KR20150013452A

KR20150013452A - 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법

Info

Publication number: KR20150013452A
Application number: KR1020147028791A
Authority: KR
Inventors: 도모코 아라타케; 겐타 긴조
Original assignee: 교와 메덱스 가부시키가이샤
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-18
Publication date: 2015-02-05
Also published as: EP2843045A1; EP2843045B1; HK1202895A1; JP6124414B2; BR112014025874B1; US9683228B2; KR101972628B1; EP2843045A4; CA2869445C; CN104245931B; CA2869445A1; WO2013161676A1; CN104245931A; US20150104847A1; JPWO2013161676A1

Abstract

콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법, 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법, 및 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물을 제공한다. 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법, 및 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법 ; 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물. 본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법, 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법, 및 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물은 메타볼릭 신드롬 등의 임상 진단에 유용하다.

Description

콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법{METHOD FOR STABILIZING CHOLESTEROL OXIDASE}

본 발명은 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법, 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법, 및 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물에 관헌 것이다.

콜레스테롤옥시다아제는 콜레스테롤과 산소 분자를 기질로 하는 산화 환원 효소이다. 임상 검사에 있어서 콜레스테롤옥시다아제를 사용하는 콜레스테롤 측정이 자주 행해지고 있다. 검체 중의 콜레스테롤에 콜레스테롤옥시다아제가 작용하여 과산화수소가 생성되고, 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제 존재 하에서 산화 발색형 색원체와 반응시켜 색소로 유도하고, 생성된 색소의 흡광도를 측정한다는, 비색법에 의한 검체 중의 콜레스테롤의 측정 방법 등이 임상 검사에서 사용되고 있다.

콜레스테롤의 측정에 사용되는 콜레스테롤옥시다아제는 불안정하고, 콜레스테롤옥시다아제를 함유하는 측정 시약의 보존 중에 실활되어 측정 시약의 성능이 악화된다는 과제가 있다.

이 과제에 대해서, 콜레스테롤옥시다아제를 함유하는 용액에 알칼리 금속의 염화물 및/또는 알칼리 토금속의 염화물을 첨가하는 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법 (특허 문헌 1 참조), 소 혈청 알부민, 덱스트란, 폴리에틸렌글리콜에서 선택되는 수용성 담체와 화학 결합시키는 것에 의한, 용액 상태에 있어서의 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법 (특허 문헌 2 참조), 콜레스테롤옥시다아제를 함유하는 용액에, 소 혈청 알부민 및 리신을 첨가함으로써 콜레스테롤옥시다아제를 안정화시키는 방법 (특허 문헌 3 참조), 단백질 분해물과 공존시키는 것에 의한 건조 상태의 콜레스테롤옥시다아제를 안정화시키는 방법 (특허 문헌 4 참조) 등이 알려져 있다.

(특허 문헌 1) 일본 공개특허공보 소52-143285호 (특허 문헌 2) 일본 공개특허공보 평6-062846호 (특허 문헌 3) 일본 공개특허공보 평8-187095호 (특허 문헌 4) 일본 공개특허공보 2005-114368호

본 발명의 목적은 장기 보존에 적절한 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법, 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법, 및 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 본 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시킴으로써, 콜레스테롤옥시다아제가 안정적으로 유지된다는 지견을 알아내고 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 [1] ∼ [6] 에 관헌 것이다.

[1] 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법.

[2] α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 [1] 에 기재된 안정화 방법.

[3] 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법.

[4] α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 [3] 에 기재된 보존 방법.

[5] 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물.

[6] α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 [5] 에 기재된 안정화 조성물.

본 발명에 의해서, 장기 보존에 적절한 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법, 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법, 및 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물이 제공된다.

본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법은 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 방법이다.

본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법은 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 방법이다.

본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물은 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 조성물이다.

본 발명에 있어서「안정」이란 장기간 콜레스테롤옥시다아제를 보존해도 콜레스테롤옥시다아제의 효소 활성이 유지되고 있는 것을 의미하고, 구체적으로는, 콜레스테롤옥시다아제의 수용액을 5 ℃ 에서 2 주간 보존하고, 5 ℃ 에서 2 주간 보존 후의 콜레스테롤옥시다아제 활성이, 콜레스테롤옥시다아제 수용액 조제 직후의 콜레스테롤옥시다아제 활성의 75 ％ 이상인 것을 말한다. 콜레스테롤옥시다아제 활성은 예를 들어 이하의 방법에 의해서 측정할 수 있다.

콜레스테롤 및 검출용 시약을 함유하는 콜레스테롤옥시다아제 활성 평가용 시약을 조제한다. 검출용 시약으로는, 예를 들어 퍼옥시다아제와, 후술하는 산화 발색형 색원체를 함유하는 시약을 사용할 수 있다. 검체 A (x ㎕) 에 콜레스테롤옥시다아제 활성 평가용 시약 (y ㎕) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 반응을 실시하여 반응 5 분 후의 반응액의 흡광도 E1_A 를 측정한다. 또한, 37 ℃ 에서 5 분간 반응을 실시하고, 반응 10 분 후의 반응액의 흡광도 E2_A 를 측정하고, E2_A 에서 E1_A 를 뺀 흡광도차 ΔE'_A 를 산출한다. 검체로서 검체 A 대신에 증류수를 사용한 것 이외에는, 동일한 방법에 의해서 37 ℃ 에서 5 분간 반응 후의 반응액의 흡광도 E1_O 을 측정하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 반응을 실시하고, 반응 10 분 후의 반응액의 흡광도 E2_O 을 측정하고, E2_O 에서 E1_O 을 뺀 흡광도차 ΔE_O 을 산출한다. ΔE'_A 에서 ΔE_O 을 빼어 검체 A 에 대한 흡광도차 ΔE_A 로 한다. 이 흡광도차 ΔE_A 로부터 콜레스테롤옥시다아제의 활성을 산출한다. 산화 발색형 색원체로서, 4-아미노안티피린 (4-AA) 과 N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE) 의 조합을 사용한 경우에는, 콜레스테롤옥시다아제의 활성은 이하의 식 (I) 에 의해서 산출된다.

[수학식 1]

콜레스테롤옥시다아제 활성 (U/㎖) - ΔE_A/16.9 × (x ＋ y)/x (Ⅰ)

상기 식 (I) 로부터 알 수 있는 바와 같이, 콜레스테롤옥시다아제 활성은 ΔE_A 에 비례하기 때문에 콜레스테롤옥시다아제 활성의 지표로서 ΔE_A 를 사용할 수 있다.

콜레스테롤옥시다아제의 안정화는, 예를 들어 이하의 방법에 의해서 평가할 수 있다. 콜레스테롤옥시다아제를 함유하는 검체로서, 완충액에 콜레스테롤옥시다아제와 α-케토산을 첨가하여 조제한 검체 A 에 대해서, 조제 직후의 검체 A_{(조제 직후)} 와, 검체 A_{(조제 직후)} 를 5 ℃ 2 주간 보존한 후의 검체 A_{(보존 후)} 를 조제한다. 또, 완충액에 콜레스테롤옥시다아제만을 첨가하여 조제한, α-케토산을 함유하지 않는 검체 a 에 대해서, 조제 직후의 검체 a_{(조제 직후)} 와, 검체 a_{(조제 직후)} 를 5 ℃ 2 주간 보존한 후의 검체 a_{(보존 후)} 를 조제한다. 검체로서 검체 A_{(조제 직후)} 를 사용하여 검체 A_{(조제 직후)} 와 콜레스테롤옥시다아제 활성 평가용 시약의 반응을 37 ℃ 에서 5 분간 실시하고, 반응액의 흡광도 E1_{A (조제 직후)} 를 측정하고, 추가로, 37 ℃ 에서 5 분간 반응을 실시하고, 반응 10 분 후의 반응액의 흡광도 E2_{A (조제 직후)} 를 측정하고, E2_{A (조제 직후)} 에서 E1_{A (조제 직후)} 를 뺀 흡광도차 ΔE'_{A (조제 직후)} 를 산출한다. 검체로서 검체 A_{(조제 직후)} 대신에 증류수를 사용한 것 이외에는, 동일한 방법에 의해서, 37 ℃ 에서 5 분간 반응 후의 반응액의 흡광도 E1₀ 을 측정하고, 추가로, 37 ℃ 에서 5 분간 반응을 실시하고, 반응 10 분 후의 반응액의 흡광도 E2_O 을 측정하고, E2_O 에서 E1_O 을 뺀 흡광도차 ΔE_O 을 산출한다. ΔE'_{A (조제 직후)} 에서 ΔE_O 을 빼서, 검체 A_{(조제 직후)} 에 대한 흡광도차 ΔE_{A (조제 직후)} 로 한다.

검체로서 검체 A_{(조제 직후)} 대신에 검체 A_{(보존 후)} 를 사용한 것 이외에는, 상기와 동일한 방법에 의해서, 검체 A_{(보존 후)} 에 대한 흡광도차 ΔE_{A (보존 후)} 를 산출한다. 마찬가지로, 검체로서 검체 A_{(조제 직후)} 대신에 검체 a_{(조제 직후)} 를 사용하여 검체 a_{(조제 직후)} 에 대한 흡광도차 ΔE_{a (조제 직후)} 를, 검체로서 검체 A_{(조제 직후)} 대신에 검체 a_{(보존 후)} 를 사용하여 검체 a_{(보존 후)} 에 대한 흡광도차 ΔE_{a (보존 후)} 를 산출한다. 검체 A 에 있어서의 콜레스테롤옥시다아제의 잔존율은 이하의 식 (Ⅱ) 에 의해서 산출한다.

[수학식 2]

잔존율 (％) ＝ ΔE_{A (보존 후)}/ΔE_{A (조제 직후)} × 100 (Ⅱ)

마찬가지로, 검체 a 에 있어서의 콜레스테롤옥시다아제의 잔존율은 이하의 식 (Ⅲ) 에 의해서 산출한다.

[수학식 3]

잔존율 (％) ＝ ΔE_{a (보존 후)}/ΔE_{a (조제 직후)} × 100 (Ⅱ)

상기 식 (Ⅱ) 에서 산출된 검체 A 에 있어서의 콜레스테롤옥시다아제의 잔존율이 75 ％ 이상이고, 또한, 상기 식 (Ⅲ) 에서 산출된 검체 a 에 있어서의 콜레스테롤옥시다아제의 잔존율보다 높을 경우, α-케토산에 의해서 콜레스테롤옥시다아제가 안정화되었다고 평가할 수 있다.

본 발명에 있어서의 콜레스테롤옥시다아제는 EC1.1.3.6 으로 분류되는 효소로서, 이하의 반응을 촉매하는 효소이다.

콜레스테롤 ＋ O₂ → 콜레스토-4-엔-온 ＋ H₂O₂

상기 반응을 촉매하는 콜레스테롤옥시다아제로는, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤옥시다아제 이외에, 유전자 공학적인 수법에 의해서 제조되는 콜레스테롤옥시다아제 등을 들 수 있고, 콜레스테롤옥시다아제 (CHODI ; 키코만사 제조), 콜레스테롤옥시다아제 (CHO-PEWL ; 키코만사 제조), 콜레스테롤옥시다아제 (CHO-CE ; 키코만사 제조), 콜레스테롤옥시다아제 (COO-321 ; 토요 방적사 제조) 등의 시판품을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 수성 매체로는 콜레스테롤옥시다아제를 안정적으로 유지할 수 있는 수성 매체이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있고, 완충액이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 콜레스테롤옥시다아제의 수성 매체 중의 농도는 통상적으로 0.01 ∼ 300 U/㎖ 이다. 완충액으로는, 콜레스테롤옥시다아제를 안정적으로 유지할 수 있는 pH 의 영역에 완충능을 갖는 완충제가 바람직하고, 예를 들어 인산 완충액, 붕산 완충액, 굿 완충액 등을 들 수 있다. 굿 완충액에 사용되는 굿 완충제로는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (Tris), 비스(2-하이드록시에틸)이미노트리스(하이드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노이아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판술폰산)(POPSO), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 콜레스테롤옥시다아제는 통상적으로 pH 5 ∼ 9 의 수성 매체 중에서 보존되고, pH 6 ∼ 8 의 수성 매체 중에서 보존되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서의 α-케토산은 콜레스테롤옥시다아제를 안정화시키는 α-케토산이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 피루브산, α-케토글루타르산, 옥살로아세트산 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, α-케토산은 염이어도 되고, 염으로는 예를 들어 리튬염, 나트륨염, 칼륨염, 암모늄염, 칼슘염, 마그네슘염 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 α-케토산의 수성 매체 중의 농도는 콜레스테롤옥시다아제를 안정화시키는 농도이면 특별히 제한은 없고 통상적으로 0.05 ∼ 40 m㏖/ℓ 이다.

본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법은 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시켜 보존하는 방법이다. 본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법에 사용되는 데있어서의 콜레스테롤옥시다아제와 그 농도, 및 α-케토산과 그 농도는, 상기 콜레스테롤옥시다아제 안정화 방법과 동일한 것을 들 수 있다. 본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법에 있어서의 보존 기간은, 콜레스테롤옥시다아제가 안정적으로 보존되는 기간이면 특별히 제한은 없고 통상적으로 1 ∼ 2 년간이다. 또, 본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법에 있어서의 보존 온도는, 콜레스테롤옥시다아제가 안정적으로 보존되는 온도이면 특별히 제한은 없고 통상적으로 -5 ∼ 45 ℃ 이고, 0 ∼ 30 ℃ 가 바람직하고, 2 ∼ 10 ℃ 가 특히 바람직하다.

본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법에 있어서는, α-케토산 혹은 그 염 외에, 계면활성제, 방부제, 단백질 등을 콜레스테롤옥시다아제에 공존시켜도 된다. 계면활성제로는 예를 들어 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 등을 들 수 있다. 방부제로는 예를 들어 아지화, 킬레이트제 등을 들 수 있다. 아지화물로는 예를 들어 아지화나트륨 등을 들 수 있다. 킬레이트제로는 예를 들어 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA) 혹은 그 염 등을 들 수 있다. 염으로는 예를 들어 나트륨염, 칼륨염 등을 들 수 있다. 단백질로는 예를 들어 알부민 등을 들 수 있고, 알부민으로는 예를 들어 소 혈청 알부민 (BSA) 등을 들 수 있다.

본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물에는, 콜레스테롤옥시다아제 및 α-케토산 혹은 그 염 외에, 과산화수소 측정계에 기초하는 측정 대상 성분의 측정 방법에 사용되는 시약 및 키트에 통상적으로 함유되는 구성 요소가 함유되어 있어도 된다. 측정 대상 성분으로는, 총콜레스테롤 (TC), 고밀도 리포 단백 중의 콜레스테롤 (HDL-C), 중간 밀도 리포 단백 중의 콜레스테롤 (IDL-C), 저밀도 리포 단백 중의 콜레스테롤 (LDL-C), 초저밀도 리포 단백 중의 콜레스테롤 (VLDL-C), 램넌트 유사 리포 단백 중의 콜레스테롤 (RLP-C), 소립자 저밀도 리포 단백 중의 콜레스테롤 (sdLDL-C), HDL 아분획 중의 콜레스테롤 (HDL2-C, HDL3-C), 유리형 콜레스테롤 (FC) 등을 들 수 있다.

예를 들어 콜레스테롤 (TC, HDL-C, LDL-C, IDL-C, VLDL-C, RLP-C, sdLDL-C, HDL2-C, HDL3-C, FC) 의 측정 방법에서 사용되는 시약 및 키트에는, 콜레스테롤옥시다아제 외에, 콜레스테롤에스테라아제, 퍼옥시다아제, 산화 발색형 색원체 등이 함유된다.

산화 발색형 색원체로는 로이코형 색원체, 산화커플링형 색원체 등을 들 수 있다.

로이코형 색원체는 퍼옥시다아제의 존재 하에서 과산화수소와 반응하여 단독으로 색소를 생성하는 기능을 갖는다. 로이코형 색원체로는, 예를 들어 테트라메틸벤지딘, o-페닐렌디아민, 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노) 디페닐아민 나트륨염 (DA-64), 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 나트륨염 (DA-67), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.

산화커플링 발색형 색원체는 퍼옥시다아제의 존재 하에서 과산화수소와 반응하여 색소를 생성하는 기능을 갖는다. 이 색소를 생성하는 반응에 있어서는, 1 쌍의 산화커플링 발색형 색원체의 조합이 사용된다. 1 쌍의 산화커플링 발색형 색원체의 조합으로는 커플러와 아닐린류의 조합, 커플러와 페놀류의 조합을 들 수 있다.

커플러로는 예를 들어 4-아미노안티피린 (4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논하이드라진 등을 들 수 있다.

아닐린류로는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-디(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-삭시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 등을 들 수 있다.

페놀류로는 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-하이드록시-2,4,6-트리요오드벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.

본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물에는 전술한 계면활성제, 방부제, 단백질 등이 함유되어 있어도 된다.

이하, 실시예에 의해서 본 발명을 보다 상세하게 설명하는데, 이들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 실시예, 비교예 및 시험예에 있어서는, 하기 메이커의 시약 및 효소를 사용하였다.

MOPS (도진 화학 연구소사 제조), EMSE (다이토 케믹스사 제조), 4-AA (아크테크사 제조), 바이오 에이스 (케이·아이 화성사 제조), PGM-50 (폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르 ; 와코 순약 공업사 제조), 콜산나트륨 (나카라이테스크사 제조), 콜레스테롤 (쥰세이 화학사 제조), 2-프로판올 (와코 순약 공업사 제조), 트리톤 X-100 (시그마사 제조), 피루브산나트륨 (칸토 화학사 제조), α-케토글루타르산·이나트륨 (MP 바이오메디컬사 제조), 옥살로아세트산 (칸토 화학사 제조), 퍼옥시다아제 (토요 방적사 제조), CHO-CE (콜레스테롤옥시다아제 ; 키코만사 제조).

실시예 1

이하의 방법에 의해서, α-케토산에 의한 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 효과를 검토하였다.

(1) 검체

이하의 조성으로 이루어지는 검체 A (검체 A0 ∼ A3), 및 검체 B (검체 B0 ∼ B3) 를 조제하였다.

<검체 A (검체 A0 ∼ A3)>

MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ

CHO-CE 2 kU/ℓ

α-케토산 (표 1 참조, 검체 A0 는 무첨가)

<검체 B (검체 B0 ∼ B3)>

MOPS (pH 7.0) 20 m㏖/ℓ

트리톤 X-100 1 ％

CHO-CE 2 kU/ℓ

α-케토산 (표 1 참조, 검체 B0 는 무첨가)

(2) 콜레스테롤옥시다아제 활성 측정용 시약

이하의 조성으로 이루어지는 시약 A, 및 시약 B 를 조제하였다.

<시약 A>

MOPS (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ

EMSE 　　0.3 g/ℓ

4-AA 0.1 g/ℓ

바이오 에이스 0.3 g/ℓ

PGM-50 10 g/ℓ

콜산나트륨 5 g/ℓ

퍼옥시다아제　　　　 15 kU/ℓ

<시약 B>

콜레스테롤의 2-프로판올 용액 (5 ㎎/㎖)

시약 A (50 ㎖) 에 시약 B (2 ㎖) 첨가하고, 잘 교반하여 콜레스테롤옥시다아제 활성 측정용 시약으로 하였다.

(3) 조제 직후의 검체에 대한 흡광도차

반응 셀에 조제 직후의 검체 A1 (2.4 ㎕) 와, 상기 (2) 의 콜레스테롤옥시다아제 활성 측정용 시약 (225 ㎕) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 가온한 후의 반응액의 흡광도 E1_{A1 (조제 직후)} 을 주파장 546 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 측정하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 가온하여, 반응 10 분 후의 반응액의 흡광도 E2_{A1 (조제 직후)} 을 주파장 546 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 측정하고, E2_{A1 (조제 직후)} 에서 E1_{A1 (조제 직후)} 을 빼어 ΔE'_{A1 (조제 직후)} 로 하였다.

검체로서 증류수를 사용하여 동일한 반응을 실시하고, 반응 10 분 후의 반응액의 흡광도 E2_O 에서 반응 5 분 후의 반응액의 흡광도 E1_O 을 빼어 ΔE_O 로 하였다. ΔE'_{A1 (조제 직후)} 에서 ΔE_O 를 빼어 조제 직후의 검체 A1 에 대한 흡광도차 ΔE_{A1 (조제 직후)} 로 하였다.

(4) 5 ℃ 2 주간 보존 후의 검체에 대한 흡광도차

조제 직후의 검체 A1 대신에, 5 ℃ 2 주간 보존 후의 검체 A1 을 사용한 것 이외에는, 상기 (3) 과 동일한 방법에 의해서, 5 ℃ 2 주간 보존 후의 검체 A1 에 대한 흡광도차 ΔE_{A1 (보존 후)} 을 결정하였다.

(5) 5 ℃ 2 주간 보존 후의 검체 중의 콜레스테롤옥시다아제의 잔존율

상기 (3) 에서 결정된 ΔE_{A1 (조제 직후)} 과 (4) 에서 결정된 ΔE_{A1 (보존 후)} 로부터, 조제 직후의 검체 중의 콜레스테롤옥시다아제에 대한 5 ℃ 2 주간 보존 후의 검체 중의 콜레스테롤옥시다아제의 잔존율을 상기 식 (Ⅱ) 에 의해서 결정하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

검체로서 검체 A1 대신에 검체 A2, 검체 A3, 및 검체 B1 ∼ B3 의 각 검체를 사용한 것 이외에는, 상기 (1) ∼ (5) 와 동일한 방법에 의해서, 조제 직후의 각 검체 중의 콜레스테롤옥시다아제에 대한, 5 ℃ 2 주간 보존 후의 각 검체 중의 콜레스테롤옥시다아제의 잔존율을 결정하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

또한, 검체 A1 대신에 검체 A0 및 검체 B0 를 사용하고, 상기 식 (Ⅱ) 대신에 상기 식 (Ⅲ) 을 사용한 것 이외에는, 상기 (1) ∼ (5) 와 동일한 방법에 의해서, 조제 직후의 각 검체 중의 콜레스테롤옥시다아제에 대한, 5 ℃ 2 주간 보존 후의 각 검체 중의 콜레스테롤옥시다아제의 잔존율을 결정하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

검체	α- 케토산 (농도)	잔존율 (%)
A0	-	61
A1	피루브산나트륨 (0.5 g/ℓ)	88
A2	α-케토글루타르산ㆍ2나트륨 (0.5 g/ℓ)	91
A3	옥살로아세트산 (0.5 g/ℓ)	80
B0	-	71
B1	피루브산나트륨 (0.5 g/ℓ)	95
B2	α-케토글루타르산ㆍ2나트륨 (0.5 g/ℓ)	85
B3	옥살로아세트산 (0.5 g/ℓ)	79

표 1 로부터 분명한 바와 같이, 계면활성제가 함유되지 않은 검체 (A0 ∼ A3) 를 사용한 경우이어도, 계면활성제가 함유되어 있는 검체 (B0 ∼ B3) 를 사용한 경우이어도, 콜레스테롤옥시다아제의 잔존율은 α-케토산 비공존 하와 비교하여 α-케토산 공존 하에서 높고, 75 ％ 이상인 것을 알 수 있었다. 그에 반하여, α-케토산 혹은 그 염 비공존하에서는 잔존율은 75 ％ 미만으로 낮았다. 따라서, 콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시킴으로써 콜레스테롤옥시다아제가 안정화되는 것을 알 수 있었다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의해서, 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법, 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법, 및 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물이 제공된다. 본 발명의 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법, 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법, 및 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물은 메타볼릭 신드롬 등의 임상 진단에 유용하다.

Claims

콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 방법.
제 1 항에 있어서,
α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 안정화 방법.
콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤옥시다아제의 보존 방법.
제 3 항에 있어서,
α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 보존 방법.
콜레스테롤옥시다아제에 α-케토산 혹은 그 염을 수성 매체 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤옥시다아제의 안정화 조성물.
제 5 항에 있어서,
α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 안정화 조성물.