CN103757089A

CN103757089A - 一种检测饮用水中卫生质量和gmp工厂表面卫生的atp生物发光试剂、方法及试剂盒

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Publication number: CN103757089A
Application number: CN201410013473.5A
Authority: CN
Inventors: 吴慧清; 吴清平; 李程思; 张菊梅; 郭伟鹏
Original assignee: Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd
Priority date: 2014-01-10
Filing date: 2014-01-10
Publication date: 2014-04-30

Abstract

本发明公开一种检测饮用水中卫生质量和GMP工厂表面卫生的ATP生物发光试剂、方法及试剂盒。本发明所述的ATP生物发光试剂，包括荧光素酶、D-荧光素、去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，所述的荧光素酶必须经过纯化，纯化的荧光素酶的活力本底比达到50～3000，其使得ATP生物发光试剂的发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10^-7/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5～7.5，将荧光素酶、D-荧光素、去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统混合后冷冻得到冻干粉。本发明采用高灵敏度稳定发光的ATP生物发光试剂对饮用水卫生质量及GMP工厂表面卫生进行快速检测，在半小时内可以完成取样与快速检测。

Description

一种检测饮用水中卫生质量和GMP工厂表面卫生的ATP生物发光试剂、方法及试剂盒

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测饮用水中卫生质量和GMP工厂表面卫生的ATP生物发光试剂、方法及试剂盒。

背景技术：

水是生命之源，水的安全涉及到千家万户，关系到每一个人的生命健康。饮水安全包括理化和微生物两个方面因素，并且这两个因素在某些方面相互影响。在现行的饮用水国标中，其中细菌总数是必检项目，即使因为饮用水中消毒副产物问题实施的矿泉水国家标准细菌总数不作为强制检测项目，但新增了3个致病菌的检测，而且矿泉水生产厂家在生产过程中饮用水企业实行HACCP质量管理体系，快速检测技术的应用是非常必要的。国家饮用水标准GB/T5750112-2006中菌落总数为必检项目，定义为在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1ml水样中的细菌数。饮用水所含菌落的总数（倾注法倒平板），按该方法规定所得结果只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温需氧细菌菌落总数。ATP生物发光技术是一种以ATP的生物发光反应为基础的快速检测技术，不需要培养过程，极大地缩短了微生物数量检测时间，可以根据检测结果直接改善工作，为卫生监督进行现场应急处理提供快捷可靠的依据，可广泛应用于HACCP和GMP的关键环节监测。实施GMP卫生标准的工厂，其微生物数量和表面卫生清洁度检测是质控体系中需要监控的重要指标。在食品加工企业建立了卫生标准操作程序之后，还必须设定监控程序，实施检查、记录和纠正措施。样品中的细菌总数和表面卫生清洁度的检测是许多监控指标中的两个代表性指标，指示卫生微生物污染程度和清洁消毒的有效性。食品工厂的表面样品是指与食品接触的表面，例如加工设备、工器具、包装材料、加工人员的工作服、手套等等。这些与食品接触的表面的清洁度直接影响食品的安全与卫生，也是验证清洁消毒的效果的标准。检测项目为细菌总数、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌。GMP工厂的卫生指标的干净标准为经过消毒的设备和工器具以食品接触面总数低于100个/cm²为宜，对于卫生要求更严格的工序，应低于10个/cm²，沙门氏菌及金黄色葡萄球菌等致病菌不得检出，GMP工厂工人手的合格指标为低于30个/cm²。

另外作为最简单有效的表面卫生传统的检测方法，接触皿法被广泛用于检测生产区域细菌和酵母霉菌的表面污染情况，需要一个培养过程，达不到在线检测的要求。生物发光方法通过测量表面总的ATP含量来判断表面是否干净清洁，是非常灵敏的卫生学检测方法。一个干净的表面需要无菌，但是如果被任何生物材料污染（指示有ATP的存在），它为微生物的快速繁殖提供了基础，这种污染源可以很容易被ATP检测方法检测到，但是传统的微生物学方法往往不能做到。自1970年代以来，Shape与其合作者应用ATP生物发光法在食品中检测微生物的数量，ATP生物发光法用于评价细菌污染的研究日益增加，一些商业的ATP生物发光系统作为一种卫生检测仪已经成功地用于HACCP体系的原位控制，然而最大多数的商业试剂盒中去除非细胞ATP干扰的试剂是昂贵的，操作也比较复杂，因此限制了它们在食品工业的应用。一般的ATP生物发光技术的检测灵敏度在10^4-5个细菌细胞/mL，与有效的表面卫生及消毒效果的评价指标有一定的差距。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能够快速、有效地检测饮用水中卫生质量和GMP工厂表面卫生的ATP生物发光试剂、方法及试剂盒。

本发明采用高灵敏度稳定发光的ATP生物发光试剂对饮用水卫生质量及GMP工厂表面卫生进行快速检测，在半小时内可以完成取样与快速检测。

本发明所述的检测饮用水中卫生质量和GMP工厂表面卫生的ATP生物发光试剂，其特征在于，包括荧光素酶、D-荧光素、去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，所述的荧光素酶必须经过纯化，具体制备方法为：取天然萤火虫虫尾，通过添加酶提取液研磨、离心和硫酸铵沉淀得到粗酶制剂；再通过复溶、透析、超滤、离心和阳离子交换法进行纯化，纯化过程中的NTE缓冲液是经过去ATP处理的，进一步经一次分子排阻层析或亲和层析和二次分子排阻层析，即得到纯化的荧光素酶，其使得ATP生物发光试剂的发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10^-7mol/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5～7.5；所述的D-荧光素的纯度为99%以上（Area%，HPLC），其在ATP生物发光试剂中的终浓度为20～150μg/mL；所述的去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统含10～100mg/L海藻糖、5～100mg/L PEG、0～2.0mol/L蔗糖、0.1～2.0mol/L甘氨酸、0～2.0mol/L DMSO、0～1mmol/L焦磷酸（ppi）、25mmol/L甘氨酰甘氨酸、1.0mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT，pH7.2～7.8。

本发明中荧光素酶的制备方法参考发明专利ZL200610034384.4，唯一不同之处是纯化过程中的NTE缓冲液是经过去ATP处理的，所得到的纯化的荧光素酶的活力本底比达到50～3000。

所述的去ATP无菌处理，具体为每25mL被处理试剂添加10μL10u/mL三磷酸腺苷双磷酸酶，25～30℃室温处理5min，经121℃，15min灭菌。

本发明的ATP生物发光试剂是通过以下方法制备的：将荧光素酶、D-荧光素和去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统按上述要求混合后冻干，得到冻干粉即为ATP生物发光试剂。

冻干粉形式的ATP生物发光试剂有利于其活力保存和保证其产品质量。

所述的D-荧光素，其制备方法参考发明专利201110459845.3，具体为：通过去ATP充氮气的发光检测缓冲液含25mmol/L甘氨酰甘氨酸、1.0mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT、pH7.8配制成10mg/ml的浓缩样品后过0.22μm滤膜，再用同样的缓冲液稀释至1mg/ml即得到D-荧光素。D-荧光素的纯度为99%以上（Area%,HPLC）。

一种检测饮用水中卫生质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：首先复配ATP生物发光试剂：ATP生物发光试剂添加去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，使ATP生物发光试剂的发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10^-7/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5～7.5；然后通过真空抽滤将待检水样过0.45μm或0.22μm滤膜，弃废液，再加2.5ml无菌超纯水洗脱滤膜上的微生物，得到浓缩了100倍的样品，测量时，每取0.1ml浓缩样品，加入0.1mlATP提取剂EC，振匀后室温下作用1.5～2.5min，再加入0.1mlGDB发光测试缓冲液，振匀后加入0.1ml复配后的ATP生物发光试剂，立即置于ATP生物发光检测仪进行发光检测，同时检测无菌水作为对照的空白样品发光值，样品发光值减去空白发光值后取对数，通过发光曲线计算待测水样中的细菌总数，细菌总数TBC=N×（505×10^{（A+BLogRLU）}）/3×10^-16（个/升），N=稀释倍数，A，B为ATP生物发光试剂的标准ATP发光曲线测试后，ATP浓度和净相对发光值取双对数后获得的线性回归的发光方程的系数。每批ATP生物发光试剂或使用时间较长时须进行发光曲线的测量，同时计算ATP生物发光试剂的发光回归方程系数和相关性，以确认ATP发光试剂的有效性。

所述的真空抽滤，优选使用三头或多头不锈钢真空抽滤系统，该系统配套一个带缓冲容器的真空泵及可以取下和用酒精点火灭菌的不锈钢三头或多头真空抽滤支架，该系统购自广东环凯生物技术有限公司。

上述检测饮用水中卫生质量的方法，能检出大于10cells/mL中温菌的水样，此方法得出的活菌总数相比平板培养法在数量级上是准确的，能够快速检测饮用水中的中温菌的含量。

一种检测GMP工厂表面卫生的方法，其特征在于，包括以下步骤:

（1）、取样：通过无菌棉签浸润擦拭缓冲液，10×10cm²可重复使用的不锈钢丝材质取样框对待测表面取样并在原来含擦拭缓冲液的离心管或试管中洗下表面物，得到表面样品液；

（2）、去除非细胞ATP：每取0.5ml表面样品液加入带0.22μm滤膜过滤柱的2.0ml纯化滤膜柱，10000r/min，离心30S，弃废液，再加入0.2ml无菌超纯水，10000r/min，离心30S，弃废液，即去掉表面样品中的非细胞ATP；

（3）、滤膜上微生物细胞ATP抽提及发光测试：首先复配ATP生物发光试剂：ATP生物发光试剂添加去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，使ATP生物发光试剂的发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10^-7/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5～7.5；然后将带0.22μm滤膜的滤膜柱换至2.0ml无菌的离心管中，在滤膜柱中直接加0.1mlATP提取试剂EC振匀后室温下作用1.5～2.5min（同一批测试包括空白样均需一致），加入0.1mlGDB发光测试缓冲液，10000r/min，离心30S，再加入0.1ml无菌超纯水后，再次将滤膜柱上的ATP等试剂洗下，去掉滤膜柱，加入0.1ml复配后的ATP生物发光试剂置于ATP生物发光检测仪测试样品发光值，同时进行空白样品的发光测试；

（4）、细菌总数的计算：表面样品发光值减去空白样品发光值后通过发光曲线计算表面样品的细菌总数，细菌总数TBC=N×（505×10^{（A+BLogRLU）}）/3×10^-16（个/升），N=稀释倍数，A，B为ATP发光试剂的标准ATP发光曲线测试后，ATP浓度和净相对发光值取双对数后获得的线性回归的发光方程的系数。每批ATP发光试剂或使用时间较长时须进行发光曲线的测量，同时计算ATP发光试剂的发光回归方程系数和相关性，以确认ATP发光试剂的有效性。

（5）、评价：对低于空白样品发光值10³cfu/ml的表面样品，按GMP工厂的严格标准均可以判断为合格，高于空白样品的发光值的样品则直接通过发光曲线计算，和GMP标准比较即可判断是否合格。

所述的0.4ml发光系统，包括0.1ml10^-7mol/L标准ATP、0.1ml无菌超纯水、0.1mlGDB发光测试缓冲液和0.1ml荧光素酶。

所述的ATP生物发光检测仪，优选发光性能好、稳定性好、线性检测范围较宽、检测灵敏度以ATP计最高达到10^-18molATP的高性能的ATP生物发光检测仪。本发明使用的是广东环凯微生物科技有限公司研制的第二代高性能便携式ATP生物发光检测仪HKM（Ⅱ）ATP发光仪或美国Promega GLOMAX^TM20/20ATP发光检测仪。

一种检测饮用水中卫生质量的试剂盒，其特征在于，包括：ATP生物发光试剂，去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，GDB发光测试缓冲液，ATP提取剂EC，10^-7mol/L标准ATP，无菌去ATP的超纯水。

优选，检测饮用水中卫生质量的试剂盒中还包括0.45μm和0.22μm的无菌一次性滤膜。

一种检测GMP工厂表面卫生的试剂盒，其特征在于，包括：无菌去ATP的擦拭缓冲液，ATP生物发光试剂，去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，GDB发光测试缓冲液，ATP提取剂EC，10^-7mol/L标准ATP，无菌去ATP的超纯水。

优选，检测GMP工厂表面卫生的试剂盒中还包括2.0mL无菌透明离心管，10×10cm²可重复使用的不锈钢丝材质取样框，均匀度一致的长柄无菌棉拭，一次性无菌的带0.22μm滤膜过滤柱的2.0ml纯化滤膜柱。

所述的GDB发光测试缓冲液含有25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，α-环糊精CD的含量为0.1～2.0%，pH5.0～7.8；所述的ATP提取剂EC含有1～30g/L TritonX-100，0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵，0.1～3.0g/L二甲亚砜，0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸，0.01～0.1g/L硫酸镁；所述的无菌去ATP的擦拭缓冲液为用超纯水配制的0～2.0%TXP-10（酚醚磷酸酯TXP-10），经去ATP灭菌处理；所述的复配缓冲液为含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2；所述的去ATP处理，具体为每25mL被处理试剂添加10μL10u/mL三磷酸腺苷双磷酸酶，25～30℃室温处理5min。

使用美国Promega GLOMAX^TM20/20ATP发光检测仪进行本发明的ATP生物发光试剂的发光曲线的检测，本发明的ATP生物发光试剂（型号：HBB2000）的发光曲线如图1所示。ATP生物发光试剂：Log[ATP]=^A+BLogRLU，对于本发明的ATP生物发光试剂，A=-14.5771,B=1.0588,R=0.9963），10^-7～10^-12mol/L ATP,n=6；或：Log[ATP]=^A+BLogRLU,对于本发明的ATP生物发光试剂，A=-14.9482，B=1.1235Log，R=0.9937，10^-7～10^-13mol/L ATP,n=7。

由于不同类型的微生物中ATP含量水平不同，同一类型的微生物每个细胞中的ATP含量基本上是在一个数值上下波动，如细菌数与ATP含量对应关系为细菌细胞ATP含量：0.18×10-16～8.75×10^-16g（ATP）/cell,其平均值约3.0×10^-16g（ATP）/cell，因此样品中的细菌总数TBC可用下列方程计算：

细菌总数TBC=N×（505×10^A+BLogRLU）/3×10^-16（个/升），N=稀释倍数；或：TBC=N×（505×10^A+BLogRLU）/3×10^-16（个/升），N=稀释倍数，A，B为ATP发光试剂的标准ATP发光曲线测试后，ATP浓度和净相对发光值取双对数后获得的线性回归的发光方程的系数。本发明的ATP生物发光试剂的检测灵敏度可以提高到10^-13mol/L，发光方程系数A=-14.9482， B=1.1235Log，其相关性达到了R=0.9937，但在10^-7～10^-12mol/LATP范围内其发光曲线的线性最好。

本发明的ATP生物发光试剂在室温下1小时内其发光活力相对稳定，其线性检测限稳定在10^-12mol/LATP，高端发光活力在一小时的检测时间比较稳定。

本发明的ATP生物发光试剂在荧光素酶的制备方法及缓冲稳定系统上进行了改进，在室温30℃条件下，1小时内通过连续三次进行ATP发光曲线测试检验ATP生物发光试剂的稳定性，结果见表1。

表1.ATP生物发光试剂的稳定性测试结果

结果表明：在室温下1小时内均可以稳定荧光素酶的发光活力，其线性检测限稳定在10^-12mol/LATP，高端发光活力在一小时的检测时间比较稳定。

附图说明：

图1是本发明的ATP生物发光试剂在0.4mL发光体系中的标准ATP发光曲线，其中，横坐标为标准ATP浓度；HBB2000代表本发明的ATP生物发光试剂。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用的方法及技术如无特别说明均为常规的方法及技术。

实施例1：ATP生物发光试剂的制备

通过去ATP充氮气的发光检测缓冲液含25mmol/L甘氨酰甘氨酸、1.0mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT、pH7.8配制成10mg/ml的浓缩样品后过0.22μm滤膜，再用同样的缓冲液稀释至1mg/ml即得到D-荧光素。D-荧光素的纯度为99%以上（Area%，HPLC）。

荧光素酶必须经过纯化，制备方法参考发明专利ZL200610034384.4，唯一不同之处是纯化过程中的NTE缓冲液是经过去ATP处理的。具体制备方法为：取天然萤火虫虫尾，通过添加酶提取液研磨、离心和硫酸铵沉淀得到粗酶制剂；再通过复溶、透析、超滤、离心和阳离子交换法进行纯化，纯化过程中的NTE缓冲液是经过去ATP处理的，进一步经一次分子排阻层析或亲和层析和二次分子排阻层析，即得到纯化的荧光素酶，其使得ATP生物发光试剂的活力本底比达到50～3000，其发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10^-7mol/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5～7.5；D-荧光素的纯度为99%（Area%，HPLC），其在ATP生物发光试剂中的终浓度为20～150μg/mL；去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统含10mg/L海藻糖、5mg/L PEG、0.1～mol/L甘氨酸、25mmol/L甘氨酰甘氨酸、1.0mmol/L EDTA、1.0mmol/LDTT，pH7.2～7.8。

将荧光素酶、D-荧光素、去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统按照上述要求混合后冻干，得到冻干粉，即为ATP生物发光制剂。

实施例2：ATP生物发光试剂的制备

荧光素酶必须经过纯化，制备方法参考发明专利ZL200610034384.4，唯一不同之处是纯化过程中的NTE缓冲液是经过去ATP处理的。具体制备方法为：取天然萤火虫虫尾，通过添加酶提取液研磨、离心和硫酸铵沉淀得到粗酶制剂；再通过复溶、透析、超滤、离心和阳离子交换法进行纯化，纯化过程中的NTE缓冲液是经过去ATP处理的，进一步经一次分子排阻层析或亲和层析和二次分子排阻层析，即得到纯化的荧光素酶，其使得ATP生物发光试剂的活力本底比达到50～3000，其发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10^-7/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5～7.5；D-荧光素的纯度为99%（Area%，HPLC），其在ATP生物发光试剂中的终浓度为20～150μg/mL；所述的去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统含100mg/L海藻糖、100mg/L PEG、2.0mol/L蔗糖、2.0mol/L甘氨酸、2.0mol/L DMSO、1mmol/L焦磷酸（ppi）、25mmol/L甘氨酰甘氨酸、1.0mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT，pH7.2～7.8。

实施例3：人工样品中活菌数的ATP生物发光检测和平板培养法检测

本实施例采用实施例1制备的ATP生物发光试剂进行检测。

首先复配ATP生物发光试剂：ATP生物发光试剂添加去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，使ATP生物发光试剂的发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10^-7/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5～7.5。

通过用营养肉汤（NB）37℃培养大肠杆菌80991d后，10000r/min离心2分钟得到菌泥，再用无菌超纯水稀释，通过ATP生物发光检测法检测样品中活菌总数，同时以NA培养基进行平板培养方法比对检测，检测结果见表2。

液体样品活菌总数的ATP生物发光检测方法：取2×1ml大肠杆菌8099菌液人工菌悬液经无菌水10倍稀释至10^-8，取0.1ml人工菌悬液样品加0.1ml ATP提取剂EC，振匀后室温（25～30℃）下作用1.5～2.5min，再加入0.1mlGDB发光测试缓液，振匀后加入0.1ml ATP生物发光试剂，立即置于美国Promega GLOMAX^TM20/20ATP发光检测仪上进行发光法测试，同时测试无菌水作为对照的空白样品发光值，样品发光值减去空白对照发光值后取对数，查发光曲线，计算细菌总数，细菌总数TBC=N×（505×10^A+BLogRLU）/3×10^-16（个/升），N=稀释倍数，A，B为ATP发光试剂的标准ATP发光曲线测试后，ATP浓度和净相对发光值取双对数后获得的线性回归的发光方程的系数。结果如表2所示。

表2.人工样品悬液中ATP生物发光测试与平板培养结果

结果表明，除了SE-0的6.9×10⁸的高端和SE-7小于1.39×10³的低端外，通过本发明的ATP生物发光试剂进行人工样品悬液的ATP生物发光测试结果平板培养检测结果的对应性非常好，其检测线性范围为3.10×10⁸～1.39×10³cells/ml，测灵敏度达到10³cells/ml，此数值在数量级上与平板培养法是对应的，因此通过改进ATP发光试剂的性能可以将直接ATP发光法的细菌检测下限降至10³cells/ml。

实施例4：不同类型水样中细菌总数的ATP生物发光检测和平板培养法检测

本实施例采用实施例2制备的ATP生物发光试剂进行检测。

包含不同类型的水源水、自来水、矿泉水和纯净水等34个饮用水水样通过ATP生物发光检测法和平板培养检测法计数水样中的细菌总数。

饮用水ATP生物发光检测法：通过三头不锈钢真空抽滤系统分别将上述34种水样250ml过0.45μm滤膜，同时，再取250ml上述34种水样通过三头不锈钢真空抽滤系统过0.45μm滤膜，弃废液，分别加入2.5ml无菌超纯水洗脱滤膜上的微生物，得到浓缩了100倍的样品，取0.1ml浓缩样品，再加入0.1ml ATP提取剂EC，振匀后室温下作用1.5～2.5min，再加入0.1ml GDB发光测试缓冲液，振匀后加入0.1ml复配后的ATP生物发光试剂，立即置于美国PromegaGLOMAX^TM20/20ATP发光检测仪，同时检测无菌水作为对照的空白样品发光值，样品发光值减去空白发光值后取对数，通过发光曲线计算待测水样中的细菌总数，细菌总数TBC=N×（505×10^{（A+BLogRLU）}）/3×10^-16（个/升），N=稀释倍数，A，B为ATP发光试剂的标准ATP发光曲线测试后，ATP浓度和净相对发光值取双对数后获得的线性回归的发光方程的系数。同时取浓缩了100倍的水样用两种培养基（NA和R2A）进行平板培养计数，检测结果见表3。

表3.不同类型的水样的ATP发光检测结果与平板培养结果

注：A法指过0.22μm滤膜将水样浓缩100倍后，进行ATP生物发光测试；B法指过0.45μm滤膜将水样浓缩100倍后进行ATP生物发光测试；A法（cells/ml）和B法（cells/ml）均指换算为原水样中的菌数。

结果分析：（1）、过0.22μm滤膜浓缩100倍的水样进行的ATP生物发光检测结果总体高于过0.45μm滤膜浓缩100倍的水样，证明0.22μm滤膜浓缩100倍的水样的ATP发光值基本上代表水样中的总的生物量的情况，换算为细菌总数后，其结果高于国标法的NA培养结果，过0.45μm滤膜浓缩100倍的水样基本上去掉了大部分的低温菌，能代表水中的中温菌数量。

（2）、当过0.45μm滤膜浓缩100倍的水样的发光值低于空白样品时，换算为原水时，在国标法一定是合格的，如1，2，3，5，13，16，17，23，24，26，31，33等12个水样。

（3）、过0.45μm滤膜浓缩100倍的水样其发光净值的对数值按发光方程折算为细菌总数时，基本上能代表中温菌的含量，但有时也和国标法不一致的情况，如水样中有霉菌污染时，因国标法的活菌总数检测只检测中温细菌，霉菌是另外检测的，故发光法检测值大于平板检测法。

结论：通过0.45μm滤膜浓缩100倍的水样，其测试取样的误差降低了，本发明的ATP 生物发光试剂的检测限在10³cells/ml左右，浓缩100倍后能检出大于10cells/ml中温菌的水样，此测试出来的活菌总数在数量级是准确的，因此通过不锈钢三头或多真空抽滤法浓缩100倍的ATP生物发光法能作为一个快速评价方法测试水样中的中温菌的含量。

实施例5：GMP工厂表面卫生样品的ATP生物发光检测与平板培养法检测

本实施例采用实施例2制备的ATP生物发光试剂进行检测。

10×10cm²表面样品通过均匀度一致的长柄无菌棉拭浸润1.5ml无菌去ATP擦拭缓冲液取样洗下后，其可用于测试的表面样品体积在1.0～1.3ml之间，对表面样品分别进行以下3个处理测试：

1）、取0.1ml表面样品提取ATP后进行直接的ATP生物发光检测：直接加0.1mlATP提取试剂EC振匀后室温下作用1.5～2.5min（同一批测试包括空白样均需一致），然后加入0.1mlGDB发光测试缓冲液，10000r/min，离心30S，再加入0.2ml无菌超纯水后，再次将滤膜柱上的ATP等试剂洗下，去掉滤膜柱，加入复配后的ATP生物发光试剂0.1ml，置于美国PromegaGLOMAX^TM20/20ATP发光检测仪测试样品发光值，同时进行空白样品的发光测试，细菌总数的计算：表面样品发光值减去空白样品发光值后通过发光曲线计算表面样品的细菌总数，细菌总数TBC=N×（505×10^{（A+BLogRLU）}）/3×10^-16（个/升），N=稀释倍数，A，B为ATP发光试剂的标准ATP发光曲线测试后，ATP浓度和净相对发光值取双对数后获得的线性回归的发光方程的系数。

2）、取0.5ml表面样品过带0.22μm滤膜过滤柱的2.0ml纯化滤膜柱，10000rp/min离心30S，弃废液后再加0.2ml无菌纯水，10000rp/min离心30S，弃废液，将0.22μm滤膜过滤柱换至2.0ml无菌离心管中，一份加0.1mlATP提取剂EC，于室温（25～30℃）下作用2.25min（1.5～2.5min影响不大，但同一批样的作用时间要尽量一致，以去除误差），10000rp/min离心30S，再加0.1ml无菌超纯水，再次10000rp/min离心30S，弃2.0ml纯化滤膜柱，加入上0.1ml ATP生物发光试剂，于美国Promega GLOMAX^TM20/20ATP发光检测仪上进行发光检测其CP3S值，同时以无菌去ATP擦拭缓冲液作为对照，进行同样的发光检测，表面样品发光值减去空白样发光值后取对数，根据样品发光对数值换算成细菌总数，细菌总数TBC=N×（505×10^A+BLogRLU）/3×10^-16（个/升），N=稀释倍数，A，B为ATP发光试剂的标准ATP发光曲线测试后，ATP浓度和净相对发光值取双对数后获得的线性回归的发光方程的系数。

3）、剩下的表面样品通过NA，37℃培养5天进行细菌总数计算，结果见表4。

表4.表面样品的ATP生物发光法和平板法检测结果

检测结果分析：表面样品通过直接ATP生物发光测试，发光法检测结果通常高于平板培养值，但也可以表示表面相对的干净程度；取0.5ml表面样品过带0.22μm滤膜过滤柱的2.0ml纯化滤膜柱可以去掉表面样品中的绝大部分的非细胞ATP，当表面样品通过纯化滤膜柱后进行ATP生物发光法检测值低于空白样品值时，其检测结果低于1.0×10³cells/ml，对于手部样品，其换算结果在7cells/cm²以下，对于台面样品，其换算结果在在10cells/cm²，已经满足GMP工厂对合格菌数（手部干净准标：30cfu/cm²以下，表面干净指标：10～100cfu/cm²）的要求，因此通过纯化滤膜柱去掉表面样品非细胞ATP后进行ATP生物发光法检测可以用于GMP工厂表面和工人手部卫生的快速评价。对于通过纯化滤膜柱进行ATP生物发光检测的检测值大于空白值的表面样品，可以通过净发光对数值和发光方程计算出单位表面积中的菌数，通过与标准比较即可判断。

Claims

1.一种检测饮用水中卫生质量和GMP工厂表面卫生的ATP生物发光试剂，其特征在于，包括荧光素酶、D-荧光素、去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，所述的荧光素酶必须经过纯化，具体制备方法为：取天然萤火虫虫尾，通过添加酶提取液研磨、离心和硫酸铵沉淀得到粗酶制剂；再通过复溶、透析、超滤、离心和阳离子交换法进行纯化，纯化过程中的NTE缓冲液是经过去ATP处理的，进一步经一次分子排阻层析或亲和层析和二次分子排阻层析，即得到纯化的荧光素酶，其使得ATP生物发光试剂的发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10^-7mol/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5～7.5；所述的D-荧光素的纯度为99%以上，其在ATP生物发光试剂中的终浓度为20～150μg/mL；所述的去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统含10～100mg/L海藻糖、5～100mg/L PEG、0～2.0mol/L蔗糖、0.1～2.0mol/L甘氨酸、0～2.0mol/L DMSO、0～1mmol/L焦磷酸、25mmol/L甘氨酰甘氨酸、1.0mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT,pH7.2～7.8。

2.根据权利要求1所述的ATP生物发光试剂，其特征在于，所述的去ATP无菌处理，为用三磷酸腺苷双磷酸酶处理后，经121℃，15min灭菌。

3.一种检测饮用水中卫生质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：首先复配ATP生物发光试剂：ATP生物发光试剂添加去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，使ATP生物发光试剂的发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10^-7/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5～7.5；然后通过真空抽滤将待检水样过0.45μm或0.22μm滤膜，弃废液，再加2.5ml无菌超纯水洗脱滤膜上的微生物，得到浓缩了100倍的样品，测量时，每取0.1ml浓缩样品，加入0.1mlATP提取剂EC，振匀后室温下作用1.5～2.5min，再加入0.1mlGDB发光测试缓冲液，振匀后加入0.1ml复配后的ATP生物发光试剂，立即置于ATP生物发光检测仪进行发光检测，同时检测无菌水作为对照的空白样品发光值，样品发光值减去空白发光值后取对数，通过发光曲线计算待测水样中的细菌总数，细菌总数TBC=N×（505×10^{（A+BLogRLU）}）/3×10^-16（个/升），N=稀释倍数，A，B为ATP生物发光试剂的标准ATP发光曲线测试后，ATP浓度和净相对发光值取双对数后获得的线性回归的发光方程的系数。

4.一种检测GMP工厂表面卫生的方法，其特征在于，包括以下步骤:

（2）、去除非细胞ATP：每取0.5ml表面样品液加入含带0.22μm滤膜过滤柱的2.0ml纯化滤膜柱，10000r/min，离心30S，弃废液，再加入0.2ml无菌超纯水，10000r/min，离心30S，弃废液，即去掉表面样品中的非细胞ATP；

（3）、首先复配ATP生物发光试剂：ATP生物发光试剂添加去ATP无菌处理的发光稳定缓冲系统，使ATP生物发光试剂的发光比活力在0.4mL发光体系中，用1×10^-7/L ATP测量时的相对发光对数值达到6.5～7.5；然后将带0.22μm滤膜的滤膜柱换至2.0ml无菌的离心管中，在滤膜柱中直接加0.1mlATP提取试剂EC振匀后室温下作用1.5～2.5min，同一批测试包括空白样均需一致，加入0.1mlGDB发光测试缓冲液，10000r/min，离心30S，再加入0.1ml无菌超纯水后，再次将滤膜柱上的ATP等试剂洗下，去掉滤膜柱，加入0.1ml复配后的ATP生物发光试剂置于ATP生物发光检测仪测试样品发光值，同时进行空白样品的发光测试；

（4）、细菌总数的计算：表面样品发光值减去空白样品发光值后通过发光曲线计算表面样品的细菌总数，细菌总数TBC=N×（505×10^{（A+BLogRLU）}）/3×10^-16（个/升），N=稀释倍数，A，B为ATP发光试剂的标准ATP发光曲线测试后，ATP浓度和净相对发光值取双对数后获得的线性回归的发光方程的系数；

（5）、评价：对低于空白样品发光值103cfu/ml的表面样品，按GMP工厂的严格标准均可以判断为合格，高于空白样品的发光值的样品则直接通过发光曲线计算，和GMP标准比较即可判断是否合格。

5.一种权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，所述的ATP生物发光检测仪为发光性能好、稳定性好、线性检测范围较宽、检测灵敏度以ATP计最高达到10^-18molATP的高性能的ATP生物发光检测仪。

6.一种检测饮用水中卫生质量的试剂盒，其特征在于，包括：ATP生物发光试剂及其复配缓冲液，GDB发光测试缓冲液，ATP提取剂EC，10^-7mol/L标准ATP，无菌去ATP的超纯水。

7.根据权利要求5所述的检测饮用水中卫生质量的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括0.45μm和0.22μm的无菌一次性滤膜。

8.一种检测GMP工厂表面卫生的试剂盒，其特征在于，包括：无菌去ATP的擦拭缓冲液，ATP生物发光试剂及其复配缓冲液，GDB发光测试缓冲液，ATP提取剂EC，10^-7mol/L标准ATP，无菌去ATP的超纯水。

9.根据权利要求7所述的检测GMP工厂表面卫生的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括2.0mL无菌透明离心管，10×10cm²可重复使用的不锈钢丝材质取样框，均匀度一致的长柄无菌棉拭，一次性无菌的带0.22μm滤膜过滤柱的2.0ml纯化滤膜柱。

10.根据权利要求6或8所述的试剂盒，其特征在于，所述的GDB发光测试缓冲液含有25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，α-环糊精CD的含量为0.1～2.0%，pH5.0～7.8；所述的ATP提取剂EC含有1～30g/L TritonX-100，0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵，0.1～3.0g/L二甲亚砜，0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸，0.01～0.1g/L硫酸镁；所述的无菌去ATP的擦拭缓冲液为用超纯水配制的0～2.0%酚醚磷酸酯TXP-10，经去ATP灭菌处理；所述的复配缓冲液为含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2；所述的去ATP处理，具体为每25mL被处理试剂添加10μL10u/mL三磷酸腺苷双磷酸酶，25～30℃室温处理5min。