WO2013161676A1 - コレステロールオキシダーゼの安定化方法 - Google Patents

コレステロールオキシダーゼの安定化方法 Download PDF

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知子 荒武
健太 金城
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協和メデックス株式会社
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    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03006—Cholesterol oxidase (1.1.3.6)

Definitions

  • the present invention relates to a method for stabilizing cholesterol oxidase, a method for storing cholesterol oxidase, and a composition for stabilizing cholesterol oxidase.
  • Cholesterol oxidase is an oxidoreductase that uses cholesterol and oxygen molecules as substrates. In clinical tests, cholesterol is often measured using cholesterol oxidase. Cholesterol oxidase acts on cholesterol in the sample to produce hydrogen peroxide. The resulting hydrogen peroxide reacts with oxidative coloring chromogen in the presence of peroxidase to lead to the dye, and the absorbance of the dye is measured. A method for measuring cholesterol in a specimen by a colorimetric method, etc., is used in clinical tests.
  • JP-A-52-143285 JP-A-6-062846 Japanese Patent Laid-Open No. 8-187095 JP 2005-114368 A
  • An object of the present invention is to provide a method for stabilizing cholesterol oxidase suitable for long-term storage, a method for storing cholesterol oxidase, and a composition for stabilizing cholesterol oxidase.
  • the present inventors have found that cholesterol oxidase is stably maintained by coexisting cholesterol oxidase with ⁇ -keto acid or a salt thereof in an aqueous medium.
  • the headline and the present invention were completed. That is, the present invention relates to the following [1] to [6].
  • ⁇ -keto acid is ⁇ -keto acid selected from the group consisting of pyruvic acid, ⁇ -ketoglutaric acid and oxaloacetic acid.
  • the ⁇ -keto acid is ⁇ -keto acid selected from the group consisting of pyruvic acid, ⁇ -ketoglutaric acid and oxaloacetic acid.
  • the ⁇ -keto acid is ⁇ -keto acid selected from the group consisting of pyruvic acid, ⁇ -ketoglutaric acid and oxaloacetic acid.
  • the present invention provides a method for stabilizing cholesterol oxidase, a method for storing cholesterol oxidase, and a composition for stabilizing cholesterol oxidase suitable for long-term storage.
  • the method for stabilizing cholesterol oxidase according to the present invention is characterized in that ⁇ -keto acid or a salt thereof coexists in cholesterol oxidase in an aqueous medium.
  • the method for preserving cholesterol oxidase according to the present invention is a method characterized in that ⁇ -keto acid or a salt thereof coexists in cholesterol oxidase in an aqueous medium.
  • the stabilized composition of cholesterol oxidase of the present invention is a composition characterized in that ⁇ -keto acid or a salt thereof coexists in cholesterol oxidase in an aqueous medium.
  • “stable” means that the enzyme activity of cholesterol oxidase is maintained even when cholesterol oxidase is stored for a long period of time. Specifically, an aqueous solution of cholesterol oxidase is stored at 5 ° C. for 2 weeks. The cholesterol oxidase activity after storage at 5 ° C. for 2 weeks is 75% or more of the cholesterol oxidase activity immediately after the preparation of the cholesterol oxidase aqueous solution. Cholesterol oxidase activity can be measured, for example, by the following method.
  • a cholesterol oxidase activity evaluation reagent containing cholesterol and a detection reagent is prepared.
  • a detection reagent for example, a reagent containing peroxidase and an oxidative coloring chromogen described later can be used.
  • a reagent for evaluating cholesterol oxidase activity (y ⁇ L) is added to sample A (x ⁇ L), reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and the absorbance E1 A of the reaction solution after 5 minutes of reaction is measured. Further subjected to reaction for 5 minutes at 37 ° C., absorbance E2 A of the reaction solution after the reaction 10 minutes was measured to calculate the E2 absorbance difference obtained by subtracting the E1 A from A Delta] E 'A.
  • cholesterol oxidase activity is proportional to Delta] E A, as an index of cholesterol oxidase activity, can be used Delta] E A.
  • the stabilization of cholesterol oxidase can be evaluated by, for example, the following method.
  • sample A for sample A prepared by adding cholesterol oxidase and ⁇ -keto acid to the buffer, sample A (immediately after preparation) and sample A (immediately after preparation) are stored at 5 ° C for 2 weeks.
  • sample A for sample a without ⁇ -keto acid prepared by adding only cholesterol oxidase to the buffer, sample a (immediately after preparation) and sample a (immediately after preparation) were stored at 5 ° C. for 2 weeks.
  • Prepare a later specimen a (after storage) for sample containing cholesterol oxidase
  • sample A prepared by adding cholesterol oxidase and ⁇ -keto acid to the buffer
  • sample A immediately after preparation
  • sample A for sample A without ⁇ -keto acid prepared by adding only cholesterol oxidase to the buffer
  • sample a (immediately after preparation) and sample a were stored at 5 ° C. for 2 weeks.
  • sample A (immediately after preparation) as a sample
  • the reaction between sample A (immediately after preparation) and the cholesterol oxidase activity evaluation reagent is performed at 37 ° C. for 5 minutes, and the absorbance E1 A (immediately after preparation) of the reaction solution is measured. Further, the reaction was carried out at 37 ° C for 5 minutes, and the absorbance E2 A (immediately after preparation) of the reaction solution 10 minutes after the reaction was measured, and the difference in absorbance ⁇ E ' A obtained by subtracting E1 A (immediately after preparation ) from E2 A (immediately after preparation). Calculate (immediately after preparation) .
  • the absorbance E1 0 of the reaction solution after 5 minutes of reaction at 37 ° C. were measured, for 5 minutes reaction was further 37 ° C.
  • the absorbance E2 O of the reaction solution after the reaction 10 minutes was measured to calculate the absorbance difference Delta] E O minus the E1 O from E2 O.
  • ⁇ E O is subtracted from ⁇ E ′ A (immediately after preparation) to obtain an absorbance difference ⁇ E A (immediately after preparation) with respect to specimen A (immediately after preparation) .
  • the absorbance difference ⁇ E A (after storage) with respect to the sample A (after storage) is calculated by the same method as described above except that the sample A (after storage) is used instead of the sample A ( immediately after preparation) .
  • the specimen A (immediately after preparation) calculating the analyte a absorbance difference Delta] E a for (after storage) (after storage) by using a sample a (after storage) instead of.
  • the residual rate of cholesterol oxidase in the sample A is calculated by the following formula (II).
  • Cholesterol oxidase in the present invention is an enzyme classified into EC 1.1.3.6 and an enzyme that catalyzes the following reaction. Cholesterol + O 2 ⁇ Cholest-4-en-one + H 2 O 2
  • cholesterol oxidase examples include cholesterol oxidase produced by genetic engineering techniques, in addition to cholesterol oxidase derived from animals, plants or microorganisms.
  • Cholesterol oxidase (CHODI; manufactured by Kikkoman)
  • cholesterol Commercial products such as oxidase (CHO-PEWL; manufactured by Kikkoman Corp.), cholesterol oxidase (CHO-CE; manufactured by Kikkoman Corp.), cholesterol oxidase (COO-321; manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and the like can also be used.
  • the aqueous medium is not particularly limited as long as it is an aqueous medium that can stably hold cholesterol oxidase.
  • examples thereof include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferable.
  • the concentration of cholesterol oxidase in the aqueous medium in the present invention is usually 0.01 to 300 U / mL.
  • a buffering agent having a buffering ability in a pH region capable of stably holding cholesterol oxidase is preferable, and examples thereof include a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, and a Good buffer solution.
  • Examples of the Good buffer used in the Good buffer include 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis -Tris), N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA), piperazine-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfone Acid (ACES), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2- Aminoethanesulfonic acid (TES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES), piperaz
  • the ⁇ -keto acid in the present invention is not particularly limited as long as it is an ⁇ -keto acid that stabilizes cholesterol oxidase, and examples thereof include pyruvic acid, ⁇ -ketoglutaric acid, and oxaloacetic acid.
  • ⁇ -keto acid may be a salt, and examples of the salt include lithium salt, sodium salt, potassium salt, ammonium salt, calcium salt, magnesium salt and the like.
  • the concentration of ⁇ -keto acid in the aqueous medium in the present invention is not particularly limited as long as it is a concentration that stabilizes cholesterol oxidase, and is usually 0.05 to 40 mmol / L.
  • the method for preserving cholesterol oxidase of the present invention is a method for preserving cholesterol oxidase in the presence of ⁇ -keto acid or a salt thereof in an aqueous medium.
  • the cholesterol oxidase and its concentration, and the ⁇ -keto acid and its concentration used in the method for preserving cholesterol oxidase of the present invention are the same as those in the above-mentioned cholesterol oxidase stabilization method.
  • the storage period in the method for storing cholesterol oxidase of the present invention is not particularly limited as long as cholesterol oxidase is stably stored, and is usually 1 to 2 years.
  • the storage temperature in the method for storing cholesterol oxidase of the present invention is not particularly limited as long as it is a temperature at which cholesterol oxidase is stably stored, and is usually -5 to 45 ° C, preferably 0 to 30 ° C, 2 ⁇ 10 ° C. is particularly preferred.
  • a surfactant, preservative, protein, and the like may coexist in cholesterol oxidase.
  • the surfactant include nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and amphoteric surfactants.
  • preservatives include azides and chelating agents. Examples of the azide include sodium azide. Examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) or a salt thereof. Examples of the salt include sodium salt and potassium salt.
  • the protein include albumin and the like, and examples of albumin include bovine serum albumin (BSA) and the like.
  • the stabilized composition of cholesterol oxidase of the present invention is usually included in reagents and kits used in the measurement method of the measurement target component based on the hydrogen peroxide measurement system. May be included.
  • Components to be measured include total cholesterol (TC), cholesterol in high density lipoprotein (HDL-C), cholesterol in intermediate density lipoprotein (IDL-C), cholesterol in low density lipoprotein (LDL-C) , Cholesterol in very low density lipoprotein (VLDL-C), cholesterol in remnant-like lipoprotein (RLP-C), cholesterol in small particle low density lipoprotein (sdLDL-C), cholesterol in HDL subfractions (HDL2-C, HDL3-C), free cholesterol (FC) and the like.
  • TC total cholesterol
  • HDL-C high density lipoprotein
  • IDL-C intermediate density lipoprotein
  • LDL-C low density lipoprotein
  • RVLP-C cholesterol in remnant-like lipoprotein
  • sdLDL-C cholesterol in HDL subfractions
  • HDL2-C, HDL3-C free cholesterol
  • reagents and kits used for measuring cholesterol (TC, HDL-C, LDL-C, IDL-C, VLDL-C, RLP-C, sdLDL-C, HDL2-C, HDL3-C, FC)
  • cholesterol oxidase cholesterol esterase, peroxidase, oxidative coloring type chromogen and the like are contained.
  • Examples of the oxidative coloring type chromogen include a leuco chromogen and an oxidative coupling chromogen.
  • the leuco chromogen has a function of reacting with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to generate a dye alone.
  • leuco chromogens include tetramethylbenzidine, o-phenylenediamine, 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (CCAP), 10-N-methylcarbamoyl- 3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (MCDP), N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt (DA-64), 10-N- ( Carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt (DA-67), 4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine, bis [3-bis (4
  • the oxidative coupling chromogen has a function of reacting with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to produce a dye.
  • a combination of a pair of oxidative coupling chromogens is used.
  • Examples of the combination of a pair of oxidative coupling chromogens include a combination of a coupler and an aniline, and a combination of a coupler and a phenol.
  • coupler examples include 4-aminoantipyrine (4-AA) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine.
  • anilines include N- (3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy -3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOPS), N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N, N-dimethyl-3-methylaniline, N , N-di (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (
  • phenols examples include phenol, 4-chlorophenol, 3-methylphenol, 3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzoic acid (HTIB) and the like.
  • the stabilized composition of cholesterol oxidase of the present invention may contain the aforementioned surfactant, preservative, protein and the like.
  • Reagent for measuring cholesterol oxidase activity Reagent A and reagent B having the following composition were prepared.
  • cholesterol is used regardless of whether a sample (A0 to A3) containing no surfactant is used or a sample (B0 to B3) containing a surfactant.
  • the residual rate of oxidase was higher in the presence of ⁇ -keto acid than in the absence of ⁇ -keto acid, and was found to be 75% or more.
  • the residual rate was as low as less than 75%. Accordingly, it was found that cholesterol oxidase is stabilized by allowing ⁇ -keto acid or a salt thereof to coexist in cholesterol oxidase in an aqueous medium.
  • the present invention provides a method for stabilizing cholesterol oxidase, a method for storing cholesterol oxidase, and a composition for stabilizing cholesterol oxidase.
  • the method for stabilizing cholesterol oxidase, the method for preserving cholesterol oxidase, and the composition for stabilizing cholesterol oxidase of the present invention are useful for clinical diagnosis of metabolic syndrome and the like.

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Abstract

　コレステロールオキシダーゼの安定化方法、コレステロールオキシダーゼの保存方法、及び、コレステロールオキシダーゼの安定化組成物を提供する。　コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸を水性媒体中で共存させることを特徴とするコレステロールオキシダーゼの安定化方法、及び、コレステロールオキシダーゼの保存方法；コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸を水性媒体中で共存させることを特徴とするコレステロールオキシダーゼの安定化組成物。　本発明のコレステロールオキシダーゼの安定化方法、コレステロールオキシダーゼの保存方法、及び、コレステロールオキシダーゼの安定化組成物はメタボリックシンドローム等の臨床診断に有用である。

Description

コレステロールオキシダーゼの安定化方法
　本発明は、コレステロールオキシダーゼの安定化方法、コレステロールオキシダーゼの保存方法、及び、コレステロールオキシダーゼの安定化組成物に関する。
　コレステロールオキシダーゼは、コレステロールと酸素分子を基質とする酸化還元酵素である。臨床検査において、コレステロールオキシダーゼを用いるコレステロールの測定がしばしば行われている。検体中のコレステロールにコレステロールオキシダーゼが作用して過酸化水素が生成し、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下、酸化発色型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度を測定する、という比色法による検体中のコレステロールの測定方法等が臨床検査において用いられている。
　コレステロールの測定に使用されるコレステロールオキシダーゼは不安定であり、コレステロールオキシダーゼを含む測定試薬の保存中に失活し、測定試薬の性能が悪化するという課題がある。
　この課題に対して、コレステロールオキシダーゼを含む溶液にアルカリ金属の塩化物および／またはアルカリ土類金属の塩化物を添加するコレステロールオキシダーゼの安定化方法（特許文献１参照）、ウシ血清アルブミン、デキストラン、ポリエチレングリコールから選択される水溶性担体と化学結合させることによる、溶液状態におけるコレステロールオキシダーゼの安定化方法（特許文献２参照）、コレステロールオキシダーゼを含む溶液に、牛血清アルブミン及びリジンを添加することによりコレステロールオキシダーゼを安定化する方法（特許文献３参照）、タンパク質分解物と共存させることによる乾燥状態のコレステロールオキシダーゼを安定化する方法（特許文献４参照）等が知られている。
特開昭５２－１４３２８５号公報 特開平６－０６２８４６号公報 特開平８－１８７０９５号公報 特開２００５－１１４３６８号公報
　本発明の目的は、長期保存に適したコレステロールオキシダーゼの安定化方法、コレステロールオキシダーゼの保存方法、及び、コレステロールオキシダーゼの安定化組成物を提供することにある。
　本発明者らは本課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることにより、コレステロールオキシダーゼが安定に保持される、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］～［６］に関する。
［１］　コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることを特徴とするコレステロールオキシダーゼの安定化方法。
［２］　α－ケト酸が、ピルビン酸、α－ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα－ケト酸である［１］記載の安定化方法。
［３］　コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることを特徴とするコレステロールオキシダーゼの保存方法。
［４］　α－ケト酸が、ピルビン酸、α－ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα－ケト酸である［３］記載の保存方法。
［５］　コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることを特徴とするコレステロールオキシダーゼの安定化組成物。
［６］　α－ケト酸が、ピルビン酸、α－ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα－ケト酸である［５］記載の安定化組成物。
　本発明により、長期保存に適したコレステロールオキシダーゼの安定化方法、コレステロールオキシダーゼの保存方法、及び、コレステロールオキシダーゼの安定化組成物が提供される。
　本発明のコレステロールオキシダーゼの安定化方法は、コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることを特徴とする方法である。
　本発明のコレステロールオキシダーゼの保存方法は、コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることを特徴とする方法である。
　本発明のコレステロールオキシダーゼの安定化組成物は、コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることを特徴とする組成物である。
　本発明において「安定」とは、長期間コレステロールオキシダーゼを保存してもコレステロールオキシダーゼの酵素活性が維持されていることを意味し、具体的には、コレステロールオキシダーゼの水溶液を5℃で2週間保存し、5℃で2週間保存後のコレステロールオキシダーゼ活性が、コレステロールオキシダーゼ水溶液調製直後のコレステロールオキシダーゼ活性の75%以上であることをいう。コレステロールオキシダーゼ活性は、例えば、以下の方法により測定することができる。
　コレステロール及び検出用試薬を含む、コレステロールオキシダーゼ活性評価用試薬を調製する。検出用試薬としては、例えばペルオキシダーゼと後述の酸化発色型色原体とを含む試薬を用いることができる。検体A(xμL)にコレステロールオキシダーゼ活性評価用試薬(yμL)を添加し、37℃で5分間反応を行い、反応5分後の反応液の吸光度E1Aを測定する。さらに37℃で5分間反応を行い、反応10分後の反応液の吸光度E2Aを測定し、E2AからE1Aを差し引いた吸光度差ΔE’Aを算出する。検体として検体Aの代わりに蒸留水を用いる以外は同様の方法により、37℃で5分間反応後の反応液の吸光度E1Oを測定し、さらに37℃で5分間反応を行い、反応10分後の反応液の吸光度E2Oを測定し、E2OからE1Oを差し引いた吸光度差ΔEOを算出する。ΔE’AからΔEOを差し引き、検体Aに対する吸光度差ΔEAとする。この吸光度差ΔEAより、コレステロールオキシダーゼの活性を算出する。酸化発色型色原体として、４－アミノアンチピリン(4-AA)とN-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-サクシニルエチレンジアミン(EMSE)の組み合わせを用いた場合には、コレステロールオキシダーゼの活性は以下の式(I)により算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　上記式(I)から分かる様に、コレステロールオキシダーゼ活性はΔEAに比例するため、コレステロールオキシダーゼ活性の指標として、ΔEAを用いることができる。
　コレステロールオキシダーゼの安定化は、例えば以下の方法により評価することができる。コレステロールオキシダーゼを含む検体として、緩衝液にコレステロールオキシダーゼとα－ケト酸とを添加して調製した検体Aについて、調製直後の検体A（調製直後）と、検体A（調製直後）を5℃2週間保存した後の検体A（保存後）とを調製する。また、緩衝液にコレステロールオキシダーゼのみを添加して調製した、α－ケト酸を含まない検体aについて、調製直後の検体a（調製直後）と、検体a（調製直後）を5℃2週間保存した後の検体a（保存後）を調製する。検体として検体A（調製直後）を用いて、検体A（調製直後）とコレステロールオキシダーゼ活性評価用試薬との反応を37℃で5分間行い、反応液の吸光度E1A（調製直後）を測定し、さらに37℃で5分間反応を行い、反応10分後の反応液の吸光度E2A（調製直後）を測定し、E2A（調製直後）からE1A（調製直後）を差し引いた吸光度差ΔE’A（調製直後）を算出する。検体として検体A（調製直後）の代わりに蒸留水を用いる以外は同様の方法により、37℃で5分間反応後の反応液の吸光度E10を測定し、さらに37℃で5分間反応を行い、反応10分後の反応液の吸光度E2Oを測定し、E2OからE1Oを差し引いた吸光度差ΔEOを算出する。ΔE’A（調製直後）からΔEOを差し引き、検体A（調製直後）に対する吸光度差ΔEA（調製直後）とする。
　検体として、検体A（調製直後）の代わりに検体A（保存後）を用いる以外は上記と同様の方法により、検体A（保存後）に対する吸光度差ΔEA（保存後）を算出する。同様に、検体として、検体A（調製直後）の代わりに検体a（調製直後）を用いて検体a（調製直後）に対する吸光度差ΔEa（調製直後）を、検体として、検体A（調製直後）の代わりに検体a（保存後）を用いて検体a（保存後）に対する吸光度差ΔEa（保存後）を算出する。検体Aにおけるコレステロールオキシダーゼの残存率は、以下の式(II)により算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　同様に、検体aにおけるコレステロールオキシダーゼの残存率は、以下の式(III)により算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　上記式(II)で算出した検体Aにおけるコレステロールオキシダーゼの残存率が75%以上であり、かつ、上記式(III)で算出した検体aにおけるコレステロールオキシダーゼの残存率よりも高い場合、α－ケト酸によりコレステロールオキシダーゼが安定化された、と評価することができる。
　本発明におけるコレステロールオキシダーゼは、EC1.1.3.6に分類される酵素で、以下の反応を触媒する酵素である。
　コレステロール＋O2→ コレスト－４－エン－オン＋H2O2
　上記反応を触媒するコレステロールオキシダーゼとしては、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等が挙げられ、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＤＩ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ－ＰＥＷＬ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ－ＣＥ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ－３２１；東洋紡績社製）等の市販品を用いることもできる。
　本発明において、水性媒体としては、コレステロールオキシダーゼを安定に保持し得る水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。本発明におけるコレステロールオキシダーゼの水性媒体中の濃度は、通常0.01～300 U/mLである。緩衝液としては、コレステロールオキシダーゼを安定に保持し得るpHの領域に緩衝能を有する緩衝剤が好ましく、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。グッド緩衝液に使用されるグッド緩衝剤としては、例えば2－モルホリノエタンスルホン酸(MES)、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(Tris)、ビス（2－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、N－（2－アセトアミド）イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン－N,N’－ビス（2－エタンスルホン酸）(PIPES)、N－（2－アセトアミド）－2－アミノエタンスルホン酸(ACES)、N,N－ビス（2－ヒドロキシエチル）－2－アミノエタンスルホン酸(BES)、3－モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－2－アミノエタンスルホン酸(TES)、2－〔4－（2－ヒドロキシエチル）－1－ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、ピペラジン－N,N’－ビス（2－ヒドロキシプロパンスルホン酸）(POPSO)、N－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン(Tricine)、N,N－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン(Bicine)、N－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－3－アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N－シクロヘキシル－2－アミノエタンスルホン酸(CHES)、N－シクロヘキシル－3－アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。
　本発明において、コレステロールオキシダーゼは、通常、pH5～9の水性媒体中で保存され、pH6～8の水性媒体中で保存されることが好ましい。
　本発明におけるα－ケト酸は、コレステロールオキシダーゼを安定化させるα－ケト酸であれば特に制限はなく、例えばピルビン酸、α－ケトグルタル酸、オキサロ酢酸等が挙げられる。本発明において、α－ケト酸は塩であってもよく、塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。
　本発明におけるα－ケト酸の水性媒体中の濃度は、コレステロールオキシダーゼを安定化する濃度であれば特に制限はなく、通常、0.05～40 mmol/Lである。
　本発明のコレステロールオキシダーゼの保存方法は、コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させて保存する方法である。本発明のコレステロールオキシダーゼの保存方法に使用されるおけるコレステロールオキシダーゼとその濃度、及びα－ケト酸とその濃度は、上記コレステロールオキシダーゼ安定化方法と同様のものが挙げられる。本発明のコレステロールオキシダーゼの保存方法における保存期間は、コレステロールオキシダーゼが安定に保存される期間であれば特に制限はなく、通常、1～2年間である。また、本発明のコレステロールオキシダーゼの保存方法における保存温度は、コレステロールオキシダーゼが安定に保存される温度であれば特に制限はなく、通常、-5～45℃であり、0～30℃が好ましく、2～10℃が特に好ましい。
　本発明のコレステロールオキシダーゼの保存方法においては、α－ケト酸若しくはその塩の他に、界面活性剤、防腐剤、蛋白質等をコレステロールオキシダーゼに共存させてもよい。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化物、キレート剤等が挙げられる。アジ化物としては、例えばアジ化ナトリウム等が挙げられる。キレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)もしくはその塩等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。蛋白質としては、例えばアルブミン等が挙げられ、アルブミンとしては、例えばウシ血清アルブミン(BSA)等が挙げられる。
　本発明のコレステロールオキシダーゼの安定化組成物には、コレステロールオキシダーゼ及びα－ケト酸若しくはその塩の他に、過酸化水素測定系に基づく測定対象成分の測定方法に使用される試薬およびキットに通常含まれる構成要素が含まれていてもよい。測定対象成分としては、総コレステロール(TC)、高密度リポ蛋白中のコレステロール(HDL-C)、中間密度リポ蛋白中のコレステロール(IDL-C)、低密度リポ蛋白中のコレステロール(LDL-C)、超低密度リポ蛋白中のコレステロール(VLDL-C)、レムナント様リポ蛋白中のコレステロール(RLP-C)、小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール(sdLDL-C)、HDL亜分画中のコレステロール(HDL2-C, HDL3-C)、遊離型コレステロール(FC)等が挙げられる。
　例えばコレステロール(TC, HDL-C, LDL-C, IDL-C, VLDL-C, RLP-C, sdLDL-C, HDL2-C, HDL3-C, FC)の測定方法に使用される試薬およびキットには、コレステロールオキシダーゼの他に、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化発色型色原体等が含有される。
　酸化発色型色原体としては、ロイコ型色原体、酸化カップリング型色原体等が挙げられる。
　ロイコ型色原体は、ペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と反応して、単独で色素を生成する機能を有する。ロイコ型色原体としては、例えばテトラメチルベンジジン、o-フェニレンジアミン、10-N-カルボキシメチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン(CCAP)、10-N-メチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン(MCDP)、N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA-64)、10-N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)、4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔3-ビス（4-クロロフェニル）メチル-4-ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
　酸化カップリング発色型色原体は、ペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と反応して色素を生成する機能を有する。この色素を生成する反応においては、一対の酸化カップリング発色型色原体の組み合わせが用いられる。一対の酸化カップリング発色型色原体の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせが挙げられる。
　カプラーとしては、例えば4-アミノアンチピリン(4-AA)、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
　アニリン類としては、N-（3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メチルアニリン(TOOS)、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3-メチルアニリン(TOPS)、N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N-ジメチル-3-メチルアニリン、N,N-ジ（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-アセチルエチレンジアミン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-4-フルオロ-3,5-ジメトキシアニリン(F-DAOS)等が挙げられる。
　フェノール類としては、フェノール、4-クロロフェノール、3-メチルフェノール、3-ヒドロキシ-2,4,6-トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。
　本発明のコレステロールオキシダーゼの安定化組成物には、前述の界面活性剤、防腐剤、蛋白質等が含まれていてもよい。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
　ＭＯＰＳ（同仁化学研究所社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、４－ＡＡ（アクテック社製）、バイオエース（ケイ・アイ化成社製）、ＰＧＭ－５０（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル；和光純薬工業社製）、コール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）、コレステロール（純正化学社製）、２－プロパノール（和光純薬工業社製）、トリトンＸ－１００（シグマ社製）、ピルビン酸ナトリウム（関東化学社製）、α－ケトグルタル酸・２ナトリウム（ＭＰバイオメディカル社製）、オキサロ酢酸（関東化学社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、ＣＨＯ－ＣＥ（コレステロールオキシダーゼ；キッコーマン社製）。
　以下の方法により、α－ケト酸によるコレステロールオキシダーゼの安定化効果を検討した。
（１）検体
　以下の組成からなる検体A（検体A0～A3）、及び、検体B（検体B0～B3）を調製した。
＜検体A（検体A0～A3）＞
　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　20 mmol/L
　ＣＨＯ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　2 kU/L
　α－ケト酸（第１表参照、検体A0は無添加）
＜検体B（検体B0～B3）＞
　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　20 mmol/L
　トリトンＸ－１００　　　　　　　　　　1%
　ＣＨＯ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　2 kU/L
　α－ケト酸（第１表参照、検体B0は無添加）
（２）コレステロールオキシダーゼ活性測定用試薬
　以下の組成からなる試薬Ａ、及び、試薬Ｂを調製した。
＜試薬Ａ＞
　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　50 mmol/L
　ＥＭＳＥ　　　　　　　　　　　　　　　0.3 g/L
　４－ＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　0.1 g/L
　バイオエース　　　　　　　　　　　　　0.3 g/L
　ＰＧＭ－５０　　　　　　　　　　　　　10 g/L
　コール酸ナトリウム　　　　　　　　　　5 g/L
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　15 kU/L
＜試薬Ｂ＞
　コレステロールの2-プロパノール溶液(5 mg/mL)
　試薬Ａ(50 mL)に試薬Ｂ(2 mL)添加し、よく攪拌し、コレステロールオキシダーゼ活性測定用試薬とした。
（３）調製直後の検体に対する吸光度差
　反応セルへ調製直後の検体A1(2.4μL)と、上記（２）のコレステロールオキシダーゼ活性測定用試薬(225μL)とを添加し、37℃で5分間加温した後の反応液の吸光度E1A1（調製直後）を主波長546 nm、副波長800 nmで測定し、さらに37℃で5分間加温し、反応10分後の反応液の吸光度E2A1（調製直後）を主波長546 nm、副波長800 nmで測定し、E2A1（調製直後）からE1A1（調製直後）を差し引き、ΔE’A1（調製直後）とした。
　検体として蒸留水を用いて同様の反応を行い、反応10分後の反応液の吸光度E2Oから反応5分後の反応液の吸光度E1Oを差し引き、ΔEOとした。ΔE’A1（調製直後）からΔEOを差し引き、調製直後の検体A1に対する吸光度差ΔEA1（調製直後）とした。
（４）5℃2週間保存後の検体に対する吸光度差
　調製直後の検体A1の代わりに、5℃2週間保存後の検体A1を用いる以外は上記（３）と同様の方法により、5℃2週間保存後の検体A1に対する吸光度差ΔEA1（保存後）を決定した。
（５）5℃2週間保存後の検体中のコレステロールオキシダーゼの残存率
　上記（３）で決定したΔEA1（調製直後）と（４）で決定したΔEA1（保存後）とから、調製直後の検体中のコレステロールオキシダーゼに対する5℃2週間保存後の検体中のコレステロールオキシダーゼの残存率を上記式(II)により決定した。結果を第１表に示す。
　検体として、検体A1の代わりに検体A2、検体A3、及び、検体B１～B3の各検体を用いる以外は上記（１）～（５）と同様の方法により、調製直後の各検体中のコレステロールオキシダーゼに対する、5℃2週間保存後の各検体中のコレステロールオキシダーゼの残存率を決定した。結果を第１表に示す。
　さらに、検体A1の代わりに、検体A0及び検体B0を用い、上記式(II)の代わりに、上記式(III)を用いる以外は上記（１）～（５）と同様の方法により、調製直後の各検体中のコレステロールオキシダーゼに対する、5℃2週間保存後の各検体中のコレステロールオキシダーゼの残存率を決定した。結果を第１表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　第１表から明らかな様に、界面活性剤が含まれていない検体(A0～A3)を用いた場合でも、界面活性剤が含まれている検体(B0～B3)を用いた場合でも、コレステロールオキシダーゼの残存率は、α－ケト酸非共存下に比較して、α－ケト酸共存下で高く、75%以上であることが分かった。それに対して、α－ケト酸若しくはその塩非共存下では、残存率は75%未満と低かった。従って、コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることにより、コレステロールオキシダーゼが安定化されることが分かった。
　本発明により、コレステロールオキシダーゼの安定化方法、コレステロールオキシダーゼの保存方法、及び、コレステロールオキシダーゼの安定化組成物が提供される。本発明のコレステロールオキシダーゼの安定化方法、コレステロールオキシダーゼの保存方法、及び、コレステロールオキシダーゼの安定化組成物はメタボリックシンドローム等の臨床診断に有用である。
 

Claims (6)

  1. 　コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることを特徴とするコレステロールオキシダーゼの安定化方法。
  2. 　α－ケト酸が、ピルビン酸、α－ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα－ケト酸である請求項１記載の安定化方法。
  3. 　コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることを特徴とするコレステロールオキシダーゼの保存方法。
  4. 　α－ケト酸が、ピルビン酸、α－ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα－ケト酸である請求項３記載の保存方法。
  5. 　コレステロールオキシダーゼにα－ケト酸若しくはその塩を水性媒体中で共存させることを特徴とするコレステロールオキシダーゼの安定化組成物。
  6. 　α－ケト酸が、ピルビン酸、α－ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα－ケト酸である請求項５記載の安定化組成物。
     
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