CN103940883A

CN103940883A - 可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法、应用、装置及检测方法

Info

Publication number: CN103940883A
Application number: CN201310021751.7A
Authority: CN
Inventors: 只金芳; 钱俊; 李久铭
Original assignee: Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Current assignee: Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority date: 2013-01-21
Filing date: 2013-01-21
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2033-01-21
Also published as: CN103940883B

Abstract

本发明公开了一种可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法，包括：将微生物菌液与混合溶胶混合均匀，之后涂在基片上，然后在上面滴加固化液，得到微生物膜，将微生物膜从基片上取下，覆盖在电极表面，用固定器压紧，得到一次性微生物膜传感器。该传感器使得现有的微生物传感器的使用成本大大下降，且操作更简单。本发明还公开了该一次性微生物膜传感器的应用，含该一次性微生物膜传感器的电化学检测装置及其检测方法。该电化学检测装置在测定水体毒性时具有快速灵敏、操作方便，可实时、在线检测水体毒性，成本低等特点。

Description

可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法、应用、装置及检测方法

技术领域

本发明属于微生物传感器技术和环境监测领域，具体地涉及可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法、应用、装置及检测方法。

背景技术

随着工农业生产的迅速发展，越来越多的有毒物质如重金属、农药通过生产和使用过程进入到水体，对水环境造成了严重的污染。这些物质在环境中经过复杂的物理、化学和生物转化过程，又会形成新的污染物。一些污染物还可能进入食物链并在生物体内蓄积，最终对生物产生各种各样的毒性效应。

传统的理化分析方法能定量分析某一种或某一类污染物的含量，却不能直接、全面地反映各种有毒物质对环境的综合影响，无法判定有毒物质浓度和生物效应之间的直接关系。理化分析方法还需要昂贵的仪器设备，操作程序复杂。

生物毒性检测是利用活的生物体来检测环境中的水体有毒化学污染情况，生物毒性的评价不仅能检测污染物对环境的影响状况，更能反映污染物对生物生长繁殖的影响，弥补理化检测方法的不足。在水污染研究中，它已经成为监测和评价水体环境质量的重要手段之一。生物毒性实验方法主要包括分子水平、细胞水平和生物体水平三个层次。其中生物体水平实验材料有鱼类、无脊椎动物、植物等，使用广泛，但是对实验生物的种系要求苛刻、假阳性高、不利于实现现场监测。分子水平的材料主要有如DNA、P450等，这种方法能较准确的反应某类毒性效应，但由于具有一定的选择性而不利于总毒性的反映。研究者们还探讨了采用微生物作为生物敏感物质分析水样毒性。研究发现，发光细菌测试法具有能在短时间内得到可靠的毒性资料成为经典的毒性检测方法，但易受样品色度、离子强度、浊度的干扰，在此情况下就不能得到可靠结果，而且测量过程需人工配制一系列空白溶液和标准溶液，操作复杂、耗时，仪器成本较高。此外，还有通过微生物生化需氧量来判断污染的程度；但生物需氧量通常需要将水样充满完全密闭的溶解氧瓶中，在20℃的暗处培养5d，这样会使得生物毒性的检测滞后，人们不能及时对疑似毒性水体进行控制。

近年来兴起的利用微生物传感器对水环境进行生物毒性检测方法和技术，不仅具有成本低、易操作、结果直观等优点，更重要的是它可以直接测定水体污染物的综合急性生物毒性，其测定值能较全面地反映水体中污染物的总毒性效应，具有实际参考价值。这种微生物传感器毒性分析法具有不受样品色度、离子强度和浊度干扰等特点，并可通过固定特定毒性敏感指示微生物对不同污染物的毒性做出评价，毒性分析结果更客观真实，具有便携、灵敏、快速和可实时在线分析检测等特点，有望用于大量污染水体的综合急性生物毒性连续在线检测。

由于微生物电极在检测生物毒性的过程中，所固定的微生物会受到有毒物质的毒害，因此若重复使用可能会导致微生物电极的灵敏度降低，分析结果偏低，所以构建一次性使用的微生物电极非常必要。

受试微生物是微生物传感器信息捕捉的关键功能元件，微生物的选择直接影响到生物传感器毒性分析的灵敏性。在近年来的研究中，已有采用如大肠杆菌（E.coli）、费氏弧菌（V.fischeri）或混合菌株如活性污泥（Activated sludge）的研究报道。酵母菌作为真核生物的代表，相比原核生物而言，其对毒物的毒性数据更有客观性和实际参考价值。但以酵母菌作为急性毒性检测受试对象的报道并不多，主要因为酵母菌的细胞壁对外界不良环境有很强的耐受性从而导致对毒物的急性毒性检测不灵敏。为提高分析检测实验的灵敏度，可对酵母菌进行预处理如部分去除表面细胞壁。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法。该一次性微生物膜传感器使得现有的微生物传感器的使用成本大大下降，且操作更简单。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的应用。该一次性微生物膜电极传感器可用作电化学检测的工作电极。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种含可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的电化学检测装置。它包括工作电极、对电极、参比电极、电解池；所述工作电极为一次性微生物膜电极传感器。该电化学检测装置在测定水体毒性时具有快速灵敏、操作方便，可实时、在线检测水体毒性，成本低等特点。

本发明要解决的第四个技术问题是提供使用含可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的电化学检测装置检测的方法。

本发明提供一种可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法，包括：将微生物菌液与混合溶胶混合均匀，之后涂在基片上，然后在上面滴加固化液，在20～25℃条件下保持适当时间，得到微生物膜，将微生物膜从基片上取下，覆盖在电极表面，用固定器压紧，得到一次性微生物膜传感器；所述混合溶胶为聚乙烯醇溶胶和海藻酸钠溶胶的混合物；所述固化液为钙盐溶液。

滴加固化液后，通常固化10～20分钟。之后将微生物膜从基片上取下后，使用蒸馏水冲洗，之后再室温下干燥，放置在4℃冰箱冷冻保存待用。

进一步地，所述微生物菌液与混合溶胶的混合体积比为1：5～10；所述混合溶胶中聚乙烯醇溶胶和海藻酸钠溶胶的混合体积比为1:0.2～0.5；所述固化液的质量浓度为2%～5%；所述聚乙烯醇溶胶的质量浓度为5%～10%，海藻酸钠溶胶的质量浓度为1%～2.5%。聚乙烯醇溶胶和海藻酸钠溶胶的混合溶胶是作为包埋剂。

进一步地，所述固化液为硝酸钙、硫酸钙或氯化钙溶液。

优选地，所述固化液为硫酸钙溶液。使用硫酸钙作为固化液效果最好，因为硫酸根可诱导PVA形成微晶降低溶胀性。

进一步地，所述微生物菌液为酵母菌和/或大肠杆菌。应了解，大肠杆菌和酵母菌分别为原核生物和真核生物的代表，因此其他原核生物和真核生物及两者的混合菌也同样可使用。

优选地，使用30%的甲醇或乙醇预处理12～24h后的酵母菌作为微生物菌液。这样的目的是部分去除细胞壁同时又能维持微生物的正常生命活动，提高灵敏度。

优选地，所述大肠杆菌和酵母菌的混合比例为大肠杆菌40～100份重量、酵母菌20～80份重量。

所述基片为玻片或PET塑料片。使用的基片应该是洁净的。

所述电极为玻碳电极、金电极、铂电极或硼掺杂金刚石薄膜电极。

优选地，在使用混合溶胶前，通过冻融技术、Na₂SO₄诱导微晶形成或使用低浓度戊二醛交联的方法来降低其溶胀性。可使用匀胶机将微生物菌液与混合溶胶的混合液均匀地涂在基片上。

本发明提供一种可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的应用，该一次性微生物膜传感器可用作三电极体系的电化学检测装置的工作电极或者电化学传感器的工作电极。所述一次性微生物膜传感器是通过前述的“一种可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法”来制得。

本发明提供一种含可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的电化学检测装置，包括聚四氟乙烯电解池、一次性微生物膜传感器、对电极、参比电极，对电极和参比电极的一部分置于聚四氟乙烯电解池内；所述聚四氟乙烯电解池的底部设有小孔，聚四氟乙烯电解池外、靠近其底部处设置一次性微生物膜传感器，其通过小孔与聚四氟乙烯电解池连通，所述聚四氟乙烯电解池的底部和一次性微生物膜传感器之间设有橡胶密封圈。所述一次性微生物膜传感器是通过前述的“一种可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法”来制得。所述电解池中加入细菌呼吸营养溶液。

所述一次性微生物膜传感器作为工作电极。橡胶密封圈的面积即为有效工作电极面积。

在实际应用时，一次性微生物膜传感器的一面相接有不锈钢底板架子，通过该不锈钢底板架子把一次性微生物膜传感器固定在聚四氟乙烯电解池的底部的外面。

聚四氟乙烯电解池上面再盖有一不锈钢板，并用电极螺丝帽压紧。该不锈钢板下放电解池，同时也是螺丝帽压紧的平台，起桥梁作用。

本发明提供使用含可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的电化学检测装置检测的方法，包括以下步骤：

安装好电化学检测装置；在恒电压计时电流实验模式下，设定工作电压，待背景电流稳定后，加入电子传递介质，电流经变化后逐渐平稳，之后加入待检测液记录电流的改变，进行即时监测和检测水体的生物毒性。

进一步地，所述电子传递介质为铁氰化钾、二氯酚吲哚酚钠、N,N,N’,N’-四甲基-1,4-苯二胺、2,6-二甲基苯醌、甲萘醌、苯醌。

优选地，加入电子传递介质苯醌，至苯醌浓度为0.1mM～1.0mM。

进一步地，设定工作电压为0.2v～0.7v。

进一步地，工作电极微生物膜传感器使用前预先在10mL呼吸营养溶液中活化10min。

所述细菌呼吸营养溶液为pH=7.0/0.01M磷酸盐缓冲液中含有10mmol/L乳酸钠、10mmol/L丁二酸钠、10mmol/L葡萄糖。

使用电化学工作站记录该一次性微生物膜传感器电流的变化曲线，根据电流抑制曲线，可计算出不同浓度梯度对应的抑制率大小。

抑制率和抑制物质浓度之间关系表达式为：抑制率%=(1-I₂/I₁)×100%。式中，I₁为加入毒物前的稳态电流，I₂为加入毒物后的稳态电流。

待一次检测结束后，更换微生物膜即可进行下一次毒性检测。

所述一次性微生物膜传感器是通过前述的“一种可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法”来制得。

本发明具有以下优点：

1、通过对酵母菌进行部分去除细胞壁预处理后而制备的一次性微生物膜传感器，毒性分析灵敏度高、重复性好；首次将部分剥离酵母菌细胞壁预处理应用到水体急性生物毒性检测上，有效提高检测灵敏度。

2、本发明的一次性微生物膜传感器制备方法简单，操作方便，成本低；具有很强的韧性、良好的生物兼容性；检测完一次后更换微生物膜即可进行下一次毒性检测，操作方便、可快速进行野外分析。

3、本发明的三电极体系的电化学检测装置具有密封性好、操作简单、工作电极可拆换的优点。

4.本发明的电化学传感器可即时监测水体生物毒性的改变和检测水体生物毒性大小，达到即时、在线、连续的检测，具有分析灵敏度高、成本低廉、操作简单方便等特点。

附图说明

图1是本发明的电化学检测装置的结构示意图。

图2是实施例1进行水体急性生物毒性测试的电流随时间的实时响应曲线。

图3是实施例1进行水体急性生物毒性测试的剂量-效应曲线。

图4是实施例2进行水体急性生物毒性测试的剂量-效应曲线。

图5是实施例3进行水体急性生物毒性测试的剂量-效应曲线。

图6是实施例4进行水体急性生物毒性测试的剂量-效应曲线。

图7是实施例5进行水体急性生物毒性测试的剂量-效应曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行进一步说明。

图1为本发明的电化学检测装置的结构示意图。

实施例1

一种可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器：

一、一次性使用微生物膜的制备

以酵母菌为受试微生物，接种酿酒酵母（S.cerevisiae）于液体培养基中，液体培养基成分为（质量浓度）：酵母膏（1%）、蛋白胨（2%）、葡萄糖（2%），生长24h，离心分离得湿菌体，悬浮磷酸缓冲溶液中4℃保存待用。

为提高分析灵敏度，可通过使用30%的甲醇或乙醇对酵母菌的细胞壁进行预处理12～24h，达到部分去除细胞壁的同时又能维持微生物的正常生命活动的效果。

取100μL处理后的酵母菌菌液加入1mL溶解的混合溶胶（聚乙烯醇溶胶（5%）和海藻酸钠溶胶（1%）的混合体积比为1:0.2）中，混合均匀，滴涂于洁净的塑料基片上，匀胶机混匀，然后滴加少量固化液（为硫酸钙溶液，质量浓度为2%）于表面，在室温下保持15分钟从基片上取下，蒸馏水冲洗室温下干燥待用。

二、电化学传感器用于检测水体生物毒性及毒性评价

三电极体系的电化学检测装置的组装：将合适大小的微生物膜覆盖在电极表面，用垫圈、电极帽压紧，安装好所述一次性微生物膜传感器装置，在一底部有圆形小孔的电解池的底部外面，通过一个不锈钢架子固定所述一次性微生物膜传感器，在该一次性微生物膜传感器的另一面相接有一不锈钢底板；所述一次性微生物膜传感器与所述电解池之间用橡胶密封圈（橡胶密封圈的外径不大于工作电极的边长，垫圈直径为3mm）进行密封；将作为对电极的铂电极和作为参比电极的银/氯化银电极置于所述电解池之中，以所述的一次性微生物膜传感器作为工作电极；电化学检测装置组装完成后，由下到上依次为不锈钢底板、工作电极、橡胶密封圈、电解池。

细菌呼吸作用的营养溶液为pH=7.0、0.01M磷酸盐缓冲液中含有10mmol/L乳酸钠、10mmol/L丁二酸钠、10mmol/L葡萄糖。

测量前加入10mL细菌呼吸作用的营养溶液中活化10min，然后在0.31V(vs Ag/AgCl)下测定电流变化。大约400s左右电流稳定后，加入一定量p-苯醌电子传递介质，待电流信号稳定，加入不同浓度待测样品进行毒性测试。此过程由电化学工作站记录该微生物传感器电流的变化曲线，根据电流抑制曲线，可计算出不同浓度梯度对应的抑制率大小。抑制率和抑制物质浓度之间关系表达式为：抑制率%=(1-I₂/I₁)×100%。其中，I₁为加入毒物前的稳态电流，I₂为加入毒物后的稳态电流。待一次检测结束后，更换微生物膜即可进行下一次毒性检测。

配置不同浓度的重金属离子如Ni²⁺溶液作为被测溶液进行水质急性生物毒性测试，计时电流曲线如图2所示，结果显示，可以看到加入Ni²⁺后20秒内稳态电流迅速降低，表明制备的微生物膜传感器可以在很短的时间内显示水体中毒性物质浓度的突变。在加入有毒物质后电流有不同程度地下降，这表明重金属离子Ni²⁺对酵母菌有很明显的毒性效应。通过基于米门方程的双曲线函数拟合进行计算得到剂量-效应曲线，如图3所示，抑制率和抑制物质浓度之间的关系表达式为：

μ=μmax·C/（k+C）

其中，μ为抑制率；μmax为估算所得的最大抑制率；k为常数；C为抑制污染物浓度。重金属离子Ni²⁺的EC50值为40.36μg/mL。同样方法可用于检测其他有毒物质的急性生物毒性。

实施例2

操作方法和步骤同实施例1中的对重金属离子生物毒性评价，唯一的变化是：配置不同浓度的待测溶液3,5-二氯苯酚(DCP)溶液作为被测溶液进行水质急性生物毒性测试，DCP在国际上毒性测试中经常被用作参照物。结果显示，在加入有毒物质后DCP电流有不同程度地下降，这表明DCP对酵母菌有很明显的毒性效应。通过基于米门方程的双曲线函数拟合进行计算得到剂量-效应曲线，如图4所示，DCP的EC50值为11.45μg/mL。与实施例5的混合菌检查的结果比较，灵敏度显著提高。

实施例3

操作方法和步骤同实施例1中的对重金属离子生物毒性评价，唯一的变化是：配置不同浓度的有机物溶液如农药乙酰甲胺磷作为被测溶液进行水质急性生物毒性测试。结果显示，在加入有毒物质乙酰甲胺磷后电流有不同程度地下降，这表明农药乙酰甲胺磷对酵母菌有很明显的毒性效应。通过基于米门方程的双曲线函数拟合进行计算得到剂量-效应曲线，如图5所示，农药乙酰甲胺磷的EC50值为52.58μg/mL。与实施例4的大肠杆菌检查的结果比较，灵敏度显著提高。

实施例4

以大肠杆菌为受试微生物，接种大肠杆菌（E.coli）于液体培养基中，生长16h，离心分离得湿菌体，悬浮磷酸缓冲溶液中4℃保存待用。

该一次性微生物膜的制备过程也适用于大肠杆菌。取100μL处理后的大肠杆菌菌液加入1mL溶解的混合溶胶（聚乙烯醇溶胶（10%）和海藻酸钠溶胶（2.5%）的混合体积比为1:0.5）中，混合均匀，滴涂于洁净的基片上，匀胶机混匀。然后滴加少量固化液（为硝酸钙溶液，质量浓度为5%）于表面，在室温下固定15分钟从载玻片上取下，蒸馏水冲洗室温下干燥待用。

置不同浓度的有机磷农药乙酰甲胺磷溶液作为被测溶液进行水质急性生物毒性测试，结果显示，加入有毒物质乙酰甲胺磷后电流有不同程度地下降，这表明乙酰甲胺磷对大肠杆菌有很明显的毒性效应。通过基于米门方程的双曲线函数拟合进行计算得到剂量-效应曲线，如图6所示，抑制率和抑制物质浓度之间的关系表达式为：

μ=μmax·C/（k+C）

其中，μ为抑制率；μmax为估算所得的最大抑制率；k为常数；C为抑制污染物浓度。农药乙酰甲胺磷的EC50值为77.55μg/mL。

实施例5

以大肠杆菌（E.coli）和酿酒酵母（S.cerevisiae）的混合菌株作为受试微生物，取冷冻干燥的大肠杆菌（50份）和酿酒酵母（20份）进行菌株混合复配。取复配好的混合菌株加入磷酸缓冲溶液中，4℃保存待用。

该一次性微生物膜的制备过程也适用于混合菌。取100μL该混合菌液加入1mL溶解的混合溶胶中，混合均匀，滴涂于洁净的基片上，匀胶机混匀。然后滴加少量固化液于表面，在室温下保持15分钟从载玻片上取下，蒸馏水冲洗室温下干燥待用。

配置不同浓度的3,5-二氯苯酚(DCP)溶液作为被测溶液进行水质急性生物毒性测试，结果显示，加入3,5-二氯苯酚(DCP)有毒物质后电流有不同程度地下降，这表明3,5-二氯苯酚(DCP)对该混合菌微生物有很明显的毒性效应。通过基于米门方程的双曲线函数拟合进行计算得到剂量-效应曲线，如图7所示。抑制率和抑制物质浓度之间的关系表达式为：

μ=μmax·C/（k+C）

其中，μ为抑制率；μmax为估算所得的最大抑制率；k为常数；C为抑制污染物浓度。DCP的EC50值为32.33μg/mL。

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，并非对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法，其特征在于，包括：将微生物菌液与混合溶胶混合均匀，之后涂在基片上，然后在上面滴加固化液，在20～25℃条件下保持适当时间，得到微生物膜，将微生物膜从基片上取下，覆盖在电极表面，用固定器压紧，得到一次性微生物膜传感器；所述混合溶胶为聚乙烯醇溶胶和海藻酸钠溶胶的混合物；所述固化液为钙盐溶液。

2.根据权利要求1所述的可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法，其特征在于，所述微生物菌液与混合溶胶的混合体积比为1：5～10；所述混合溶胶中聚乙烯醇溶胶和海藻酸钠溶胶的混合体积比为1:0.2～0.5；所述固化液的质量浓度为2%～5%；所述聚乙烯醇溶胶的质量浓度为5%～10%，海藻酸钠溶胶的质量浓度为1%～2.5%。

3.根据权利要求1或2所述的可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法，其特征在于，所述固化液为硝酸钙、硫酸钙或氯化钙溶液。

4.根据权利要求3所述的可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法，其特征在于，所述固化液为硫酸钙溶液；使用硫酸钙作为固化液效果最好，因为硫酸根可诱导PVA形成微晶降低溶胀性。

5.根据权利要求1所述的可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法，其特征在于，所述微生物菌液为酵母菌和/或大肠杆菌。

6.根据权利要求1所述的可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法，其特征在于，使用30%的甲醇或乙醇预处理12～24h后的酵母菌作为微生物菌液。

7.根据权利要求1所述的可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌和酵母菌的混合比例为大肠杆菌40～100份重量、酵母菌20～80份重量。

8.根据权利要求1所述的可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的制备方法，其特征在于，在使用混合溶胶前，通过冻融技术、Na₂SO₄诱导微晶形成或使用低浓度戊二醛交联的方法来降低其溶胀性。

9.如权利要求1～8任一所述的可快速检测水体急性生物毒性的一次性微生物膜传感器的应用，其特征在于，该一次性微生物膜传感器可用作三电极体系的电化学检测装置的工作电极或者电化学传感器的工作电极。

10.一种含权利要求1～9任一所述的可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的电化学检测装置，其特征在于，包括聚四氟乙烯电解池、一次性微生物膜传感器、对电极、参比电极，对电极和参比电极的一部分置于聚四氟乙烯电解池内；所述聚四氟乙烯电解池的底部设有小孔，聚四氟乙烯电解池外、靠近其底部处设置一次性微生物膜传感器，其通过小孔与聚四氟乙烯电解池连通，所述聚四氟乙烯电解池的底部和一次性微生物膜传感器之间设有橡胶密封圈。

11.使用含权利要求1～10任一所述的可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的电化学检测装置检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

12.根据权利要求11所述的电子传递介质，其特征在于，所述电子传递介质为铁氰化钾、二氯酚吲哚酚钠、N,N,N’,N’-四甲基-1,4-苯二胺、2,6-二甲基苯醌、甲萘醌、苯醌。优选电子介体为苯醌。

13.根据权利要求11所述的可快速检测水体生物毒性的一次性微生物膜传感器的电化学检测装置检测的方法，其特征在于，加入电子传递介质浓度为0.1mM～1.0mM；设定工作电压为0.2v～0.7v；工作电极微生物膜传感器使用前预先在10mL呼吸营养溶液中活化10min。