CN108535232B - Atp硫酸化酶活性的检测方法 - Google Patents

Atp硫酸化酶活性的检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，包括以下步骤：(1)先将不同浓度焦磷酸分别和腺苷5’三磷酸、荧光素/荧光素酶混合，得到混合物；(2)将混合物分成两等份后分别加入测试样品池和对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入ATP硫酸化酶；(4)开启探测仪，检测测试样品池中的产物ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度和对照样品池中的荧光强度，得到荧光强度时间曲线；(5)针对不同标准浓度的PPi，测得对应的FPPi，生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：(7)根据米氏公式，拟合所得的Vmax即是衡量ATP硫酸化酶活性参数；(8)判断ATP硫酸化酶活性。采用本发明的检测方法能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性。

Description

ATP硫酸化酶活性的检测方法
技术领域
本申请涉及一种检测方法，具体涉及ATP硫酸化酶活性的检测方法。
背景技术
ATP硫酸化酶能够将焦磷酸(PPi)与腺苷5’三磷酸(APS)耦合并催化成三磷酸腺苷(ATP)，其活性直接影响催化速率及检测灵敏度。而PPi是生命体内重要的能量代谢分子，对其的快速实时定量检测能间接探测生命体的能量代谢过程，尤其是主要代谢路径的识别。
现在还没有一种能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性的方法。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性的方法。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，包括以下步骤：
(1)先将不同浓度焦磷酸PPi分别和腺苷5’三磷酸APS、荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合，得到不同浓度PPi的混合物；
(2)将每个PPi浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；
(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入三磷酸腺苷ATP硫酸化酶，则测试样品池发生酶促反应：
Figure BDA0001632947390000011
根据上述反应可知：PPi通过上述反应以1:1化学计量生成ATP，终态ATP的浓度等同于初态PPi的浓度；
其中ATP sulfurylase表示三磷酸腺苷硫酸化酶，k+表示ATP sulfurylase同时与PPi和APS的结合速率；k--表示ATP sulfurylase与PPi和APS完全解离的速率；kcat表示ATPsulfurylase对PPi的催化速率；
(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的产物ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；
(5)针对不同标准浓度PPi的混合物，测得每个浓度对应的PPi荧光强度FPPi，进而生成校准曲线；
(6)制作米氏曲线：
根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α9：
在线性区间:
[ATP]＝α9FATP，
[ATP]表示ATP的浓度；FATP为与[ATP]对应的稳态时测试样品池荧光强度减去对照样品池的荧光强度；
所述荧光强度时间曲线在起始点的导数即可换算成该PPi浓度对应的反应速率：
Figure BDA0001632947390000021
t为检测时间，fATP为[ATP]对应的实时荧光强度；
基于终态ATP的浓度等同于初态PPi的浓度，不同浓度PPi存在对应的反应速率，以PPi浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出PPi浓度所述对应的VPPi，连接这些点，制作得到米氏曲线；
(7)求出Vmax：
根据米氏公式：
Figure BDA0001632947390000022
其中，[PPi]表示PPi的浓度，Vmax表示最大速率，KM表示米氏常数；
拟合所得的Vmax即是衡量ATP硫酸化酶的活性参数。
所述混合物中：
所述PPi选用的标准浓度分别为1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、200nM、300nM和400nM，体积均为30uL。
所述ATP硫酸化酶加入量为30uL，浓度为1nM。
所述缓冲液加入量为30uL；
缓冲液BBS按照以下配比配置:130mM NaCl，5mM KCl，1.5mM CaCl2，1mM MgSO4，5mM葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白；pH＝7.4。
所述luciferin/luciferase的体积为10uL。
所述APS的浓度为1nM，体积为30uL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
采用本发明的检测方法能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例提供的反应动力学定量探测仪的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的测试转盘的结构示意图；
图3是本发明实施例提供的样品池和对照池荧光强度的时间曲线图；
图4是本发明实施例提供的校准曲线图；
图5是本发明实施例提供的米氏曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
本发明的检测原理：
ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)能催化PPi与腺苷5’三磷酸(APS)合成ATP。而ATP浓度可以由luciferin/luciferase的方法经荧光强度定量。测量ATP浓度的变化也就直接测量了该反应的动力学，且稳态时ATP的浓度就是初态PPi浓度(假设APS过饱和)。因此测得的反应动力学常数可以被用来衡量ATP硫酸化酶的活性。
参见图1和图2，一种反应动力学定量探测仪，包括：
测试转盘1，测试转盘1上设有测试样品池2和对照样品池3，测试转盘1通过转轴4连接电机5，电机5能够带动测试转盘1转动和定位；
控制器6，通过导线7连接电机5，用于控制电机5的转轴4转动和定位；
光电倍增管8，通过导线7连接控制器6，用于采集测试样品池2或对照样品池3中的样品自发光的化学荧光，将所述化学荧光转换成电信号并发送给控制器6的数据处理系统，控制器6的数据处理系统根据接收的电信号分析测试样品或对照样品的检测浓度。
优选地，电机5还连接有码盘9和码盘计数器10，用于测试样品池2或对照样品池3的定位，码盘计数器10通过导线7连接控制器6。
优选地，测试样品池2和对照样品池3对称设置在测试转盘1的中心轴线的两侧，测试样品池2和对照样品池3位于测试转盘1的同一条轴线上。
本发明还提供一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，包括以下步骤：
(1)先将不同浓度1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、200nM、300nM和400nM[PPi]焦磷酸30uL分别和饱和浓度1nM腺苷5’三磷酸APS30uL、荧光素luciferin/荧光素酶luciferase10uL混合，得到多个混合物；
(2)将同一PPi浓度混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；
(3)在对照样品池中再注入缓冲液30uL，在测试样品池中注入1nM ATP硫酸化酶30uL，则测试样品池发生酶促反应：
Figure BDA0001632947390000051
根据上述反应可知：PPi通过上述反应以1:1化学计量生成ATP，终态ATP的浓度等同于初态PPi的浓度；
其中ATP sulfurylase表示三磷酸腺苷硫酸化酶，k+表示ATP sulfurylase同时与PPi和APS的结合速率；k--表示ATP sulfurylase与PPi和APS完全解离的速率；kcat表示ATPsulfurylase对PPi的催化速率；缓冲液BBS按照以下配比配置:130mM NaCl，5mM KCl，1.5mMCaCl2，1mM MgSO4，5mM葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白；pH＝7.4。
(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的产物三磷酸腺苷(ATP)与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；
如图3所示，控制面板显示两条荧光强度(f)的时间曲线，曲线fADP代表检测样品池实时荧光强度与时间曲线，曲线fControl代表对照样品池实时荧光强度与时间曲线；对样品池起始点的荧光强度时间曲线求导，可以间接获得反应的初始速率VPPi；稳态时样品池与对照池的荧光强度差(FATP＝fATP-fControl)直接反应了产物ATP的浓度。
(5)针对不同标准浓度PPi的混合物，测得每个浓度对应的PPi荧光强度FPPi，进而生成如图4所示的校准曲线；其中
FAMP≡[fAMP-fControl]t→∞；
图4为荧光强度与产物ATP浓度之间的标准曲线。8个标准浓度[ATP]分别为1、5、10、50、100、200、300和400nM，针对每个标准浓度各做9个独立实验，进行平均后每个浓度对应一个点，得到如图4所示的统计结果(点)。整个浓度区间均呈线性，拟合结果表明：[ATP]＝0.063FATP。
(6)制作米氏曲线：
根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α9：
在线性区间:
[ATP]＝α9FATP，
[ATP]表示ATP的浓度；FATP为[ATP]对应的稳态时测试样品池荧光强度减去对照样品池的荧光强度；
如图3所示的荧光强度时间曲线在起始点的导数即可换算成该PPi浓度对应的反应速率：
VATP反应速率是如图3所示的荧光强度时间曲线在起始点的导数：
Figure BDA0001632947390000061
t为检测时间，fATP为[ATP]对应的实时荧光强度；
基于终态ATP的浓度等同于初态PPi的浓度，不同浓度PPi存在对应的反应速率，以浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出PPi浓度所述对应的VPPi，连接这些点，制作得到如图5所示米氏曲线；
(7)求出Vmax：
根据米氏公式：
Figure BDA0001632947390000062
Vmax为:最大速率，KM为:米氏常数；
8个标准浓度[PPi]分别为1、5、10、50、100、200、300和400nM，针对每个标准浓度各做9个独立实验，得到的实验数据进行平均后每个浓度对应一个点，得到如图5所示的统计结果(点)。整个浓度区间呈米氏关系，拟合结果表明：KM＝49nM，Vmax＝1028nM/s。
拟合所得的Vmax即是衡量ATP硫酸化酶的活性参数。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (5)

1.一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)先将不同浓度焦磷酸PPi分别和腺苷-5’-三磷酸APS、荧光素luciferin、荧光素酶luciferase混合，得到不同浓度PPi的混合物；所述不同浓度焦磷酸PPi分别为1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、200nM、300nM和400nM的PPi，体积均为30uL；
(2)将每个PPi浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；
(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入三磷酸腺苷ATP硫酸化酶，测试样品池发生酶促反应：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
根据上述反应可知：PPi通过上述反应以1:1化学计量生成ATP，终态ATP的浓度等同于初态PPi的浓度；
其中ATP sulfurylase表示三磷酸腺苷硫酸化酶，k+表示ATP sulfurylase同时与PPi和APS的结合速率；k_表示ATP sulfurylase与PPi和APS完全解离的速率；kcat表示ATPsulfurylase对PPi的催化速率；
(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的产物ATP与荧光素、荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池的荧光强度-时间曲线fATP和对照样品池的荧光强度-时间曲线fControl；
(5)针对不同浓度PPi的混合物，测得每个浓度对应的ATP荧光强度FATP，其中FATP≡[fATP-fControl]t→∞，其中t为检测时间，即FATP为与ATP浓度对应的稳态时测试样品池的荧光强度减去对照样品池的荧光强度，进而生成FATP-ATP浓度校准曲线；
(6)制作米氏曲线：
根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α9：
在线性区间:
[ATP]＝α9FATP，
[ATP]表示ATP的浓度；
通过以下公式将测试样品池的荧光强度-时间曲线在起始点的导数换算成该PPi浓度对应的反应速率：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
t为检测时间；
以PPi浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出PPi浓度所对应的反应速率，连接这些点，制作得到米氏曲线；
(7)求出Vmax：
根据米氏公式：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
其中，VPPi表示上述反应速率，[PPi]表示PPi的浓度，Vmax表示最大速率，KM表示米氏常数；
拟合所得的Vmax即是衡量ATP硫酸化酶活性的参数。
2.根据权利要求1所述的ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，所述ATP硫酸化酶加入量为30uL，浓度为1nM。
3.根据权利要求1所述的ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，所述缓冲液加入量为30uL；
缓冲液按照以下配比配置:130mM NaCl，5mM KCl，1.5mM CaCl2，1mM MgSO4，5mM葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白；pH＝7.4。
4.根据权利要求1-3任一项所述的ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，所述荧光素和荧光素酶的总体积为10uL。
5.根据权利要求1-3任一项所述的ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，所述APS的浓度为1nM，体积为30uL。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1804602A (zh) * 2005-12-15 2006-07-19 卢麟麟 表面清洁程度及微生物污染快速检测方法和装置

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