BR112014025874B1

BR112014025874B1 - métodos para estabilizar uma colesterol oxidase e para preservar uma colesterol oxidase

Info

Publication number: BR112014025874B1
Application number: BR112014025874-0A
Authority: BR
Inventors: Tomoko Aratake; Kenta Kinjo
Original assignee: Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co., Ltd.
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-18
Publication date: 2021-05-25
Also published as: EP2843045A1; CA2869445A1; KR20150013452A; EP2843045A4; CA2869445C; HK1202895A1; EP2843045B1; JP6124414B2; WO2013161676A1; JPWO2013161676A1; US9683228B2; CN104245931B; CN104245931A; US20150104847A1; KR101972628B1

Abstract

MÉTODOS PARA ESTABILIZAR UMA COLESTEROL OXIDASE E PARA PRESERVAR UMA COLESTEROL OXIDASE, E, COMPOSIÇÃO ESTABILIZADA DE COLESTEROL OXIDASE. A presente invenção fornece um método para estabilizar uma colesterol oxidase, um método para preservar uma colesterol oxidase e uma composição estabilizada de colesterol oxidase. Um método para estabilizar uma colesterol oxidase e um método para conservar uma colesterol oxidase, que compreende permitir que a colesterol oxidase coexista com um alfa-cetoácido em um meio aquoso, e uma composição estabilizada da colesterol oxidase que compreende permitir que a colesterol oxidase coexista com um alfa-cetoácido em um meio aquoso. O método para estabilizar uma colesterol oxidase, o método para preservar uma colesterol oxidase e uma composição estabilizada de colesterol oxidase, de acordo com a presente invenção, são úteis para o diagnóstico clínico, como, por exemplo, da síndrome metabólica.

Description

Campo Técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um método para estabilizar uma colesterol oxidase, um método para preservar uma colesterol oxidase e uma composição estabilizada de colesterol oxidase.

Técnica Anterior

[0002] Uma colesterol oxidase é uma oxidorredutase que atua sobre o colesterol e uma molécula de oxigênio, como substrato. A medição do colesterol usando uma colesterol oxidase é geralmente realizada em ensaios clínicos. Um método para medir o colesterol em uma amostra por um método colorimétrico ou similar é usado em testes clínicos. Em tal método colorimétrico, a colesterol oxidase atua sobre o colesterol em uma amostra para formar peróxido de hidrogênio, o qual reage com um cromógeno oxidativo-corante na presença de uma peroxidase para converter o cromógeno em um corante, e a absorvância do corante formado é medida.

[0003] Uma colesterol oxidase utilizada para medir o colesterol é instável. O problema das colesterol oxidases é que a colesterol oxidase é desativada durante a conservação de um reagente para medição, que contém a colesterol oxidase para gerar um desempenho reduzido do reagente para a medição.

[0004] Um método para estabilizar uma colesterol oxidase, em que cloreto de metal alcalino e/ou cloreto de metal alcalino terroso é adicionado a uma solução contendo a colesterol oxidase (consulte o documento patente 1), um método para estabilizar uma colesterol oxidase em solução, em que a colesterol oxidase é quimicamente ligada a um veículo hidrossolúvel selecionado dentre albumina de soro bovino, dextrana e polietilenoglicol (consulte o documento patente 2), um método para estabilizar uma colesterol oxidase pela adição de albumina de soro bovino e lisina a uma solução contendo a colesterol oxidase (consulte o documento patente 3), um método para estabilizar uma colesterol oxidase em um estado seco, permitindo que a colesterol oxidase coexista com os produtos de decomposição da proteína (consulte o documento patente 4), e similares, são conhecidos para esse problema. Documentos da Técnica Anterior Documentos de Patentes Documento de Patente 1: Publicação do Pedido de Patente Japonesa não examinada No. 52-143285 Documento de Patente 2: Publicação do Pedido de Patente Japonesa não examinada No. 6-062846 Documento de Patente 3: Publicação do Pedido de Patente Japonesa não examinada No. 8-187095 Documento de Patente 4: Publicação do Pedido de Patente Japonesa não examinada No. 2005-114368

Resumo da Invenção Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção

[0005] Um objeto da presente invenção é fornecer um método para estabilizar uma colesterol oxidase adequada para conservação a longo prazo, um método para preservar uma colesterol oxidase e uma composição estabilizada de colesterol oxidase.

Meios para Resolver os Problemas

[0006] Os presentes inventores verificaram que, como resultado de estudos intensivos para resolver o problema, a coexistência de uma colesterol oxidase com um a-cetoácido, ou um sal do mesmo em um meio aquoso, permite manter a colesterol oxidase estável, completando dessa forma a presente invenção. Ou seja, a presente invenção refere-se aos itens [1] a [6] a seguir. [1] Método para estabilizar uma colesterol oxidase, que compreende permitir que uma colesterol oxidase coexista com um α- cetoácido ou um sal do mesmo em um meio aquoso. [2] Método para estabilizar uma colesterol oxidase, de acordo com [1], em que o a-cetoácido é um a-cetoácido selecionado do grupo consistindo em ácido pirúvico, ácido a-cetoglutárico e ácido oxaloacético. [3] Método para preservar uma colesterol oxidase, que compreende permitir que a colesterol oxidase coexista com um a-cetoácido ou um sal do mesmo em um meio aquoso. [4] Método para preservar uma colesterol oxidase, de acordo com [3], em que o a-cetoácido é um a-cetoácido selecionado do grupo consistindo em ácido pirúvico, ácido a-cetoglutárico e ácido oxaloacético. [5] Composição estabilizada de colesterol oxidase, que compreende permitir que a colesterol oxidase coexista com um a-cetoácido ou um sal do mesmo em um meio aquoso. [6] Composição estabilizada da colesterol oxidase, de acordo com [5], em que o a-cetoácido é um a-cetoácido selecionado do grupo consistindo em ácido pirúvico, ácido a-cetoglutárico e ácido oxaloacético.

Efeito da Invenção

[0007] A presente invenção fornece um método para estabilizar uma colesterol oxidase adequada para conservação a longo prazo, um método para preservar uma colesterol oxidase e uma composição estabilizada de colesterol oxidase.

Modo para Realizar a Invenção

[0008] Um método para estabilizar uma colesterol oxidase, de acordo com a presente invenção, é um método que compreende permitir que a colesterol oxidase coexista com um a-cetoácido ou um sal do mesmo em um meio aquoso.

[0009] Um método para preservar uma colesterol oxidase, de acordo com a presente invenção, é um método que compreende permitir que a colesterol oxidase coexista com um a-cetoácido ou um sal do mesmo em um meio aquoso.

[00010] Uma composição estabilizada de colesterol oxidase, de acordo com a presente invenção, é uma composição que compreende deixar a colesterol oxidase coexistir com um a-cetoácido ou um sal do mesmo em um meio aquoso.

[00011] "Estabilização", na presente invenção, significa que a atividade enzimática de uma colesterol oxidase é mantida mesmo se a colesterol oxidase for preservada por um longo período, e significa que, especificamente, depois de uma solução aquosa de uma colesterol oxidase ser preservada a 5°C durante 2 semanas, a atividade da colesterol oxidase após a conservação a 5°C durante 2 semanas é igual a 75% ou mais da atividade da colesterol oxidase imediatamente após a preparação da solução aquosa da colesterol oxidase. A atividade de uma colesterol oxidase pode ser medida, por exemplo, de acordo com o método a seguir.

[00012] Um reagente para avaliar uma atividade da colesterol oxidase que compreende colesterol e um reagente para detecção é preparado. Como o reagente para detecção, um reagente que compreende uma peroxidase e um cromógeno oxidativo-corante descrito acima podem, por exemplo, ser usados. O reagente (y μl) para avaliar a atividade da colesterol oxidase é adicionado a uma amostra A (x μl) e a reação é realizada a 37°C durante 5 minutos, e a absorvância da solução reacional 5 minutos após a reação, E1A, é medida. A reação é adicionalmente realizada a 37°C durante 5 minutos, a absorvância da solução reacional 10 minutos após a reação, E2A, é medida, e a diferença das absorvâncias, ΔE'A, é calculada subtraindo E1A de E2A. A absorvância da solução reacional após a reação a 37°C durante 5 minutos, E10, é medida pelo mesmo método, exceto que água destilada é usada como uma amostra ao invés da amostra A. A reação é adicionalmente realizada a 37°C durante 5 minutos e a absorvância da solução reacional 10 minutos após a reação, E20, é medida, e a diferença das absorvâncias, ΔE0, é calculada subtraindo E10 de E20. ΔE0 é subtraído de ΔE'A para fornecer, dessa forma, a diferença das absorvâncias, ΔEA, para a amostra A. Essa diferença nas absorvâncias, ΔEA, é usada para calcular a atividade da colesterol oxidase. No caso de uma combinação de 4-aminoantipirina (4-AA) e N-etil-N-(3-metilfenil)-N'- succiniletilenodiamina (EMSE) ser usada como um cromógeno oxidativo- corante, a atividade da colesterol oxidase é calculada a partir da expressão (I) a seguir: [Expressão 1]

[00013] Como pode ser observado a partir da expressão (I) acima descrita, a atividade da colesterol oxidase é proporcional ao ΔEA e, dessa forma, ΔEA pode ser usado como um indicador da atividade da colesterol oxidase.

[00014] A estabilização da colesterol oxidase pode ser avaliada, por exemplo, de acordo com o método a seguir. Como para uma amostra A preparada pela adição de uma colesterol oxidase e a-cetoácido a uma solução tampão como uma amostra contendo a colesterol oxidase, uma amostra A(imediatamente após a preparação) imediatamente após a preparação e uma amostra A(após a conservação) obtida após a conservação da amostra A(imediatamente após a preparação) a 5°C durante 2 semanas são preparadas. Adicionalmente, como para uma amostra a que é preparada pela adição de uma colesterol oxidase a uma solução tampão e que não contém a-cetoácido, uma amostra a(imediatamente após a preparação) imediatamente após a preparação e uma amostra a(após a conservação) obtida após a conservação da amostra a(imediatamente após a preparação) a 5°C durante 2 semanas são preparadas. A reação da amostra A(imediatamente após a preparação) com um reagente para avaliar a atividade da colesterol oxidase é realizada a 37°C durante 5 minutos usando a amostra A(imediatamente após a preparação) como uma amostra, e em seguida, a absorvância da solução reacional, E1A(imediatamente após a preparação) é medida. A reação é adicionalmente realizada a 37 °c durante 5 minutos, e a absorvância da solução reacional 10 minutos após a reação, E2A(imediatamente após a preparação) é medida. A diferença nas absorvâncias, ΔE'A(imediatamente após a preparação) é calculada pela subtração de E1A(imediatamente após a preparação) de E2A(imediatamente após a preparação). A absorvância da solução reacional após a reação a 37°C durante 5 minutos, E10, é medida pelo mesmo método, exceto que água destilada é usada como uma amostra ao invés da amostra A(imediatamente após a preparação). A reação é adicionalmente realizada a 37°C durante 5 minutos, e a absorvância da solução reacional a 10 minutos após a reação, E20, é medida. E10 é subtraída de E20 para, dessa forma, calcular a diferença nas absorvâncias, ΔE0. ΔE0 é subtraído de ΔE'A(imediatamente após a preparação) para, dessa forma, fornecer a diferença das absorvâncias, ΔEA(imediatamente após a preparação) para a amostra A(imediatamente após preparação).

[00015] A diferença nas absorvâncias, ΔEA^Sa conservação) para a amostra A(após a conservação) é calculada pelo mesmo método conforme descrito acima, exceto que a amostra A(após a conservação) é usada como uma amostra, ao invés da amostra A(imediatamente após a preparação). Da mesma forma, a diferença das absorvâncias, δea(imediatamente após a preparação) para a amostra a(imediatamente após a preparação) é calculada usando a amostra a(imediatamente após a preparação) como uma amostra ao invés da amostra A(imediatamente após a preparação) e a diferença das absorvâncias, δe^s a conservação) para a amostra a(após a conservação), é calculada usando a amostra a(após a conservação) como uma amostra ao invés de vez da amostra A(imediatamente após a preparação). A razão residual da colesterol oxidase na amostra A é calculada a partir da seguinte expressão (II): [Expressão 2]

[00016] De modo semelhante, a razão residual da colesterol oxidase na amostra a é calculada a partir da seguinte expressão (III): [Expressão 3]

[00017]

[00018] No caso da razão residual da colesterol oxidase na amostra A calculada a partir da expressão (II) acima descrita ser igual a 75% ou mais, e mais alta do que a razão residual da colesterol oxidase na amostra a calculada a partir da expressão (III) descrita acima, pode-se avaliar que a colesterol oxidase foi estabilizada como o a-cetoácido.

[00019] A colesterol oxidase na presente invenção é uma enzima classificada em EC1.1.3.6, e que catalisa a seguinte reação:

[00020] Exemplos de colesterol oxidase que catalisam a reação descrita acima incluem: uma colesterol oxidase derivada de animais, plantas ou microrganismos; e colesterol oxidases produzidas por um método de manipulação genética. Podem ser usados produtos comercialmente disponíveis, como a colesterol oxidase (CHODI; fabricada por KIKKOMAN CORPORATION), uma colesterol oxidase (CHO-PEWL; fabricada por KIKKOMAN CORPORATION), uma colesterol oxidase (CHO-CE; fabricada por KIKKOMAN CORPORATION) e uma colesterol oxidase (COO-321; fabricada por TOYOBO CO., Ltd.).

[00021] O meio aquoso na presente invenção não é particularmente limitado contanto que ele seja um meio aquoso que possa manter a colesterol oxidase estável. Exemplos do meio aquoso incluem água deionizada, água destilada e uma solução tampão, e é preferencialmente uma solução tampão. A concentração da colesterol oxidase em um meio aquoso na presente invenção varia geralmente de 0,01 a 300 U/ml. Um tampão com uma capacidade de tamponamento na região do ph onde a colesterol oxidase pode ser mantida estável é preferencial como uma solução tampão. Exemplos incluem uma solução de tampão fosfato, uma solução de tampão borato e uma solução de tampão de Good. Exemplos do tampão de Good usado na solução do tampão de Good incluem o ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES), tris(hidroximetil)aminometano (Tris), bis(2- hidroxietil)iminotris(hidroximetil)metano (Bis-Tris), ácido N-(2- acetamido)iminodiacético (ADA), ácido piperazino-N,N'-bis(2- etanossulfônico) (PIPES), ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanossulfônico (ACES), ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico (BES), ácido 3-morfolinopropanossulfônico (MOPS) e ácido N-[tris(hidroximetil)metil]-2- aminoetanossulfônico (TES), ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1- piperazinil]etanossulfônico (HEPES), ácido piperazino-N,N'-bis(2- hidroxipropanossulfônico) (POPSO), N-[tris(hidroximetil)metil]glicina (Tricina), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (Bicina), ácido N- tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanossulfônico (TAPS), ácido N-ciclo- hexil-2-aminoetanossulfônico (CHES) e ácido N-ciclo-hexil-3- aminopropanossulfônico (CAPS).

[00022] Na presente invenção, a colesterol oxidase é geralmente preservada em meio aquoso, com um ph de 5 a 9 e, preferencialmente preservada em meio aquoso com um ph de 6 a 8.

[00023] O a-cetoácido na presente invenção não é particularmente limitado, contanto que seja um a-cetoácido que pode estabilizar a colesterol oxidase, e exemplos incluem o ácido pirúvico, ácido a-cetoglutárico e ácido oxaloacético. Na presente invenção, o a-cetoácido pode ser um sal, e exemplos do sal incluem um sal de lítio, um sal de sódio, um sal de potássio, um sal de amônio, um sal de cálcio e um sal de magnésio.

[00024] A concentração do a-cetoácido em um meio aquoso na presente invenção não é particularmente limitada, contanto que seja uma concentração que possa estabilizar a colesterol oxidase, e que seja geralmente de 0,05 a 40 mmol/L.

[00025] Um método para preservar uma colesterol oxidase, de acordo com a presente invenção, é um método que compreende permitir que a colesterol oxidase coexista com um a-cetoácido ou um sal do mesmo em um meio aquoso. Exemplos da colesterol oxidase e da concentração da mesma, e do a-cetoácido e da concentração do mesmo usados no método para preservar uma colesterol oxidase de acordo com a presente invenção são os mesmos que aqueles utilizados no método para estabilizar uma colesterol oxidase mencionada acima. O período de conservação no método para preservar uma colesterol oxidase de acordo com a presente invenção não é particularmente limitado, contanto que seja um período durante o qual a colesterol oxidase seja estavelmente preservada, geralmente de 1 a 2 anos. Além disso, a temperatura de conservação no método para preservar uma colesterol oxidase de acordo com a presente invenção não é particularmente limitada, contanto que seja uma temperatura na qual a colesterol oxidase é estavelmente preservada, e é geralmente de -5 a 45°C, preferencialmente de 0 a 30°C, e de modo particularmente preferido de 2 a 10°C.

[00026] No método para preservar uma colesterol oxidase de acordo com a presente invenção, um tensoativo, um conservante, uma proteína e similares, bem como um a-cetoácido e um sal do mesmo podem coexistir com a colesterol oxidase. Exemplos do tensoativo incluem um tensoativo não iônico, um tensoativo catiônico, um tensoativo aniônico e um tensoativo anfotérico. Exemplos do conservante incluem uma azida e um quelante. Exemplos da azida incluem azida de sódio. Exemplos do quelante incluem ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e um sal do mesmo. Exemplos do sal incluem um sal de sódio e um sal de potássio. Exemplos da proteína incluem albumina, e exemplos de albumina incluem albumina de soro bovino (BSA).

[00027] Uma composição estabilizada da colesterol oxidase de acordo com a presente invenção pode incluir componentes geralmente incluídos em um reagente, e um kit usado em um método para medir um componente a ser mensurado com base em um sistema de medição de peróxido de hidrogênio, além de uma colesterol oxidase e um a-cetoácido ou um sal do mesmo. Exemplos do componente a ser mensurado incluem colesterol total (CT), colesterol na lipoproteína de alta densidade (HDL-C), colesterol na lipoproteína de densidade intermediária (IDL-C), colesterol na lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), colesterol na lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL-C), colesterol na lipoproteína tipo remanescente (RLP-C), colesterol na lipoproteína de baixa densidade pequena e densa (sdldl-C), colesterol em subfrações da HDL (HDL2-C, HDL3-C) e colesterol livre (FC).

[00028] O reagente e kit usados no método para medir o colesterol (TC, HDL-C, LDL-C, IDL-C, VLDL-C, RLP-C, sdldl-C, HDL2-C, HDL3-C e FC) incluem, por exemplo, uma colesterol esterase, uma peroxidase e um cromógeno oxidativo-corante além de uma colesterol oxidase.

[00029] Exemplos do cromógeno oxidativo-corante incluem um leucocromógeno e um cromógeno de acoplamento oxidativo.

[00030] O leucocromógeno tem a função de reagir com o peróxido de hidrogênio na presença de uma peroxidase para, desse modo, formar em si um corante. Exemplos do leucocromógeno incluem tetrametilbenzidina, o- fenilenodiamina, 10-N-carboximetilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H- fenotiazina (CCAP), 10-N-metilcarbamoil-3,7-bis(dimetilamino)-10H- fenotiazina (MCDP), sal de sódio da N-(carboximetilaminocarbonil)-4,4'- bis(dimetilamino)difenilamina (DA-64), sal de sódio da 10-N- (carboximetilaminocarbonil)-3,7-bis(dimetilamino)-10H-fenotiazina (DA-67), 4,4'-bis(dimetilamino)difenilamina e bis[3-bis(4-clorofenil)metil-4- dimetilaminofenil]amina (BCMA).

[00031] O cromógeno corante de acoplamento oxidativo tem a função de reagir com o peróxido de hidrogênio na presença de uma peroxidase para, dessa forma, formar um corante. Nessa reação para formar um corante, uma combinação de um par de cromógenos corantes de acoplamento oxidativo é usada. Exemplos da combinação do par de cromógenos corantes de acoplamento oxidativo incluem uma combinação de um acoplador e uma anilina, e combinações de um acoplador e um fenol. Exemplos do acoplador incluem 4-aminoantipirina (4-AA) e 3-metil-2- benzotiazolinona hidrazina.

[00032] Exemplos da anilina incluem são exemplos de N-(3- sulfopropil)anilina, N-etil-N-(2-hidróxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina (TOOS), N-etil-N-(2-hidróxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetilanilina (MAOS), N-etil-N-(2- hidróxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina (DAOS), N-etil-N-(3-sulfopropil)- 3-metilanilina (TOPS), N-(2-hidróxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina (HDAOS), N,N-dimetil-3-metilanilina, N,N-di(3-sulfopropil)-3,5- dimetoxianilina, N-etil-N-(3-sulfopropil)-3-metoxianilina, N-etil-N-(3- sulfopropil)anilina, N-etil-N-(3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina, N-(3- sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina, N-etil-N-(3-sulfopropil)-3,5-dimetilanilina, N-etil-N-(2-hidróxi-3-sulfopropil)-3-metoxianilina, N-etil-N-(2-hidróxi-3- sulfopropil)anilina, N-etil-N-(3-metilfenil)-N'-succiniletilenodiamina (EMSE), N-etil-N-(3-metilfenil)-N'-acetiletilenodiamina e N-etil-N-(2- hidróxi-3-sulfopropil)-4-flúor-3,5-dimetoxianilina (F-DAOS). Exemplos de fenol incluem 4-clorofenol, 3-metilfenol e ácido 3-hidróxi-2,4,6- tri-iodobenzoico (HTIB).

[00033] A composição estabilizada de colesterol oxidase de acordo com a presente invenção pode compreender o tensoativo, conservante e a proteína acima mencionados.

[00034] Adiante, a presente invenção é descrita mais especificamente de acordo com os Exemplos, os quais não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de alguma forma. Observa-se que os reagentes e as enzimas dos seguintes fabricantes foram usados nos Exemplos, Exemplos Comparativos e Exemplos de Teste.

[00035] MOPS (fabricado por DOJINDO LABORATORIES), EMSE (fabricado por Daito Chemix Corporation), 4-AA (fabricado por ACTEC, Inc.),bioace (fabricado por KI Chemical Industry Co., Ltd.),PGM-50 (éter polioxietileno-octilfenílico; fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.),colato de sódio (fabricado por NACALAI TESQUE, Inc.)Colesterol (fabricado por JUNSEI CHEMICAL CO., Ltd.),2-propanol (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.),Triton X-100 (fabricado por Sigma Chemical Company), piruvato de sódio (fabricado por KANTO CHEMICAL CO., INC.),ácido a-cetoglutárico dissódico (fabricado por MP Biomedicals, LLC),ácido oxaloacético (fabricado por KANTO CHEMICAL CO., Inc.),peroxidase (fabricado por TOYOBO CO., Ltd.)E CHO-CE (colesterol oxidase; fabricada por KIKKOMAN CORPORATION).

Exemplos Exemplo 1

[00036] O efeito de um a-cetoácido para estabilizar uma colesterol oxidase foi avaliado pelo método a seguir.

[00037] (1) Amostra

[00038] As amostras A (amostras A0 a A3) e as amostras B (amostras B0 a B3), compreendendo as composições a seguir, foram preparadas.

[00039] (2) Reagente para medir a atividade da colesterol oxidase O reagente A e o reagente B, compreendendo as composições a seguir, foram preparados.

[00043] O Reagente B (2 ml) foi adicionado ao Reagente A (50 ml) e bem misturado, para através disso fornecer um reagente para medir a atividade da colesterol oxidase. (3) Diferença nas absorvâncias para uma amostra imediatamente após a preparação

[00044] A amostra A1 imediatamente após a preparação (2,4 μl) e o reagente para medir a atividade da colesterol oxidase (225 μl) de (2) descrito acima foram adicionados a uma célula reacional. Após aquecer a 37°C durante 5 minutos, a absorvância da solução reacional, E1A1(imediatamente após a preparação), foi medida no comprimento de onda principal de 546 nm e em um subcomprimento de onda de 800 nm. A solução reacional foi adicionalmente aquecida a 37°C durante 5 minutos, e a absorvância da solução reacional 10 minutos após a reação, E2A1(imediatamente após a preparação), foi medida no comprimento de onda principal de 546 nm e no subcomprimento de onda de preparação) para fornecer ΔE'A1(imediatamente após a preparação).

[00045] Semelhantemente, a reação foi realizada utilizando água destilada como uma amostra. A absorvância da solução reacional 5 minutos após a reação, E10, foi subtraída da absorvância da solução reacional 10 minutos após a reação, E20, para fornecer ΔE0. ΔE0 foi subtraído de ΔE'A1(imediatamente após a preparação) para fornecer a diferença das absorvâncias, ΔEA1(imediatamente após a preparação) para a amostra A1 (imediatamente após a preparação). (4) Diferença nas absorvâncias para uma amostra após a conservação a 5°C durante 2 semanas

[00046] Exceto que a amostra A1, após a conservação a 5°C durante 2 semanas foi usada ao invés da amostra A1 imediatamente após a preparação, a diferença nas absorvâncias, ΔEAI^Sa conservação) para a amostra A1 após a conservação a 5°C durante 2 semanas foi determinada pelo mesmo método como em (3) descrito acima. (5) Razão residual de uma colesterol oxidase na amostra após a conservação a 5°C durante 2 semanas.

[00047] A razão residual da colesterol oxidase na amostra após a conservação a 5°C durante 2 semanas em relação à colesterol oxidase na amostra imediatamente após a preparação foi determinada a partir de ΔEA1(imediatamente após a preparação) determinada em (3)descrito acima, e ΔEA1(após a conservação) determinado em (4) descrito acima, usando a expressão (II) acima descrita. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

[00048] A razão residual da colesterol oxidase em cada uma das amostras após a conservação a 5°C durante 2 semanas em relação à colesterol oxidase em cada uma das amostras imediatamente após a preparação foi determinada pelo mesmo método como em (1) a (5) descrito acima, exceto que as amostras A2 e A3 e as amostras B1 a B3 foram, cada uma usadas como a amostra, ao invés da amostra A1. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

[00049] Além disso, a razão residual da colesterol oxidase em cada uma das amostras após a conservação a 5°C durante 2 semanas em relação à colesterol oxidase em cada uma das amostras imediatamente após a preparação foi determinada pelo mesmo método como em (1) a (5) descrito acima, exceto que a amostra A0 ou a amostra B0 foi usada ao invés da amostra A1, e a expressão (III) acima descrita foi usada ao invés da expressão (II) descrita acima. Os resultados são mostrados na Tabela 1. [Tabela 1] Tabela 1

[00050] Conforme observado a partir da tabela 1, verificou-se que, no caso em que as amostras sem tensoativo (A0 a A3) foram usadas ou no caso em que as amostras contendo 8um tensoativo (B0 a B3) foram usadas, a razão residual da colesterol oxidase na coexistência de um a-cetoácido foi maior que na ausência de um a-cetoácido, e foi igual ou superior a 75%. Ao contrário, na ausência de um a-cetoácido ou de um sal do mesmo, a razão residual foi tão baixa quanto inferior a 75%. Dessa forma, verificou-se que a coexistência de uma colesterol oxidase com um a-cetoácido, ou um sal do mesmo, em um meio aquoso estabiliza a colesterol oxidase.

Aplicabilidade Industrial

[00051] A presente invenção fornece um método para estabilizar uma colesterol oxidase, um método para preservar uma colesterol oxidase e uma composição estabilizada de colesterol oxidase. O método para estabilizar uma colesterol oxidase, o método para preservar uma colesterol oxidase e uma composição estabilizada de colesterol oxidase, de acordo com a presente invenção, são úteis para o diagnóstico clínico, como, por exemplo, da síndrome metabólica.

Claims

1. Método para estabilizar uma colesterol oxidase, caracterizadopelo fato de compreender permitir que a colesterol oxidase coexista com um a-cetoácido ou um sal do mesmo em um meio aquoso.

2. Método para estabilizar uma colesterol oxidase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o a-cetoácido é um a- cetoácido selecionado do grupo consistindo em ácido pirúvico, ácido α- cetoglutárico e ácido oxaloacético.

3. Método para preservar uma colesterol oxidase, caracterizado pelo fato de compreender permitir que a colesterol oxidase coexista com um a-cetoácido ou um sal do mesmo em um meio aquoso.

4. Método para preservar uma colesterol oxidase, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o a-cetoácido é um a- cetoácido selecionado do grupo consistindo em ácido pirúvico, ácido a- cetoglutárico e ácido oxaloacético.