CN106770563A - 一种检测水体急性生物毒性的双电子介体电化学生物传感器及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测水体急性生物毒性的双电子介体电化学生物传感器及其应用，该生物传感器涉及水体中污染物质的急性生物毒性检测。本发明所述双电子介体电化学生物传感器可用于评价重金属、酚和农药的生物毒性和实际水体的毒性检测和在线监测，具有一体化，灵敏度高，操作步骤简单和便于储存和携带的特点。

Description

一种检测水体急性生物毒性的双电子介体电化学生物传感器及其应用

技术领域

本发明涉及生物毒性检测领域，尤其是涉及水体中污染物质的急性生物毒性检测。

背景技术

由于对全球工业化的负面效应和高度发达的制造业的负面影响的预期不足，近几十年来，环境污染事故频发。化学污染物排放到自然环境中，对环境生物以及人类生活都构成了巨大的潜在威胁。因此迫切需要提高公众对环境保护的认识，建立一个快速、简便、实时的监测系统，以对环境中的急性生物毒性进行检测，并对环境生物的潜在危害进行评估，提供一个可以实现提前预警和在线监测的方法。

目前建立的比较成熟的水体分析方法主要是基于色谱分析，尽管色谱分析方法具有很高的检测灵敏度和广谱性，但在实际操作中它不仅需要专业人员的操作，而且不能提供实时监测数据，也不能够反映样品的生物危害性。在这样的背景下，生物传感器的出现成为了水体急性生物毒性检测的替代和互补的工具。

在生物毒性检测领域，目前比较成熟产品的主要有ToxAlert 10，Microtox以及LUMIStox，其检测机理主要是基于费氏弧菌的荧光响应，尽管其具有很高的灵敏度且能够很好地反应水体生物毒性的大小，但由于其不能够实时在线检测，以及对水体的清洁程度要求较高等缺点，因此不适用与实际水体的在线监测。电化学法具有灵敏度高、易于在线检测、与现代分析仪器兼容性好等特点，利用电化学方法来进行即时监测及检测水体生物毒性有着广泛的应用前景，受到越来越多的关注。但是现有的电化学生物传感器进行生物毒性检测时，往往需要额外向检测体系中加入电子介体，这不仅使检测步骤更加复杂，而且加入的电子介体往往很难除去，对检测体系造成二次污染。此外，现有的电化学检测体系大多采用单一电子介体，脂溶性的电子介体能够更好的与菌体进行电子传递，但在水中的溶解度低，而水溶性的电子介体虽然溶解度较高，但与菌体的电子传递效率低，因此这种传感器往往存在检测信号弱，灵敏度低等问题。

因此，需要提供一种新型的检测水体生物毒性的电化学传感器及其制备方法。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种可用于即时监测和检测水体生物毒性的电化学生物传感器；它包括工作电极、对电极、参比电极、电解池；它可进行即时监测水体生物毒性的改变和检测水体生物毒性大小，达到即时、在线、连续的检测，具有分析灵敏度高、成本低廉、操作简单、便于携带等特点。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种可用于即时监测和检测水体生物毒性的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：

一种检测水体急性生物毒性的双电子介体电化学生物传感器，其通过如下方法制备：

制备微生物菌液；将电子介体固定在菌体表面；制备高分子膜包覆电极；所述高分子膜包覆电极吸附固定微生物菌体，制得双电子介体电化学生物传感器；

其中，所述电子介体固定在菌体表面的方法包括如下步骤：在菌液体系中加入葡萄糖、水溶性介体和脂溶性介体，恒温培养；离心法洗涤菌体；重悬菌体得到固定有双电子介体的菌液；所述水溶性介体为铁氰化钾；所述脂溶性介体选自苯醌、二氯酚靛酚、甲萘醌、中性红、没食子蓝、甲基红、1-甲氧基吩嗪硫酸甲酯、异吩恶唑酮或2,3,5,6-四甲基-1,4-苯二胺和甲苯胺蓝，优选为甲萘醌；

所述制备高分子生物膜包覆电极的方法包括如下步骤：制备壳聚糖水溶胶；将所述水溶胶电沉积于玻碳电极表面，清洗，制得高分子生物膜包覆电极；其中所述壳聚糖水溶胶为：硼掺杂纳米金刚石壳聚糖水溶胶、石墨烯壳聚糖水溶胶或碳量子点壳聚糖水溶胶，优选为硼掺杂纳米金刚石壳聚糖水溶胶；

所述高分子膜包覆电极吸附固定微生物菌体的方法包括如下步骤：将高分子生物膜包覆电极浸泡在固定有电子介体的菌液中，静置吸附；清洗，即获得微生物传感器。所述菌体为大肠杆菌或酵母，优选地，所述酵母为酿酒酵母。

其中所述培养基为细菌或真菌培养基，优选地，所述细菌培养基选自但不限于LB培养基、SOB培养基或SOC培养基；所述真菌培养基选自但不限于YPD、YEPD或MA培养基。所述培养基为无菌培养基。优选地，培养菌体至对数生长期。

所述收集菌体的方法为：离心分离培养的菌体；离心法洗涤菌体；将清洗后的菌体重新悬浮，即得到微生物菌液。所述收集菌体的方法进一步包括将菌液浓度调整至OD600＝3.0。

所述离心法洗涤菌体是指用缓冲液将菌体重悬后，再次离心菌体，以收集菌体。可用离心法多次洗涤菌体沉淀。所用缓冲液可以是本领域可用的缓冲液，如PBS、0.65-0.9％的NaCl或TBS。

所述葡萄糖的浓度为0-7.5mM；所述脂溶性介体的浓度为0-0.5mM；所述甲萘醌的浓度为0.01-0.1mM；所述铁氰化钾的浓度为5-40mM。

所述制备高分子生物膜包覆电极方法包括如下步骤：制备壳聚糖水溶胶；将所述水溶胶电沉积于玻碳电极表面，清洗，制得高分子生物膜包覆电极。

所述生物传感器可置于4℃冰箱中冷藏待用。

所述双电子介体电化学生物传感器可作为工作电极与对电极与参比电极组成三电极体系。

利用所述双电子介体电化学生物传感器检测水体的生物毒性的方法，包括如下步骤：

在电解池中将工作电极、对电极和参比电极组成三电极体系；在电解池中加入平衡液并施加电压；电流稳定后加入待测样品；利用抑制率判定待测样品的毒性，所述工作电极为双电子介体电化学生物传感器。

所述对电极为Pt电极或碳电极，优选地为Pt对电极。

所述参比电极为饱和甘汞电极或Ag/AgCl(sat’KCl)电极，优选地为Ag/AgCl(sat’KCl)电极。

所施加电压为0.4-0.6V。

样品含有有毒物质时，由于有毒物质对微生物细胞代谢活动的抑制作用，会导致阳极电流的下降。所述抑制率反应加入待测样品前后电流的变化，通过以下公式计算：

抑制率(％)＝(1-I₂/I₁)×100％

其中，I₁是加入待测样品前的稳态电流，I₂是加入待测样品后的稳态电流。

当抑制率为50％时的有毒物质的浓度为该有毒物质的IC50值，IC50值能够间接反应水体生物毒性的大小。

本发明的有益效果如下：

本发明通过铁氰化钾-甲萘醌双电子介体与酵母菌的特异性作用将电子介体固定，并将固定有电子介体的微生物通过吸附的作用制备成微生物膜生物电极，得到全细胞微生物电化学传感器，用于水体中重金属离子、酚类、农药等有毒物质的急性生物毒性检测。双电子介体会大大增强信号强度，提高传感器的灵敏度。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出铁氰化钾-甲萘醌双电子介体检测生物毒性原理图。

图2示出单一电子介体和双电子介体的计时电流曲线。

图3示出3,5-二氯苯酚生物毒性的检测结果。

图4示Cu²⁺的生物毒性的检测结果。

图5示出出3种实际水体生物毒性的检测结果。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1：单一电子介体电化学生物传感器和双电子介体电化学生物传感器电流放大效果对比

1.双电子介体电化学生物传感器的制备：

酿酒酵母的(YEPD)培养基配制方法如下：取1g酵母膏、2g蛋白胨溶于90ml去离子水中，取1g葡萄糖溶于10ml去离子水中，于120℃高压灭菌锅中分别灭菌20min，自然冷却后混合即可使用。

接种培养:取100mL YPED培养基，接种酿酒酵母(S288C)，30℃恒温水浴培养16h，摇床速度200rpm，培养所得细菌正好处于对数生长期。

收集菌体：将培养所得的酵母菌离心分离，转速6000rpm，离心5min，用50mM PBS将离心所得的菌体沉淀清洗两次，然后将清洗后的菌体沉淀重新悬浮在50mM PBS中，得到一定浓度的菌液待用；调整菌液浓度至OD600＝3.0。

2、固定电子介体：在10mL的菌液体系中，加入7.5mM葡萄糖，0.05mM甲萘醌，20mM铁氰化钾，30℃恒温培养1h。将培养后的菌体6000rpm离心8min，所得到的菌体用50mM PBS重新悬浮，定容至10mL。

3、制备高分子膜包覆电极：取0.1g壳聚糖，100μl冰醋酸，7.455mg KCl，5mg cBND，超声溶解在10mL超纯水中，制得硼掺杂纳米金刚石壳聚糖水溶胶。将所得到的壳聚糖水溶胶在-3V vs Ag/AgCl(sat’KCl)的电压下电沉积5min，得到沉积有壳聚糖薄膜的玻碳电极，将所得到的沉积有壳聚糖薄膜的玻碳电极用超纯水反复清洗，洗去未沉积的壳聚糖溶胶，制得高分子膜包覆电极。

4.制备双电子介体电化学生物传感器：将高分子膜包覆电极浸泡在上述步骤中所得的吸附有介体的菌体悬浮液中，静置吸附30min，用超纯水反复清洗，洗去未完全吸附的菌体，即制得双电子介体生物传感器，所得工作电极可置于4℃冰箱中冷藏待用。

5.单电子介体生物传感器的制备：

采用与双电子介体电化学生物传感器中相同的步骤合成高分子膜包覆的电极，但是在介体吸附固定中采用单电子介体，制备单电子介体电化学生物传感器)，具体步骤如下：

在10mL的菌液体系中，加入7.5mM葡萄糖，0.05mM甲萘醌，30℃恒温培养1h。将培养后的菌体6000rpm离心8min，所得到的菌体用50mM重新悬浮，定容至10mL，获得吸附有单电子介体(甲萘醌)的菌体悬浮液。

将高分子膜包覆电极浸泡在所得的吸附有单电子介体的菌体悬浮液中，静置吸附30min，用超纯水反复清洗，洗去未完全吸附的菌体，即制得甲萘醌单介体电化学生物传感器；

在10mL的菌液体系中，加入7.5mM葡萄糖，20mM K₃Fe(CN)₆，30℃恒温培养1h。将培养后的菌体6000rpm离心8min，所得到的菌体用50mMPBS重新悬浮，定容至10mL，获得吸附有单电子介体(K₃Fe(CN)₆)的菌体悬浮液。

将沉积有壳聚糖薄膜的玻碳电极浸泡在所得的吸附有单电子介体(K₃Fe(CN)₆)的菌体悬浮液中，静置吸附30min，用超纯水反复清洗，洗去未完全吸附的菌体，即制得K₃Fe(CN)₆单介体电化学生物传感器；

6.电流信号检测：

将双电子生物传感器用O型垫圈压紧作为工作电极，Pt丝为对电极，Ag/AgCl(sat’KCl)为参比电极组装成三电极体系。电解池中加入超纯水作为平衡溶液，施加0.4V电压(vs Ag/AgCl sat’KCl)，待体系稳定5min后加入25mg/L 3,5-二氯苯酚(DCP)溶液，测量加入毒物前后的稳态电流。

采用上述相同步骤，将单电子介体生物传感器用O型垫圈压紧作为工作电极，Pt丝为对电极，Ag/AgCl(sat’KCl)为参比电极组装成三电极体系。电解池中加入超纯水作为平衡溶液，施加0.4V电压(vs Ag/AgCl sat’KCl)，待体系稳定5min后加入25mg/L 3,5-二氯苯酚(DCP)溶液，测量加入毒物前后的稳态电流。

7.结果分析

当采用双电子介体电化学生物传感器作为工作电极时，其电流强度是使用K₃Fe(CN)₆作为电子介体的单电子介体电化学生物传感器的2倍，是使用甲萘醌作为电子介体的单电子介体电化学生物传感器的13倍。此外，当使用双电子介体电化学生物传感器时，对毒物的检测灵敏度也比使用单电子介体电化学生物传感器有很大提升，如图2，当在300s处加入25mg/L DCP时，双电子介体电化学生物传感器的电流出现明显的下降，而两种单电子介体电弧学生物传感器对毒物的信号响应并不明显。因此，采用双电子介体电化学生物传感器对电流信号强度，检测灵敏度都有很大的提升。

实施例2：3,5-二氯苯酚的水体生物毒性检测：

1.制备工作电极

酿酒酵母的(YEPD)培养基配制方法如下：取1g酵母膏、2g蛋白胨溶于90ml去离子水中，取1g葡萄糖溶于10ml去离子水中，于120℃高压灭菌锅中分别灭菌20min，自然冷却后混合即可使用。

接种培养:取100mL YPED培养基，接种酿酒酵母(S288C)，30℃恒温水浴培养16h，摇床速度200rpm，培养所得细菌正好处于对数生长期。

收集菌体：将培养所得的酵母菌离心分离，转速6000rpm，离心5min，用50mM PBS将离心所得的菌体沉淀清洗两次，然后将清洗后的菌体沉淀重新悬浮在50mM PBS中，得到一定浓度的菌液待用；调整菌液浓度至OD600＝3.0。

2、固定电子介体：在10mL的菌液体系中，加入7.5mM葡萄糖，0.05mM甲萘醌，20mM铁氰化钾，30℃恒温培养1h。将培养后的菌体6000rpm离心8min，所得到的菌体用50mM PBS重新悬浮，定容至10mL，获得吸附有双电子介体的菌体悬浮液。

3、制备高分子膜包覆电极：取0.1g壳聚糖，100μl冰醋酸，7.455mg KCl，5mg cBND，超声溶解在10mL超纯水中，制得硼掺杂纳米金刚石壳聚糖水溶胶。将所得到的壳聚糖水溶胶在-3V vs Ag/AgCl(sat’KCl)的电压下电沉积5min，得到沉积有壳聚糖薄膜的玻碳电极，将所得到的沉积有壳聚糖薄膜的玻碳电极用超纯水反复清洗，洗去未沉积的壳聚糖溶胶，制得高分子膜包覆电极。

4.制备双电子介体电化学生物传感器：将高分子膜包覆电极浸泡在上述步骤中所得的获得吸附有双电子介体的菌体悬浮液中，静置吸附30min，用超纯水反复清洗，洗去未完全吸附的菌体，即制得双电子介体电化学生物传感器，所得工作电极可置于4℃冰箱中冷藏待用。

5.水体毒性的检测

在室温条件下，将实施例2所制备双电子介体电化学生物传感器作为工作电极用O型垫圈压紧，采用Pt丝作为对电极，Ag/AgCl(sat’KCl)为参比电极组装成三电极体系，电解池中加入超纯水作为平衡溶液，施加0.4V电压(vsAg/AgCl sat’KCl)，待体系稳定5min后加入3,5-二氯苯酚(DCP)溶液，DCP所选取的浓度梯度为0、5、10、15、20、25mg/L，测量加入DCP后的稳态电流。

利用抑制率判定待测样品的毒性。所述抑制率反应加入待测样品前后电流的变化，通过以下公式计算：

抑制率(％)＝(1-I₂/I₁)×100％

其中，I₁是加入待测样品前的稳态电流，I₂是加入待测样品后的稳态电流。

根据公式计算其抑制率，并根据抑制率曲线，见图3，计算其IC50值为16.48mg/L。

实施例3：Cu²⁺的水体生物毒性检测：

制备浓度梯度为0、5、10、15、20、25mg/L的Cu²⁺溶液，检测不同浓度的Cu²⁺的生物毒性，具体检测过程同实施例2，根据公式计算其抑制率，得到浓度-抑制率曲线，见图4。计算得到Cu²⁺的IC50为10.12mg/L。

实施例4：实际水体的生物毒性检测：

对垃圾填埋场废水、电镀废水和实验室有机废水等实际水体的生物毒性进行检测，检测方法同实施例2，根据加入废水前后稳态电流的变化计算抑制率，比较实际废水的生物毒性大小，见图5。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种检测水体急性生物毒性的双电子介体电化学生物传感器，其特征在于，通过如下方法制备：

制备微生物菌液；将电子介体固定在菌体表面；制备高分子膜包覆电极；所述高分子膜包覆电极吸附固定微生物菌体，制得双电子介体电化学生物传感器；

其中，所述电子介体固定在菌体表面的方法包括如下步骤：在菌液体系中加入葡萄糖、水溶性介体和脂溶性介体，恒温培养；离心法洗涤菌体；重悬菌体得到固定有双电子介体的菌液；所述水溶性介体为铁氰化钾；所述脂溶性介体选自苯醌、二氯酚靛酚、甲萘醌、中性红、没食子蓝、甲基红、1-甲氧基吩嗪硫酸甲酯、异吩恶唑酮或2,3,5,6-四甲基-1,4-苯二胺和甲苯胺蓝，优选为甲萘醌；

所述制备高分子生物膜包覆电极的方法包括如下步骤：制备壳聚糖水溶胶；将所述水溶胶电沉积于玻碳电极表面，清洗，制得高分子生物膜包覆电极；其中所述壳聚糖水溶胶为：硼掺杂纳米金刚石壳聚糖水溶胶、石墨烯壳聚糖水溶胶或碳量子点壳聚糖水溶胶，优选为硼掺杂纳米金刚石壳聚糖水溶胶；

所述高分子膜包覆电极吸附固定微生物菌体的方法包括如下步骤：将高分子生物膜包覆电极浸泡在固定有电子介体的菌液中，静置吸附；清洗，即获得微生物传感器。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌体为大肠杆菌或酵母。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为0-7.5mM。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述铁氰化钾的浓度为5-40mM。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脂溶性介体的浓度为0-0.5mM。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甲萘醌的浓度为0.01-0.1mM。

8.利用权利要求1-7任一项所述的生物传感器检测水体的急性生物毒性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

在电解池中将工作电极、对电极和参比电极组成三电极体系，其中所述工作电极为双电子介体电化学生物传感器；在电解池中加入平衡液并施加电压；电流稳定后加入待测样品；利用抑制率判定待测样品的毒性。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抑制率计算公式如下：

抑制率(％)＝(1-I₂/I₁)×100％

其中，I₁是加入待测样品前的稳态电流，I₂是加入待测样品后的稳态电流。