CN101097200A - 5'-核苷酸酶诊断试剂盒及5'-核苷酸酶活性浓度测定方法 - Google Patents
5'-核苷酸酶诊断试剂盒及5'-核苷酸酶活性浓度测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的5’-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒可以是干粉状态，在使用前溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、α-酮戊二酸、还原型辅酶、腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)、过氧化物酶(peroxidase EC 1.11.1.7)、还原型色原体组合、稳定剂及抗干扰剂，这些成分可以配成单剂试剂盒、双剂试剂盒或三剂试剂盒；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400－700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出5'－核苷酸酶活性浓度的大小。与现有技术相比，本发明不仅便于推广应用，而且由于所生成的染料均有较高的摩尔消光系数，因此灵敏度高、精确度好。
Description
技术领域
本发明涉及一种5’-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术
医学研究表明，5’-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5’-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5’-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。
5’-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法为：5’-核苷酸酶作用于H3-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结果，求得5’-核苷酸酶活性。或者利用5’-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5’-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的5’-核苷酸酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行5’-核苷酸酶活性浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明5’-核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下：
腺苷单磷酸+水
5’-核苷酸酶 腺苷+单磷酸盐
腺苷+水
腺苷脱氨酶 肌苷+氨离子
氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶
谷氨酸脱氢酶 谷氨酸
+辅酶+水
谷氨酸+水+氧
谷氨酸氧化酶 氨离子+α-酮戊二酸+
过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合
过氧化物酶 吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
这种方法应用腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)将腺苷酶解产生氨。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)使氨不断地被重复循环利用，并同时不断地循环扩增产出过氧化氢。
过氧化物酶将过氧化氢与还原型色原体组合作用，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)，含量高低的光吸收大小，通过测量400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的速度，得出5’-核苷酸酶活性浓度大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明5’-核苷酸酶诊断试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
腺苷脱氨酶 5000U/L
谷氨酸脱氢酶 100000U/L
谷氨酸氧化酶 8000U/L
α-酮戊二酸 16mmol/L
过氧化物酶 30000 U/L
还原型色原体组合A 6mmol/L
抗干扰剂 30mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任一个组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
本发明的5’-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：缓冲液、稳定剂、α-酮戊二酸、还原型辅酶、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、抗干扰剂。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、α-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、抗干扰剂。
试剂2
缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶、谷氨酸氧化酶。
α-酮戊二酸、还原型辅酶、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、α-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、抗干扰剂。
试剂3
缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶、谷氨酸氧化酶。
α-酮戊二酸、还原型辅酶、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的5’-核苷酸酶诊断试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
腺苷脱氨酶 8000U/L
谷氨酸脱氢酶 150000U/L
谷氨酸氧化酶 8000U/L
α-酮戊二酸 16mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
4-氨基抗砒 2mmol/L
石碳酸 10mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出5’-核苷酸酶活性的浓度大小。
实施例二
本实施例的5’-核苷酸酶诊断试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
谷氨酸脱氢酶 120000U/L
α-酮戊二酸 16mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
腺苷脱氨酶 4000U/L
谷氨酸氧化酶 8000U/L
4-氨基抗砒 0.6mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出5’-核苷酸酶活性的浓度大小。
实施例三5’-核苷酸酶诊断试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
还原型辅酶 0.25mmol/L
谷氨酸脱氢酶 100000U/L
α-酮戊二酸 16mmol/L
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
过氧化物酶 40000U/L
双甲基苯胺 2mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
腺苷脱氨酶 5000U/L
谷氨酸氧化酶 8000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出5’-核苷酸酶活性的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好。
Claims (7)
1.一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的5’-核苷酸酶活性浓度测定方法，其方法原理如下：
腺苷单磷酸+水
5’-核苷酸酶 腺苷+单磷酸盐
腺苷+水
腺苷脱氨酶 肌苷+氨离子
氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶
谷氨酸脱氢酶 谷氨酸
+辅酶+水
谷氨酸+水+氧
谷氨酸氧化酶 氨离子+α-酮戊二酸+
过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合
过氧化物酶 吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出5’-核苷酸酶活性浓度大小测定结果。
腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)作为作用酶，功能为产生氨。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作为循环酶，将氨不断地被重复循环利用，并同时不断地扩增产生过氧化氢。
过氧化物酶作为显色酶，将过氧化氢与还原型色原体组合作用发生显色反应。
2.一种5’-核苷酸酶诊断试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 1-50mmol/L
还原型辅酶 0.1-0.35mmol/L
腺苷脱氨酶 2000-50000U/L
谷氨酸脱氢酶 2000-500000U/L
谷氨酸氧化酶 2000-500000U/L
α-酮戊二酸 2-20mmol/L
过氧化物酶 500-500000U/L
还原型色原体组合 0.1-20mmol/L
抗干扰剂 1-50mmol/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；
也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述5’-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、α-酮戊二酸、还原型辅酶、腺苷脱氨酶(AdenosineDeiminase EC 3.5.4.4)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidaseEC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)、过氧化物酶(EC 1.11.1.7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述5’-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、α-酮戊二酸、还原型辅酶、腺苷脱氨酶(AdenosineDeiminase EC 3.5.4.4)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidaseEC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)、过氧化物酶(EC 1.11.1.7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、α-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及抗干扰剂组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶、谷氨酸氧化酶及抗干扰剂组成。α-酮戊二酸、还原型辅酶、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述5’-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、α-酮戊二酸、还原型辅酶、腺苷脱氨酶(Adenosine Deiminase EC 3.5.4.4)、谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)、过氧化物酶(EC1.11.1.7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、α-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合及抗干扰剂组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、腺苷脱氨酶、谷氨酸氧化酶组成。α-酮戊二酸、还原型辅酶、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶及抗干扰剂在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述5’-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
7.根据权利要求2所述5’-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |