CN102854233B

CN102854233B - 基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102854233B
Application number: CN201210344456.0A
Authority: CN
Inventors: 汤琳; 周耀渝; 曾光明; 龚继来; 李贞�; 刘媛媛; 章毅; 杨贵德; 严洲; 雷晓霞
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2012-09-17
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-09-17
Also published as: CN102854233A

Abstract

本发明公开了一种基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，包括一玻碳电极，玻碳电极的检测端表面沉积有纳米金粒子，纳米金粒子外表面吸附L-赖氨酸薄膜，L-赖氨酸薄膜外侧加载有序介孔碳载纳米金，有序介孔碳载纳米金上吸附有酪氨酸酶；其制备方法包括以下步骤：首先制备有序介孔碳载纳米金悬浮液；然后在玻碳电极上用电化学方法沉积纳米金颗粒，再将纳米金修饰电极的检测端浸入L-赖氨酸溶液中，用电化学方法使纳米金颗粒外表面形成一层L-赖氨酸薄膜，再将有序介孔碳载纳米金悬浮液滴加到检测端表面，晾干后再滴加酪氨酸酶溶液，得到酪氨酸酶生物传感器。本发明具有成本低、制作简单、使用寿命长、酶活性高、检测精度和效率高等优点。

Description

基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种生物传感器及其制备方法和应用，尤其涉及一种酪氨酸酶生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

目前，对苯二酚、邻苯二酚等有机污染物的主要测定方法有色谱法、紫外分光法、同步荧光光谱法、分光光度法、导数光度法、流动注射分析法等，但是，这些方法都存在前处理复杂、耗时长、样品基体效应大、分析周期长等缺陷，对工作人员的操作水平要求高且仪器昂贵，很难在中小型企业中推广应用。例如：采用分光光度法检测时，由于对底物浊度的要求和光干扰物质的影响，限制了其精确性和使用范围；而采用液相和气相色谱法检测，检测前需要对样品进行分离，分离过程通常需要预处理，操作步骤比较繁琐和耗时，检测仪器相对昂贵，且不便携带，不能进行实时检测。

生物传感器是基于生物有机成分(如酶、抗体、核酸、细胞、微生物等)，对待检物质进行专一的识别，产生的信号经过信号传导器转变为电信号、光信号，进而定量检测出待测物质的一项新技术。运用生物传感器来检测环境中的重金属、病原微生物、有害有机物具有特异性强、检测灵敏度高、检测效率高、成本低廉的特点，因此成为了环境保护工作中的一个研究热点。

目前，科研人员正努力提高生物传感器的稳定性、重复性以及结构的可靠性，其中，利用各种新型材料固定生物敏感元件并保持活性是发展生物传感器的一个重要方向。制作生物酶传感器的关键是如何高效地固定酶，并保持酶的活性。常用的酶固定方法有：吸附固定法、包埋固定法、共价固定法和交联固定法，这些方法存在固定不牢固、固定中使用的交联剂影响酶的活性、以及容易使用到对环境有害的物质等缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种成本低廉、制作简单、使用寿命长、酶活性高、检测精度和效率高的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，还相应提供一种酪氨酸酶生物传感器的制备方法，以便通过一种成本低廉、工艺简单、制作快速的工艺使酪氨酸酶的固定具有更好的稳定性和高活性的保持；在此基础上，还提供一种前述酪氨酸酶生物传感器的应用，该应用能够以低成本、简化操作、快速响应、高检测精度及较强抗干扰性强等特点实现对邻苯二酚、对苯二酚等苯二酚类物质的高效检测。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，所述生物传感器包括一玻碳电极，所述玻碳电极的检测端表面沉积有纳米金粒子，纳米金粒子外表面吸附一层L-赖氨酸(L-Lysine)薄膜，所述L-赖氨酸薄膜外侧加载一层有序介孔碳载纳米金(OMC-Au)，有序介孔碳载纳米金上吸附(物理吸附)有酪氨酸酶。

本发明的上述技术方案中，通过采用有序介孔碳载纳米金来固定酪氨酸酶，回避了化学修饰酪氨酸酶的操作步骤，大大提高了固定酪氨酸酶的活性；另外，有序介孔碳(OMC)因其具有较大孔容及巨大的比表面积，而纳米金(AuNPs)具有高催化活性且能通过自组装形成复合材料的纳米结构，这对本发明的生物传感器具有进一步的增效作用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)修饰有序介孔碳：向准备好的有序介孔碳(OMC)材料中加入氯金酸溶液并超声分散12h～24h，超声后加入柠檬酸钠溶液和硼氢化钠溶液(柠檬酸钠具有还原性，可将金离子还原)，经离心、洗涤、干燥后，修饰得到有序介孔碳载纳米金；将有序介孔碳载纳米金加至溶剂(例如二甲基甲酰胺)超声分散后得到有序介孔碳载纳米金悬浮液；

(2)沉积纳米金：在一置备好的玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积纳米金颗粒，得到纳米金修饰电极，晾干备用；

(3)沉积L-赖氨酸：将步骤(2)中制得的纳米金修饰电极的检测端浸入配制好的L-赖氨酸溶液(赖氨酸水溶液)中，用电化学方法使纳米金颗粒外表面形成一层L-赖氨酸薄膜，得到L-赖氨酸-纳米金修饰电极；

(4)加载有序介孔碳载纳米金：将步骤(1)中制得的有序介孔碳载纳米金悬浮液滴加到步骤(3)中制得的L-赖氨酸-纳米金修饰电极的检测端表面，晾干后得到复合材料修饰电极；(本步骤为纯物理加载，未经任何化学修饰)；

(5)固定酪氨酸酶：在步骤(4)中制得的复合材料修饰电极上滴加(或将电极浸入)配制好的酪氨酸酶溶液，通过充分的物理吸附作用使酪氨酸酶固定于复合材料修饰电极的有序介孔碳载纳米金粒子上，得到酪氨酸酶生物传感器。

上述的制备方法，所述步骤(1)中，有序介孔碳的与氯金酸、柠檬酸钠和硼氢化钠的质量比优选为1∶0.05～0.12∶0.01∶0.00075。所述氯金酸溶液、柠檬酸钠溶液、硼氢化钠溶液的质量浓度均优选为0.07％～0.1％。

上述的制备方法，所述步骤(3)中，L-赖氨酸溶液的浓度范围优选为1.0×10^-3mo1/L～1.0×10^-2mol/L。

上述的制备方法，所述步骤(1)中，所述有机溶剂优选为二甲基甲酰胺(DMF)，所述有序介孔碳载纳米金悬浮液的浓度优选为1.0mg/mL～3mg/mL；所述步骤(4)中，检测端表面滴加有序介孔碳载纳米金悬浮液体积范围优选为5μL～10μL。

上述的制备方法，所述步骤(5)中，所述酪氨酸酶溶液的pH优选值为4.5～9.2，所述酪氨酸酶溶液中酪氨酸酶的浓度优选为0.05mg/μL～0.1mg/μL(一般其用量为5μL～10μL)。

上述的制备方法，所述有序介孔碳优选是采用包括以下步骤的制备方法制得：

(1)合成硅基分子筛SBA-15：将嵌段共聚物P123置于盐酸中溶解，然后逐滴加入正硅酸乙酯(P123与正硅酸乙酯的质量比优选为8∶17)，搅拌后水浴加热，温度控制在30℃～35℃，然后将混合物移至转移至反应釜中，在140℃～150℃水热24h，抽滤，洗涤至中性，风干，再放入箱式电阻炉中焙烧(控制升温速率为1℃/min，在550℃空气中焙烧4h～5h)，得到硅基分子筛SBA-15；

(2)合成有序介孔碳：将制得的硅基分子筛SBA-15与水、蔗糖、浓硫酸混合(混合的质量比优选为1∶5∶1.25～2.5∶0.14)，混合物置于100℃～160℃温度下干燥(保持10h～12h)直至混合物变为黑色，然后将黑色的混合物置于惰性气体保护下在自制管式石英电阻炉中进行高温热解(控制升温速率优选5℃/min，在900℃中焙烧4h～5h)，使蔗糖完全碳化，再用NaOH溶液(优选1mol/L～3mol/L)去除热解产物中的二氧化硅分子筛模板，过滤、洗涤、干燥后即得到有序介孔碳。

本发明的上述制备方法不仅工艺简单、成本低廉、制作快速，而且使酪氨酸酶的固定更稳固，并能维持酪氨酸酶的高活性。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的酪氨酸酶生物传感器在检测苯二酚中的应用，检测时的具体操作方法包括以下步骤：以所述的酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中进行电化学反应时的氧化电流大小，然后根据苯二酚浓度与氧化电流变化的线性回归方程，即可定性或定量地测定待测溶液中的苯二酚。

上述的应用中，所述苯二酚特别优选为对苯二酚或邻苯二酚；

所述对苯二酚浓度与氧化电流变化的线性回归方程优选为：

P_HQ＝66.954-9.5357lgC_HQ (1)

式(1)中，P_HQ为对苯二酚检测时的电流变化值，单位为μA；C_HQ为待测溶液中对苯二酚的浓度值，单位为M；式(1)的相关系数为R²＝0.9565，检测下限为5×10^-8M；

所述邻苯二酚浓度与氧化电流变化的线性回归方程优选为：

P_CC＝88.394-13.081lgC_CC (2)

式(2)中，P_CC为邻苯二酚检测时的电流变化值，单位为μA；C_CC为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为M；式(2)的相关系数为R²＝0.9771，检测下限为2.5×10^-8M；

所述对苯二酚、邻苯二酚的线性检测范围均为4×10^-7M～8.0×10^-5M。

上述的应用中，所述三电极系统检测待测溶液时用到的电待测溶液的响应电流较大且稳定。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器不仅成本低廉、制作简单，而且采用了多层组合的修饰方式，具有优化的微观结构。首先，将纳米金颗粒用电化学的方法沉积在电极表面，使其具有优越的电子传递能力和导电性能，然后通过L-赖氨酸薄膜层，将有序介孔碳载纳米金加载在电极上，这能够显著提高生物传感器和待测溶液间电子的转移速度，能够快速获得稳定的响应电流，最后用物理吸附法将酪氨酸酶固定在有序介孔碳载纳米金上，因有序介孔碳具有很好的生物相容性，其能够维持酪氨酸酶的高活性，使酪氨酸酶生物传感器使用寿命更长，酪氨酸酶活性更高。可见，本发明的酪氨酸酶生物传感器充分集成了现有技术中的各种技术手段，使组合后的生物传感器实现了各技术手段的优势互补、协同增效，大大提高了生物传感器的稳定性、重复性和传感器结构的可靠性，提高了现有生物传感器的检测水平。

2.本发明酪氨酸酶生物传感器的制备方法不仅工艺步骤简单、工艺成本小、制作效率高，借助物理吸附法将酪氨酸酶固定到有序介孔碳载纳米金修饰的玻碳电极上，使酪氨酸酶固定更稳固，并能维持酪氨酸酶的高活性。

3.本发明的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器可用于检测邻苯二酚、对苯二酚等有机酚类污染物，由于生物传感器上酪氨酸酶的高活性，对于邻苯二酚、对苯二酚的氧化能够起到良好的催化效果，本发明的酪氨酸酶生物传感器具有卓越的电子传导能力，使得每次达到稳定响应电流的时间很短，因此，在可测定的浓度范围内，测定结果较理想，用于水样测定的加标回收率在96.2％～102.6％之间，与传统的高效液相色谱法相比，成本低廉、操作简单、响应速度快、检测精度高、抗干扰性强。

附图说明

图1为本发明实施例中酪氨酸酶生物传感器的自组装过程示意图。

图2为本发明实施例中酪氨酸酶生物传感器的检测反应原理图。

图3为本发明实施例中制得的有序介孔碳的扫描电镜图。

图4为本发明实施例中制得的有序介孔碳的透射电镜图。

图5为本发明实施例中制得的有序介孔碳载纳米金的透射电镜图。

图6为本发明实施例中制得的(OMC-Au/L-Lysine/Au)修饰电极扫描电镜图。

图7为本发明实施例中制得的有序介孔碳载纳米金和有序介孔碳的XRD衍射对比图，其中a表示有序介孔碳，b表示有序介孔碳载纳米金。

图8为本发明实施例的酪氨酸酶生物传感器在制作过程中各种中间体的电化学阻抗图谱。

图9为本发明实施例中酪氨酸酶生物传感器检测时的pH值优化图。

图10为本发明实施例中酪氨酸酶生物传感器检测时的pH值优化图。

图11为本发明实施例2中检测对苯二酚、邻苯二酚时的差分脉冲伏安法曲线图。

图12为本发明实施例2中检测对苯二酚时的DPV图，其中内插图为不同浓度与之对应的响应电流。

图13为本发明实施例2中检测邻苯二酚时的DPV图，其中内插图为不同浓度与之对应的响应电流。

图例说明：

1.玻碳电极；2.纳米金粒子；3.L-赖氨酸薄膜；4.有序介孔碳载纳米金；5.酪氨酸酶。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：

一种如图1所示的本发明基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，该生物传感器包括一玻碳电极1，玻碳电极1的检测端表面沉积有纳米金粒子2，纳米金粒子2外表面吸附一层L-赖氨酸薄膜3，L-赖氨酸薄膜3外侧加载一层有序介孔碳载纳米金4，有序介孔碳载纳米金4上物理吸附有酪氨酸酶5。

本实施例的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1.制备有序介孔碳。

1.1介孔硅模板SBA-15的合成：将8.0g嵌段共聚物Pluronic P123置于盐酸(270g H₂O和320mL、1.54M的盐酸混配而成)中，于35℃水浴中搅拌直至其溶解，然后逐滴加入17g正硅酸乙酯(TEOS)，将此混合物在35℃下搅拌20h，然后将混合物转移至反应釜中，在140℃温度下水浴加热24h，将所得产物抽滤、再用蒸馏水洗涤至滤液为中性，室温下风干，干燥后得到白色粉末；为了去除其中的模板剂，将白色粉末放入箱式电阻炉中焙烧，控制升温速率为1℃/min，在550℃空气中焙烧4h，研磨即得硅基分子筛SBA-15白色粉末。

1.2合成有序介孔碳：取1g上述制得的SBA-15，另取5mL水溶解蔗糖1.25g和0.14gH₂SO₄，并与SBA-15混合，将混合物置于箱式电阻炉中并在100℃温度下保持6h，然后将温度升高至160℃，再保温6h，使混合物的颜色成为黑色；然后将黑色的混合物于氮气流保护下在900℃的石英管式炉中进行热解，并使蔗糖碳化，热解6h后保存碳化聚合物，并用3M NaOH溶液充分去除二氧化硅分子筛模板，过滤出来之后用去离子水洗涤至中性，干燥后即获得有序介孔碳(OMC)。本实施例制得的有序介孔碳的扫描电镜图如图3所示，本实施例制得的有序介孔碳的透射电镜图如图4所示，由图3、图4可知该有序介孔碳为棒状结构。

2.修饰有序介孔碳。

取步骤1制备好的2mg有序介孔碳材料，向其中加入0.1％(下文中未特别说明的百分数均表示质量分数)的氯金酸溶液100mg(即有序介孔碳与氯金酸溶液的质量比为1∶50)，超声分散12h～24h，然后加入1％的柠檬酸钠溶液1mL，1min后加入0.075％硼氢化钠溶液1mL，超声30min后得到黑色溶液，直到溶液的颜色没有改变，再将黑色溶液经离心(4000rpm转速下高速旋转)，用去离子水洗涤，最后置于80℃条件下干燥，修饰得到有序介孔碳载纳米金。本实施例制得的有序介孔碳载纳米金的透射电镜图如图5所示，相比图4可见，纳米金粒子已经成功负载在有序介孔碳上。通过X射线衍射测定有序介孔碳载纳米金和有序介孔碳，其XRD衍射图谱如7所示，图7进一步表明有序介孔碳载纳米金材料制备成功。

3.沉积纳米金。

在一置备好的玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积纳米金颗粒，具体操作方法是，将该玻碳电极放入0.1％的HAuCl₄水溶液中，电流时间曲线(I-T)法扫描，初始电位为-0.2～0.5v，时间100s～400s，得到纳米金修饰电极，晾干备用。

4.沉积L-赖氨酸。

将步骤3中制得的纳米金修饰电极的检测端浸入配制好的1.0×10^-3 mol/L的L-赖氨酸水溶液(将L-赖氨酸溶于pH＝8.0的PBS缓冲液中)中，用电化学方法使纳米金颗粒外表面形成一层L-赖氨酸薄膜，具体是采用CV法扫描，-2.0v～2.0v，30段，扫描速率0.05v/s，得到L-赖氨酸-纳米金修饰电极。

5.加载有序介孔碳载纳米金。

将步骤2制得的1mg有序介孔碳载纳米金在1mL有机溶剂二甲基甲酰胺中超声分散1h，得到1.0mg/mL的有序介孔碳载纳米金悬浮液(黑色)，然后将该有序介孔碳载纳米金悬浮液滴加到步骤4中制得的L-赖氨酸-纳米金修饰电极的检测端表面(4cm²的圆柱形电极表面滴加5μL～10μL)，晾干后得到复合材料修饰电极，其扫描电镜图如图6所示，由图6可知，有序介孔碳载金、L-赖氨酸依次由外至内分布在纳米金粒子的外表面，这说明有序介孔碳载金/L-赖氨酸/纳米金修饰电极的固定化过程是可行的。

6.固定酪氨酸酶。

将步骤5中制得的复合材料修饰电极的检测端浸入配制好5μL～10μL的酪氨酸酶溶液(0.05mg/μL～0.1mg/μL)中，通过充分的物理吸附作用使酪氨酸酶固定于复合材料修饰电极的有序介孔碳载纳米金粒子上，得到酪氨酸酶生物传感器。将该酪氨酸酶生物传感器保存于4℃条件下备用。

用电化学交流阻抗图谱(EIS)法分别表征上述制备过程中玻碳电极(GCE)、纳米金修饰电极(GC/Au)、L-赖氨酸-纳米金修饰电极(GC/Au/L-Lysine)、复合材料修饰电极(GC/Au/L-Lysine/OMC-Au)以及生物传感器(GC/Au/L-Lysine/OMC-Au/tyrosinase)，其结果如图8所示，由8可见，GCE的半圆很大，这说明GCE的电阻大，表明GCE传导电子的能力很弱；而当纳米金、L-赖氨酸及有序介孔碳载纳米金修饰后半圆很小，电阻显著降低，其电子传递速度大大提高，这说明有序介孔碳和纳米金大大增强了电子传递能力；而在最后固定酪氨酸酶后的生物传感器，其工作电极的电子传导速度介于以上两者之间(参见图8)，其主要原因是L-赖氨酸以及酪氨酸酶的吸附在一定程度上阻碍了电子的快速传递，但相比GCE本身，本发明的酪氨酸酶生物传感器传递电子的速度还是得到了明显的提高，应用时能显著提高工作电极和电解液间电子的转移速度，快速获得稳定的响应电流。

由以上制备过程及表征图谱数据可见，本实施例的酪氨酸酶生物传感器不仅使用寿命长、酪氨酸酶活性高，而且制备方法成本低廉、工艺简单、制作快速，酪氨酸酶不经过任何化学修饰而是借助吸附法固定到玻碳电极表面，使酪氨酸酶的固定更稳固，并能维持酪氨酸酶的高活性。

本发明的上述固定方法也能用于与酪氨酸酶具有近似性质的其他生物有机成分的生物传感器的构建。

实施例2：酪氨酸酶生物传感器的检测应用

将本发明实施例1的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站连接，对待测溶液中的对苯二酚、邻苯二酚浓度进行检测。

工作条件：所用的电解液为1/15mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，在pH＝4.5～9.2范围内测定酪氨酸酶生物传感器对同一浓度邻苯二酚的电流响应值，优化结果如图9和图10所示，选定pH＝6.98为最佳pH值，因为在此pH值下，其响应电流大且稳定。

本发明的酪氨酸酶生物传感器的检测原理如图2所示：酪氨酸酶催化氧化邻苯二酚成邻醌，邻醌在电极上得到电子，又被还原成邻苯二酚，通过检测还原电流的大小来定量指示待测液中邻苯二酚的浓度；但对苯二酚不是酪氨酸酶的直接底物，在酪氨酸酶和邻醌的作用下形成对醌，同样对醌在电极上得到电子，又被还原成对苯二酚，通过检测还原电流的大小来定量指示待测液中对苯二酚的浓度，由于对苯二酚不是酪氨酸酶的直接底物，因此，在后面检测下限中，邻苯二酚的检测下限更低。

本发明检测过程的主反应式如下所示：

o-quinone(benzoquinone)+2e+2H⁺→CC(HQ)。

采用差分脉冲伏安法(DPV)测定对苯二酚、邻苯二酚浓度，测量池中加入10mL的PBS电解液，里面放置一个磁力搅拌子，每测定一次后，用PBS清洗电极三次，再用于下一次测定，检测结果如图11、图12和图13所示。

由图12可见，对苯二酚浓度与氧化电流变化的线性回归方程优选为：

P_HQ＝66.954-9.5357lgC_HQ (1)

式(1)中，P_HQ为对苯二酚检测时的电流变化值，单位为μA；C_HQ为待测溶液中对苯二酚的浓度值，单位为M；式(1)的相关系数为R²＝0.9565，检测下限为5×10^-8M。

由图13可见，邻苯二酚浓度与氧化电流变化的线性回归方程优选为：

P_CC＝88.394-13.081lgC_CC (2)

式(2)中，P_CC为邻苯二酚检测时的电流变化值，单位为μA；C_CC为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为M；式(2)的相关系数为R²＝0.9771，检测下限为2.5×10^-8M。

将本实施例的酪氨酸酶生物传感器用于实际水样样品的检测，检测结果如下表1、表2所示，该表中原水取自湘江橘子洲大桥段，C₁为原水过滤后测定的对苯二酚、邻苯二酚的浓度(均为0)，经过过滤后加入确定浓度的对苯二酚、邻苯二酚，制成A、B、C、D四个水样，四个水样的配制浓度如C₂栏所示，而C₃栏为本发明酪氨酸酶生物传感器按照本实施例的检测方法和检测条件测定的浓度值。从加标回收率可以看出，本发明的生物传感器在可测定的浓度范围内，加标回收率基本在95.7％～103.8％之间，测定结果理想，相比传统的高效液相色谱法，本发明的检测方法操作简单，且不受其它污染物的干扰。

表1电化学传感器检测水中的对苯二酚

水样	C₁mol·L^-1	C₂mol·L^-1	C₃mol·L^-1	回收率
					A	0	1×10^-6	0.933×10^-7	96.6％
B	0	5×10^-5	5.13×10^-5	102.6％
					C	0	10^-5	0.993×10^-5	99.3％

D

0

2×10^-4

1.32×10^-4

96.2％

表2电化学传感器检测水中的邻苯二酚

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，如将L-赖氨酸换成其他的生物有机成分等，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，所述生物传感器包括一玻碳电极，其特征在于：所述玻碳电极的检测端表面沉积有纳米金粒子，纳米金粒子外表面吸附一层L-赖氨酸薄膜，所述L-赖氨酸薄膜外侧加载一层有序介孔碳载纳米金，有序介孔碳载纳米金上吸附有酪氨酸酶。

2.一种如权利要求1所述的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）修饰有序介孔碳：向准备好的有序介孔碳材料中加入氯金酸溶液，超声后加入柠檬酸钠溶液和硼氢化钠溶液，经离心、洗涤、干燥后，修饰得到有序介孔碳载纳米金；将有序介孔碳载纳米金加至溶剂超声分散后得到有序介孔碳载纳米金悬浮液；

（2）沉积纳米金：在一置备好的玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积纳米金颗粒，得到纳米金修饰电极，晾干备用；

（3）沉积L-赖氨酸：将步骤（2）中制得的纳米金修饰电极的检测端浸入配制好的L-赖氨酸溶液中，用电化学方法使纳米金颗粒外表面形成一层L-赖氨酸薄膜，得到L-赖氨酸-纳米金修饰电极；

（4）加载有序介孔碳载纳米金：将步骤（1）中制得的有序介孔碳载纳米金悬浮液滴加到步骤（3）中制得的L-赖氨酸-纳米金修饰电极的检测端表面，晾干后得到复合材料修饰电极；

（5）固定酪氨酸酶：在步骤（4）中制得的复合材料修饰电极上滴加配制好的酪氨酸酶溶液，通过充分的物理吸附作用使酪氨酸酶固定于复合材料修饰电极的有序介孔碳载纳米金粒子上，得到酪氨酸酶生物传感器。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，有序介孔碳与氯金酸、柠檬酸钠和硼氢化钠的质量比为1∶0.05～0.12∶0.01∶0.00075。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，L-赖氨酸溶液的浓度范围为1.0×10^-3mol/L～1.0×10^-2mol/L。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述溶剂为有机溶剂二甲基甲酰胺，所述有序介孔碳载纳米金悬浮液的浓度为1.0 mg/mL～3 mg/mL；所述步骤（4）中，检测端表面滴加5 μL～10 μL的有序介孔碳载纳米金悬浮液。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中，所述酪氨酸酶溶液的pH值为4.5～9.2，所述酪氨酸酶溶液中酪氨酸酶的浓度为0.05 mg/μL～0.1 mg/μL。

7.根据权利要求2～6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述有序介孔碳是采用包括以下步骤的制备方法制得：

（1）合成硅基分子筛SBA-15：将嵌段共聚物P123置于盐酸中溶解，然后逐滴加入正硅酸乙酯，搅拌后水浴加热，温度控制在30℃～35℃，然后将混合物移至反应釜中，在140℃～150℃水热，抽滤，洗涤至中性，风干，再放入电阻炉中焙烧，得到硅基分子筛SBA-15；

（2）合成有序介孔碳：将制得的硅基分子筛SBA-15与水、蔗糖、浓硫酸混合，混合物置于100℃～160℃温度下干燥直至混合物变为黑色，然后将黑色的混合物置于惰性气体保护下进行高温热解，使蔗糖完全碳化，再用NaOH溶液去除热解产物中的二氧化硅分子筛模板，过滤、洗涤、干燥后即得到有序介孔碳。

8.一种如权利要求1所述的酪氨酸酶生物传感器或者权利要求2～7中任一项所述制备方法制得的酪氨酸酶生物传感器在检测苯二酚中的应用，检测时的具体操作方法包括以下步骤：以所述的酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中进行电化学反应时的氧化电流大小，然后根据苯二酚浓度与氧化电流变化的线性回归方程，即可定性或定量地测定待测溶液中的苯二酚。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述苯二酚为对苯二酚或邻苯二酚；

所述对苯二酚浓度与氧化电流变化的线性回归方程为：

P_HQ =66.954－9.5357lgC_HQ （1）

式（1）中，P_HQ为对苯二酚检测时的电流变化值，单位为µA；C_HQ为待测溶液中对苯二酚的浓度值，单位为M；式（1）的相关系数为R²=0.9565，检测下限为5×10⁻⁸M；

所述邻苯二酚浓度与氧化电流变化的线性回归方程为：

P_CC =88.394 -13.081lgC_CC （2）

式（2）中，P_CC为邻苯二酚检测时的电流变化值，单位为µA；C_CC为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为M；式（2）的相关系数为R²=0.9771，检测下限为2.5×10⁻⁸M；

所述对苯二酚、邻苯二酚的线性检测范围均为4×10⁻⁷M～8.0×10⁻⁵M。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述三电极系统检测待测溶液时用到的电解液为pH值为4.5～9.2的磷酸盐缓冲溶液。