-NADP
を行い、β-NADPの吸光度変化量からアンモニア量を換算し、その量から前記酵素反応物を定量する方法があげられる。
該色原体としては酸化発色型色原体又は酸化カップリング発色型色原体が挙げられるが、酸化カップリング発色型色原体が好ましい。
該カプラーとしては、例えば、4−アミノアンチピリン(4AAP)、3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)、2−ヒドラゾノ−2,3−ジヒドロ−3−メチル−6−ベンゾチアゾールスルホン酸(SMBTH)、N−メチル−3−メトキシ―4’−アミノ−ジフェニルアミン(NCP−06)、N−メチル−4−アミノ―ジフェニルアミン(NCP−04)等がある。
カプラーと酸化縮合する該アニリン類(トリンダー試薬)又は該フェノール類としては、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン(TOOS)、N−エチル−N−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン(DAPS)、N−スルホプロピルアニリン(HALPS)、N−エチル−N−スルホプロピル−m−アニシジン(ADPS)、N−エチル−N−スルホプロピルアニリン(ALPS)、N−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン(HDAPS)、N−エチル−N−スルホプロピルアニリン(ALPS)、N−スルホプロピル−3,5−ジメチルアニリン(MAPS)、3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。
該色原体としては酸化発色型色原体又は酸化カップリング発色型色原体などが挙げられるが、酸化カップリング発色型色原体が好ましい。
汎用の自動分析装置としては、例えば、(株)日立製の7020形、7070形、7170形、7180形、7700形、9000形、LABOSPECT 003形、LABOSPECT 006形、LABOSPECT 008形;(株)日本電子製のJCA−BM6010形、JCA−BM6050形、JCA−BM6070形、JCA−BM9130形、JCA−BM8000G形;(株)東芝製のTBA−120FR、TBA−c8000、TBA−2000FR、TBA−c16000;(株)ベックマン・コールター製のAU480、AU640、AU680、AU5800;(株)古野電気製のCA−270、CA−400などの自動分析装置がある。
汎用の自動分析装置のサンプルポートに測定する生体採取試料をセットし、第一試薬として亜鉛要求性酵素を含む溶液をセットし、第二試薬として該酵素反応物を検出定量するために使用する試薬を含む溶液をセットし、生体採取試料、第一試薬及び第二試薬の分注量、反応時間、反応温度、測定波長を入力し測定を行う。
又、第一試薬、第二試薬はpH6.5からpH9.5が好ましく、緩衝剤としてMES、Bis−Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES等を用いるのが好ましい。
更に、再現性向上のための試薬(たとえば非イオン性界面活性剤のBriji−35、両性イオン性界面活性剤のアンヒトール20BS)や防腐剤(アジ化ナトリウム)、あるいは酵素安定性のための試薬(たとえば(血清)アルブミンなど)を加えてもよい。
反応温度としては20℃から45℃、好ましくは37℃である。
更に、他の実施態様としては、LabonChipの形態で、生体採取試料を、亜鉛要求性酵素及びその基質を含む乾燥試薬の上通過反応させた後、該酵素反応物を検出定量するための乾燥試薬の上を通過させ、最終的な試料体積を増加させることなく、亜鉛濃度を計測する方法がある。
本発明の測定用キットの各試薬の構成は2以上に分かれていてもよい。
亜鉛存在下での種々のアセチル−D−アミノ酸に対する反応性確認
1.方法
水溶液中に含まれる亜鉛をアセチル−D−アミノ酸を基質として用いた場合に測定できるか検討した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
生理食塩水および亜鉛を1000μg/dL含む生理食塩水
第一試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS] pH9.0(同仁化学)
100mM
HTIB(同仁化学) 1mM
Briji−35(ナカライテスク) 0.1%
Flavin adenine dinucleotide(ロシュ・ダイアグノスティクス) 0.5mM
Catalase(キッコーマン) 200KU/L
D−amino acid oxidase 1KU/L
(シグマアルドリッチ)
D−aminoacylase1(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
Acetyl−D−amino acid (渡辺化学) 100mM
第二試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS] pH9.0(同仁化学)
100mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 4mM
Potassium ferrocyanide(和光純薬) 1mM
BPSH−25(日光ケミカルス) 2%
Sodium azide(ナカライテスク) 0.09%
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
各基質に対する吸光度変化量(x10000)を表1に示す。
亜鉛水溶液中の希釈直線性の確認
1.方法
亜鉛水溶液における希釈直線性の検討を行った。
試料
酢酸亜鉛を365μg/dLになるように生理食塩水に溶解し、その溶液を生理食塩水にて7段階に希釈した。
第一試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS] pH9.0(同仁化学)
100mM
HTIB(同仁化学) 1mM
Briji−35(ナカライテスク) 0.1%
Flavin adenine dinucleotide 0.5mM
(ロシュ・ダイアグノスティクス)
Catalase(キッコーマン) 200KU/L
D−amino acid oxidase 1KU/L
(シグマアルドリッチ)
D−aminoacylase1(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
Acetyl−D−Phenylalanine(渡辺化学) 100mM
第二試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS] pH9.0(同仁化学)
100mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 4mM
Potassium ferrocyanide(和光純薬) 1mM
BPSH−25(日光ケミカルス) 2%
Sodium azide(ナカライテスク) 0.09%
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
本法での希釈直線性を図1に示す。
希釈倍率をX、本法をYとして希釈直線性を確認した。図1に示したように、Y = 52.38X − 5.99、相関係数0.9996と良好な結果が得られた。このことから本法は希釈直線性が正確であるといえる。
生体試料での添加回収試験の確認
1.方法
生体試料中の亜鉛を正確に測定できるか確認するため添加回収試験を実施した。試料および試薬は以下の通りである。なお、比較例として亜鉛を測定する場合の一般的な方法である、キレート剤用いた直接法も検討した。
試料
下記に示す3種類の試料を作製し、添加回収試験を実施した。
生体試料(亜鉛濃度95μg/dL)と生理食塩水を9対1で混合したもの[I]
生体試料(亜鉛濃度95μg/dL)と亜鉛水溶液(亜鉛濃度1000μg/dL)を9対1で混合したもの [II]
生理食塩水と亜鉛水溶液(亜鉛濃度1000μg/dL)を9対1で混合したもの[III]
第一試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS]pH8.5(同仁化学)
100mM
HTIB(同仁化学) 1mM
ユニセーフA−LM(日油) 1%
D−aminoacylase1(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
第二試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH7.0(同仁化学)
250mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 4mM
Potassium ferrocyanide(和光純薬) 1mM
BPSH−25(日光ケミカルス) 2%
Acetyl−D−phenylalanine(渡辺化学) 400mM
D−amino acid oxidase(池田糖化工業) 50KU/L
Flavin adenine dinucleotide 1.5mM
(ロシュ・ダイアグノスティクス)
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
添加回収率(%) = (試料[II]− 試料[III]) / 試料[I]× 100
各試料に対する本測定系の測定値と添加回収率を表2に示す。
共存物質を含む生体試料中の亜鉛測定
1.方法
共存物質を添加した場合に試料中の亜鉛を正確に測定できるか検討した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
生体試料(亜鉛濃度110μg/dL)と共存物質を9対1で混合し、共存物質を目的の濃度にした。
添加した共存物質と終濃度は以下の通りである。
抱合型ビリルビン 20mg/dL
非抱合型ビリルビン 20mg/dL
ヘモグロビン 200mg/dL
乳糜 3000FTU
イントラリピッド 5%
第一試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS]pH8.5(同仁化学)
100mM
HTIB(同仁化学) 1mM
アンヒトール 20BS(花王) 1%
D−aminoacylase1(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
第二試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH7.0(同仁化学)
250mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 4mM
Potassium ferrocyanide(和光純薬) 1mM
BPSH−25(日光ケミカルス) 2%
Acetyl−D−phenylalanine(渡辺化学) 400mM
D−amino acid oxidase(池田糖化工業) 50KU/L
Flavin adenine dinucleotide 1.5mM
(ロシュ・ダイアグノスティクス)
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
各共存物質に対する本測定系の影響率を表4に示す。
ヒト血清中の亜鉛測定
1.方法
既存法(直接法)との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート剤を用いた、アキュラスオートZnを使用した。
試料
インフォームドコンセントの得られたヒト血清(n=10)を用いた。
第一試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS] pH8.5(同仁化学)
100mM
HTIB(同仁化学) 1mM
ユニセーフA−LM(日油) 1%
D−aminoacylase1(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
第二試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH7.0
250mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 4mM
Potassium ferrocyanide(和光純薬) 1mM
BPSH−25(日光ケミカルス) 2%
Acetyl−D−phenylalanine(渡辺化学) 400mM
D−amino acid oxidase(池田糖化工業) 50KU/L
Flavin adenine dinucleotide
(ロシュ・ダイアグノスティクス) 1.5mM
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
既存法との相関性を図2に示す。
既存法をX、本法をYとして相関性を確認した。図2に示したように、Y = 1.0455X − 3.7367、相関係数0.9826と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できているといえる。
金属特異性の確認
1.方法
ヒト血液中に含まれる金属を測定した場合の反応性を確認した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
生体濃度に調製した金属を含む生理食塩水。金属種と添加量を表4に示す。
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS]pH8.5(同仁化学)
50mM
HTIB(同仁化学) 1mM
アンヒトール20BS(花王) 1%
D−aminoacylase1(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
第二試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH7.0(同仁化学)
250mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 4mM
Potassium ferrocyanide(和光純薬) 1mM
BPSH−25(日光ケミカルス) 2%
Acetyl−D−phenylalanine(渡辺化学) 400mM
D−amino acid oxidase(池田糖化工業) 50KU/L
Flavin adenine dinucleotide 1.5mM
(ロシュ・ダイアグノスティクス)
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
各金属に対する吸光度変化量(x10000)を表5に示す。
ヒト血清中の亜鉛測定における界面活性剤の影響
1.方法
既存法(直接法)との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート剤を用いた、アキュラスオートZnを使用した。
試料
インフォームドコンセントの得られたヒト血清(n=10)を用いた。
第一試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS]pH8.5(同仁化学)
100mM
HTIB(同仁化学) 1mM
D−aminoacylase1(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
ユニセーフA−LM(日油) 0% 又は 1%
第二試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH7.0
250mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 4mM
Potassium ferrocyanide(和光純薬) 1mM
Acetyl−D−phenylalanine(渡辺化学) 400mM
D−amino acid oxidase(池田糖化工業) 50KU/L
Flavin adenine dinucleotide 1.5mM
(ロシュ・ダイアグノスティクス)
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
キレート法との相関性を図3(界面活性剤0%)及び、図4(界面活性剤1%)に示す。
既存法をX、本法をYとして相関性を確認した。図3ではY = 1.009X + 2.831、相関係数0.9334、図4ではY = 0.884X + 6.684、相関係数0.9772と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できているといえる。また、界面活性剤の添加による測定性能の違いは認められなかった。
アルコール脱水素酵素を用いた反応系の確認
1.方法
水溶液中に含まれる亜鉛をモノエタノールアミンを基質として用いた場合に測定できるか検討した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
生理食塩水および亜鉛を500μg/dL含む生理食塩水
第一試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS] pH8.5(同仁化学)
100mM
Monoethanol amine(和光純薬) 100mM
第二試薬
2−Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate [MES]pH6.0(同仁化学) 50mM
β−Nicotinamide adenine dinucleotide(オリエンタル酵母) 10mM
Potassium ferrocyanide 1mM
Alcohol dehydrogenase(オリエンタル酵母)25KU/L
各亜鉛添加量に対する吸光度変化量を表6に示す。試料中に亜鉛が含まれている場合においても、吸光度変化は生じなかった。
炭酸脱水素酵素を用いた反応系の確認
1.方法
水溶液中に含まれる亜鉛をパラニトロフェニル酢酸を基質として用いた場合に測定できるか検討した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
酢酸亜鉛を650μg/dLになるように生理食塩水に溶解し、その溶液を生理食塩水にて10段階に希釈した。
第一試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH7.5(同仁化学)
500mM
Carbonic anhydrase(SERVA) 0.25mg/mL(protein concentration)
第二試薬
塩化ナトリウム(和光純薬) 150mM
p−Nitrophenyl acetate 4.5mM
Carbonic anhydraseを75mMのPyridine 2,6−dicarboxylic acid(東京化成)溶液に溶解させ、Pyridine 2,6−dicarboxylic acidに亜鉛を12時間結合させる。次いで、200mMのリン酸二水素ナトリウム溶液 pH7.4(和光純薬)にて12時間透析を行う。透析を計3回行うことでCarbonic anhydrase中の亜鉛を完全に除去させる。
本法での希釈直線性を図5に示す。
希釈倍率をX、本法をYとして希釈直線性を確認した。図5に示したように、Y = 63.32X + 1.17、相関係数0.9993と良好な結果が得られた。このことから本法は希釈直線性が正確であるといえる。
炭酸脱水素酵素を用いたヒト血清中の亜鉛測定
1.方法
既存法(直接法)との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート剤を用いた、アキュラスオートZnを使用した。
試料
インフォームドコンセントの得られたヒト血清(n=25)を用いた。
第一試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH7.5(同仁化学)
500mM
Carbonic anhydrase(SERVA) 0.2mg/mL(protein concentration)
第二試薬
コハク酸 pH5.0(和光純薬) 50mM
塩化ナトリウム(和光純薬) 150mM
p−Nitrophenyl acetate 4.5mM
測定法は参考例2と同様の方法にて測定した。
キレート法との相関性を図6に示す。
既存法をX、本法をYとして相関性を確認した。図6に示したように、Y = 1.2228X + 130.47、相関係数0.4037と良好な結果が得られなかった。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できていないことが示された。
ウシ血清アルブミン添加による亜鉛測定試薬の安定化
1.方法
亜鉛測定試薬にウシ血清アルブミンを添加することによる試薬の安定性向上について検討した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
酢酸亜鉛を300μg/dLになるように生理食塩水に溶解し、その溶液を生理食塩水にて4段階に希釈した。
第一試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS]pH9.0(同仁化学)
50mM
TOOS(同仁化学) 1mM
D−aminoacylase1(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
ユニセーフA−LM(花王ケミカルス) 1%
Barium chloride (ナカライテスク) 25mM
Bovine serum albumin(Sigma−Aldrich)
0%又は3%
第二試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH7.0(同仁化学)
250mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 4mM
Potassium ferrocyanide(和光純薬) 1mM
Acetyl−D−phenylalanine(渡辺化学) 400mM
D−amino acid oxidase(池田糖化工業) 5KU/L
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
BPSH−25(日光ケミカルス) 2%
Triton X−100(Sigma−Aldrich) 0.5%
Sodium chloride(和光純薬) 150mM
測定法は実施例1と同様の方法にて測定し、主波長を600nmに変更して測定を行った。
上記0日目、7日目の試薬を用いて測定した各亜鉛濃度の吸光度に対し、同日に測定した対応する亜鉛0μg/dLの吸光度の差を各亜鉛濃度における反応感度とし、式[(7日目感度/0日目感度)x100]によって感度維持率を算出した。
熱安定性試験におけるBSA添加の有無による感度結果を表7に示す。熱安定性試験0日目を感度100%とすると、BSA未添加では試験7日目に感度が0%となるのに対し、BSAを添加すると99%−103%に感度が維持されることが示された。このことからBSAの添加により試薬の安定性が向上したといえる。
ヒト血漿中の亜鉛測定
1.方法
既存法(直接法)との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート発色剤を用いた、アキュラスオートZnを使用した。
試料
インフォームドコンセントの得られたヒト血漿(n=50)を用いた。
第一試薬
N−Tris(hydroxymethyl)methyl−3−aminopropanesulfonic acid [TAPS]pH8.5(同仁化学)
50mM
HTIB(同仁化学) 1mM
D−aminoacylase1(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
ユニセーフA−LM(花王ケミカルス) 1%
Barium chloride (ナカライテスク) 25mM
Bovine serum albumin(Sigma−Aldrich)
3%
第二試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH7.0(同仁化学)
250mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 4mM
Potassium ferrocyanide(和光純薬) 1mM
Acetyl−D−phenylalanine(渡辺化学) 400mM
D−amino acid oxidase(池田糖化工業) 5KU/L
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
BPSH−25(日光ケミカルス) 2%
Triton X−100(Sigma−Aldrich) 0.5%
Sodium chloride(和光純薬) 150mM
キレート法との相関性を図7に示す。
既存法をX、本法をYとして相関性を確認した。図7に示したように、Y = 0.9136X − 7.7713、相関係数0.9912と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できているといえる。
D−aminoacylase2を用いた亜鉛水溶液中の希釈直線性の確認
1.方法
亜鉛要求性酵素としてD−aminoacylase2、および対応する基質として馬尿酸を用いた亜鉛測定試薬により、亜鉛水溶液における希釈直線性の検討を行った。
試料
酢酸亜鉛を500μg/dLになるように生理食塩水に溶解し、その溶液を生理食塩水にて5段階に希釈した。
第一試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH8.0(同仁化学)
100mM
TOOS(同仁化学) 2mM
Triton X−100(Sigma−Aldrich) 0.05%
Hippuric acid(和光純薬) 100mM
Sarcosine oxidase(東洋紡) 10KU/L
S−adenosyl−L−methionine p−toluenesulfonate(Carbosynth Limited) 10mM
Glycine N−methyl transferase(耐熱性酵素研究所)
1KU/L
D−aminoacylase2(耐熱性酵素研究所) 1KU/L
第二試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH8.0(同仁化学)
100mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 6mM
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
測定法は、以下のようにして行った。日立7180型自動分析装置を用い、試料5μLと第一試薬150μLとを37℃、5分間混合した後、得られる液に、第二試薬50μLを加え同温度で5分間、発色反応させる。発色反応開始後の1分間当りの吸光度変化を主波長546nm、副波長700nmで測定した。
本法での希釈直線性を図8に示す。
希釈倍率をX、本法をYとして希釈直線性を確認した。図8に示したように、Y = 98.76X + 10.18、相関係数0.9986と良好な結果が得られた。このことから本法は希釈直線性が正確であるといえる。
D−aminoacylase2を用いたヒト血清中の亜鉛測定
1.方法
亜鉛要求性酵素としてD−aminoacylase2、および対応する基質として馬尿酸を用いた亜鉛測定試薬によるヒト血清中の亜鉛測定において、既存法(直接法)との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート発色剤を用いた、アキュラスオートZnを使用した。試料および試薬は以下の通りである。
ヒトプール血清に酢酸亜鉛をそれぞれ250μg/dL、500μg/dL、700μg/dL添加した。また、インフォームドコンセントの得られたヒト血清(n=6)を用いた。
第一試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH8.0(同仁化学)
100mM
TOOS(同仁化学) 1mM
Triton X−100(Sigma−Aldrich) 0.1%
Hippuric acid(和光純薬) 100mM
Sarcosine oxidase(東洋紡) 10KU/L
Catalase(キッコーマンバイオケミファ) 100KU/L
S−adenosyl−L−methionine p−toluenesulfonate(Carbosynth Limited) 10mM
Glycine N−methyl transferase(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
第二試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH8.0(同仁化学)
100mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 3mM
Triton X−100(Sigma−Aldrich) 0.1%
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
D−aminoacylase2(耐熱性酵素研究所) 5KU/L
Sodium azide(ナカライテスク) 0.09%
キレート法との相関性を図9に示す。
既存法をX、本法をYとして相関性を確認した。図9に示したように、Y = 1.0178X − 0.92、相関係数0.9985と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できているといえる。
D−aminoacylase2を用いたヒト血清中の亜鉛測定
1.方法
亜鉛要求性酵素としてD−aminoacylase2を用いた亜鉛測定試薬において、対応する基質としてN−Acetyl−D−Tryptophanを用いた場合の、ヒト血清中に含まれる亜鉛測定の既存法(直接法)との相関性を確認した。なお、既存法としてキレート発色剤を用いた、アキュラスオートZnを使用した。試料および試薬は以下の通りである。
試料
インフォームドコンセントの得られたヒト血清(n=20)を用いた。
第一試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH8.0(同仁化学)
100mM
TOOS(同仁化学) 1mM
D−aminoacylase2(耐熱性酵素研究所) 0.75KU/L
第二試薬
2−[4−(2−Hydroxyethyl)−1−piperazinyl]ethanesulfonic acid [HEPES] pH7.0(同仁化学)
100mM
4−aminoantipyrine(埼京化成) 3mM
N−Acetyl−D−Tryptophan(渡辺化学) 100mM
Triton X−100(Sigma−Aldrich) 0.1%
Peroxidase(東洋紡) 10KU/L
D−amino acid oxidase(池田糖化工業) 5KU/L
キレート法との相関性を図10に示す。
既存法をX、本法をYとして相関性を確認した。図10に示したように、Y = 0.9969X − 9.802、相関係数0.8349と良好な結果が得られた。このことから本法はヒト生体採取試料中の亜鉛を正確に測定できているといえる。
Claims (19)
- (1)生体採取試料に該生体採取試料内に存在しない亜鉛要求性酵素を加えるステップ、
(2)さらに該亜鉛要求性酵素の基質を加え、該亜鉛要求性酵素を反応させるステップ、
(3)該酵素反応物を検出定量するステップ及び
(4)得られた結果から、該生体試料中の亜鉛濃度を決定するステップ
を含む、生体試料中の亜鉛濃度測定方法
[ここでステップ(1)及び(2)は同時または連続してでもよい]。 - 生体採取試料が血清又は血漿である、請求項1に記載の測定方法。
- 前記亜鉛要求性酵素がアミノアシラーゼである請求項1又は2に記載の測定方法。
- 前記アミノアシラーゼがD−アミノアシラーゼ(DAA)である請求項3に記載の方法。
- 前記基質がN−アシルD−アミノ酸である、請求項4に記載の測定方法。
- 前記N−アシルD−アミノ酸がアセチルD−アミノ酸である、請求項5に記載の測定方法。
- 前記アセチルD−アミノ酸が、アセチルD−フェニルアラニン(Ac―D−Phe)、アセチルD−メチオニン(Ac―D−Met)、アセチルD−ロイシン(Ac―D−Leu)、及びアセチルD−バリン(Ac―D−Val)からなる群から選択されるアセチルD−アミノ酸である、請求項6に記載の測定方法。
- 前記酵素反応物がD−アミノ酸である、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記酵素反応物がD−Phe、D−Met、D−Leu及びD−Valからなる群から選択されるD−アミノ酸である、請求項7に記載の測定方法。
- 前記ステップ(3)が、さらに
(3−1)D−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)を加え、D−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ;ならびに
(3−2)得られた過酸化水素の量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、請求項8又は9に記載の測定方法。 - 前記ステップ(3−2)がペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ発色基質(色原体)を用いて、生成する色素の発色の検出を含む、請求項10に記載の測定方法。
- 前記ペルオキシダーゼ発色基質(色原体)が、4−アミノアンチピリン(4−AAP)と3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸(HTIB)とからなる発色基質(色原体)である請求項11に記載の測定方法。
- 色素の発色の検出を測定波長546nm〜700nmの吸光度にて行う請求項12に記載の測定方法。
- 前記ステップ(3)が、さらに
(3−1)D−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)を加え、D−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ;ならびに
(3−2)得られたα―ケト酸の量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、請求項8または9に記載の測定方法。 - 前記ステップ(3)が、さらに
(3−1)D−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)を加え、D−アミノ酸を脱アミノ化し、α―ケト酸とアンモニア、及び過酸化水素を得るステップ;ならびに
(3−2)得られたアンモニアの量から前記酵素反応物を検出定量するステップを含む、請求項8または9に記載の測定方法。 - 請求項1から15のいずれか一項に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素とその基質を含むキット。
- 請求項10から15のいずれか一項に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるD−アミノアシラーゼ、その基質であるN−アシルD−アミノ酸、ならびにD−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)を含むキット。
- 請求項11に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるD−アミノアシラーゼ、その基質であるN−アシルD−アミノ酸、D−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)ならびにペルオキシダーゼとペルオキシダーゼ発色基質を含むキット。
- 請求項12又は13に記載の測定方法に使用するためのキットであって、亜鉛要求性酵素であるD−アミノアシラーゼ、その基質であるN−アシルD−アミノ酸、D−アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)ならびにペルオキシダーゼと、4−アミノアンチピリン(4−AAP)と3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸 (HTIB)とからなる発色基質(色原体)であるペルオキシダーゼ発色基質を含むキット。
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