JP6004942B2 - 測定対象成分の測定方法 - Google Patents
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Description
[2] 検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素を酸化発色型色原体と反応させる、検体中の測定対象成分の測定方法において、生成した過酸化水素と酸化発色型色原体との反応をα−ケト酸存在下に行うことを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定方法における過酸化物の影響抑制方法。
[3] α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である[1]又は[2]記載の方法。
[4] 酸化発色型色原体が、ロイコ型色原体である[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5] ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である[4]記載の方法。
[6] フェノチアジン誘導体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである[5]記載の方法。
[7] 酸化発色型色原体が、酸化カップリング型色原体である[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[8] 酸化カップリング型色原体が、カップラーと、アニリン誘導体又はフェノール誘導体との組み合わせである[7]記載の方法。
[10] α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である[9]記載の試薬。
[11] 酸化発色型色原体が、ロイコ型色原体である[9]又は[10]記載の試薬。
[12] ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である[11]記載の試薬。
[13] フェノチアジン誘導体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである[12]記載の試薬。
[14] 酸化発色型色原体が、酸化カップリング型色原体である[9]又は[10]記載の試薬。
[15] 酸化カップリング型色原体が、カップラーと、アニリン誘導体又はフェノール誘導体との組み合わせである[14]記載の試薬。
[17] ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である[16]記載のキット。
[18] フェノチアジン誘導体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである[17]記載のキット。
[19] 第1試薬及び第2試薬を含む、検体中の測定対象成分の測定用キットであって、カップラーと、アニリン誘導体又はフェノール誘導体とがそれぞれ、第1試薬及び第2試薬の別々の試薬に含まれ、過酸化活性物質、過酸化水素生成試薬及びα−ケト酸がそれぞれ、第1試薬及び第2試薬の一方又は両方に含まれることを特徴とするキット。
[20] α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である[16]〜[19]のいずれかに記載のキット。
本発明の測定対象成分の測定方法は、検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素をα−ケト酸存在下に酸化発色型色原体を用いて測定することを特徴とする。本発明の測定対象成分の測定方法は、検体中に存在する過酸化物の影響が抑制され、正確に検体中の測定対象成分を測定することができる。
工程1:検体中の測定対象成分を過酸化水素生成試薬と反応させ、過酸化水素を生成させる工程;
工程2:工程1で生成した過酸化水素を、α−ケト酸及び過酸化活性物質の存在下、酸化発色型色原体と反応させて色素を生成させる工程;
工程3:工程2で生成した色素の吸光度を測定する工程;
工程4:既知濃度の測定対象成分を用いて作成された、測定対象成分の濃度又は活性と吸光度との関係を表す検量線に、工程3で測定した吸光度を相関させる工程;
工程5:検体中の測定対象成分の濃度又は活性を決定する工程。
本発明の、検体中の測定対象成分の測定用試薬は、本発明の測定方法に用いられる試薬であり、過酸化水素生成試薬、α−ケト酸、過酸化活性物質及び酸化発色型色原体を含む。
・測定用試薬1
過酸化水素生成試薬、α−ケト酸、過酸化活性物質及びロイコ型色原体を含む試薬。
・測定用試薬2
過酸化水素生成試薬、α−ケト酸、過酸化活性物質及びカップリング型色原体を含む試薬。
・測定用キット1
第1試薬
ロイコ型色原体及びα−ケト酸を含む試薬。
第2試薬
過酸化活性物質及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット2
第1試薬
ロイコ型色原体、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第2試薬
過酸化活性物質及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット3
第1試薬
ロイコ型色原体、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第2試薬
過酸化活性物質、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第1試薬
過酸化活性物質及びα−ケト酸を含む試薬。
第2試薬
ロイコ型色原体及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット5
第1試薬
過酸化活性物質、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第2試薬
ロイコ型色原体及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット6
第1試薬
過酸化活性物質、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第2試薬
ロイコ型色原体、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第1試薬
カップラー及びα−ケト酸を含む試薬。
第2試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、過酸化活性物質、及び、過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット8
第1試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、及び、α−ケト酸を含む試薬。
第2試薬
カップラー、過酸化活性物質及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第1試薬
カップラー、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第2試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、過酸化活性物質、及び、過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット10
第1試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、α−ケト酸、及び、過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第2試薬
カップラー、過酸化活性物質及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第1試薬
カップラー、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第2試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、過酸化活性物質、α−ケト酸、及び、過酸化水素生成試薬を含む試薬。
・測定用キット12
第1試薬
アニリン誘導体又はフェノール誘導体、α−ケト酸、及び、過酸化水素生成試薬を含む試薬。
第2試薬
カップラー、過酸化活性物質、α−ケト酸及び過酸化水素生成試薬を含む試薬。
本発明の過酸化物の影響抑制方法は、検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素を酸化発色型色原体と反応させる、検体中の測定対象成分の測定方法において、生成した過酸化水素と酸化発色型色原体との反応をα−ケト酸存在下に行うことを特徴とする抑制方法である。
本発明の過酸化物の影響抑制方法により、検体中の測定対象成分を正確に測定することができる。
工程1:α−ケト酸を含む試薬[以下、試薬(+)という]と、α−ケト酸を含まない試薬[以下、試薬(−)という]を調製する工程
工程2:検体と試薬(+)とを反応させて、生成した色素の吸光度を測定する工程
工程3:検体と試薬(−)とを反応させて、生成した色素の吸光度を測定する工程
工程4:工程2で測定した吸光度と、工程3で測定した吸光度とを比較する工程。
MES(同仁化学研究所社製)、Bis−Tris(同仁化学研究所社製)、ADA(同仁化学研究所社製)、ペルオキシダーゼ(POD;東洋紡績社製)、ピルビン酸ナトリウム(関東化学社製)、α−ケトグルタル酸(関東化学社製)、オキサロ酢酸(関東化学社製)、DA−67(和光純薬工業社製)、4−AA(埼京化成社製)、EMSE(ダイトーケミックス社製)、塩化カルシウム二水和物(和光純薬工業社製)、硫酸ナトリウム(関東化学社製)、硝酸ナトリウム(関東化学社製)、デシルトリメチルアンモニウム ブロマイド(C10TMA;東京化成社製)、1−ドデシルピリジニウム クロライド(東京化成社製)、グルコース(MERCK製)、フルクトシルVHLTPE(フルクトシルヘキサペプチド;ペプチド研究所社製)、グルコース酸化酵素(GOD;東洋紡績社製)、サーモリシン(プロテアーゼ;天野エンザイム社製)、アクチナーゼE(プロテアーゼ;科研製薬社製)、FPOX−CE(フルクトシルペプチド酸化酵素;キッコーマン社製)、FPOX−CET(フルクトシルペプチド酸化酵素;キッコーマン社製)、ディスパノールTOC(ポリオキシエチレントリデシルエーテル;日油社製)、ノニオンE230(ポリオキシエチレンオレイルエーテル;日油社製)。
以下の組成からなるグルコース測定用キット(キットA)を調製した。
第1試薬
MES(pH6.25) 20mmol/L
DA−67 50μmol/L
ピルビン酸ナトリウム 5g/L
第2試薬
MES(pH6.25) 20mmol/L
POD 10kU/L
GOD 5kU/L
以下の組成からなるグルコース測定用キット(キットa)を調製した。
第1試薬
MES(pH6.25) 20mmol/L
DA−67 50μmol/L
第2試薬
MES(pH6.25) 20mmol/L
POD 10kU/L
GOD 5kU/L
以下の4つの検体を調製した。
・検体1:グルコース及びディスパノールTOCをそれぞれ90μmol/L、0%含有する水溶液
・検体2:グルコース及びディスパノールTOCをそれぞれ90μmol/L、0.25%含有する水溶液
・検体3:グルコース及びディスパノールTOCをそれぞれ90μmol/L、0.5%含有する水溶液
・検体4:グルコース及びディスパノールTOCをそれぞれ90μmol/L、1%含有する水溶液
ディスパノールTOCは、ポリオキシエチレン系界面活性剤であり、過酸化物の生成源である。検体1〜4において、ディスパノールTOC濃度に依存して、過酸化物が多く含まれる。
上記(3)で調製した検体1(1.5μL)と、(1)で調製したキットAの第1試薬(150μL)とを37℃で5分間反応させて、吸光度(E1)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。次いで、キットAの第2試薬(50μL)を添加し、さらに37℃で5分間反応させて、吸光度(E2)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。測定は、日立H7180にて行った。吸光度(E2)から吸光度(E1)を差し引いて、検体1の反応吸光度(E1A)とした。
以下の組成からなるグルコース測定用キット(キットB)を調製した。
第1試薬
MES(pH6.25) 20mmol/L
EMSE 0.3g/L
ピルビン酸ナトリウム 5g/L
第2試薬
MES(pH6.25) 20mmol/L
POD 10kU/L
4−AA 0.1g/L
GOD 5kU/L
以下の組成からなるグルコース測定用キット(キットb)を調製した。
第1試薬
MES(pH6.25) 20mmol/L
EMSE 0.3g/L
第2試薬
MES(pH6.25) 20mmol/L
POD 10kU/L
4−AA 0.1g/L
GOD 5kU/L
実施例1で調製した検体1〜4を用いた。
上記(3)で調製した検体1(15μL)と、(1)で調製したキットAの第1試薬(150μL)とを37℃で5分間反応させて、吸光度(E1)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。次いで、キットAの第2試薬(50μL)を添加し、さらに37℃で5分間反応させて、吸光度(E2)を主波長546nm、副波長800nmで測定した。測定は、日立H7180にて行った。吸光度(E2)から吸光度(E1)を差し引いて、検体1の反応吸光度(E1B)とした。
以下の組成からなるフルクトシルVHLTPE測定用キット(キットC)を調製した。
第1試薬
Bis−Tris(pH7.0) 10mmol/L
塩化カルシウム二水和物 10mmol/L
硫酸ナトリウム 7.5mmol/L
C10TMA 17g/L
DA−67 20μmol/L
サーモリシン 1200kU/L
ピルビン酸ナトリウム 5g/L
第2試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
POD 120kU/L
FPOX−CE 12kU/L
以下の組成からなるフルクトシルVHLTPE測定用キット(キットc)を調製した。
第1試薬
Bis−Tris(pH7.0) 10mmol/L
塩化カルシウム二水和物 10mmol/L
硫酸ナトリウム 7.5mmol/L
C10TMA 17g/L
DA−67 20μmol/L
サーモリシン 1200kU/L
第2試薬
ADA(pH7.0) 50mmol/L
POD 120kU/L
FPOX−CE 12kU/L
以下の4つの検体を調製した。
・検体1:フルクトシルVHLTPE及びディスパノールTOCをそれぞれ18μmol/L、0%含有する水溶液
・検体2:フルクトシルVHLTPE及びディスパノールTOCをそれぞれ18μmol/L、0.05%含有する水溶液
・検体3:フルクトシルVHLTPE及びディスパノールTOCをそれぞれ18μmol/L、0.1%含有する水溶液
・検体4:フルクトシルVHLTPE及びディスパノールTOCをそれぞれ18μmol/L、0.2%含有する水溶液
ディスパノールTOCは、ポリオキシエチレン系界面活性剤であり、過酸化物の生成源である。検体1〜4において、ディスパノールTOC濃度に依存して、過酸化物が多く含まれる。
上記(3)で調製した検体1(9.6μL)と、(1)で調製したキットCの第1試薬(120μL)とを37℃で5分間反応させて、吸光度(E1)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。次いで、キットCの第2試薬(40μL)を添加し、さらに37℃で5分間反応させて、吸光度(E2)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。測定は、日立H7180にて行った。吸光度(E2)から吸光度(E1)を差し引いて、検体1の反応吸光度(E1C)とした。
検体1に対して行った一連の操作を、検体2〜4それぞれに対しても行い、検体2に対する吸光度(ΔE2C)、検体3に対する吸光度(ΔE3C)、検体4に対する吸光度の相対値(ΔE4C)を決定した。検体1に対する吸光度(ΔE1C)を100とした時の、検体2〜4に対する吸光度(ΔE2C〜ΔE4C)の相対値を第8表に示す。
(1)ピルビン酸含有グルコース測定用キット
以下の組成からなるグルコース測定用キット(キットD1〜D3)を調製した。キットD1は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0%のキットを、キットD2は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0.02%のキットを、キットD3は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0.1%のキットを表す。
第1試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
EMSE 0.3g/L
ノニオンE230 0,0.02又は0.1%
ピルビン酸ナトリウム 5g/L
第2試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
4−AA 0.1g/L
POD 40kU/L
GOD 100kU/L
以下の組成からなるグルコース測定用キット(キットE1〜E3)を調製した。キットE1は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0%のキットを、キットE2は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0.02%のキットを、キットE3は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0.1%のキットを表す。
第1試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
EMSE 0.3g/L
ノニオンE230 0,0.02又は0.1%
α−ケトグルタル酸 1g/L
第2試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
4−AA 0.1g/L
POD 40kU/L
GOD 100kU/L
以下の組成からなるグルコース測定用キット(キットF1〜F3)を調製した。キットF1は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0%のキットを、キットF2は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0.02%のキットを、キットF3は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0.1%のキットを表す。
第1試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
EMSE 0.3g/L
ノニオンE230 0,0.02又は0.1%
オキサロ酢酸 0.2g/L
第2試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
4−AA 0.1g/L
POD 40kU/L
GOD 100kU/L
以下の組成からなるグルコース測定用キット(キットd1〜d3)を調製した。キットd1は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0%のキットを、キットd2は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0.02%のキットを、キットd3は、第1試薬中のノニオンE230濃度が0.1%のキットを表す。
第1試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
EMSE 0.3g/L
ノニオンE230 0,0.02又は0.1%
第2試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
4−AA 0.1g/L
POD 40kU/L
GOD 100kU/L
生理食塩水(2.0μL)と、(1)で調製したキットD1の第1試薬(180μL)とを37℃で5分間反応させて、吸光度(E1)を主波長546nm、副波長700nmで測定した。次いで、キットD1の第2試薬(60μL)を添加し、さらに37℃で5分間反応させて、吸光度(E2)を主波長546nm、副波長700nmで測定した。測定は、日立H7170にて行った。吸光度(E2)から吸光度(E1)を差し引いて、生理食塩水のブランク吸光度(ED1)とした。
さらに、キットD1の代わりにキットD3を用いて同様の測定を行い、生理食塩水のブランク吸光度(ED3)を算出した。
キットD1〜D3の代わりに、上記(2)で調製したα−ケトグルタル酸を含有するキットE1〜E3をそれぞれ用いる以外は(5)と同様の方法により、キットE1〜E3のそれぞれのキットのブランク吸光度(ΔEE1〜ΔEE3)を算出した。キットE1〜キットE3のそれぞれのキットのブランク吸光度(ΔEE1〜ΔEE3)を第9表に示す。
キットD1〜D3の代わりに、上記(3)で調製したオキサロ酢酸を含有するキットF1〜F3をそれぞれ用いる以外は(5)と同様の方法により、キットF1〜F3のそれぞれのキットのブランク吸光度(ΔEF1〜ΔEF3)を算出した。キットF1〜キットF3のそれぞれのキットのブランク吸光度(ΔEF1〜ΔEF3)を第9表に示す。
キットD1〜D3の代わりに、上記(4)で調製したα−ケト酸を含有しないキットd1〜d3をそれぞれ用いる以外は(5)と同様の方法により、キットd1〜d3のそれぞれのキットのブランク吸光度(ΔEd1〜ΔEd3)を算出した。キットd1〜キットd3のそれぞれのキットのブランク吸光度(ΔEd1〜ΔEd3)を第9表に示す。
(1)ピルビン酸含有ヘモグロビンA1c測定用キット
以下の組成からなるヘモグロビンA1c測定用キット(キットG)を調製した。
第1試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
塩化カルシウム二水和物 10mmol/L
硝酸ナトリウム 100mmol/L
1−ドデシルピリジニウム クロライド 1.4g/L
アクチナーゼE 340kU/L
DA−67 30μmol/L
ノニオンE230 0.01%
ピルビン酸ナトリウム 2g/L
第2試薬
Bis−Tris(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CET 6kU/L
POD 120kU/L
以下の組成からなるヘモグロビンA1c測定用キット(キットH)を調製した。
第1試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
塩化カルシウム二水和物 10mmol/L
硝酸ナトリウム 100mmol/L
1−ドデシルピリジニウム クロライド 1.4g/L
アクチナーゼE 340kU/L
DA−67 30μmol/L
ノニオンE230 0.01%
α−ケトグルタル酸 0.3g/L
第2試薬
Bis−Tris(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CET 6kU/L
POD 120kU/L
以下の組成からなるヘモグロビンA1c測定用キット(キットI)を調製した。
第1試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
塩化カルシウム二水和物 10mmol/L
硝酸ナトリウム 100mmol/L
1−ドデシルピリジニウム クロライド 1.4g/L
アクチナーゼE 340kU/L
DA−67 30μmol/L
ノニオンE230 0.01%
オキサロ酢酸 0.3g/L
第2試薬
Bis−Tris(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CET 6kU/L
POD 120kU/L
以下の組成からなるヘモグロビンA1c測定用キット(キットe)を調製した。
第1試薬
MES(pH6.5) 50mmol/L
塩化カルシウム二水和物 10mmol/L
硝酸ナトリウム 100mmol/L
1−ドデシルピリジニウム クロライド 1.4g/L
アクチナーゼE 340kU/L
DA−67 30μmol/L
ノニオンE230 0.01%
第2試薬
Bis−Tris(pH7.0) 50mmol/L
FPOX−CET 6kU/L
POD 120kU/L
ヘモグロビンA1c濃度が3.2,4.0,4.9,5.6,6.5,7.6,9.7μmol/Lである各血球、及び、生理食塩水(ヘモグロビンA1c濃度:0μmol/L)を検体として用いた。
キットGの代わりに、上記(2)で調製したα−ケトグルタル酸を含有するキットHを用いる以外は(5)と同様の方法により、キットHにおける各検体の反応吸光度(ΔEH)を算出した。キットHにおける各検体の反応吸光度(EH)及びキットeにおける各検体の反応吸光度(Ee)を図2に示す。
キットGの代わりに、上記(3)で調製したオキサロ酢酸を含有するキットIを用いる以外は(5)と同様の方法により、キットIにおける各検体の反応吸光度(ΔEI)を算出した。キットIにおける各検体の反応吸光度(EI)及びキットeにおける各検体の反応吸光度(Ee)を図3に示す。
Claims (13)
- α−ケト酸が添加された水溶液に検体を添加し、α−ケト酸を含有する水溶液中で、検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素をα−ケト酸存在下にロイコ型色原体を用いて測定することを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定方法。
- 検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素をロイコ型色原体と反応させる、検体中の測定対象成分の測定方法において、α−ケト酸が添加された水溶液に検体を添加し、α−ケト酸を含有する水溶液中で、検体中の測定対象成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素とロイコ型色原体との反応をα−ケト酸存在下に行うことを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定方法における過酸化物の影響抑制方法。
- α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である請求項1又は2記載の方法。
- ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- フェノチアジン誘導体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである請求項4記載の方法。
- 過酸化水素生成試薬、α−ケト酸、過酸化活性物質及びロイコ型色原体を含有することを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定用試薬。
- α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である請求項6記載の試薬。
- ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である請求項6又は7記載の試薬。
- フェノチアジン誘導体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである請求項8記載の試薬。
- 第1試薬及び第2試薬を含む、検体中の測定対象成分の測定用キットであって、ロイコ型色原体と過酸化活性物質がそれぞれ、第1試薬及び第2試薬の別々の試薬に含まれ、過酸化水素生成試薬及びα−ケト酸がそれぞれ、第1試薬及び第2試薬の一方又は両方に含まれることを特徴とするキット。
- ロイコ型色原体が、フェノチアジン誘導体である請求項10記載のキット。
- フェノチアジン誘導体が、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンである請求項11記載のキット。
- α−ケト酸が、ピルビン酸、α−ケトグルタル酸及びオキサロ酢酸からなる群より選ばれるα−ケト酸である請求項10〜12のいずれかに記載のキット。
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