CN102323318B

CN102323318B - 一种检测过氧化氢的酶电极及其制备方法

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Publication number: CN102323318B
Application number: CN201110139076.9A
Authority: CN
Inventors: 左霞; 张会; 李楠
Original assignee: Capital Normal University
Current assignee: Capital Normal University
Priority date: 2011-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2031-05-26
Also published as: CN102323318A

Abstract

本发明涉及一种检测过氧化氢的碳纳米管-金属酞菁/酶修饰玻碳电极的制备方法，属于电化学分析检测技术领域。本发明通过原位合成法制备了多壁碳纳米管-酞菁钴复合材料，采用滴涂法制备了碳纳米管-金属酞菁/过氧化氢酶修饰电极，制作了一种新型的电化学生物传感器，可以快速稳定、灵敏准确的检测H₂O₂，并可以消除抗坏血酸等常见物质对H₂O₂测定的干扰。

Description

一种检测过氧化氢的酶电极及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种酶电极及其制备方法，特别涉及一种用于检测过氧化氢的碳纳米管-金属酞菁/酶修饰玻碳电极及其制备方法，属于电化学分析检测技术领域。

背景技术

过氧化氢(H₂O₂)是过氧化酶参与的酶促反应产物，H₂O₂的测定在工业、生物、环境、临床诊断和食品分析等领域都有非常重要的作用，因此对H₂O₂的检测引起了人们越来越多的关注。目前，检测H₂O₂一般采用滴定、化学发光、荧光和电化学等方法，其中电化学分析方法由于具有较高的灵敏度、良好的线性范围、快速而稳定的响应信号而被广泛研究。酶电极往往由于其制备过程复杂，稳定性差，不能长期保存，灵敏度大幅度下降而不能广泛使用，因此制备稳定性能好且工艺过程简单的过氧化氢酶电极，成为现在的迫切需求。碳纳米管(CNT)由于其出色的电学、化学特性和生物相容性，经过化学和生化功能化后，越来越多的应用于电化学生物传感器的研究。

刘赵荣等于2007年在“多壁碳纳米管过氧化氢酶电极的研制及其电化学性能研究”一文中，公开了一种制备多壁碳纳米管过氧化氢酶电极的方法并对其电化学性能进行了研究，该方法将过氧化氢酶(CAT)固定在多壁碳纳米管(MWCNT)-Nafion膜中，制备了MWCNT-Nafion\CAT电极，发现固定在Nafion膜中的MWCNT能在CAT和玻碳电极之间有效地传递电子，能实现MWCNT修饰电极上CAT的直接电子转移。实验表明，该电极于4℃保存20天后，其伏安响应能保持80％左右，但其稳定性，灵敏性等仍不能取得非常令人满意的效果。

针对上述问题本发明提供了一种制备检测过氧化氢的碳纳米管-金属酞菁/酶修饰玻碳电极的方法，其是利用酞菁对电极进行了修饰，其中酞菁(Pc)作为一种共面的18个π电子共轭大环体系被证实与自然界存在的卟啉十分类似。Northwest大学的Marks和Brian Hoffman证实，由酞菁和碘组成的晶状电荷转移化合物具有类似金属的导电性。由于酞菁在形成电荷转移化合物时其电导率明显提高，所以该化合物可以作为电传感器来检测有毒或氧化性气体。ATVartanyan 1948年报导，酞菁在光照下同样可以提高其电导率，显示了酞菁作为光导材料的巨大潜力。酞菁化合物不仅结构上具有很好的可调变性，对空气甚至酸碱都具有高稳定性。本发明通过利用酞菁(Pc)对电极进行修饰后，得到的电极相较于现有技术来说其具有响应快，灵敏度高，重现性和稳定性高等优点，可直接用于H₂O₂的测定。且本发明提供的制备方法简单、快速、易于操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测过氧化氢的酶电极的制备方法，使用本方法制得的酶电极作为一种新型的电化学生物传感器，可用于快速稳定、灵敏准确的检测H₂O₂，同时消除抗坏血酸等常见干扰物质对测定的影响，并具有高的稳定性，保存期限更长。

本发明的制备一种过氧化氢酶电极的方法，其特征在于具有以下步骤：

(1)将邻苯二腈、无水氯化钴(CoCl₂)、多壁碳纳米管(MWNT)和二氮双杂环(DBU)在有机溶剂中超声混合均匀，反应物邻苯二腈、CoCl₂以及DBU的摩尔比为2～4∶1～4∶2～4，多壁碳纳米管的质量为0.05～0.3g，有机溶剂的体积为20～60mL；

(2)将上述混合物在氮气保护下，于130～220℃下搅拌反应1～4h，产物过滤后用无水甲醇洗涤，烘干后得深黑色粉末状固体，即多壁碳纳米管-酞菁钴(MWNT-CoPc)；

(3)称取2～6mg的MWNT-CoPc粉末，超声分散于1～3mL无水乙醇中。即得分散均匀的复合修饰剂；

(4)将分散均匀的复合修饰剂滴涂于干净的玻碳电极(GCE)表面，依次滴涂2～5μL的过氧化氢酶(Cat)和1～2μL 5％Nafion溶液，室温下干燥，即得到本发明所述的碳纳米管-金属酞菁/酶修饰玻碳电极(MWNT-CoPc/Cat/Nafion电极)；

其中，所述的多壁碳纳米管，直径为20～200nm，长度为2～20μm；步骤1)中所述的有机溶剂选自正戊醇、喹啉、硝基苯、氯萘或三氯苯等其中至少一种；

按照上述的方法即可制得的本发明所述的一种检测过氧化氢的酶电极。

本发明利用MWNT-CoPc复合材料的吸附性，使过氧化氢酶固定在MWNT-CoPc修饰电极表面，制备了MWNT-CoPc/Cat/Nafion修饰玻碳电极，本发明的酶电极可用于过氧化氢的检测，具体的可将所述的酶电极作为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极，组成三电极系统，即可实现对H₂O₂的检测。

采用循环伏安法和计时电流法研究了该修饰电极在pH为6.0～8.0的磷酸缓冲溶液(PBS)中对H₂O₂的电催化性能。由于MWNT大的比表面积有利于酶的固定，良好的生物相容性保持了对H₂O₂的电催化活性，独特的电子特性促进了电子传递速率。此外，较低的工作电位，能有效地消除干扰物质对测定的影响。本方法测定AA的线性范围为1.0×10^-5～1.52×10^-3M，检出限为1.0×10^-6M，响应时间不超过2s，平行测定5次的相对标准偏差为3.75％，30天时测定响应电流仍保持在80％以上。

附图说明

图1为本发明中MWNT-CoPc/Cat/Nafion电极在0.1mol/L PBS(pH 7.0)中的循环伏安图，(a)未加H₂O₂(b)加入0.27mM H₂O₂；

图2为本发明中MWNT-CoPc/Cat/Nafion电极对H₂O₂的计时安培曲线。

具体实施方式

下面通过药理性及临床观察实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1

MWNT-CoPc/Cat/Nafion修饰玻碳电极的制备

(1)将1g邻苯二腈、0.25g无水氯化钴、0.1g多壁碳纳米管(MWNT)、1mLDBU和40mL正戊醇超声混合均匀，180℃下加热搅拌2h，产物过滤后用无水甲醇洗涤，在80℃下干燥4h，得深黑色粉末MWNT-CoPc；

(2)称取3mg MWNT-CoPc，超声分散于1mL的无水乙醇中；将分散均匀的复合修饰剂滴涂于干净的玻碳电极(GCE)表面，干燥后依次滴涂2μL的过氧化氢酶(Cat)和1μL 5％Nafion溶液，室温下干燥，即得到MWNT-CoPc/Cat/Nafion电极。

实施例2

MWNT-CoPc/Cat/Nafion修饰玻碳电极的制备

(1)将0.6g邻苯二腈、0.18g无水氯化钴、0.1g多壁碳纳米管(MWNT)、0.6mL DBM和30mL硝基苯超声混合均匀，160℃下加热搅拌3h，产物过滤后用无水甲醇洗涤，在100℃下干燥2h，得深黑色粉末MWNT-CoPc；

(2)称取3mg MWNT-CoPc，超声分散于1mL的无水乙醇中；将分散均匀的复合修饰剂滴涂于干净的玻碳电极(GCE)表面，干燥后依次滴涂4μL的过氧化氢酶(Cat)和2μL 5％Nafion溶液，室温下干燥，即得到MWNT-CoPc/Cat/Nafion电极。

实施例3

MWNT-CoPc/Cat/Nafion修饰玻碳电极的制备

(1)将1.5g邻苯二腈、0.35g无水氯化钴、0.18g多壁碳纳米管(MWNT)、2mL DBM和60mL三氯苯超声混合均匀，160℃下加热搅拌2h，，产物过滤后用无水甲醇洗涤，在100℃下干燥2h，得深黑色粉末MWNT-CoPc；

(2)称取6mg MWNT-CoPc，超声分散于2mL的无水乙醇中。将分散均匀的复合修饰剂滴涂于干净的玻碳电极(GCE)表面，干燥后依次滴涂4μL的过氧化氢酶(Cat)和2μL 5％Nafion溶液，室温下干燥，即得到MWNT-CoPc/Cat/Nafion电极。

实施例4电化学测试

将实施例1中得到的MWNT-CoPc/Cat/Nafion修饰玻碳电极用于电化学测试：

(1)MWNT-CoPc/Cat/Nafion电极的循环伏安测试。将WNT-CoPc/Cat/Nafion电极作为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极；底液为0.1mol/L PBS(pH 7.0)和含有0.27mM H₂O₂的0.1mol/L PBS(pH 7.0)；扫描范围为-0.7～0.2V，扫速为100mV/s，所得到的循环伏安图见图1。

(2)MWNT-CoPc/Cat/Nafion电极对H₂O₂的计时电流测试。将MWNT-CoPc/Cat/Nafion电极作为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极；底液为0.1mol/L PBS(pH 7.0)；恒定电压为-0.37V，在磁力搅拌下，连续加入不同浓度的H₂O₂溶液，测试结果见图2。

本方法测定AA的线性范围为1.0×10^-5～1.52×10^-3M，检出限为1.0×10^-6M，响应时间不超过2s，平行测定5次的相对标准偏差为3.75％，30天时测定响应电流仍保持在80％以上。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种检测过氧化氢的酶电极的制备方法，其特征在于制备方法包括以下步骤：

（1）将邻苯二腈、无水氯化钴、多壁碳纳米管和二氮双杂环在有机溶剂中超声混合均匀，反应物邻苯二腈、无水氯化钴以及二氮双杂环的摩尔比为2～4：1～4：2～4，多壁碳纳米管的质量为0.05～0.3g，有机溶剂的体积为20～60mL；所述的有机溶剂选自正戊醇、喹啉、硝基苯、氯萘或三氯苯其中至少一种；

（2）将上述混合物在氮气保护下，于130～220℃下搅拌反应1～4小时，产物过滤后用无水甲醇洗涤，烘干后得深黑色粉末状固体，即多壁碳纳米管-酞菁钴；

（3）称取2～6mg的多壁碳纳米管-酞菁钴粉末，超声分散于1～3mL无水乙醇中，即得分散均匀的复合修饰剂；

（4）将分散均匀的复合修饰剂滴涂于干净的玻碳电极表面，依次滴涂2～5μL的过氧化氢酶和1～2μL5%Nafion溶液，室温下干燥，即得到本方法所述的检测过氧化氢的酶电极。

2.按照权利要求1所述的制备检测过氧化氢的酶电极的方法，其特征在于所述的多壁碳纳米管，直径为20～200nm，长度为2～20μm。

3.按照权利要求1或2所述的方法制得的一种检测过氧化氢的酶电极。

4.权利要求3所述的酶电极在检测过氧化氢中的应用。

5.按照权利要求4所述的酶电极在检测过氧化氢中的应用，其特征在于将所述的酶电极作为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极，组成三电极系统，对H₂O₂进行检测。