CN108548782A - 5’-核苷酸酶活性的检测方法及反应动力学定量探测仪 - Google Patents

5’-核苷酸酶活性的检测方法及反应动力学定量探测仪 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种5’‑核苷酸酶活性的检测方法及反应动力学定量探测仪，该探测仪包括：激发光源，用于发射激发光；设有测试样品池和对照样品池的测试转盘，测试转盘连接电机，电机连接控制器；控制器分别连接电机和激发光源，用于控制激发光源发射激发光；分光片设置在激发光源的光路上，用于将激发光源发射的光分光到聚焦镜上，聚焦镜设置在分光片的分光光路上，用于对经过分光片的光进行聚焦，聚焦后的光照射到测试样品池或对照样品池；连接控制器的光电倍增管，用于采集样品受激后的发射光，并转换成电信号再发送给数据处理系统，数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度。本发明能够方便快捷的检测5’‑核苷酸酶活性。

Description

5’-核苷酸酶活性的检测方法及反应动力学定量探测仪
技术领域
本申请涉及一种检测方法，具体涉及5’-核苷酸酶活性的检测方法及反应动力学定量探测仪。
背景技术
5’-核苷酸酶能够催化AMP(单磷酸腺苷)转变成腺苷(Ade)，其活性直接影响转化速率，也间接决定了对生命体内能量分子之一的AMP直接测量的效率。
现在还没有一种能够方便快捷的检测5’-核苷酸酶活性的方法。
发明内容
由于现实需要，期望提供一种能够方便快捷的5’-核苷酸酶活性的检测方法。
本发明还提供一种用于检测5’-核苷酸酶活性的反应动力学定量探测仪。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种反应动力学定量探测仪，包括：
激发光源，用于发射激发光；
测试转盘，所述测试转盘上设有测试样品池和对照样品池，所述测试转盘通过转轴连接电机，所述电机能够带动所述测试转盘转动和定位，所述电机通过导线连接控制器；
控制器，通过导线分别连接电机和激发光源，用于控制激发光源发射激发光，用于控制电机的转轴转动和定位；
分光片和聚焦镜，所述分光片设置在所述激发光源的光路上，所述聚焦镜设置在所述分光片的分光光路上，所述分光片用于将所述激发光源发射的光分光到所述聚焦镜上，所述聚焦镜用于对经过所述分光片的光进行聚焦，聚焦后的光照射到测试样品池或对照样品池；
光电倍增管，通过导线连接所述控制器，用于采集测试样品池或对照样品池中的样品受激后的发射光，将所述发射光转换成电信号并发送给所述控制器的数据处理系统，所述控制器的数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度。
所述电机还连接有码盘和码盘计数器，用于测试样品池或对照样品池的定位，所述码盘计数器通过导线连接所述控制器。
所述测试样品池和对照样品池对称设置在所述测试转盘的中心轴线的两侧，所述测试样品池和对照样品池位于所述测试转盘的同一条轴线上。
进一步地，还包括第一滤光片，所述第一滤光片设置在所述激发光源与所述分光片之间。
进一步地，还包括第二滤光片，所述第二滤光片设置在所述光电倍增管与所述分光片之间。
所述激发光源发射的激发光为540nm；所述测试样品池或对照样品池的发射光为590nm。
本发明还提供一种使用上述的反应动力学定量探测仪检测5’-核苷酸酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)将AMP单磷酸腺苷、ADA腺苷脱氨酶、PNP嘌呤核苷磷酸化酶、XO黄嘌呤氧化酶、ADHP10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪和HRP辣根过氧化物酶混合，得混合物，所述混合物中各组分的浓度相同；
(2)将所述混合物分成相同的两份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池。在对照样品池再加入BBS缓冲液30uL；
(3)在测试样品池中则加入5’-NT，样品池会发生酶促反应：
根据上述反应可知：AMP通过上述级联反应以1:1化学计量生成试卤灵，试卤灵的浓度对应AMP的浓度；
其中Ade为腺苷，Ino为肌苷，Hyp为次黄嘌呤，Resorufin为试卤灵；VAde表示Ade转换成Ino的速率，VIno表示Ino转换成Hyp的速率，VHyp表示Hyp转换成H2O2的速率，和VH2O2表示H2O2转换成Resorufin的速率；K+表示AMP结合5’-NT的速率，k--表示AMP与5’-NT的解离速率，kcat表示5’-NT催化成Ade的速率；
(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的样品浓度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的样品浓度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；
(5)针对不同标准浓度试卤灵Resorufin，测得每个浓度对应的试卤灵荧光强度FResorufin,进而生成校准曲线；
(6)制作米氏曲线：
根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α：
在线性区间:[Resorufin]＝αFResorufin
[Resorufin]表示Resorufin的浓度；FResorufin为对应的[Resorufin]测得的荧光强度；
根据级联反应的总体速率为所述的荧光强度时间曲线在起始点的导数：
V′AMP为AMP脱磷酸根的反应速率，t为级联反应时间，fAMP为不同[AMP]时测得的级联反应产生的荧光强度随时间的变化；
则AMP脱磷酸根反应的速率：
其中，VH2O2，VHyp，VIno和VAde的测量方法如下：
在样品池中注入下列等体积(70uL)样品：
对照样品池0：5’-NT(5uM/10uL)+ADA(5uM/10uL)+PNP(5uM/10uL)+XO(5uM/10uL)+ADHP(5uM/10uL)+HRP(5uM/10uL)+BBS(5uM/10uL)；
测试样品池1：H2O2(50nM,10uL)+5’-NT(5nM/10uL)+ADA(5nM/10uL)+PNP(5nM/10uL)+XO(5nM/10uL)+ADHP(5nM/10uL)+HRP(5nM/10uL)；
测试样品池1反应方程：
则：
其中，而V(i)表示直接从样品池(i)测得的反应速率，fwell(i)和fwell(0)分别代表测试样品池(i)和对照样品池(0)的实时590nm荧光强度(i＝1,…,5)。
测试样品池2：Hyp(100nM,10uL)+5’-NT(5nM/10uL)+ADA(5nM/10uL)+PNP(5nM/10uL)+XO(5nM/10uL)+ADHP(5nM/10uL)+HRP(5nM/10uL)；
测试样品池2反应方程：
测试样品池3：Ino(150nM,10uL)+5’-NT(5nM/10uL)+ADA(5nM/10uL)+PNP(5nM/10uL)+XO(5nM/10uL)+ADHP(5nM/10uL)+HRP(5nM/10uL)；
测试样品池3反应方程：
测试样品池4：Ade(200nM,10uL)+5’-NT(5nM/10uL)+ADA(5nM/10uL)+PNP(5nM/10uL)+XO(5nM/10uL)+ADHP(5nM/10uL)+HRP(5nM/10uL),
测试样品池4反应方程：
(7)判断5’-NT活性：
根据米氏公式：
其中，Vmax表示最大速率，KM表示米氏常数。
拟合所得的Vmax即是衡量5’-NT活性的参数。
所述试卤灵的选择浓度分别为1、5、10、50、100、200、300和400nM。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
采用本发明的检测方法能够方便快捷的检测5’-核苷酸酶活性。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例提供的反应动力学定量探测仪的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的测试转盘的结构示意图；
图3是本发明实施例提供的荧光强度的时间曲线图；
图4是本发明实施例提供的校准曲线图；
图5是本发明实施例提供的衡量5’-核苷酸酶活性的AMP反应米氏曲线；
图6是本发明实施例提供的另一组荧光强度的时间曲线图。
图中：1激发光源，2测试转盘，3测试样品池，4对照样品池，5转轴，6电机，7导线，8控制器，9分光片，10聚焦镜，11光电倍增管，12码盘，13码盘计数器，14第一激发光滤光片，15第二激发光滤光片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
参见图1和图2，一种用于检测5’-核苷酸酶活性的反应动力学定量探测仪，包括：
激发光源1，用于发射540nm的激发光；
测试转盘2，测试转盘2上设有测试样品池3和对照样品池4，测试转盘2通过转轴5连接电机6，电机6能够带动测试转盘2转动，电机6通过导线7连接控制器8；
控制器8，通过导线7分别连接电机6和激发光源1，用于控制激发光源1发射激发光，用于控制电机6的转轴5转动和定位；
分光片9和聚焦镜10，分光片9设置在激发光源1的光路上，聚焦镜10设置在分光片9的分光光路上，分光片9用于将激发光源1发射的光分光到聚焦镜10上，聚焦镜19用于对经过分光片9的光进行聚焦，聚焦后的光照射到测试样品池3或对照样品池4；
光电倍增管11，通过导线7连接控制器8，用于采集测试样品池3或对照样品池4的590nm的发射光，将所述发射光转换成电信号并发送给控制器8的数据处理系统，控制器8的数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度。
进一步地，电机6还连接有码盘12和码盘计数器13，用于测试样品池或对照样品池的定位，码盘计数器13通过导线7连接控制器8。
参见图2，进一步地，测试样品池3和对照样品池4对称设置在测试转盘2的中心轴线的两侧，测试样品池3和对照样品池4位于测试转盘2的同一条轴线上。
进一步地，还包括第一激发光滤光片14，第一激发光滤光片14设置在激发光源1与分光片9之间。
进一步地，还包括第二激发光滤光片15，第二激发光滤光片15设置在光电倍增管11与分光片9之间。
本发明的反应动力学荧光探测仪，开启电机，电机转动同步带动测试转盘转动，通过码盘定位测试样品池和对照样品池，并同时由控制器读取数据，再对数据做动力学处理，最终将测试结果输出。
本发明的检测原理：
试卤灵(Resorufin)是稳定的光敏测试剂，在540nm激发下会发射590nm荧光，且其发射的荧光强度与自身浓度存在良好的线性关系。双氧水(H2O2)与10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(ADHP)以1:1化学计量(可以是浓度比)在辣根过氧化物酶(HRP)的催化下生成试卤灵；次黄嘌呤(Hyp:hypoxanthine)在黄嘌呤氧化酶(XO:xanthine oxidase)的作用下也以1:1的化学计量氧化成尿酸(Uric acid)和双氧水；肌苷(Ino:inosine)在嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，purine nucleoside phosphorylase)的作用下以1:1的化学计量磷酸化成次黄嘌呤；腺苷(Ade:adenosine)在腺苷脱氨酶(ADA，adenosine deaminase)的作用下也以1:1的化学计量生成肌苷；而单磷酸腺苷(AMP)在5’-核苷酸酶(5’-NT:5’-nucleotidase)的作用下也是以1:1的化学计量生成腺苷。因此AMP可以通过上述级联反应以1:1化学计量生成试卤灵，实时探测试卤灵浓度的变化也就间接测量了AMP脱磷酸根反应的动力学，且稳态时试卤灵的浓度就是AMP的浓度(假设5’-NT,ADA,PNP,XO,HRP和ADHP都过饱和)。测得的反应动力学常数可以被用来衡量5’-核苷酸酶(5’-NT)的活性。
基于上述的原理，本发明使用反应动力学定量探测仪检测5’-核苷酸酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)将AMP单磷酸腺苷、BBS缓冲液、ADA腺苷脱氨酶、PNP嘌呤核苷磷酸化酶、XO黄嘌呤氧化酶、ADHP10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪和HRP辣根过氧化物酶混合，得混合物，所述混合物中各组分的浓度相同；
BBS按照以下配比配置:130mM NaCl，5mM KCl，1.5mM CaCl2，1mM MgSO4，5mM葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白；pH＝7.4。
(2)将所述混合物分成相同的两份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；
(3)在测试样品池中再加入5’-NT，样品池会发生酶促反应：
根据上述反应可知：AMP通过上述级联反应以1:1化学计量生成试卤灵，试卤灵的浓度等同于AMP的浓度；
其中Ade为腺苷，Ino为肌苷，Hyp为次黄嘌呤，Resorufin为试卤灵；VAde表示Ade转换成Ino的速率，VIno表示Ino转换成Hyp的速率，VHyp表示Hyp转换成H2O2的速率，和VH2O2表示H2O2转换成Resorufin的速率；K+表示AMP结合5’-NT的速率，k--表示AMP与5’-NT的解离速率，kcat表示5’-NT催化成Ade的速率；
(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的样品浓度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的样品浓度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；
如图3所示，控制面板显示两条荧光强度(f)的时间曲线，曲线fAMP代表检测样品池荧光强度与时间曲线，曲线fcontrol(control对照)代表对照样品池荧光强度与时间曲线。对样品池起始点的荧光强度时间曲线求导，可以间接获得反应的初始速率VAMP；稳态时样品池与对照池的荧光强度差(FResorufin＝fResorufin-fControl)直接反应了产物Resorufin的浓度。
(5)生成标准曲线：
按照以下定义：
FAMP≡[fAMP-fControl]t→∞；
FAMP为[AMP]对应的荧光强度，fAMP表示有样品池的实时荧光强度，而fcontrol表示对照池的实时荧光强度。
此定义表示AMP脱磷酸根后生成Ade的量化指标。针对不同标准浓度[Resorufin]试卤灵Resorufin，试卤灵浓度选择分别为1、5、10、50、100、200、300和400nM。测得每个浓度对应的试卤灵荧光强度FResorufin,进而生成如图4所示的校准曲线；
图4为荧光强度与产物Resorufin浓度之间的标准曲线。8个标准浓度[Resorufin]分别为1、5、10、50、100、200、300和400nM，针对每个标准浓度各做9个独立实验，进行平均后每个浓度对应一个点，得到如图4所示的统计结果(点)。整个浓度区间均呈线性，拟合结果表明试卤灵的浓度：[Resorufin]＝0.07FResorufin。
(6)制作米氏曲线：
根据所得到的如图4所示的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α5：
在线性区间:
[AMP]＝αFAMP
[AMP]表示AMP的浓度；FAMP为[AMP]对应的稳态时的荧光强度；
根据级联反应的总体速率为图3所示的荧光强度时间曲线在起始点的导数：
V′AMP为AMP脱磷酸根反应速率，t为荧光反应时间，fAMP为[AMP]对应的实时荧光强度；
则AMP脱磷酸根反应的速率：
其中，VH2O2，VHyp，VIno和VAde的测量方法如下：
在样品池中注入下列等体积(70uL)样品：
对照样品池0：5’-NT(5uM/10uL)+ADA(5uM/10uL)+PNP(5uM/10uL)+XO(5uM/10uL)+ADHP(5uM/10uL)+HRP(5uM/10uL)+BBS(5uM/10uL)；
测试样品池1：H2O2(50nM,10uL)+5’-NT(5nM/10uL)+ADA(5nM/10uL)+PNP(5nM/10uL)+XO(5nM/10uL)+ADHP(5nM/10uL)+HRP(5nM/10uL)；
测试样品池1反应方程：
则：
其中，而V(i)表示直接从样品池(i)测得的反应速率，fwell(i)和fwell(0)分别代表测试样品池(i)和对照样品池(0)的实时590nm荧光强度(i＝1,…,5)。
测试样品池2：Hyp(100nM,10uL)+5’-NT(5nM/10uL)+ADA(5nM/10uL)+PNP(5nM/10uL)+XO(5nM/10uL)+ADHP(5nM/10uL)+HRP(5nM/10uL)；
测试样品池2反应方程：
测试样品池3：Ino(150nM,10uL)+5’-NT(5nM/10uL)+ADA(5nM/10uL)+PNP(5nM/10uL)+XO(5nM/10uL)+ADHP(5nM/10uL)+HRP(5nM/10uL)；
测试样品池3反应方程：
测试样品池4：Ade(200nM,10uL)+5’-NT(5nM/10uL)+ADA(5nM/10uL)+PNP(5nM/10uL)+XO(5nM/10uL)+ADHP(5nM/10uL)+HRP(5nM/10uL),
测试样品池4反应方程：
开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的样品浓度和对照样品池中的样品浓度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线如图6所示；
如图6所示，控制面板显示4条荧光强度(f)的时间曲线，曲线(0)代表对照样品池的荧光强度与时间曲线；曲线(1)代表测试样品池1的荧光强度与时间曲线；曲线(2)代表测试样品池2的荧光强度与时间曲线；曲线(3)代表测试样品池3的荧光强度与时间曲线；曲线(4)代表测试样品池4的荧光强度与时间曲线；对测试样品池起始点的荧光强度时间曲线求导，可以间接获得相应的反应的初始速率VH2O2，VHyp，VIno和VAde。
根据以上测得的速率分别为：
V(1)＝0.05s-1,V(2)＝0.02s-1,V(3)＝0.01s-1,V(4)＝0.006s-1。
对应各级的催化反应速率:
VH2O2＝V(1)/0.05uM＝1.0s-1uM-1；
VHyp＝[V(2)-1-V(1)-1]-1/0.1uM＝0.33s-1uM-1；
VIno＝[V(3)-1-V(2)-1]-1/0.15uM＝0.13s-1uM-1,
VAde＝[V(4)-1-V(3)-1]-1/0.2uM＝0.075s-1uM-1。
不同AMP浓度([AMP]：1、5、10、50、100、200、300和400nM)下测得各个VAMP，得到衡量5’-NT活性如图5所示的米氏曲线；
(7)判断5’-NT活性：
根据米氏公式：
其中，Vmax表示最大速率。KM表示米氏常数。
8个标准浓度[AMP]分别为1、5、10、50、100、200、300和400nM，针对每个标准浓度各做9个独立实验，进行平均后每个浓度对应一个点，得到如图5所示的统计结果(点)。整个浓度区间呈米氏关系，拟合结果表明：KM＝50nM，Vmax＝800nM/s。
拟合所得的Vmax即是衡量5’-NT活性的参数。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (9)

1.一种反应动力学定量探测仪，其特征在于，包括：
激发光源，用于发射激发光；
测试转盘，所述测试转盘上设有测试样品池和对照样品池，所述测试转盘通过转轴连接电机，所述电机能够带动所述测试转盘转动和定位，所述电机通过导线连接控制器；
控制器，通过导线分别连接电机和激发光源，用于控制激发光源发射激发光，用于控制电机的转轴转动和定位；
分光片和聚焦镜，所述分光片设置在所述激发光源的光路上，所述聚焦镜设置在所述分光片的分光光路上，所述分光片用于将所述激发光源发射的光分光到所述聚焦镜上，所述聚焦镜用于对经过所述分光片的光进行聚焦，聚焦后的光照射到测试样品池或对照样品池；
光电倍增管，通过导线连接所述控制器，用于采集测试样品池或对照样品池中的样品受激后的发射光，将所述发射光转换成电信号并发送给所述控制器的数据处理系统，所述控制器的数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度。
2.根据权利要求1所述的反应动力学定量探测仪，其特征在于，所述电机还连接码盘和码盘计数器，用于测试样品池或对照样品池的定位，所述码盘计数器通过导线连接所述控制器。
3.根据权利要求2所述的反应动力学定量探测仪，其特征在于，所述测试样品池和对照样品池对称设置在所述测试转盘的中心轴线的两侧，所述测试样品池和对照样品池位于所述测试转盘的同一条轴线上。
4.根据权利要求1-3任一项所述的反应动力学定量探测仪，其特征在于，还包括第一滤光片，所述第一滤光片设置在所述激发光源与所述分光片之间。
5.根据权利要求4所述的反应动力学定量探测仪，其特征在于，还包括第二滤光片，所述第二滤光片设置在所述光电倍增管与所述分光片之间。
6.根据权利要求4所述的反应动力学定量探测仪，其特征在于，所述激发光源发射的激发光为540nm；所述测试样品池或对照样品池的发射光为590nm。
7.一种使用权利要求1-6任一项所述的反应动力学定量探测仪检测5’-核苷酸酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将AMP单磷酸腺苷、ADA腺苷脱氨酶、PNP嘌呤核苷磷酸化酶、XO黄嘌呤氧化酶、ADHP10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪和HRP辣根过氧化物酶混合，得混合物，所述混合物中各组分的浓度相同；
(2)将所述混合物分成相同的两份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；在对照样品池再加入BBS缓冲液30uL；
(3)在测试样品池中则加入5’-NT，样品池会发生酶促反应：
根据上述反应可知：AMP通过上述级联反应以1:1化学计量生成试卤灵，试卤灵的浓度对应AMP的浓度；
其中Ade为腺苷，Ino为肌苷，Hyp为次黄嘌呤，Resorufin为试卤灵；VAde表示Ade转换成Ino的速率，VIno表示Ino转换成Hyp的速率，VHyp表示Hyp转换成H2O2的速率，和VH2O2表示H2O2转换成Resorufin的速率；K+表示AMP结合5’-NT的速率，k--表示AMP与5’-NT的解离速率，kcat表示5’-NT催化成Ade的速率；
(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的样品浓度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的样品浓度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；
(5)针对不同标准浓度试卤灵Resorufin，测得每个浓度对应的试卤灵荧光强度FResorufin,进而生成校准曲线；
(6)制作米氏曲线：
根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α：
在线性区间:[Resorufin]＝αFResorufin
[Resorufin]表示Resorufin的浓度；FResorufin为对应的[Resorufin]测得的荧光强度；
根据级联反应的总体速率为所述的荧光强度时间曲线在起始点的导数：
V′AMP为AMP脱磷酸根的反应速率，t为级联反应时间，fAMP为不同[AMP]时测得的级联反应产生的荧光强度随时间的变化；
则AMP脱磷酸根反应的速率：
其中，VH2O2，VHyp，VIno和VAde的测量方法如下：
在样品池中注入下列等体积(70uL)样品：
对照样品池0：5’-NT5uM/10uL、ADA5uM/10uL、PNP5uM/10uL、XO5uM/10uL、ADHP5uM/10uL、HRP5uM/10uL和BBS5uM/10uL；
测试样品池1：H2O250nM,10uL、5’-NT5nM/10uL、ADA5nM/10uL、PNP5nM/10uL、XO5nM/10uL、ADHP5nM/10uL和HRP5nM/10uL；
测试样品池1反应方程：
则：
其中，而V(i)表示直接从样品池(i)测得的反应速率，fwelli和fwell0分别代表测试样品池i和对照样品池0的实时590nm荧光强度i＝1、2、3、4或5；
测试样品池2：Hyp100nM,10uL、5’-NT5nM/10uL、ADA5nM/10uL、PNP5nM/10uL、XO5nM/10uL、ADHP5nM/10uL和HRP5nM/10uL；
测试样品池2反应方程：
测试样品池3：Ino150nM,10uL、5’-NT5nM/10uL、ADA5nM/10uL、PNP5nM/10uL、XO5nM/10uL、ADHP5nM/10uL和HRP5nM/10uL；
测试样品池3反应方程：
测试样品池4：Ade200nM,10uL、5’-NT5nM/10uL、ADA5nM/10uL、PNP5nM/10uL、XO5nM/10uL、ADHP5nM/10uL和HRP5nM/10uL,
测试样品池4反应方程：
(7)判断5’-NT活性：
根据米氏公式：
其中，Vmax表示最大速率，KM表示米氏常数；
拟合所得的Vmax即是衡量5’-NT活性的参数。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述试卤灵的选择浓度分别为1、5、10、50、100、200、300和400nM。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述BBS缓冲液按照以下配比配置:130mM NaCl，5mM KCl，1.5mM CaCl2，1mM MgSO4，5mM葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白；pH＝7.4。
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