CN107037093A - 一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其制备、应用方法 - Google Patents

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赵克娟
李长华
陈佳琪
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Abstract

本发明涉及一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其制备、应用方法，所述酪氨酸酶电化学生物传感器包括对电极、参比电极和工作电极；所述工作电极下述三种电极中的一种：1)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极；2)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3‑氨丙基三乙氧基的玻碳电极；3)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极。本发明所述酪氨酸酶电化学生物传感器具有选择性好、催化活性高、反应速度快、检测范围宽、检测下限低、操作稳定性及储存稳定性好等优点，可用于对多种酚类化合物进行定量分析；其制备方法简单、成本低廉、适用于在线检测，易于应用在实际工业及环境检测。

Description

一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其制备、应用方法
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器技术领域，尤其涉及一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其制备、应用方法。
背景技术
酚类化合物是环境中广泛存在的一类有机污染物，主要来自化工、医药、炼焦等工业排放及农药降解，威胁人类用水安全。随着人们对环境安全意识的逐步提高，迫切要求快速准确地测量地表水及饮用水的安全状况。目前对于酚类有机污染物的主要测定方法有色谱法、紫外分光光度法、流动注射分析法等。但这些方法都存在着仪器昂贵、样品预处理、操作过程复杂、分析周期长以及对工作人员的操作水平要求高等缺点，难以实现产业化，无法满足环境中酚类化合物的准确快速检测的要求。
生物传感器是基于生物组分对底物进行专一的识别，通过信号传导器将产生的信号以光、电等形式传递出来，通过信号大小定量检测底物的一项新技术。因其具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、在复杂的体系中进行在线连续监测，特别是它的高度自动化、微型化与集成化的特点，使其在近几十年获得蓬勃而迅速的发展。生物传感器技术已经成为一个非常活跃的工程技术研究领域，它在国民经济的各个部门如食品、制药、化工、临床检验、生物医学、环境监测等方面有广泛的应用前景。
酪氨酸酶生物传感器因其灵敏度高、分析速率快、选择性好等优点,已被广泛用于酚类化合物的检测；如图4所示，是酪氨酸酶电化学生物传感器与酚类化合物的反应原理图。如图5所示，是酪氨酸酶对单酚化合物及双酚化合物的催化循环示意图。但酪氨酸酶是一种具有生物催化活性的蛋白质，在生物体外容易失去活性，在生物传感器应用中，生物酶需要被固定在一个基板上以实现直接电子传递或者增大表面积以达到效率放大作用。利用各种固定方法将生物敏感元件固定于基板表面并保持活性是生物传感器发展的重要方向。现有的酪氨酸酶传感器普遍存在的问题是制备方法复杂、成本高、操作和存储稳定性不够高等。
经查阅相关专利文献，公开号为102854233A的中国专利公开了一种“基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及其制备方法和应用”，通过在玻碳电极表面沉积纳米金粒子，之后吸附L-赖氨酸薄膜，在L-赖氨酸薄膜上加载有序介孔碳载纳米金，最后吸附酪氨酸酶。其制备过程中所使用的纳米金材料昂贵，制备过程复杂，并且酪氨酸酶的用量为0.05mg/μL-0.1mg/μL，酪氨酸酶用量大，生产成本很高。公开号为102928488A的中国专利公开了一种“酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法”，利用亲水性离子液体与介孔碳制备复合材料，再将酪氨酸酶加入到复合材料中制备酪氨酸酶工作电极。介孔碳材料的制备过程复杂，需要使用浓硫酸，并且制备过程中需要升温750-950度，使用有机溶剂，易造成环境污染，酪氨酸酶的用量为2.5-20mg/mL，生产成本较高。公开号为103278541A的中国专利公开了一种“用于检测双酚A的电化学生物传感器及其制备方法和应用”，使用石墨烯/金复合物以及壳聚糖来修饰固定酪氨酸酶电极，使用的金及生物材料价格昂贵，需要多种有机及无机试剂，并且使用酪氨酸酶的浓度高达4.5mg/mL。
发明内容
本发明提供了一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其制备、应用方法，所述酪氨酸酶电化学生物传感器具有选择性好、催化活性高、反应速度快、检测范围宽、检测下限低、操作稳定性及储存稳定性好等优点，可用于对多种酚类化合物进行定量分析；其制备方法简单、成本低廉、适用于在线检测，易于应用在实际工业及环境检测。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案实现：
一种酪氨酸酶电化学生物传感器，包括对电极、参比电极和工作电极；其特征在于，所述工作电极为下述三种电极中的一种：
1)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极；
2)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极；
3)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极。
所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极是在玻碳电极的检测端滴涂氧化石墨烯的甲苯溶液，制备氧化石墨烯修饰的玻碳电极；再将氧化石墨烯修饰的玻碳电极表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制备三聚氯氰/氧化石墨烯修饰的玻碳电极；最后将酪氨酸酶固定在三聚氯氰/氧化石墨烯修饰的玻碳电极上，制备得到修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极。
所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极是在玻碳电极表面滴涂3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，制备伯胺基修饰的玻碳电极，再将伯胺基修饰的玻碳电极表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制备三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的玻碳电极；最后将酪氨酸酶固定在三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的玻碳电极上，制备得到表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极。
所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极是将碳毡电极浸没在三聚氯氰的甲苯溶液中，制备三聚氯氰修饰的碳毡电极，然后将酪氨酸酶固定在三聚氯氰修饰的碳毡电极上，制备得到表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极。
所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极的制备方法具体包括如下步骤：
1)制备氧化石墨烯的甲苯溶液：使用甲苯为溶剂，配制氧化石墨烯浓度为1～5mg/mL的氧化石墨烯甲苯溶液，将所配制的溶液超声波震荡1小时以上，备用；
2)制备三聚氯氰的甲苯溶液：使用甲苯为溶剂，配制三聚氯氰浓度为1～50mmol/L的三聚氯氰甲苯溶液；
3)制备酪氨酸酶溶液：使用浓度为1～100mM、pH值为3.5～9.5的缓冲溶液，配制浓度为0.05～1mg/mL的酪氨酸酶溶液；
4)制备表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极：将玻碳电极依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光，然后依次在去离子水和乙醇中各超声清洗3次以上，每次不少于5分钟，之后氮气干燥；在干燥后的玻碳电极表面先滴涂氧化石墨烯甲苯溶液，固定后用甲苯溶液清洗，氮气干燥；然后滴涂三聚氯氰甲苯溶液，固定后经甲苯溶液清洗，氮气干燥；然后再在电极表面滴涂酪氨酸酶溶液并固定；以上各溶液在电极表面的固定时间均为15分钟～24小时；
所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极的制备方法具体包括如下步骤：
1)将玻碳电极依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光，然后依次在去离子水和乙醇中各超声清洗3次以上，每次不少于5分钟，之后氮气吹干；
2)在干燥后的玻碳电极表面先滴涂体积比为20％～30％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，吸附1小时以上，之后用甲苯溶液清洗，氮气干燥；然后滴涂浓度为1～50mmol/L三聚氯氰的甲苯溶液，固定15分钟以上，再经甲苯清洗，氮气干燥；最后在该玻碳电极表面滴涂浓度为0.05～1mg/mL的酪氨酸酶溶液，溶剂采用浓度为1～100mM、pH值为3.5～9.5的缓冲溶液，室温放置1小时以上；
3)将修饰后的玻碳电极放入缓冲溶液中搅拌清洗3次以上，每次至少5分钟，去除表面弱吸附的酶分子，将该酪氨酸酶电化学生物传感器保存于4℃条件下备用。
所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极是将碳毡电极的制备方法具体包括如下步骤：
1)将碳毡电极放入去离子水中，超声波清洗10分钟以上；
2)将清洗好的碳毡电极真空干燥，之后浸没于1～50mmol/L三聚氯氰的甲苯溶液中，固定24小时以上；固定后用甲苯溶液清洗，真空干燥；再将三聚氯氰修饰后的碳毡电极浸没于0.05～1mg/mL酪氨酸酶溶液中；溶剂采用浓度为1～100mM、pH值为3.5～9.5的缓冲溶液，室温放置24小时以上；
3)将修饰后的碳毡电极放入缓冲溶液中搅拌清洗3次以上，每次至少5分钟，去除表面吸附弱的酶分子，将该酪氨酸酶生物传感器保存于4℃条件下备用。
所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液或Britton-Robinson缓冲溶液。
应用所述一种酪氨酸酶电化学生物传感器检测酚类化合物的方法，采用工作电极、参比电极和对电极建立三电极系统，其中银/氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极；三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中苯醌的还原电流的大小，然后根据底物浓度与检测电流的校正曲线，测定待测溶液中的酚类化合物的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明采用三聚氯氰作为偶联剂将酪氨酸酶固定在氧化石墨烯修饰的玻碳电极上，三聚氯氰分别与酪氨酸酶的伯氨基及氧化石墨烯所含的羟基形成化学键，从而实现酪氨酸酶在电极上的固定；与采用其他修饰方法的酪氨酸酶生物传感器相比，具有反应速度快、检测范围宽、检测下限低、操作稳定性及储存稳定性好等优点；
2)可用于对多种酚类化合物进行定量分析，适用范围广；
3)所述酪氨酸酶电化学生物传感器制备方法简单、成本低廉；
4)适用于在线检测，易于应用在实际工业及环境检测，为生物传感器的发展带来更大的进步，对于实现酚类化合物的快速检测具有一定的理论及现实意义。
附图说明
图1是本发明所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极制备过程示意图。
图2是本发明所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极制备过程示意图。
图3是本发明所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极制备过程示意图。
图4是酪氨酸酶电化学生物传感器与酚类化合物的反应原理图。
图5是酪氨酸酶对单酚化合物及双酚化合物的催化循环示意图。
图6是裸玻碳电极、修饰酪氨酸酶的玻碳电极、修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极对邻苯二酚溶液的响应图。
图7是修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极对邻苯二酚的定电位响应图。
图8是裸玻碳电极、修饰酪氨酸酶的玻碳电极、修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极的电化学交流阻抗谱图。
图9是修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极对不同底物的校正曲线。
图10是酪氨酸酶/三聚氯氰/碳毡电极(A)及酪氨酸酶/碳毡电极(B)对邻苯二酚的检测图。(a:0.1μm；b:0.3μm；c:1μm；d:3μm；e:10μm；f:30μm；g:100μm)
图11是酪氨酸酶/三聚氯氰/碳毡电极对邻苯二酚(10μm)的定电位流动注射曲线。
图12是裸碳毡电极(a)、酪氨酸酶/碳毡电极(b)、酪氨酸酶/三聚氯氰/碳毡电极(c)的循环伏安曲线。
图13是裸碳毡电极(a)、酪氨酸酶/碳毡电极(b)、酪氨酸酶/三聚氯氰/碳毡电极(c)的电化学交流阻抗谱图。
图中：1.玻碳电极 2.氧化石墨烯修饰的玻碳电极 3.三聚氯氰/氧化石墨烯修饰的玻碳电极 4.表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极 5.3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的玻碳电极 6.三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的玻碳电极 7.表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极 8.碳毡电极 9.三聚氯氰修饰的碳毡电极 10.表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极
图中各符号含义：GCE：玻碳 GO：氧化石墨烯 GO/GCE：氧化石墨烯修饰的玻碳电极CC：三聚氯氰 CC/GO/GCE：三聚氯氰/氧化石墨烯修饰的玻碳电极 TYR/CC/GO/GCE：表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极 bare GCE:裸玻碳电极 TYR/GCE:表面修饰酪氨酸酶的玻碳电极
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明：
本发明所述一种酪氨酸酶电化学生物传感器，包括对电极、参比电极和工作电极；其特征在于，所述工作电极为下述三种电极中的一种：
1)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极；
2)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极；
3)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极。
如图1所示，所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极是在玻碳电极的检测端滴涂氧化石墨烯的甲苯溶液，制备氧化石墨烯修饰的玻碳电极；再将氧化石墨烯修饰的玻碳电极表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制备三聚氯氰/氧化石墨烯修饰的玻碳电极；最后将酪氨酸酶固定在三聚氯氰/氧化石墨烯修饰的玻碳电极上，制备得到修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极。
如图2所示，所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极是在玻碳电极表面滴涂3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，制备伯胺基修饰的玻碳电极，再将伯胺基修饰的玻碳电极表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制备三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的玻碳电极；最后将酪氨酸酶固定在三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的玻碳电极上，制备得到表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极。
如图3所示，所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极是将碳毡电极浸没在三聚氯氰的甲苯溶液中，制备三聚氯氰修饰的碳毡电极，然后将酪氨酸酶固定在三聚氯氰修饰的碳毡电极上，制备得到表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极。
所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极的制备方法具体包括如下步骤：
1)制备氧化石墨烯的甲苯溶液：使用甲苯为溶剂，配制氧化石墨烯浓度为1～5mg/mL的氧化石墨烯甲苯溶液，将所配制的溶液超声波震荡1小时以上，备用；
2)制备三聚氯氰的甲苯溶液：使用甲苯为溶剂，配制三聚氯氰浓度为1～50mmol/L的三聚氯氰甲苯溶液；
3)制备酪氨酸酶溶液：使用浓度为1～100mM、pH值为3.5～9.5的缓冲溶液，配制浓度为0.05～1mg/mL的酪氨酸酶溶液；
4)制备表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极：将玻碳电极依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光，然后依次在去离子水和乙醇中各超声清洗3次以上，每次不少于5分钟，之后氮气干燥；在干燥后的玻碳电极表面先滴涂氧化石墨烯甲苯溶液，固定后用甲苯溶液清洗，氮气干燥；然后滴涂三聚氯氰甲苯溶液，固定后经甲苯溶液清洗，氮气干燥；然后再在电极表面滴涂酪氨酸酶溶液并固定；以上各溶液在电极表面的固定时间均为15分钟～24小时；
所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极的制备方法具体包括如下步骤：
1)将玻碳电极依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光，然后依次在去离子水和乙醇中各超声清洗3次以上，每次不少于5分钟，之后氮气吹干；
2)在干燥后的玻碳电极表面先滴涂体积比为20％～30％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，吸附1小时以上，之后用甲苯溶液清洗，氮气干燥；然后滴涂浓度为1～50mmol/L三聚氯氰的甲苯溶液，固定15分钟以上，再经甲苯清洗，氮气干燥；最后在该玻碳电极表面滴涂浓度为0.05～1mg/mL的酪氨酸酶溶液，溶剂采用浓度为1～100mM、pH值为3.5～9.5的缓冲溶液，室温放置1小时以上；
3)将修饰后的玻碳电极放入缓冲溶液中搅拌清洗3次以上，每次至少5分钟，去除表面弱吸附的酶分子，将该酪氨酸酶电化学生物传感器保存于4℃条件下备用。
所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极是将碳毡电极的制备方法具体包括如下步骤：
1)将碳毡电极放入去离子水中，超声波清洗10分钟以上；
2)将清洗好的碳毡电极真空干燥，之后浸没于1～50mmol/L三聚氯氰的甲苯溶液中，固定24小时以上；固定后用甲苯溶液清洗，真空干燥；再将三聚氯氰修饰后的碳毡电极浸没于0.05～1mg/mL酪氨酸酶溶液中；溶剂采用浓度为1～100mM、pH值为3.5～9.5的缓冲溶液，室温放置24小时以上；
3)将修饰后的碳毡电极放入缓冲溶液中搅拌清洗3次以上，每次至少5分钟，去除表面吸附弱的酶分子，将该酪氨酸酶生物传感器保存于4℃条件下备用。
所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液或Britton-Robinson缓冲溶液。
应用所述一种酪氨酸酶电化学生物传感器检测酚类化合物的方法，采用工作电极、参比电极和对电极建立三电极系统，其中银/氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极；三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中苯醌的还原电流的大小，然后根据底物浓度与检测电流的校正曲线，测定待测溶液中的酚类化合物的含量。
石墨烯是一种由碳原子以sp2杂化方式形成的蜂窝状平面薄膜，是一种只有一个原子层厚度的准二维材料，是目前发现的最薄、强度最大、导电导热性能最强的一种新型纳米材料，并被称为“新材料之王”。它被广泛的应用于生物电子元器件的制备中。
三聚氯氰是一种重要的精细化工产品，具有广泛的用途，它是农药工业的中间体，是制造活性染料的原料，可做有机工业生产的各种助剂，如荧光增白剂、纺织物防缩水剂、表面活性剂等，是橡胶促进剂和国防用于制造炸药的原料之一，也是医药农药工业用于合成药物的原料。
本发明采用三聚氯氰作为偶联剂将酪氨酸酶固定在氧化石墨烯修饰的玻碳电极上，三聚氯氰分别与酪氨酸酶的伯氨基及氧化石墨烯所含的羟基形成化学键而将酪氨酸酶固定在电极上。将三聚氯氰用于生物电化学传感器的制备，在生物传感器的制备中是非常少见的。与裸电极及其他修饰的酪氨酸酶生物传感器相比，三聚氯氰与酪氨酸酶通过化学偶联所制备的生物传感器制备简单、反应速度快、检测范围宽、检测下限低、具有良好的操作稳定性及储存稳定性(如图6-图13所示；)，且所用材料成本低廉。
以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
【实施例1】
本实施例采用酪氨酸酶电化学生物传感器检测溶液中的酚类化合物，酪氨酸酶电化学生物传感器包括对电极、参比电极和工作电极；其中工作电极为表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极。
本实施例所述酪氨酸酶电化学生物传感器的具体制备步骤如下：
1)将玻碳电极依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光，然后依次在去离子水和乙醇中各超声清洗3次，每次5分钟，之后氮气吹干。
2)在清洗好的玻碳电极的表面首先固定氧化石墨烯，之后通过共价偶联方法固定三聚氯氰，最后再通过共价偶联方法固定酪氨酸酶；具体操作方法是：在干燥后的玻碳电极表面先滴涂氧化石墨烯浓度为5mg/mL的氧化石墨烯甲苯溶液，吸附1小时，甲苯清洗，氮气干燥；然后滴涂三聚氯氰浓度为50mmol/L三聚氯氰甲苯溶液，固定24小时，再经甲苯清洗，氮气干燥；最后在玻碳电极表面滴涂浓度为0.5mg/mL的酪氨酸酶溶液，溶剂采用磷酸缓冲溶液(PBS)，缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH为6.5，室温放置1小时；
3)将修饰后的玻碳电极放入浓度为0.1mol/L的PBS溶液中搅拌清洗3次，每次5分钟，去除表面弱吸附的酶分子，将表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极保存于4℃条件下备用。
采用酪氨酸酶电化学生物传感器检测酚类化合物的步骤如下：
将修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极作为工作电极，银/氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站连接，对待测溶液中的酚类化合物的浓度进行检测。
工作条件：所用的电解液为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液。在pH＝4.5-9.0范围内测定酪氨酸酶生物传感器对酚类化合物的电流响应值，优化结果，选定pH＝6.5为最佳pH值，在此pH值下，响应电流大且稳定。
本实施例中，酪氨酸酶生物传感器对不同底物的检测情况如表1所示：
表1酪氨酸酶电化学生物传感器检测不同底物情况
底物 反应时间(s) 检测下限(nM) 灵敏度(nA/M) 线性范围(M)
邻苯二酚 ～3 5 363 0.005-50
苯酚 ～3 9 142 0.01-100
多巴胺 ～3 19 43 0.01-100
DOPAC ～3 72 52 0.07-70
【实施例2】
本实施例采用酪氨酸酶电化学生物传感器检测溶液中酚类化合物，所述酪氨酸酶电化学生物传感器包括对电极、参比电极和工作电极；其中工作电极为表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极。
表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极的制备过程如下：
在玻碳电极表面滴涂3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，制备伯胺基修饰的玻碳电极，再将伯胺基修饰的玻碳电极表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制备三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的玻碳电极，最后将酪氨酸酶固定在三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的玻碳电极上，制备得到表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极。
本实施例所述酪氨酸酶生物传感器的制备步骤：
1)将玻碳电极依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光，然后依次在去离子水和乙醇中各超声清洗3次，每次5分钟，之后氮气吹干。
2)在清洗好的玻碳电极的表面首先固定3-氨丙基三乙氧基硅烷，在玻碳电极表面引入伯氨基，之后通过共价偶联方法固定三聚氯氰，最后再通过共价偶联方法固定酪氨酸酶，具体操作方法是：在干燥后的玻碳电极表面先滴涂25％(体积比)3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，吸附1小时，之后甲苯清洗，氮气干燥；然后滴涂50mmol/L三聚氯氰的甲苯溶液，固定15分钟，再经甲苯清洗，氮气干燥。最后在该玻碳电极表面滴涂0.5mg/mL酪氨酸酶溶液，溶剂采用磷酸缓冲溶液(PBS)，缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH值为6.5，室温放置1小时；
3)将修饰后的玻碳电极放入0.1mol/L的PBS溶液中搅拌清洗3次，每次5分钟，去除表面弱吸附的酶分子，将表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极保存于4℃条件下备用。
采用本实施例所述酪氨酸酶电化学生物传感器检测酚类化合物的过程如下：
将表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极作为工作电极，银/氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站连接，对待测溶液中的酚类化合物的浓度进行检测。
工作条件：所用的电解液为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液。在pH＝4.5-9.0范围内测定酪氨酸酶生物传感器对酚类化合物的电流响应值，优化结果，选定pH＝6.5为最佳pH值，在此pH值下，响应电流大且稳定。
本实施例采用先在玻碳表面先修饰偶联基团，应用共价偶联的方法形成共价键，把酪氨酸酶固定在玻碳电极上；所制备的酪氨酸酶电化学生物传感器对不同底物的检测情况如表2所示：
表2酪氨酸酶电化学生物传感器检测不同底物情况
【实施例3】
本实施例采用酪氨酸酶电化学生物传感器检测溶液中酚类化合物，所述酪氨酸酶电化学生物传感器包括对电极、参比电极和工作电极；其中工作电极为表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极。碳毡电极表面含有-OH等基团，方便进行偶联反应。
本实施例所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极的制备步骤如下：
1)将碳毡电极放入去离子水中，超声波清洗10分钟；
2)将清洗好的碳毡电极真空干燥，之后浸没于50mmol/L三聚氯氰的甲苯溶液中，固定24小时；固定后用甲苯清洗，真空干燥。再将三聚氯氰修饰后的碳毡电极浸没于0.25mg/mL酪氨酸酶溶液中。溶剂采用磷酸缓冲溶液(PBS)，缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH为6.5，室温放置24小时；
3)将修饰后的碳毡电极放入0.1mol/L的PBS溶液中搅拌清洗3次，每次5分钟，去除表面吸附弱的酶分子，将表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极保存于4℃条件下备用。
采用本实施例所述酪氨酸酶生物传感器检测酚类化合物，将表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极作为工作电极，银/氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站连接，对待测溶液中的酚类化合物的浓度进行检测。
工作条件：所用的电解液为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液。在pH＝4.5-9.0范围内测定酪氨酸酶生物传感器对酚类化合物的电流响应值，优化结果，选定pH＝6.5为最佳pH值，在此pH值下，响应电流大且稳定。本实施例所述酪氨酸酶电化学生物传感器对不同底物的检测情况如表3：
表3酪氨酸酶电化学生物传感器检测不同底物情况
底物 反应时间(s) 检测下限(nM) 灵敏度(nA/M) 线性范围(M)
邻苯二酚 ～4 4.6 197 0.1-10
苯酚 ～4 20 100 0.5-10
多巴胺 ～4 50 87 0.1-10
DOPAC ～4 100 60 0.1-10
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种酪氨酸酶电化学生物传感器，其特征在于，包括对电极、参比电极和工作电极；其特征在于，所述工作电极下述三种电极中的一种：
1)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极；
2)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极；
3)表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极。
2.根据权利要求1所述的一种酪氨酸酶电化学生物传感器，其特征在于，所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极是在玻碳电极的检测端滴涂氧化石墨烯的甲苯溶液，制备氧化石墨烯修饰的玻碳电极；再将氧化石墨烯修饰的玻碳电极表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制备三聚氯氰/氧化石墨烯修饰的玻碳电极；最后将酪氨酸酶固定在三聚氯氰/氧化石墨烯修饰的玻碳电极上，制备得到修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极。
3.根据权利要求1所述的一种酪氨酸酶电化学生物传感器，其特征在于，所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极是在玻碳电极表面滴涂3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，制备伯胺基修饰的玻碳电极，再将伯胺基修饰的玻碳电极表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制备三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的玻碳电极；最后将酪氨酸酶固定在三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的玻碳电极上，制备得到表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极。
4.根据权利要求1所述的一种酪氨酸酶电化学生物传感器，其特征在于，所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极是将碳毡电极浸没在三聚氯氰的甲苯溶液中，制备三聚氯氰修饰的碳毡电极，然后将酪氨酸酶固定在三聚氯氰修饰的碳毡电极上，制备得到表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极。
5.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酶电化学生物传感器，其特征在于，所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极的制备方法具体包括如下步骤：
1)制备氧化石墨烯的甲苯溶液：使用甲苯为溶剂，配制氧化石墨烯浓度为1～5mg/mL的氧化石墨烯甲苯溶液，将所配制的溶液超声波震荡1小时以上，备用；
2)制备三聚氯氰的甲苯溶液：使用甲苯为溶剂，配制三聚氯氰浓度为1～50mmol/L的三聚氯氰甲苯溶液；
3)制备酪氨酸酶溶液：使用浓度为1～100mM、pH值为3.5～9.5的缓冲溶液，配制浓度为0.05～1mg/mL的酪氨酸酶溶液；
4)制备表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳电极：将玻碳电极依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光，然后依次在去离子水和乙醇中各超声清洗3次以上，每次不少于5分钟，之后氮气干燥；在干燥后的玻碳电极表面先滴涂氧化石墨烯甲苯溶液，固定后用甲苯溶液清洗，氮气干燥；然后滴涂三聚氯氰甲苯溶液，固定后经甲苯溶液清洗，氮气干燥；然后再在电极表面滴涂酪氨酸酶溶液并固定；以上各溶液在电极表面的固定时间均为15分钟～24小时。
6.根据权利要求3所述的一种酪氨酸酶电化学生物传感器，其特征在于，所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳电极的制备方法具体包括如下步骤：
1)将玻碳电极依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光，然后依次在去离子水和乙醇中各超声清洗3次以上，每次不少于5分钟，之后氮气吹干；
2)在干燥后的玻碳电极表面先滴涂体积比为20％～30％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，吸附1小时以上，之后用甲苯溶液清洗，氮气干燥；然后滴涂浓度为1～50mmol/L三聚氯氰的甲苯溶液，固定15分钟以上，再经甲苯清洗，氮气干燥；最后在该玻碳电极表面滴涂浓度为0.05～1mg/mL的酪氨酸酶溶液，溶剂采用浓度为1～100mM、pH值为3.5～9.5的缓冲溶液，室温放置1小时以上；
3)将修饰后的玻碳电极放入缓冲溶液中搅拌清洗3次以上，每次至少5分钟，去除表面弱吸附的酶分子，将该酪氨酸酶电化学生物传感器保存于4℃条件下备用。
7.根据权利要求4所述的一种酪氨酸酶电化学生物传感器，其特征在于，所述表面修饰酪氨酸酶/三聚氯氰的碳毡电极是将碳毡电极的制备方法具体包括如下步骤：
1)将碳毡电极放入去离子水中，超声波清洗10分钟以上；
2)将清洗好的碳毡电极真空干燥，之后浸没于1～50mmol/L三聚氯氰的甲苯溶液中，固定24小时以上；固定后用甲苯溶液清洗，真空干燥；再将三聚氯氰修饰后的碳毡电极浸没于0.05～1mg/mL酪氨酸酶溶液中；溶剂采用浓度为1～100mM、pH值为3.5～9.5的缓冲溶液，室温放置24小时以上；
3)将修饰后的碳毡电极放入缓冲溶液中搅拌清洗3次以上，每次至少5分钟，去除表面吸附弱的酶分子，将该酪氨酸酶生物传感器保存于4℃条件下备用。
8.根据权利要求5～7所述的任意一种酪氨酸酶电化学生物传感器，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液或Britton-Robinson缓冲溶液。
9.应用权利要求1所述一种酪氨酸酶电化学生物传感器检测酚类化合物的方法，其特征在于，采用工作电极、参比电极和对电极建立三电极系统，其中银/氯化银作为参比电极，铂电极作为对电极；三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中苯醌的还原电流的大小，然后根据底物浓度与检测电流的校正曲线，测定待测溶液中的酚类化合物的含量。
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