CN114252487A - 酶电极、电化学生物传感器、水中苯酚浓度的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶电极、电化学生物传感器、水中苯酚浓度的分析方法。该制备方法包括以下步骤：将酶溶液和导电材料溶液混合，得到具有导电性的酶生物识别体溶液；制备纳米金刚石修饰的电极；将偶联剂溶液与所述具有导电性的酶生物识别体溶液进行混合，之后滴在所述纳米金刚石修饰的电极的表面，除去溶剂后得到所述酶电极。本发明的电化学生物传感器可进行即时的对于水中酚类浓度的定量测定，达到及时、在线、连续的检测，具有较宽的分析浓度范围(适用于ppm和ppb级别)、便于携带、操作简单、精准度高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及苯酚类化合物的含量检测。更具体地，涉及一种酶电极、电化学生物传感器、水中苯酚浓度的分析方法。
背景技术
环境中的酚污染主要指酚类化合物对水体的污染。含酚废水是当今世界上危害大、污染范围广的工业废水之一，是水环境污染的重要来源。含酚废水直接排放、灌溉农田则可污染水、土壤、农作物甚至大气(酚类具有挥发性)，危害人类健康。因此，酚及酚类化合物是环境监测的一个重要的指标，规范和完善酚类在水中含量的指标显得尤为重要。
在我国规定的标准检验方法中，测定水中酚类的方法很多，常用的方法有溴化容量法和4-氨基安替比林比色法。溴化容量法适用于酚类浓度较高的水体，而不适于痕量酚类污染物的测定；4-氨基安替比林比色法操作繁杂，需要蒸馏、分析速度慢、易受干扰，且不易实现在线连续监测和自动化，送样范围局限性较大。
因此，开发一种准确、快速、选择性好的方法测定酚类化合物，是当今这一研究领域的热点。
电化学检测法具有快速、简便、易于实现在线检测和自动化的特点。但是如果单纯利用电化学方法通过苯酚在阳极上直接氧化进行测定，苯酚的氧化产物很容易聚合并沉积在电极表面，从而影响进一步的测试。再者，有机废水中成分复杂，可能产生其他干扰。
因此，近些年来，酚氧化酶生物传感器，即采用酶修饰电极的电化学检测酚类方法得到一定程度的关注和应用。基于酶电极的电化学检测酚类化合物的方法因其灵敏度高、响应速度快、选择性好，且可实现在线监测等特点引起了研究者的极大兴趣。但由于酶在电极的固定及活性的提高等问题，使得此类电化学生物传感器的检测范围过窄，无法多次使用以及重现性较差等；因此，还需进一步设计研发新的酶电极以克服以上酚氧化酶生物传感器的缺陷。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种酶电极的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供一种以上制备方法得到的酶电极。
本发明的第三个目的在于提供一种包含以上酶电极的电化学生物传感器。
本发明的第四个目的在于提供一种实时监测水中苯酚类化合物浓度的分析方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供一种酶电极的制备方法，包括以下步骤：
将酶溶液和导电材料溶液混合，得到具有导电性的酶生物识别体溶液；
制备纳米金刚石修饰的电极；
将偶联剂溶液与所述具有导电性的酶生物识别体溶液进行混合，之后滴在所述纳米金刚石修饰的电极的表面，除去溶剂后得到所述酶电极。
本发明的制备方法中，将导电性能优异的导电材料与酶结合制备具有导电性的酶生物识别体，增加酶与电极的电荷传递能力。为提高电极材料的生物兼容性，制备纳米金刚石修饰的电极；利用偶联剂交联经过导电修饰的酶生物识别体，使其与纳米金刚石修饰电极紧密结合，得到性能稳定的，以酶为生物识别体的、酚类化合物检测酶电极。所制备酶电极置于4℃冰箱中冷藏待用，不用时可冷冻于-30℃低温冰箱中进行长期性保存。
根据本发明的制备方法，优选地，所述导电材料包括纳米金、碳量子点和多壁碳纳米管中的一种或两种以上的组合。
根据本发明的制备方法，优选地，所述导电材料为多壁碳纳米管。更优选地，多壁碳纳米管溶液浓度为10mg/mL。
基于本发明的制备方法，优选的，所述酶包括酪氨酸酶、多酚氧化酶、微生物漆酶和苯酚酶中的一种或两种以上的组合。
基于本发明的制备方法，优选的，所述酶为酪氨酸酶。更优选地，酪氨酸酶溶液的浓度为5KU/μL。
基于本发明的制备方法，优选的，所述偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)组成的偶联剂，或戊二醛。
基于本发明的制备方法，优选的，所述偶联剂为戊二醛。更优选地，戊二醛溶液的溶剂为水浓度为2.5％v/v。
基于本发明的制备方法，优选的，所述将酶溶液和导电材料溶液混合，得到具有导电性的酶生物识别体溶液的步骤包括以下过程：
将酶溶液和超声分散过的导电材料溶液充分混合，4℃环境下静置共同培育30min，使酶能够充分吸附在导电材料上；
所述酶溶液通过如下步骤获得：将酶冻干粉与磷酸盐缓冲溶液混合稀释，获得一定浓度的酶溶液。所用缓冲液还可以是本领域可用的其他生物缓冲液。更优选地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度0.1M。
基于本发明的制备方法，优选的，所述制备纳米金刚石修饰的电极的步骤包括以下过程：
将纳米金刚石和固定液进行混合并且反复超声，制得纳米金刚石基底溶液；其中，所述固定液为可溶性淀粉胶体或壳聚糖溶液；
将所述纳米金刚石基底溶液滴在抛光过的玻碳表面，在室温下晾干，即得到所述米金刚石修饰的电极。更优选地，所述纳米金刚石基底溶液的浓度为1mg/mL。
基于本发明的制备方法，优选的，所述玻碳使用前，在5000目的砂纸上，用30-50nm的氧化铝粉末浆中打磨至光亮，用硝酸：水(V/V＝1:1)，乙醇和纯水先后超声清洗后使用。
基于本发明的制备方法，优选的，所述固定液为可溶性淀粉胶体；所述可溶性淀粉胶体的制备如下步骤：
可溶性淀粉加入稀释的醋酸溶液中，加热回流后冷却，即得到所述可溶性淀粉胶体；更优选地，所述可溶性淀粉胶体的浓度为l mg/mL。
基于本发明的制备方法，优选的，所述除去溶剂通过自然低温风干。
第二方面，本发明提供一种通过以上制备方法获得的酶电极。
第三方面，本发明提供一种包含以上酶电极的电化学生物传感器。
基于本发明的电化学生物传感器，优选地，所述电化学生物传感器包括三电极体系和电解池；
所述三电极体系包括工作电极、对电极和参比电极，所述工作电极为所述酶电极。
所述参比电极为饱和甘汞电极或饱和银/氯化银电极。
基于本发明的电化学生物传感器，优选地，所述参比电极为饱和银/氯化银电极。
基于本发明的电化学生物传感器，优选地，所述对电极为Pt电极或碳电极。
基于本发明的电化学生物传感器，优选地，所述对电极为Pt电极。
基于本发明的电化学生物传感器，优选地，所述参比电极为饱和银/氯化银电极；所述对电极为Pt电极。
第三方面，本发明提供一种使用以上电化学生物传感器实时监测水中苯酚类化合物浓度的分析方法，该分析方法包括以下步骤：
在电解池中将工作电极、对电极和参比电极组成三电极体系；在电解池中施加电压从而测定电流，从而参照标准曲线测定样品的所含苯酚类化合物浓度的含量。
根据本发明的分析方法，优选地，所述标准曲线根据以下方法获得：
将0.1M磷酸缓冲盐溶液至于电解池中，待初始电流平稳后，每间隔150s/100s 滴加1μL标准浓度为1mM的苯酚类化合物的测试溶液进行计时电流的测定，每一次测量等背景电流达到稳态电流时进行测试；测试范围为1-10μM的浓度与电流的计时电流法；记录还原电流随着时间改变的曲线；电压设定为-0.05V/-0.1V；利用测得的多个浓度对应的电流值，建立浓度-电流的线性回归方程：
|I|＝KC+A
其中I代表在特定浓度C下的电流值，C代表反应池中液体的浓度值。K、A皆为拟合值。拟合结果结果要求R2值达到0.97以上。
根据本发明的分析方法，优选地，将待测水样加入电解池中，利用磷酸缓冲盐干粉调节至0.1M磷酸缓冲盐溶液状态，待初始电流平稳后，根据电流值，利用所建立的浓度-电流的线性回归方程，计算出待测水样中苯酚类化合物的浓度。
本发明的有益效果如下：
本发明的酶电极中，将导电性能优异的导电介质与酶结合制备具有导电性的酶生物识别体，增加酶与电极的电荷传递能力；为提高电极材料的生物兼容性，使用纳米金刚石修饰的电极；利用偶联剂交联经过导电修饰的酶生物识别体使其与纳米金刚石修饰电极紧密结合，得到性能稳定的，以酶为生物识别体的酚类化合物检测电化学生物传感器。
本发明的电化学生物传感器可进行即时的对于水中酚类浓度的定量测定，达到及时、在线、连续的检测，具有较宽的分析浓度范围(适用于ppm和ppb级别)、便于携带、操作简单、精准度高等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出实施例1中酪氨酸酶修饰的玻碳电极的制备过程示意图。
图2示出实施例1中传感器对苯酚的电流随浓度加入后变化的时间-电流图。
图3示出实施例1中苯酚浓度与传感器测试电流的拟合线性图。
图4示出实施例2中传感器对对氯苯酚的电流随浓度加入后变化的时间-电流图。
图5示出实施例2中对氯苯酚浓度与传感器测试电流的拟合线性图。
图6示出实施例3中传感器对儿茶酚的电流随浓度加入后变化的时间-电流图。
图7示出实施例3中儿茶酚浓度与传感器测试电流的拟合线性图。
图8示出实施例4中传感器对对甲基苯酚的电流随浓度加入后变化的时间-电流图。
图9示出实施例4中对甲基苯酚浓度与传感器测试电流的拟合线性图。
图10示出实施例5中实际水体对酚类的响应的检测结果。
具体实施方式
为使本发明的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
酪氨酸酶电化学传感器对于苯酚浓度的检测方法
该实施例中的酪氨酸酶修饰的玻碳电极的制备过程示意图如图1所示，碳纳米管导电修饰的酪氨酸酶经过戊二醛偶联剂与纳米金刚石修饰电极结合，得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极；具体的过程包括以下步骤：
1)纳米金刚石酪氨酸酶电化学生物传感器的基底制备：
可溶性淀粉胶体的制备方法如下：
可溶性淀粉取10mg溶解在10mL含有5％(v/v)醋酸溶液(500μL+9.5mL水) 中并且在85℃下加热回流1小时，得到可溶性淀粉胶体，所得溶液在冰箱中冷却并冷藏。
纳米金刚石(NDs)修饰电极的制备：
1mg纳米金刚石粉末(颗粒大小：3-7μm)与1mL可溶性淀粉胶体超声混匀，取15μL滴在抛光过的玻碳表面，在室温下晾干。玻碳使用前，需要在5000目的砂纸上，用30-50nm的氧化铝粉末浆中打磨至光亮，用硝酸和水溶液(V/V＝1:1)，乙醇和纯水先后超声清洗后使用。
2)导电性生物识别体-酪氨酸酶在电极上的固定：
将含有10μL 5KUμL-1酪氨酸酶溶液(2500KU酪氨酸酶干粉+500μL PBS缓冲溶液)和5μL的碳纳米管溶液(10mg/mL)混合，在冰箱里共混并静置30min，使得碳纳米管更好的接近酶的活性位点，得到修饰酪氨酸酶溶液再与5μL的戊二醛偶联剂(2.5％v/v)(25％戊二醛溶液加水稀释10倍)混合，一起滴加在有NDs-淀粉的玻碳表面，放置通风阴凉处晾干。用0.1MPBS轻柔的冲洗此电极，即得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极，放在超低温环境(＜-20℃)下冷藏可长期保存。
3)电化学测试及仪器装置：
将酶电极用O型垫圈压紧作为工作电极，本方法电化学测定采用三电极体系，以酪氨酸酶修饰的玻碳电极(d＝5mm)作工作电极，铂电极作对电极，饱和银/氯化银作参比电极，室温高速搅拌下进行实验。
4)标准浓度曲线的建立：
反应缓冲液为10mL 0.1M PBS，待初始电流平稳后，每间隔150s/100s滴加1μL 标准浓度为1mM的苯酚的测试溶液进行计时电流的测定。每一次测量等背景电流达到稳态电流时进行测试。测试范围为1-10μM的浓度与电流的计时电流法，共测得10 个数据。记录还原电流随着时间改变的曲线，如图2所示。建议电压设定为-0.05V/-0.1 V为最佳测试电压。利用测得的10个浓度对应的电流值，建立浓度-电流的线性回归方程，如图3所示。
|I|＝KC+A
其中I代表在特定浓度C下的电流值，C代表反应池中液体的浓度值。K,A皆为拟合值。拟合结果结果要求R2值达到0.97以上才能进行未知浓度的测定。
5)未知浓度苯酚溶液的测定：
将未知溶液加入反应池中，利用PBS干粉调节指0.1M PBS溶液状态，待初始电流平稳后，根据电流值，利用上述公式，计算出未知浓度的大小。对于浓度过大的样品，可进行稀释测定。
实施例2：
酪氨酸酶电化学传感器对于对氯苯酚浓度的检测方法
1)纳米金刚石酪氨酸酶电化学生物传感器的基底的制备：
可溶性淀粉胶体的制备方法如下：
可溶性淀粉取10mg溶解在10mL含有5％(v/v)醋酸溶液(500μL+9.5mL水) 中并且在85℃下加热回流1小时，得到可溶性淀粉胶体，所得溶液在冰箱中冷却并冷藏。
纳米金刚石(NDs)修饰电极的制备：
1mg纳米金刚石粉末(颗粒大小：3-7nm)与1mL可溶性淀粉胶体超声混匀，取15μL滴在抛光过的玻碳表面，在室温下晾干。玻碳使用前，需要在5000目的砂纸上，用30-50nm的氧化铝粉末浆中打磨至光亮，用硝酸和水溶液(V/V＝1:1)，乙醇和纯水先后超声清洗后使用。
2)导电性生物识别体-酪氨酸酶在电极上的固定：
将含有10μL 5KUμL-1酪氨酸酶溶液(2500KU酪氨酸酶干粉+500μL PBS缓冲溶液)和5μL的碳纳米管溶液(10mg/mL)混合，在冰箱里共混并静置30min，使得碳纳米管更好的接近酶的活性位点，得到修饰酪氨酸酶溶液再与5μL的戊二醛偶联剂 (2.5％v/v)(25％戊二醛溶液加水稀释10倍)混合，一起滴加在有NDs-淀粉的玻碳表面，放置通风阴凉处晾干。用0.1M PBS轻柔的冲洗此电极，即得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极，放在超低温环境(＜-20℃)下冷藏保存备用。
3)电化学测试及仪器装置：
电化学测定采用三电极体系，以酪氨酸酶修饰的玻碳电极(d＝5mm)作工作电极，铂电极作对电极，饱和银/氯化银作参比电极，室温高速搅拌下进行实验。
4)标准浓度曲线的建立：
反应缓冲液为10mL 0.1M PBS，待初始电流平稳后，每间隔150s/100s滴加1μL 标准浓度为1mM的对氯苯酚的测试溶液进行计时电流的测定。每一次测量等背景电流达到稳态电流时进行测试。测试范围为1-10uM的浓度与电流的计时电流法。记录还原电流随着时间改变的曲线，如图4所示。建议电压设定为-0.05V/-0.1V为最佳测试电压。利用测得的10个浓度对应的电流值，建立浓度-电流的线性回归方程，如图 5所示。
|I|＝KC+A
其中I代表在特定浓度C下的电流值，C代表反应池中液体的浓度值。K,A皆为拟合值。拟合结果要求R2值达到0.97以上才能进行未知浓度的测定。
5)未知浓度对氯苯酚溶液的测定：
将未知溶液加入反应池中，利用PBS干粉调节指0.1MPBS溶液状态，待初始电流平稳后，根据电流值，利用上述公式，计算出未知浓度的大小。对于浓度过大的样品，可进行稀释测定。
实施例3：
酪氨酸酶电化学传感器对于儿茶酚浓度的检测方法
1)纳米金刚石酪氨酸酶电化学生物传感器的基底的制备：
可溶性淀粉胶体的制备方法如下：
可溶性淀粉取10mg溶解在10mL含有5％(v/v)醋酸溶液(500μL+9.5mL水) 中并且在85℃下加热回流1小时，得到可溶性淀粉胶体，所得溶液在冰箱中冷却并冷藏。
纳米金刚石(NDs)修饰电极的制备：
1mg纳米金刚石粉末(颗粒大小：3-7nm)与1mL可溶性淀粉胶体超声混匀，取15μL滴在抛光过的玻碳表面，在室温下晾干。玻碳使用前，需要在5000目的砂纸上，用30-50nm的氧化铝粉末浆中打磨至光亮，用硝酸和水溶液(V/V＝1:1)，乙醇和纯水先后超声清洗后使用。
2)将含有10μL 5KUμL-1酪氨酸酶溶液(2500KU酪氨酸酶干粉+500μL PBS 缓冲溶液)和5μL的碳纳米管溶液(10mg/mL)混合，在冰箱里共混并静置30min，使得碳纳米管更好的接近酶的活性位点，得到修饰酪氨酸酶溶液再与5μL的戊二醛偶联剂(2.5％v/v)(25％戊二醛溶液加水稀释10倍)混合，一起滴加在有NDs-淀粉的玻碳表面，放置通风阴凉处晾干。用0.1M PBS轻柔的冲洗此电极，即得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极，放在超低温环境(＜-20℃)下冷藏保存备用。
3)电化学测试及仪器装置：
电化学测定采用三电极体系，以酪氨酸酶修饰的玻碳电极(d＝5mm)作工作电极，铂电极作对电极，饱和银/氯化银作参比电极，室温高速搅拌下进行实验。
4)标准浓度曲线的建立：
反应缓冲液为10mL 0.1M PBS，待初始电流平稳后，每间隔150s/100s滴加1μL 标准浓度为1mM的儿茶酚的测试溶液进行计时电流的测定。每一次测量等背景电流达到稳态电流时进行测试。测试范围为1-10μM的浓度与电流的计时电流法。记录还原电流随着时间改变的曲线，如图6所示。建议电压设定为-0.05V/-0.1V为最佳测试电压。利用测得的10个浓度对应的电流值，建立浓度-电流的线性回归方程，如图7 所示。
|I|＝KC+A
其中I代表在特定浓度C下的电流值，C代表反应池中液体的浓度值。K,A皆为拟合值。拟合结果结果要求R2值达到0.97以上才能进行未知浓度的测定。
5)未知浓度儿茶酚溶液的测定：
将未知溶液加入反应池中，利用PBS干粉调节指0.1M PBS溶液状态，待初始电流平稳后，根据电流值，利用上述公式，计算出未知浓度的大小。对于浓度过大的样品，可进行稀释测定。
实施例4：
酪氨酸酶电化学传感器对于对甲基苯酚浓度的检测方法
1)纳米金刚石酪氨酸酶电化学生物传感器的基底的制备：
可溶性淀粉胶体的制备方法如下：
可溶性淀粉取10mg溶解在10mL含有5％(v/v)醋酸溶液(500μL+9.5mL水) 中并且在85℃下加热回流1小时，得到可溶性淀粉胶体，所得溶液在冰箱中冷却并冷藏。
纳米金刚石(NDs)修饰电极的制备：
1mg纳米金刚石粉末(颗粒大小：3-7nm)与1mL可溶性淀粉胶体超声混匀，取15μL滴在抛光过的玻碳表面，在室温下晾干。玻碳使用前，需要在5000目的砂纸上，用30-50nm的氧化铝粉末浆中打磨至光亮，用硝酸和水溶液(V/V＝1:1)，乙醇和纯水先后超声清洗后使用。
2)导电性生物识别体-酪氨酸酶在电极上的固定：
将含有10μL 5KUμL-1酪氨酸酶溶液(2500KU酪氨酸酶干粉+500μL PBS缓冲溶液)和5μL的碳纳米管溶液(10mg/mL)混合，在冰箱里共混并静置30min，使得碳纳米管更好的接近酶的活性位点，得到修饰酪氨酸酶溶液再与5μL的戊二醛偶联剂 (2.5％v/v)(25％戊二醛溶液加水稀释10倍)混合，一起滴加在有NDs-淀粉的玻碳表面，放置通风阴凉处晾干。用0.1M PBS轻柔的冲洗此电极，即得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极，放在超低温环境(＜-20℃)下冷藏保存备用。
3)电化学测试及仪器装置：
电化学测定采用三电极体系，以酪氨酸酶修饰的玻碳电极(d＝5mm)作工作电极，铂电极作对电极，饱和银/氯化银作参比电极，室温高速搅拌下进行实验。
4)标准浓度曲线的建立：
反应缓冲液为10mL 0.1M PBS，待初始电流平稳后，每间隔150s/100s滴加1μL 标准浓度为1mM的对甲基苯酚的测试溶液进行计时电流的测定。每一次测量等背景电流达到稳态电流时进行测试。测试范围为1-10μM的浓度与电流的计时电流法。记录还原电流随着时间改变的曲线，如图8所示。建议电压设定为-0.05V/-0.1V为最佳测试电压。利用测得的10个浓度对应的电流值，建立浓度-电流的线性回归方程，如图9所示。
|I|＝KC+A
其中I代表在特定浓度C下的电流值，C代表反应池中液体的浓度值。K,A皆为拟合值。拟合结果要求R2值达到0.97以上才能进行未知浓度的测定。
5)未知浓度对甲基苯酚溶液的测定：
将未知溶液加入反应池中，利用PBS干粉调节指0.1M PBS溶液状态，待初始电流平稳后，根据电流值，利用上述公式，计算出未知浓度的大小。对于浓度过大的样品，可进行稀释测定。
实施例5：
实际水体的酚类浓度的检测
对于焦化厂，煤炭厂的生产废水进行浓度含量的检测，检测方法同实施例1-4中提到的未知浓度的样品的方法一致。如图10所示，根据所得到末端的电流值I，代入前面拟合的检测苯酚线性方程(图3)中进行计算，得出浓度C。
实施例6：
利用纳米金制作酪氨酸酶电化学传感器
1)纳米金刚石酪氨酸酶电化学生物传感器的基底的制备：
可溶性淀粉胶体的制备方法如下：
可溶性淀粉取10mg溶解在10mL含有5％(v/v)醋酸溶液(500μL+9.5mL水) 中并且在85℃下加热回流1小时，得到可溶性淀粉胶体，所得溶液在冰箱中冷却并冷藏。
纳米金刚石(NDs)修饰电极的制备：
1mg纳米金刚石粉末(颗粒大小：3-7nm)与1mL可溶性淀粉胶体超声混匀，取15μL滴在抛光过的玻碳表面，在室温下晾干。玻碳使用前，需要在5000目的砂纸上，用30-50nm的氧化铝粉末浆中打磨至光亮，用硝酸和水溶液(V/V＝1:1)，乙醇和纯水先后超声清洗后使用。
纳米金溶液的制备：
将0.1g的氯金酸溶于5mL水中，取0.7mL液体溶于100mL水中加热至沸腾，一边剧烈搅拌一边加入浓度为0.04M的柠檬酸钠3mL，保持溶液沸腾30min，移除热源再搅拌10min。6500rpm转速下离心5min，取上层清液即制成纳米金溶液。
2)将含有10μL 5KUμL-1酪氨酸酶溶液(2500KU酪氨酸酶干粉+500μL PBS 缓冲溶液)和5μL的纳米金溶液混合，在冰箱里共混并静置30min，得到修饰酪氨酸酶溶液再与5μL的戊二醛偶联剂(2.5％v/v)(25％戊二醛溶液加水稀释10倍)混合，一起滴加在有NDs-淀粉的玻碳表面，放置通风阴凉处晾干。用0.1M PBS轻柔的冲洗此电极，即得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极，放在超低温环境(＜-20℃)下冷藏保存备用。
3)电化学测试及仪器装置：
电化学测定采用三电极体系，以酪氨酸酶修饰的玻碳电极(d＝5mm)作工作电极，铂电极作对电极，饱和银/氯化银作参比电极，室温高速搅拌下进行实验。
实施例7：
利用碳量子点制作酪氨酸酶传感器
1)纳米金刚石酪氨酸酶电化学生物传感器的基底的制备：
可溶性淀粉胶体的制备方法如下：
可溶性淀粉取10mg溶解在10mL含有5％(v/v)醋酸溶液(500μL+9.5mL水) 中并且在85℃下加热回流1小时，得到可溶性淀粉胶体，所得溶液在冰箱中冷却并冷藏。
纳米金刚石(NDs)修饰电极的制备：
1mg纳米金刚石粉末(颗粒大小：3-7nm)与1mL可溶性淀粉胶体超声混匀，取15μL滴在抛光过的玻碳表面，在室温下晾干。玻碳使用前，需要在5000目的砂纸上，用30-50nm的氧化铝粉末浆中打磨至光亮，用硝酸和水溶液(V/V＝1:1)，乙醇和纯水先后超声清洗后使用。
碳量子点溶液的制备：
碳量子点由蜡烛灰收集，将玻璃片置于燃烧的蜡烛火焰上方，让蜡烛灰吸附在玻璃片上，称取30mg粗蜡烛灰分散于20mL水和乙醇的混合溶液中(V/V＝1:1)超声分散，而后在3500rpm下离心5min，取上清液在6000rpm转速下离心10min，得到的黑色沉淀干燥后即可得到碳量子点，取0.2mg碳量子点与1mL水溶液混合得到碳量子点溶液。
2)将含有10μL 5KUμL-1酪氨酸酶溶液(2500KU酪氨酸酶干粉+500μL PBS 缓冲溶液)和5μL的0.2mg/mL碳量子点溶液混合，在冰箱里共混并静置30min，得到修饰酪氨酸酶溶液再与5μL的戊二醛偶联剂(2.5％v/v)(25％戊二醛溶液加水稀释 10倍)混合，一起滴加在有NDs-淀粉的玻碳表面，放置通风阴凉处晾干。用0.1M PBS 轻柔的冲洗此电极，即得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极，放在超低温环境(＜-20℃)下冷藏保存备用。
3)电化学测试及仪器装置：
电化学测定采用三电极体系，以酪氨酸酶修饰的玻碳电极(d＝5mm)作工作电极，铂电极作对电极，饱和银/氯化银作参比电极，室温高速搅拌下进行实验。
实施例8：
利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)制作酪氨酸酶传感器
1)纳米金刚石酪氨酸酶电化学生物传感器的基底的制备：
可溶性淀粉胶体的制备方法如下：
可溶性淀粉取10mg溶解在10mL含有5％(v/v)醋酸溶液(500μL+9.5mL水) 中并且在85℃下加热回流1小时，得到可溶性淀粉胶体，所得溶液在冰箱中冷却并冷藏。
纳米金刚石(NDs)修饰电极的制备：
1mg纳米金刚石粉末(颗粒大小：3-7nm)与1mL可溶性淀粉胶体超声混匀，取15μL滴在抛光过的玻碳表面，在室温下晾干。玻碳使用前，需要在5000目的砂纸上，用30-50nm的氧化铝粉末浆中打磨至光亮，用硝酸和溶液(V/V＝1:1)，乙醇和纯水先后超声清洗后使用。
2)将含有10μL 5KUμL-1酪氨酸酶溶液(2500KU酪氨酸酶干粉+500μL PBS 缓冲溶液)和5μL的碳纳米管溶液(10mg/mL)混合，在冰箱里共混并静置30min，使得碳纳米管更好的接近酶的活性位点，得到修饰酪氨酸酶溶液再与5μL 10mM1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),5μL 20mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 混合，一起滴加在有NDs-淀粉的玻碳表面，放置通风阴凉处晾干。用0.1M PBS轻柔的冲洗此电极，即得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极，放在超低温环境(＜-20℃)下冷藏保存备用。
3)电化学测试及仪器装置：
电化学测定采用三电极体系，以酪氨酸酶修饰的玻碳电极(d＝5mm)作工作电极，铂电极作对电极，饱和银/氯化银作参比电极，室温高速搅拌下进行实验。
实施例9：
利用壳聚糖溶液制作酪氨酸酶传感器
1)纳米金刚石酪氨酸酶电化学生物传感器的基底的制备：
壳聚糖溶液的制备方法：
壳聚糖水溶液由(0.2％，w/v)由壳聚糖粉末溶于醋酸水溶液(0.1％，v/v)中得到。
纳米金刚石(NDs)修饰电极的制备：
1mg纳米金刚石粉末(颗粒大小：3-7nm)与1mL壳聚糖超声混匀，取15μL 滴在抛光过的玻碳表面，在室温下晾干。玻碳使用前，需要在5000目的砂纸上，用 30-50nm的氧化铝粉末浆中打磨至光亮，用硝酸和水溶液(V/V＝1:1)，乙醇和纯水先后超声清洗后使用。
2)将含有10μL 5KUμL-1酪氨酸酶溶液(2500KU酪氨酸酶干粉+500μL PBS 缓冲溶液)和5μL的纳米金溶液混合，在冰箱里共混并静置30min，使得碳纳米管更好的接近酶的活性位点，得到修饰酪氨酸酶溶液再与5μL的戊二醛偶联剂(2.5％v/v) (25％戊二醛溶液加水稀释10倍)混合，一起滴加在有NDs-壳聚糖的玻碳表面，放置通风阴凉处晾干。用0.1MPBS轻柔的冲洗此电极，即得到酪氨酸酶修饰的玻碳电极，放在超低温环境(＜-20℃)下冷藏保存备用。
3)电化学测试及仪器装置：
电化学测定采用三电极体系，以酪氨酸酶修饰的玻碳电极(d＝5mm)作工作电极，铂电极作对电极，饱和银/氯化银作参比电极，室温高速搅拌下进行实验。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种酶电极的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
将酶溶液和导电材料溶液混合，得到具有导电性的酶生物识别体溶液；
制备纳米金刚石修饰的电极；
将偶联剂溶液与所述具有导电性的酶生物识别体溶液进行混合，之后滴在所述纳米金刚石修饰的电极的表面，除去溶剂后得到所述酶电极。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述导电材料包括纳米金、碳量子点和多壁碳纳米管中的一种或两种以上的组合；
优选地，所述导电材料为多壁碳纳米管；
更优选地，多壁碳纳米管溶液浓度为10mg/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶包括酪氨酸酶、多酚氧化酶、微生物漆酶和苯酚酶中的一种或两种以上的组合；
优选的，所述酶为酪氨酸酶；
更优选地，酪氨酸酶溶液的浓度为5KU/μL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺组成的偶联剂，或戊二醛；
优选的，所述偶联剂为戊二醛；
更优选地，戊二醛溶液的溶剂为水浓度为2.5％v/v。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将酶溶液和导电材料溶液混合，得到具有导电性的酶生物识别体溶液的步骤包括以下过程：
将酶溶液和超声分散过的导电材料溶液充分混合，4℃环境下静置共同培育30min，使酶能够充分吸附在导电材料上；
所述酶溶液通过如下步骤获得：将酶冻干粉与磷酸盐缓冲溶液混合稀释，获得一定浓度的酶溶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备纳米金刚石修饰的电极的步骤包括以下过程：
将纳米金刚石和固定液进行混合并且反复超声，制得纳米金刚石基底溶液；其中，所述固定液为可溶性淀粉胶体或壳聚糖溶液；
将所述纳米金刚石基底溶液滴在抛光过的玻碳表面，在室温下晾干，即得到所述米金刚石修饰的电极；
优选的，在5000目的砂纸上，用30-50nm的氧化铝粉末浆中打磨至光亮，用硝酸溶液，乙醇和纯水先后超声清洗后使用；
优选的，所述固定液为可溶性淀粉胶体；所述可溶性淀粉胶体的制备如下步骤：
可溶性淀粉加入稀释的醋酸溶液中，加热回流后冷却，即得到所述可溶性淀粉胶体。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述除去溶剂通过自然低温风干。
8.一种通过权利要求1-7任一项所述制备方法获得的酶电极。
9.一种包含权利要求8所述酶电极的电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器装置包括三电极体系和电解池；
所述三电极体系包括工作电极、对电极和参比电极，所述工作电极为所述酶电极；
优选地，所述参比电极为饱和甘汞电极或饱和银/氯化银电极；更优选地，所述参比电极为饱和银/氯化银电极；
优选地，所述对电极为Pt电极或碳电极；更优选地，所述对电极为Pt电极。
10.一种使用权利要求9所述的电化学生物传感器实时监测水中苯酚类化合物浓度的分析方法，该分析方法包括以下步骤：
在电解池中将工作电极、对电极和参比电极组成三电极体系；在电解池中施加电压从而测定电流，从而参照标准曲线测定样品的所含苯酚类化合物浓度的含量；
优选地，所述标准曲线根据以下方法获得：
将0.1M磷酸缓冲盐溶液至于电解池中，待初始电流平稳后，每间隔150s/100s滴加1μL标准浓度为1mM的苯酚类化合物的测试溶液进行计时电流的测定，每一次测量等背景电流达到稳态电流时进行测试；测试范围为1-10μM的浓度与电流的计时电流法；记录还原电流随着时间改变的曲线；电压设定为-0.05V/-0.1V；利用测得的多个浓度对应的电流值，建立浓度-电流的线性回归方程：
|I|＝KC+A
其中I代表在特定浓度C下的电流值，C代表反应池中液体的浓度值，K、A皆为拟合值；拟合结果结果要求R2值达到0.97以上；
优选地，将待测水样加入电解池中，利用磷酸缓冲盐干粉调节至0.1M磷酸缓冲盐溶液状态，待初始电流平稳后，根据电流值，利用所建立的浓度-电流的线性回归方程，计算出待测水样中苯酚类化合物的浓度。
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Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006292495A (ja) * | 2005-04-08 | 2006-10-26 | Toray Ind Inc | カーボンナノチューブ組成物、バイオセンサーおよびそれらの製造方法 |
| US20100126858A1 (en) * | 2003-01-30 | 2010-05-27 | Tanita Corporation | Chemical sensor type measuring apparatus |
| JP2010197075A (ja) * | 2009-02-23 | 2010-09-09 | Gunze Ltd | 水素ガスセンサ |
| CN102680547A (zh) * | 2011-03-11 | 2012-09-19 | 中国科学院理化技术研究所 | 用于检测水中酚类物质的电极及其制备方法和应用 |
| CN103175884A (zh) * | 2013-03-18 | 2013-06-26 | 山东师范大学 | 一种高灵敏度葡萄糖生物传感器及其制备方法 |
| KR20130084377A (ko) * | 2012-01-17 | 2013-07-25 | 서강대학교산학협력단 | 효소 고정 방법, 이에 의한 효소 센서 및 이를 포함하는 바이오센서 |
| US20130213823A1 (en) * | 2012-02-22 | 2013-08-22 | Advanced Diamond Technologies, Inc. | Electroanalytical sensor based on nanocrystalline diamond electrodes and microelectrode arrays |
| CN103435829A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-12-11 | 烟台绿水赋膜材料有限公司 | 一种基于邻苯二酚衍生物的纳米功能化表面修饰方法 |
| CN104865302A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-08-26 | 浙江工商大学 | 一种Cu/Ag/碳纳米管复合物修饰玻碳电极及其制备方法和应用 |
| KR101574318B1 (ko) * | 2014-10-02 | 2015-12-03 | 한국전기연구원 | 나노 다이아몬드 제조방법 및 제조장치 |
| CN106770563A (zh) * | 2015-11-24 | 2017-05-31 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种检测水体急性生物毒性的双电子介体电化学生物传感器及其应用 |
| CN107037093A (zh) * | 2017-03-02 | 2017-08-11 | 辽宁科技大学 | 一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其制备、应用方法 |
| CN107727721A (zh) * | 2017-09-01 | 2018-02-23 | 浙江工业大学 | 以壳聚糖为粘结剂负载在泡沫镍上的胆碱酯酶电极 |
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100126858A1 (en) * | 2003-01-30 | 2010-05-27 | Tanita Corporation | Chemical sensor type measuring apparatus |
| JP2006292495A (ja) * | 2005-04-08 | 2006-10-26 | Toray Ind Inc | カーボンナノチューブ組成物、バイオセンサーおよびそれらの製造方法 |
| JP2010197075A (ja) * | 2009-02-23 | 2010-09-09 | Gunze Ltd | 水素ガスセンサ |
| CN102680547A (zh) * | 2011-03-11 | 2012-09-19 | 中国科学院理化技术研究所 | 用于检测水中酚类物质的电极及其制备方法和应用 |
| KR20130084377A (ko) * | 2012-01-17 | 2013-07-25 | 서강대학교산학협력단 | 효소 고정 방법, 이에 의한 효소 센서 및 이를 포함하는 바이오센서 |
| US20130213823A1 (en) * | 2012-02-22 | 2013-08-22 | Advanced Diamond Technologies, Inc. | Electroanalytical sensor based on nanocrystalline diamond electrodes and microelectrode arrays |
| CN103175884A (zh) * | 2013-03-18 | 2013-06-26 | 山东师范大学 | 一种高灵敏度葡萄糖生物传感器及其制备方法 |
| CN103435829A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-12-11 | 烟台绿水赋膜材料有限公司 | 一种基于邻苯二酚衍生物的纳米功能化表面修饰方法 |
| KR101574318B1 (ko) * | 2014-10-02 | 2015-12-03 | 한국전기연구원 | 나노 다이아몬드 제조방법 및 제조장치 |
| CN104865302A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-08-26 | 浙江工商大学 | 一种Cu/Ag/碳纳米管复合物修饰玻碳电极及其制备方法和应用 |
| CN106770563A (zh) * | 2015-11-24 | 2017-05-31 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种检测水体急性生物毒性的双电子介体电化学生物传感器及其应用 |
| CN107037093A (zh) * | 2017-03-02 | 2017-08-11 | 辽宁科技大学 | 一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其制备、应用方法 |
| CN107727721A (zh) * | 2017-09-01 | 2018-02-23 | 浙江工业大学 | 以壳聚糖为粘结剂负载在泡沫镍上的胆碱酯酶电极 |
Non-Patent Citations (17)
| Title |
|---|
| GOPAL, P (GOPAL, P.): "Development, validation and enzyme kinetic evaluation of multi walled carbon nano tubes mediated tyrosinase based electrochemical biosensing platform for the voltammetric monitoring of epinephrine", PROCESS BIOCHEMISTRY, 28 April 2020 (2020-04-28) * |
| MAGAR, HS (MAGAR, HEND SAMY): "Highly Sensitive Choline Oxidase Enzyme Inhibition Biosensor for Lead Ions Based on Multiwalled Carbon Nanotube Modified Glassy Carbon Electrodes", ELECTROANALYSIS, 31 July 2017 (2017-07-31) * |
| MOHAMMAD AMINUL HAQUE: "Carbonized Electrodes for Electrochemical Sensing", 2019 IEEE 69TH ELECTRONIC COMPONENTS AND TECHNOLOGY CONFERENCE (ECTC), 31 May 2019 (2019-05-31) * |
| PRAKASH REWATKAR: "ptimized Bucky Paper-Based Bioelectrodes for Oxygen–Glucose Fed Enzymatic Biofuel Cells", IEEE SENSORS JOURNAL, 16 May 2018 (2018-05-16) * |
| YANG, YJ (YANG, YAJIE): "A portable instrument for monitoring acute water toxicity based on mediated electrochemical biosensor: Design, testing and evaluation", CHEMOSPHERE, 18 June 2020 (2020-06-18) * |
| ZHU, ZG: "Nano-yarn carbon nanotube fiber based enzymatic glucose biosensor", XH NANOTECHNOLOGY, 23 April 2010 (2010-04-23) * |
| 丁建英;潘欢欢;张根华;权英;詹月华;: "碳纳米管修饰的过氧化苯甲酰生物传感器的研制", 食品科学, no. 12, pages 227 - 228 * |
| 关波: "纳米金刚石及金刚石薄膜材料的功能化修饰及应用研究", 中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑, 15 March 2011 (2011-03-15) * |
| 周广之: "酪氨酸酶电化学生物传感器的构建和性能研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑, 15 December 2018 (2018-12-15) * |
| 周艳丽;只金芳;: "酪氨酸酶在硼掺杂金刚石薄膜电极上的固定及酚类化合物的检测", 电化学, no. 02, 10 June 2006 (2006-06-10) * |
| 姜姗姗: "现代纳米材料及其技术应用研究", 31 March 2020, 原子能出版社, pages: 143 * |
| 康秀芝: "新型纳米复合材料修饰电化学生物传感器的制备及应用", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑, 15 January 2019 (2019-01-15) * |
| 徐惠: "电聚合固定酶与碳纳米管修饰生物传感器的研究", 中国优秀博硕士学位论文全文数据库 (硕士) 医药卫生科技辑, 15 September 2006 (2006-09-15) * |
| 李银峰: "碳纳米材料制备及其应用研究", 31 March 2019, 中国原子能出版社, pages: 44 * |
| 林玉池: "现代传感技术与系统", 31 July 2009, 机械工业出版社, pages: 285 * |
| 王冕: "酶电极中酶固定化方法的研究进展", 现代商贸工业, 31 July 2017 (2017-07-31) * |
| 贾英民: "酶工程技术及其在农产品加工中应用", 30 June 2020, 中国轻工业出版社, pages: 659 * |
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