CN104316572B - 一种快速简便评价水源水和饮用水微生物污染风险的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速简便评价水源水和饮用水微生物污染风险的方法。本发明利用水中微生物生长速率与可生物降解有机质的关系，以及后者的代谢与溶解氧消耗的对应关系，通过检测耗氧速率实现对水中微生物污染风险的评价。本发明以简单易得的活性污泥做试验微生物，用不同浓度乙酸钠溶液做标准样，待测样品经简单预处理后测定其溶解氧消耗速率，根据标准曲线计算待测样品中的可生物降解有机物浓度，实现对样品微生物污染风险的评价。本发明相较于传统测定方法耗时短，检出限低，准确度高。本发明可对取水口、管网节点、入户自来水等饮用水系统重要位置的水样，实现快速、高灵敏度的微生物污染风险评价，切实保障城乡居民饮用水的生物安全性。
Description
技术领域
本发明属于一种饮用水生物污染监测的方法，特别涉及一种快速简便评水源水和饮用水微生物污染风险的方法，属于饮用水水质监测技术领域。
背景技术
饮用水生物安全性是对饮用水水质的基本要求，正得到社会各界越来越多的关注。世界卫生组织（WHO）在《饮用水水质准则》中指出，饮用水的卫生问题大多与微生物（细菌、病毒、原生动物或其他生物来源）的污染相关。近年来，由于污染事故频发和水源水的常态污染，我国的饮用水安全正面临着严峻挑战。在此形势下，饮用水微生物污染的风险预警就显得尤为重要。
微生物生长必须利用一定量的有机物，但平时给水管网中处于贫营养状态，微生物污染事故发生的一个必要条件是水中应有一定水平的可同化有机碳（AssimilableOrganic Carbon，AOC）支撑微生物的生长，因此可以通过测定水中AOC的水平来间接反映水体的微生物污染风险。但现有的检测方法对试验条件和操作人员的要求都比较高，最重要的是耗时长，所获得结果对水质监测风险预警很难起到指导作用。因此，有必要研发一种快速、对仪器和操作条件要求都很简单的评价水源水和饮用水微生物污染风险的方法，对解决与生物安全性相关的突发性饮用水污染事件提供有效的技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速简便评价水源水和饮用水微生物污染风险的方法。本发明利用水中微生物生长速率与水中可生物降解有机质的关系，以及后者的代谢与溶解氧消耗的对应关系，通过快速、高效检测溶解氧消耗速率实现对水中微生物污染风险的评价，做到及时预警，保障用水安全。
本方法的步骤如下：
(1)缓冲液的制备：
300mM磷酸缓冲液的配制（PH=7.2）：称取700mg K2HPO4，10mg MgSO4·7H2O，100mg(NH4)2SO4，10mg NaCl和100ug FeSO4，溶于1L超纯水中，高压灭菌，20min；
矿物质溶液的配制：称取171 mg K2HPO4，767 mg NH4Cl和1.44 g KNO3，溶于1L超纯水中，高压灭菌，20min；
(2)微生物的准备：
采集1-5L的普通城市污水处理厂曝气池（或类似工段）出水，将其静置过夜。取下层污泥离心（6000 rpm，5min），弃去上清，保留沉淀。使用3mM磷酸缓冲液将沉淀的污泥重悬，再次离心（6000 rpm，5min），弃去上清，保留沉淀。重复使用3mM磷酸缓冲液清洗沉淀的污泥3遍，备用；
(3)标准样的制备：
称取3.415g乙酸钠，加超纯水定容于1L容量瓶中，配成1g C/L的母液。加入不同体积的1g C/L母液，同时加入5mL体积的300mM磷酸缓冲液和2.5mL的矿物质盐溶液，加超纯水定容于500mL容量瓶，配制成0 μg C/L，5 μg C/L，10 μg C/L，20 μg C/L，40 μg C/L，60 μgC/L的标准液；
(4)取样及样品前处理：
按传统AOC 检测方法取样、过滤、经高压灭菌( 121℃, 20min) 后冷至室温。将样品进行不同梯度的稀释，以得到与体系中生物量、溶解氧等相适宜的有机物量，操作同（3）中描述；
将标准样和待测水样，分别取100mL移入干净的三角瓶中，使用曝气装置曝气30min-1h，使水样的溶解氧浓度达到饱和；
(5)在已放有一个磁力搅拌子的10mL玻璃样品瓶中，加入标准样或者待测水样（提前曝气至饱和），使溶液刚好充满待测装置，内部所有空气同时被排尽。从三角瓶中移走1mL样品，再加入1 mL的30%（W/W）活性污泥。瓶口立即用溶氧电极探头塞住，用生料带或者薄膜封口，保证三角瓶内无气泡且生物量不流失。立即打开溶氧仪以及磁力搅拌器，并启动溶氧值自动记录程序，每隔10s记录实时溶氧值，连续10min。整个测定过程中，磁力搅拌子以恒定的速度旋转，溶氧电极探头始终浸没在待测水样中；
(6)数据分析：
将标准样和待测水样的溶氧值变化绘制在同一个曲线图中，使用origin或其它统计软件分析溶氧值稳定变化时的曲线斜率。以标准样的碳浓度（S）为横坐标，标准样溶氧值变化的斜率（即反应速率，V）为纵坐标，绘制成曲线，并用软件拟合出相应的方程。将待测水样的溶氧值变化的斜率（V）代入方程，求得其对应的AOC浓度。通常认为，在不加消毒剂的情况下，AOC小于10 -20 μg/L；加消毒剂的情况下，AOC小于50-100 μg/L时，水质是生物稳定的。可根据计算出的AOC浓度，并依此标准判断水源水和饮用水微生物污染的风险。AOC值越大，受到（或爆发）微生物污染的风险越大，反之越小。
备注说明：将实验所需的所有玻璃器皿均采用硅酸盐材质的玻璃器皿，并使用以下方法清洗：稀硝酸浸泡过夜，使用自来水，纯水，超纯水，分别清洗三遍，置于60℃烘箱烘干。
本发明优点：
1. 耗时短：传统方法耗时长，从准备接种液到最终测定出结果，需要至少13天以上的时间；本发明采用溶氧值测定方法从准备标准液到得到待测水样结果，只需要花费1天的时间，大大缩短了检测的时间；
2. 准确度更高：传统测定方法只使用荧光假单胞菌P17（fluorescentpseudomonads）和螺旋菌NOX（spirillum）两株菌株，能够利用的碳源种类和数量有限；而本发明使用的活性污泥含有的菌株种类多，能够利用更广泛的碳源物质，测定结果更准确。
本发明的基本原理如下：
在水源水和饮用水环境中，无抑制剂存在的情况下，细菌生长的动力学方程用式（1）表示：
式中，μ—微生物比生长速率（t-1）
μ max —微生物最大比生长速率（t-1）
S—有机物浓度（mg/L）
Ks—半饱和常数，其值为1/2最大比生长速率对应的有机物的浓度（mg/L）
饮用水中有机物浓度很低，此时S<<Ks，因此饮用水中细菌生长动力学模型可以简化成一级反应，见式（2）：
异养细菌的生长必然伴随底物的利用，两者在理想情况下，存在如式（3）表示的关系：
式中，q max —底物最大比利用速率（t-1）
Y—产率系数
将公式（3）代入公式（2）得到式（4）：
微生物利用水中的有机物进行代谢反应，底物利用的动力学方程见式（5）所示：
式中，—底物利用速度（mg/（L×t））
X—微生物浓度（mg/L）
K—饱和常数，其值为1/2最大比利用速率对应的有机物的浓度（mg/L）
同样由于饮用水中有机物浓度很低，可以简化成一级反应，见式（6）：
异养细菌对底物的利用过程中，有机物的氧化分解需要消耗溶解氧。溶解氧的消耗速率与有机物的利用速度之间的关系用式（7）表示：
式中，k—相关系数，为常数
DO—溶解氧浓度（mg/L）
由公式（6）（7）推导出溶解氧消耗速率与水中可利用有机物的关系，见式（8）：
整合公式（4）（8），得到微生物比生长速率与溶解氧消耗速率之间的关系，见式（9）：
对于初始微生物浓度X一定的情况下，为常数，定义为，公式（9）简化为式（10）：
由公式（10）可以看出，水源水和饮用水中微生物比生长速率可以由水中溶解氧消耗速率来表征。水中溶解氧消耗速率提高，微生物生长速率也可能提高，微生物污染风险也就加大。因此，可以通过测定水源水和饮用水中溶解氧消耗速率，这一操作简单的方法对饮用水中微生物污染风险进行快速评价。
另外，当水中有机物含量提高，往往是由于饮用水系统受到生活污水污染，并且有机物污染往往与微生物污染伴生。因此，受污染水中的有机物污染越大，水体被微生物污染的可能性也会提高。
附图说明
图1是乙酸钠标准样实验结果拟合出的标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案，进行进一步详细描述。
配制乙酸钠母液，并稀释出系列标准液，浓度分别为0 μg C/L，5 μg C/L，10 μgC/L，20 μg C/L，40 μg C/L，60 μg C/L。并预曝气至溶解氧浓度为8.5mg/L左右。不同浓度标准液分别充满放有磁力搅拌子的样品瓶，取出1 mL样品后再加入1 mL的30%（W/W）经过预处理的活性污泥，以保证所有样品体系中微生物量相同，样品体积相同。立即用溶氧电极探头塞住瓶口，并用封口膜封住，保证三角瓶内无气泡且生物量不流失。打开溶氧仪以及磁力搅拌器，液体被匀速搅拌中测定溶解氧的实时变化，每隔10 s记录一次，共计10min。
以不同饮用水为待测样品（为测试方便，适当加入少量生活污水模拟被污染情况）。按传统AOC 检测方法取样、过滤、经高压灭菌(121℃, 20min) 后冷至室温。后续测定操作同上述的标准液。
将标准样和待测水样的溶氧值变化绘制在同一个曲线图中，使用origin软件分析溶氧值稳定变化时的曲线斜率（即反应速率，V），见表1及表2。以标准样的碳浓度（S）为横坐标，标准样溶氧值变化的斜率（即反应速率，V）为纵坐标，绘制标准曲线，并用origin软件拟合出相应的方程，见图1。
表1 标准样反应速率
| S (μg C/L) | V |
| 0 | 0.00381 |
| 5 | 0.00466 |
| 10 | 0.00479 |
| 20 | 0.00574 |
| 40 | 0.00708 |
| 60 | 0.00859 |
表2 待测水样反应速率
| 待测稀释水样 | V |
| 饮用水1 | 0.00727 |
| 饮用水2 | 0.00494 |
将待测水样的溶氧值变化的斜率（V）代入拟合方程中，得到其对应的AOC浓度，见表3。
表3 待测水样AOC浓度
| 水样 | AOC (μg C/L) |
| 饮用水1 | 42.05 |
| 饮用水2 | 11.43 |
为了进一步验证本发明测试方法的可行性，待测水样同样使用了传统的Van derKooij AOC测定法进行测定，结果见表4。本发明测定结果与传统方法结果相近，而且相对于传统方法耗时短，测定结果更准确。本发明可以对取水口、重要管网节点、入户自来水等水源水和饮用水系统重要位置的水样，实现快速、高灵敏度的微生物污染风险评价，切实保障城乡居民饮用水的生物安全性。
表4传统AOC方法测定结果
| 水样 | AOC (μg C/L) |
| 饮用水1 | 39.1 |
| 饮用水2 | 17.1 |
Claims (1)
1.一种快速简便评价水源水和饮用水微生物污染风险的方法，其特征在于通过快速、高灵敏度检测水中溶解氧消耗速率实现对水源水和饮用水中微生物污染风险的评价，具体包括以下步骤：
(1)缓冲液的配制，
(2)微生物的准备，
(3)标准样的制备，
(4)取样及样品前处理，
(5)溶解氧消耗速率的测定，
(6)数据分析；
所述步骤(1)中的缓冲液为pH＝7.2，300mM的磷酸缓冲液，配制过程如下：称取700mgK2HPO4，10mg MgSO4·7H2O，100mg(NH4)2SO4，10mg NaCl和100ug FeSO4，溶于1L超纯水中，高压灭菌20min；
所述步骤(2)中以活性污泥作为试验微生物：采集1-5L的普通城市污水处理厂曝气池或类似工段出水，将其静置过夜；取下层污泥，6000rpm下离心5min，弃去上清，保留沉淀，使用3mM磷酸缓冲液将沉淀的污泥重悬，再次6000rpm下离心5min，弃去上清，保留沉淀；重复使用3mM磷酸缓冲液清洗沉淀的污泥3遍，备用；
所述步骤(3)中以乙酸钠溶液做标准样：称取3.415g乙酸钠，加超纯水定容于1L容量瓶中，配成1g C/L的母液；加入不同体积的1g C/L母液，同时加入5mL体积的300mM磷酸缓冲液和2.5mL的矿物质盐溶液，加超纯水定容于500mL容量瓶，配制成0μg C/L，5μg C/L，10μg C/L，20μg C/L，40μg C/L，60μg C/L的标准液；矿物质盐溶液配制过程如下：称取171mgK2HPO4,767mg NH4Cl和1.44g KNO3，溶于1L超纯水中，高压灭菌20min；
所述步骤(4)中样品按传统可同化有机碳AOC检测方法取样、过滤、121℃经高压灭菌20min后，冷至室温；取不同体积的待测水样，同时加入5mL体积的300mM磷酸缓冲液和2.5mL的矿物质盐溶液，加超纯水定容于500mL容量瓶，将水样进行不同梯度的稀释，以得到与体系中生物量、溶解氧相适宜的有机物量；将标准样和待测水样，分别取100mL移入干净的三角瓶中，使用曝气装置曝气30min-1h，使水样的溶解氧浓度达到饱和；
所述步骤(5)中溶解氧消耗速率的测定：已放有一个磁力搅拌子的10mL三角瓶中，加入标准样或者待测水样，提前曝气至饱和，使溶液刚好充满待测装置，内部所有空气同时被排尽；从三角瓶中移走1mL样品，再加入1mL的质量分数30％活性污泥；瓶口立即用溶氧电极探头塞住，用生料带或者薄膜封口，保证三角瓶内无气泡且生物量不流失，立即打开溶氧仪以及磁力搅拌器，并启动溶氧值自动记录程序，每隔10s记录实时溶氧值，连续10min；整个测定过程中，磁力搅拌子以恒定的速度旋转，溶氧电极探头始终浸没在待测水样中；
所述步骤(6)中的数据分析：将标准样和待测水样的溶氧值变化绘制在同一个曲线图中，分析溶氧值稳定变化时的曲线斜率；以标准样的碳浓度S为横坐标，标准样溶氧值变化的斜率V为纵坐标，绘制成曲线，并拟合出相应的方程；将待测水样的溶氧值变化的斜率V代入方程，求得其对应的AOC浓度；通常认为，在不加消毒剂的情况下，AOC小于10-20μg/L，而加消毒剂的情况下，AOC小于50-100μg/L时，水质是生物稳定的，可根据计算出的AOC浓度，并依此标准判断水源水和饮用水微生物污染的风险，AOC值越大，受到或爆发微生物污染的风险越大，反之越小。
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