CN1804602A - 表面清洁程度及微生物污染快速检测方法和装置 - Google Patents

表面清洁程度及微生物污染快速检测方法和装置 Download PDF

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Abstract

一种用于表面清洁程度及微生物污染的快速检测方法和装置。通过高度集成的试剂和装置，可以使复杂的操作在一个操作步骤内完成并可在一分钟内得到检测结果。利用ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)在腺苷酰硫酸(adenosine－5’－phosphosulfate APS)存在的情况下可以催化焦磷酸(PPi)生成三磷酸腺苷(ATP)，使水解成焦磷酸的ATP得到还原，克服了微生物在营养条件不好水解自身ATP照成ATP荧光法检测结果不准确的问题。同时通过添加萤火虫虫荧光素酶稳定剂来简化保藏条件，添加三磷酸腺苷酶抑制剂提高检测精度及灵敏度。

Description

表面清洁程度及微生物污染快速检测方法和装置
技术领域：
本发明涉及一种试剂组及装置，尤其涉及一种对表面清洁程度及微生物污染进行快速检测的试剂组及利用试剂组进行检测的装置，同时本发明也可以被应用于消毒后的操作界面、食品生产企业的流水线和液体污染检测，属于生物化学及生物发光领域。
背景技术：
食品卫生认证体系—危害因子关键控制点(HACCP)正被引入世界范围的食品行业。许多国家，如欧盟各成员国已将其列为法定措施。目的是，让可能影响食品安全的关键因素都列入监测范围，并采用快速方法进行卫生检测以便留有时间采取改进措施。我国卫生部也曾颁发“食品企业实施HACCP体系”的指南[卫法监发(2000年)174号]。HACCP是Hazard Analysis Critical ControlPoint(危险因素分析关键控制点)的英文缩写，也是发达国家普遍采用对食品、饮料企业的生产设备的细菌及食品残渣(细菌滋生条件)污染程度进行产前监控的认证体系。随着我国人民生活水平的提高，人们的健康卫生意识逐渐提高，尤其是食品安全是当前深受政府和人民普遍关注的问题。食品卫生的不规范，给人们的生活和健康带来了极大的危害。此后，卫生部从2004年5月1日实施的“食品企业卫生规范”中对蜜饯、乳制品、饮料、熟肉制品及定型包装饮用水五类企业的环境卫生、厂房设施卫生、人员卫生及清洁消毒、污水管理提出了明确要求。
如何实施HACCP体系，在开始新一批次生产前，或清洁消毒后，生产设施食品接触表面的卫生程度就属关键控制点。以前，是通过目测观察有无食品残渣，和细菌学检测评估卫生状况。目测尽管很快，但多数情况下灵敏度不够，而细菌学检测方法，在取得结果前要经过3-7天的样品培育，完全不能适应HACCP的要求。因此，ATP法就成了既能提供实时结果，又有足够灵敏度的主要检测手段。检测总体ATP，即不区分其ATP来自食物残渣，还是来自微生物细胞。多数情况下，微生物ATP只占总体ATP的小部分。食品残渣既是微生物生长的培养基，又起抵消灭菌的作用。因此，要避免重新污染，如由空气途径引起的污染，就必须去除食品残渣。ATP检测的主要优点，在起早期的警示作用，告诉你表面清洁度较差的部位将有细菌滋生。即使是无菌的表面，ATP值高表明有食物残渣，在明天早上开始生产前就会有大量的细菌生长。统计结果显示，如果，用ATP法检测卫生水平得到改善，那么，用常规培养法也同样显示得到改善的结果。
鉴于ATP存在于所有生物体中，所以通过检测ATP，就可以间接地证明生物体的存在和表面清洁程度。20世纪80年代，英国人首先研制出ATP检测仪(检测系统)，随后发展到欧洲、美国和日本。应用范围涉及食品加工、超市和饮食行业，检测内容包括微生物和食品残渣。1998年，日本国会颁布了《关于食品制造过程管理高度化临时措施法》，其中即包含了应用ATP检测仪(检测系统)的内容。1999年，日本还成立了ATP涂抹检查研究会，专门研究该方法的使用效率和应用领域，其内容之一就是在食品卫生监测领域中，解决现场微生物的检测问题。20世纪末，一些ATP检测仪(检测系统)及技术被引进我国，到目前为止，除个别省级卫生监督检测单位装备外，主要是在一些外资或合资企业中自行检测使用。由于国内目前还缺少能与HACCP认证体系配套，对食品污染的微生物总量进行准确、快速检测的科技手段，致使已经颁布的“规范”“标准”或认证体系难以发挥应有的效果。因此，制成操作简单、易于保存、集成程度高、灵敏度高的表面清洁程度及微生物污染快速检测方法、试剂及装置，是解决我国进行快速卫生监测以满足各行业微生物标准检测以达到卫生规范要求的重要技术保障。
萤火虫的发光是由于其体内能产生称作萤火虫荧光素酶的特殊蛋白质，它是一种以ATP(三磷酸腺苷)为必需底物，能将化学能转变成光能的生物催化剂，它能将有效的存在于所有生物(人、动植物、微生物)细胞中的能量物质ATP以及荧光素转变成荧光，反应式如下：
Figure A20051013425600061
其中：ATP：三磷酸腺苷；Beetle Luciferin：虫荧光素；O2：氧气；Mg++：二价镁离子；Firefly Luciferase：萤火虫虫光素酶；AMP：一磷酸腺苷；Oxyluciferin：氧化荧光素；PPi：焦磷酸；CO2：二氧化碳。
但是由于微生物处于自然的状态和环境中，往往得不到足够的营养或在一定的状态下无法有效利用食品或一些表面上的营养物质，这就必然照成细菌会消耗掉自身的ATP来维持自身的生存(ATP水解反应或是其它的酶促反应都会大量消耗ATP)，直到外界营养变得丰富或外界营养变得能被细菌或微生物充分利用。这就照成很多的时候实际测量微生物或一些界面的表面得到的ATP经萤火虫虫荧光素酶催化发出的荧光值非常低，但是用传统的平皿计数法却得到了一个较高的污染值。
所以这就要求我们要把损失的ATP通过一些方法还原回去，才能更准确的通过ATP荧光法计算出表面清洁程度和微生物污染情况。ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)在腺苷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfate APS)存在的情况下可以催化焦磷酸(PPi)生成ATP，这样就可以使水解成焦磷酸(PPi)的ATP得到了补偿，极大的提高了灵敏度，使一些原本处于休眠或活力很低的微生物也能够被检测出来。而以往这个反应只是被应用到基因测序的工作上，但是应用在表面清洁程度和微生物污染检测上也可得到很好的效果。
发明内容：
1、发明目的：本发明提供了可通过一步操作在十几秒至一分种内便可以检测出表面清洁程度及微生物污染的快速检测试剂组及其检测装置，其目的是解决传统的“活细胞平皿计数法”对食品污染的微生物总量是否超标检测的速度慢、效率低，和已有的ATP荧光法细菌及表面清洁程度快速检测试剂组操作繁琐且不易在较高温度下保存的弊病。本发明更使用了ATP硫酸化酶在腺苷酰硫酸存在的情况下可以催化焦磷酸(PPi)生成ATP，使损失的ATP得到了补偿，从而极大的提高了灵敏度。同时本发明也是一种能与HACCP认证体系配套，对食品污染的微生物总量进行准确、快速检测的试剂组及装置。
2、技术方案：本发明是通过以下技术方案来实现的：
表面清洁程度及微生物污染快速检测试剂(QuickTest)以下简称(QT)，整个试剂系统是一个高度集成的试剂系统主要包括五部分：
(1).细菌及其它微生物的三磷酸腺苷提取释放系统
(2).将焦磷酸(PPi)还原回ATP的反应体系
(3).三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制剂
(4).三磷酸腺苷被萤火虫荧光素酶催化发光的反应体统
(5).使萤火虫荧光素酶及整个反应系统在4℃可长期稳定保存的缓冲体系一体化试剂组分及各组分浓度及质量比为：
萤火虫荧光素酶     0.1μg/ml-15mg/ml
D-虫荧光素         0.03mM-2.0mM
Triton X-100       0.1％-10％
Tween-20           0.001％-0.3％
缓冲液             0.005％-0.5％
牛血清白蛋白(BSA)  0.2mg/ml-5mg/ml
DTT                0.1mM-10mM
甘油               0.5％-20％
寡霉素(oligomycin) 0.005mM-2.5mM
辅酶A(CoA)         0.005mM-1.5mM
ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)  2×10-8U/ml-8×10-5U/ml
腺苷酰硫酸(APS)    0.002mM-1.0mM
缓冲液主要组分和浓度及质量比如下：
Tricine(三甲基甘氨酸)或Tris     1mM-50mM
硫酸镁或醋酸镁或氯化镁中的一种  0.5mM-100mM
EDTA(乙二胺四乙酸)或CDTA(环乙烷二胺四醋酸)0.1mM-20mM
用NaOH  调整pH值为7.8
各体系构成及作用机理如下：
a.细菌及其它微生物的三磷酸腺苷释放提取系统由Triton X-100构成，也可以替换成其它非离子去污剂Triton X-114，Triton X-305，TritonN101，同样可取得令人满意的效果，在多种阳离子、阴离子和非离子去污剂中，只有Triton系列的非离子去污剂才能与萤火虫荧光素酶共存与一个试剂系统中。
b.三磷酸腺苷催化发光系统由萤火虫荧光素酶、D-虫荧光素、辅酶A及缓冲液构成。辅酶A可以使萤火虫荧光素酶催化发光的效率大大提高，提高瞬时的发光值，有助于提高整个发光发应的灵敏度。
c.使萤火虫荧光素酶及整个反应系统在4℃可稳定保存至少7个月的缓冲体系由牛血清白蛋白、DTT、甘油。牛血清白蛋白、DTT在合适的浓度下可以对萤火虫荧光素酶的催化活性有促进作用，但是超过一定的浓度将对酶的催化活性产生抑制作用。甘油作为稳定剂对酶和整个体系在4℃下储存有关键性的作用，当甘油的量低于一个浓度的时候将起不到一个保护性的作用，但当甘油的浓度过高又将抑制酶的活性照成检测的灵敏度下降。
d.三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制剂。由于任何生命体内除了含有ATP外还含有可以分解ATP释放能量的三磷酸腺苷酶(ATPase)，在提取剂释放出ATP的同时也释放出了三磷酸腺苷酶，而且三磷酸腺苷酶对ATP的特异性作用不亚萤火虫荧光素酶，在几秒钟内便可把微生物内释放和食物残渣钟的ATP分解，照成萤火虫荧光素酶催化发应受到严重影响，所以必须在释放ATP的同时使三磷酸腺苷酶受到抑制甚至灭活。本发明所采用的三磷酸腺苷酶抑制剂为寡霉素(oligomycin)和EDTA共同作用。
e.ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)在腺苷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfate APS)存在的情况下可以催化焦磷酸(PPi)生成ATP，这样便能使菌体和ATP发光有一个真正可靠的对应关系。由于ATP经过萤火虫荧光素酶的催化发光也会产生PPi，所以应保证加入的ATP硫酸化酶不应高于10-7U/ml。
f.本检测装置为笔形由透明材料制成的发光反应仓，带有无ATP棉签的样品采集棒，上端试剂储存仓三部分组成。透明的发光反应仓采用玻璃或合成材料构成，合成材料为透明的聚丙烯(PP)或透明的聚苯乙烯(PS)，合成材料更便于批量生产及质量的控制。
3、优点及效果：通过本发明技术方案的实施，能够很好地解决传统的“活细胞平皿计数法”对食品污染的微生物总量进行检测的速度慢、效率低的问题。现有的ATP荧光检测法都没有成功解决的虫光素酶及虫荧光素构成的发光体系无法在非冷冻条件下长时间保存，且裂解剂和三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制剂无法和整个发光体系共存在一个体系的问题，而本发明都能够很好的解决。同时通过使用ATP硫酸化酶把PPi转化为ATP的方法就可以不用考虑由于菌体所处的生长时期不同造成ATP含量的不同而影响ATP荧光法测量的准确性。同时本发明的检测装置在无ATP棉签把手上设计了一个特殊的试剂仓，可以配合不同特性的试剂完成一些较为复杂的检测，像细菌的含量的测定，也可以有选择性的测定某种细菌的含量等。
附图的简要说明：
附图1详细的示意了笔型一步操作快速表面清洁程度及微生物污染装置的剖面图
附图2带有特殊的试剂仓的无ATP棉签中带螺纹、密封橡胶垫及十字型刺针的活塞3局部放大图
图1中整个装置由带有特殊的试剂仓的无ATP棉签2；内有铝箔膜和十字型撞针的管状连接装置5；装有表面清洁程度及微生物污染快速检测试剂(QuickTest)的透明发光反应仓10构成。
1为带有防滑条纹的旋转把手，通过旋转把手1可以使带有密封橡胶垫的活塞3向下压缩带动连在3上的十字型刺针16向下运动，刺破底端的铝箔膜封口14。随着活塞3的旋转下降可使十字型刺针16在铝箔膜封口14形成圆洞，便可使特殊用途的试剂15由于活塞3下降形成的压力而顺着圆洞留下，流入中空的硬质导管中6，沿着硬质导管中6流到硬质导管的先端的多开口处7便与附着在7上的无ATP棉签13上的检测样品先发生反应。
特殊用途的试剂15与无ATP棉签13上的检测样品的反应液被铝箔膜8截住，用力下压带有防滑条纹的旋转把手1顶端使带有特殊的试剂仓的无ATP棉签2刺破铝箔膜8，使带有特殊的试剂仓的无ATP棉签2继续向下使十字型刺针12脱离支架9刺破铝箔膜8，这样才能使原本在上层铝箔膜8上的特殊用途的试剂15与无ATP棉签13上的检测样品的反应液通过两层铝箔膜进入透明发光反应仓10，与里面的表面清洁程度及微生物污染快速检测试剂(QuickTest)11接触发生反应放出荧光。
4为可以使带有特殊的试剂仓的无ATP棉签2与内有铝箔膜和十字型撞针的管状连接装置5相对固定的小突起，可以和带有特殊的试剂仓的无ATP棉签2外壁上的凹槽相互吻合，这样才能旋转带有防滑条纹的旋转把手1使带有密封橡胶垫的活塞3向下运动。17为与螺纹18互相咬合的螺纹槽。
图2中3为带有密封橡胶垫的活塞，1为带有防滑条纹的旋转把手，18为与17互相咬合的螺纹，19为带有密封橡胶垫的活塞3下端的密封橡胶垫，16为十字型刺针。
具体实施方式：
在实施本发明时，把无ATP的棉签用无ATP的0.05％Tween20或含有10mM PBS和含有0.05％Tween20的混合溶液润湿，这样有助于把被检测物体表面的微生物及食物残渣很完全的擦拭下来。然后把棉签在被检测的表面适当大小的区域进行涂抹或擦拭，然后将棉签插入笔式的检测仓中，并用力下压棉签把手，使棉签刺破下面的铝箔复合膜，使之与下面的表面清洁程度及微生物污染快速检测试剂(QT)接触，并进行振荡使之充分混合。这时QT试剂中的裂解提取系统将裂解微生物细胞并释放出来的ATP，同时三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制剂将抑制微生物体内释放出的三磷酸腺苷酶的活性，ATP硫酸化酶催化腺苷酰硫酸(APS)和焦磷酸(PPi)反应使水解的ATP进行还原，之后含有萤火虫虫光素酶的发光体系将催化ATP荧光反应发出荧光。这时通过荧光检测仪测定从该笔式检测装置下端的透明发光仓发出的荧光量，便可推值实际样品的表面清洁程度及微生物污染情况。如有特殊要求就可以利用检测装置上的特殊的试剂仓中的试剂对检测样品先进行处理再利用以上方法检测。
通过以上操作便可以实现对食品企业生产线界面或原材料表面清洁程度及微生物污染进行快速评估。首先要对食品企业生产线界面或原材料标准化处理，然后运用国家标准方法《GB/T 4789.2-2003食品卫生微生物学检验菌落总数测定》对处理的效果进行检验，如果这种标准化处理的结果符合国家卫生标准，便把这个处理后的食品企业生产线界面或原材料表面利用本发明测得一个发光值，则这个发光值就是一个标准值，当发光值低于或近似等于此值的时候都是卫生条件符合标准，当发光值大于这个标准值时则是视为卫生条件不合格。利用这种方法极大的缩短了检测时间、提高了检测效率，为切实贯彻和推行HACCP标准提供了一个有利的工具和技术保障。
表1 Triton X-100裂解剂的最佳浓度的选择
实验的细菌为等体积、等浓度的培养16小时的大肠杆菌。菌体经过10000rpm离心1分钟，用0.85％生理盐水洗涤两边并用0.85％的生理盐水悬垂起来。10μl菌液加入到100μl反应试剂中。
Triton X-100浓度 0.10％  0.50％  1.00％  5.00％  10.00％
裂解后的荧光值 1055324  3550092  4511847  2466156  792422
从表1可知，在实验的菌液和其它试剂组成部分不变的情况下，含有1.00％浓度Triton X-100的QuickTest试剂的荧光值是最高的，所以证明1.00％浓度Triton X-100对细菌具有最佳的裂解效果。
表2为添加三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制剂与不添加三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制剂在同等条件下的对比
实验的细菌为等体积、等浓度的培养16小时的大肠杆菌。菌体经过10000rpm离心1分钟，用0.85％生理盐水洗涤两边并用0.85％的生理盐水悬垂起来。10μl菌液加入到100μl反应试剂中。
                               发光量的测定值
未添加ATPase抑制剂 添加1倍浓度寡霉素 添加3倍浓度寡霉素 添加5倍浓度寡霉素
    4029310     5358982     6124551     7373673
由上表可见添加1倍浓度寡霉素整个发光值提高了33％，而添加3倍浓度寡霉素时整个发光值提高了52％，当寡霉素的浓度提高到5倍浓度时发光值提高了83％。所以添加三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制剂对整个发光反应的测定值有很大的影响，如要得到一个比较准确而又真实的发光值就要添加三磷酸腺苷酶抑制剂。
表3为使用ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)催化腺苷酰硫酸(APS)和焦磷酸(PPi)反应对水解的ATP进行还原与未进行还原的各种试样的发光值
    样品     检测到的发光值
使用ATP sulfurylase 未用ATP sulfurylase
新鲜牛乳     258     9
纯橙汁饮料     567     0
冻肉     2236     56
水洗后的刀具     1750     0
鲜啤酒     689     0
通过表4可知，在使用ATP sulfurylase使水解的ATP还原后，能得到一个较高的发光值这样就使一些处于休眠或由于环境不利而照成微生物ATP很低的情况也能被轻易的检测出来。而传统的ATP检测法却只能测得很低的值甚至是0，所以通过使水解ATP还原的方法能更可靠、更准确的检测出那些不易被传统ATP法检测到的污染。
表4 QuickTest试剂对不同种细菌及不同浓度测试得到的发光值及通过国家标准方法《GB/T 4789.2-2003食品卫生微生物学检验菌落总数测定》得到的对应菌数
菌体浓度  金黄色葡萄球菌  大肠杆菌  酵母菌  枯草杆菌
5μl 10-1  403878  144748  667252  223603
 约106个  约105个  约105个  约105个
5μl 10-2  75119  30451  80612  91302
 约105个  约104个  约104个  约104个
5μl 10-3  15843  8120  13801  14676
 约104个  约103个  约103个  约103个
5μl 10-4  9345  6835  7534  10453
 约103个  约102个  约102个  约102个
表5含有使萤火虫荧光素酶在4℃可长期稳定保存体系和未含该体系的表面清洁程度及微生物污染快速检测试剂荧光值对比
在4℃冰箱内保存的时间 加入甘油、DTT、BSA缓冲液的发光值(10- 7M/L ATP) 只加入DTT、BSA缓冲液的发光值(10-7M/LATP)
 30天 114323567  24659788
 60天 110812676  6125815
 90天 106437705  3562957
 120天 106916191  509681
 150天 104068007  135883
 180天 106771341  54361
 210天 103215568  19797

Claims (13)

1.一种利用ATP经催化发光可对表面清洁程度及微生物污染进行快速检测和评估的方法和装置，其特征在于，使样品的三磷酸腺苷提取释放和催化发光可以一步完成；同时解决了萤火虫荧光素酶高温下不稳定，可使非耐热性萤火虫荧光素酶在4℃保存七个月以上；同时可使ATP提取剂与荧光素酶共存于一个稳定的试剂系统；并利用可催化焦磷酸(PPi)生成ATP的试剂来提高检测的灵敏度和稳定性；同时在试剂系统中加入ATP酶抑制剂以抑制细菌内部ATP酶对发光值的影响。
2.权利要求1所述的方法，表面清洁程度及微生物污染快速检测试剂系统由以下五个部分组成：
(1).细菌及其它微生物的三磷酸腺苷提取释放系统；
(2).将焦磷酸(PPi)还原回ATP的反应体系；
(3).三磷酸腺苷酶(ATPase)抑制剂；
(4).三磷酸腺苷被萤火虫荧光素酶催化发光的反应体统；
(5).使萤火虫荧光素酶及整个反应系统在4℃可稳定长期保存的缓冲体系。
3.权利要求2所述的方法，可催化焦磷酸(PPi)生成ATP的试剂系统含有ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)和腺苷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfate APS)。
4.权利要求2所述的方法，使非耐热性萤火虫荧光素酶在4℃下长期保存试剂中应加入牛血清白蛋白、DTT、甘油的混合液，甘油的含量应该不高于20％。
5.权利要求2所述的方法，可与萤火虫荧光素酶共存于一个稳定的试剂系统的三磷酸腺苷释放提取系统由Triton X-100构成，也可以替换成其它非离子去污剂Triton X-114，Triton X-305，TritonN101。
6.权利要求2所述的方法，萤火虫荧光素酶催化ATP发光体系中应添加辅酶A，以得到一个较高的瞬时发光值来提高检测的灵敏度。
7.权利要求2所述的方法，试剂系统中加入的ATP酶抑制剂为寡霉素(oligomycin)和EDTA的混合物，且浓度不能影响萤火虫荧光素酶及虫荧光素催化ATP发光。
8.权利要求2所述的方法，试剂系统组成为：
萤火虫荧光素酶           0.1μg/ml-15mg/ml
D-虫荧光素               0.03mM-2.0mM
Triton X-100             0.1％-10％
Tween-20                 0.001％-0.3％
缓冲液                   0.005％-0.5％
牛血清白蛋白(BSA)        0.2mg/ml-5mg/ml
DTT(二硫苏糖醇)          0.1mM-10mM
甘油                     0.5％-20％
寡霉素(Oligomycin)       0.005mM-2.5mM
辅酶A(CoA)               0.005mM-1.5mM
ATP硫酸化酶              2×10-8U/ml-8×10-5U/ml
腺苷酰硫酸(APS)          0.002mM-1.0mM。
9.权利要求8所述的方法，缓冲液含有：
Tricine(三甲基甘氨酸)或Tris            1mM-50mM
硫酸镁或醋酸镁或氯化镁中的一种         0.5mM-100mM
乙二胺四乙酸或CDTA(环乙烷二胺四醋酸)   0.1mM-20mM
用NaOH调整pH值为7.8。
10.权利要求1所述的方法，取样方法采取无ATP的棉签在表面进行涂抹，或样品以液体形式滴加到棉签上。
11.权利要求10所述的方法，固体样品取样前无ATP的棉签用高纯度的水或含有10mM PBS和含有0.05％Tween20的混合溶液润湿。
12.权利要求1所述的方法，整个检测装置为笔型，上端无ATP棉签的把手含有一个试剂储存仓，下端含有一个可以盛放整个试剂系统的透明发光反应仓。
13.权利要求12所述的方法，无ATP棉签把手上的试剂储存仓采用螺旋方式加压释放试剂，并配以可刺破试剂储存仓封膜的十字型刺针。
14.权利要求12所述的方法，无ATP棉签把手上的试剂储存仓可以预置与下面发光发应仓内试剂配合使用的各种试剂。
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