CN113340958A - 一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极及其应用，其中，利用立方la3d结构介孔碳CMK‑8对玻碳电极进行修饰；修饰后的玻碳电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、钛棒为对电极，组成槲皮素电化学传感器。利用该电化学传感器对槲皮素的含量进行检测。其有益效果是，利用立方la3d结构介孔碳CMK‑8进行玻碳电极修饰的工作电极制备方法简便，利用修饰后的玻碳电极组成的电化学传感器用于槲皮素检测，其检测的线性范围广、检测灵敏度高、检出限低。该电化学传感器在槲皮素实际样品的检测分析中运用时结果准确、可信、稳定性好，具备实际使用价值。

Description

一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极及其应用

技术领域

本发明涉及电化学传感检测技术领域，尤其涉及一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极及其应用。

背景技术

槲皮素是普遍存在于植物界并具有多重生物活性的一种黄酮类化合物。许多植物的茎皮、花、叶、芽、果实等部位是槲皮素广泛存在的地方，多以苷(芦丁，槲皮苷等)的形式存在,在荞麦、洋葱、苹果等蔬果中所占含量比较高。在药理学方面，槲皮素具有清除本身带有的自由基、抗氧化活性、抗病毒、抗炎、降低血糖及免疫调节等生物活性和广泛的应用，在细胞和动物实验中能够治疗多种疾病。因此，开发一种简单、便宜且灵敏的槲皮素检测方法具有重要意义。

目前，检测槲皮素的方法主要有毛细管电泳法、催化动力学荧光法、伏安法、光谱法和高效液相色谱法等。传统的技术具有较好的选择性，但其往往需要昂贵的设备，较长的时间和专业技能较高的技术人员，这些条件使这些技术无法得到大范围的运用。相对而言，电化学分析方法因其设备简单易得、检测准确度高、测定范围宽、检出限低等优点，在环境、生物、医药等领域普及度越来越大。近年来，纳米材料所修饰的电化学传感器也在各个行业得到运用，其中以碳纳米管与石墨烯的运用较为广泛，目前，已有诸多用电化学方法检测槲皮素的研究，如运用有机溶剂修饰碳糊电极、碳纳米管及其他碳材料混合修饰玻碳电极、混合碳材料用金属修饰修饰玻碳电极等方法，但其结果都存在检出限较高、重现性差、不稳定和灵敏度较低等不足。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种高灵敏度槲皮素电化学传感器工作电极及其应用，其解决了现有槲皮素电化学传感器技术中检出限较高、灵敏度较低的技术问题。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明实施例提供一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极，工作电极为经立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极(CMK-8/GCE)；在玻碳电极的工作面表面，立方la3d结构介孔碳CMK-8的负载量为0.056～0.226mg/cm²。

立方la3d结构介孔碳CMK-8的最优负载量为0.113mg/cm²，在该负载量下可以使碳材料在玻碳电极上均匀分布，使工作电极具有最大的有效的电化学活性面积，为待测物提供足够多的吸附位点。负载量过多，容易发生聚集，导致活性位点减少。

第二方面，本发明实施例提供一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极的制备方法，包括以下步骤：

S1、配制立方la3d结构介孔碳CMK-8溶液；

S2、玻碳电极(GCE)预处理；

S3、使用立方la3d结构介孔碳CMK-8溶液对玻碳电极(GCE)进行修饰。

可选的，在步骤S1中，使用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，超声分散，配制成浓度为2±0.1mg/mL的CMK-8分散液。

可选的，在步骤S2中，用0.05μm规格的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，直至玻碳电极的工作面光滑，然后用蒸馏水冲净并晾干。

氧化铝粉末是常用的抛光材料，因为其具有合适的硬度和良好的稳定性，而且纯度高，粉体粒径小，分散性好。玻碳电极抛光通常是依次使用0.5μm、0.3μm、0.05μm规格粉末逐级抛光。本发明涂覆的材料比较容易清除，直接用滤纸擦掉电极表面的涂覆材料，再用0.05μm进行抛光即可。除非电极表面有非常深的划痕或者附着了难以除去的物质，比如沉积过聚合物，不容易擦拭，才会用砂纸由粗到细进行打磨，再用氧化铝粉抛光。Au电极和玻碳电极一般都是用氧化铝抛光，Au电极不能使用砂纸打磨。玻碳电极在使用之前均需进行抛光打磨，清除表面杂质，使电极表面达到光滑状态。如果抛光程度不够，电极导电性不佳，电子转移速率低，峰电位差变大。

可选的，在步骤S3中，使用涂覆或浸涂方法，将S1制备的立方la3d结构介孔碳CMK-8溶液涂布在经步骤S2处理的玻碳电极的工作面，烘干，冷却，得到立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极。

进一步的，还包括电极的初始化步骤S4：对制备的立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极置于0.1-0.5mol/L的PBS缓冲液中，在-0.1～0.4V范围的电位窗内用差分脉冲伏安法重复扫描5次使基线稳定。如果基线不稳定，则无法准确计算检出限和灵敏度等参数，也无法对待测物进行准确定量。

进一步的，检测玻碳电极的工作面是否光滑的方法为：在5mmol/L铁氰化钾溶液中用循环伏安法检测玻碳电极的抛光程度，得到可逆的循环伏安峰形且峰电位差在70～80mV即可。

可选的，在步骤S3中，CMK-8的涂覆量为2-8μL；优选为4μL。

另一方面，本发明实施例中一种高灵敏度槲皮素电化学传感器，其包含工作电极、对电极、参比电极；其工作电极为本发明的立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极。

利用该电化学传感器进行槲皮素的含量检测的方法，包括以下步骤：

步骤1：0.1-0.5mol/L的PBS缓冲液中，在500-1500rpm磁力搅拌下进行恒电位富集，电位区间为-0.2V～0.4V，富集时间6-21min；

步骤2：电化学测试采用三电极体系：工作电极为立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极，对电极为钛棒，参比电极为饱和甘汞电极；

循环伏安法(CV)的测试条件是：初始电位-0.1V，高电位0.4V，低电位-0.1V，扫描速度0.05V/s，采样间隔0.001V，静止时间2s，灵敏度100A/V；

电化学测试的差分脉冲伏安法测定的参数为：电位区间在-0.1～0.4V，增幅为10mV，脉冲宽度为0.06s，取样间隔0.02s，脉冲周期0.5s，振幅为50mV，灵敏度100μA。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：本发明的一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极及其应用，由于采用立方la3d结构介孔碳CMK-8对玻碳电极的功能修饰，相对于现有技术而言，具有以下技术效果，

1、该电化学传感器工作电极制备方法简便，因为立方la3d结构介孔碳CMK-8具有三维贯通的孔道结构，有利于电解液的快速扩散；而且三维结构使得其在修饰电极过程中可以有效保持巨大的比表面积以及优异的电子迁移能力，使得该电化学传感器具有高度灵敏性；立方la3d结构介孔碳CMK-8的最优负载量为0.113mg/cm²，在该负载量下可以使碳材料在玻碳电极上均匀分布，使工作电极具有最大的有效的电化学活性面积，为待测物提供足够多的吸附位点。

2、利用本发明的工作电极组成的电化学传感器在对槲皮素进行检测时，检出浓度线性范围广、检测灵敏度高、检出限低。当槲皮素的浓度在1×10^-9～1×10^-6mol/L之间时，其相关线性回归方程为Ipa(μA)＝0.1169c(nmol/L)+10.70,r＝0.9934，槲皮素的检出限为1.67×10^-10mol/L(S/N＝3)。

3、利用本发明的工作电极组成的电化学传感器在对槲皮素进行检测时效果稳定，具有实际使用价值。

该电化学传感器稳定性良好，具有可重复使用性。连续5天，每天一次对1×10^{- 6}mol/L槲皮素溶液进行电化学测试，CMK-8修饰玻碳电极的峰电流保持率为76.6％。采用相同的方法对CMK-8修饰Au电极进行考察，其峰电流保持率仅为56.8％。

附图说明

图1为实施例1及对比例1-6的不同材料修饰的玻碳电极组成的槲皮素电化学传感器的DPV峰电流柱形图，图中a为FDU-15/GCE电极、b为CMK-3/GCE电极，c为CMK-8/GCE电极，d为GO/GCE电极、e为G-WCNTs/GCE电极、f为N-WCNTs/GCE电极、g为CNH/GCE电极、h为GCE电极；

图2为实施例1和对比例7在含有和不含有1×10^-6mol/L槲皮素的CV及DPV曲线，图2A中a→d分别为CMK-8/GCE电极在含有和不含1×10-6mol/L槲皮素和GCE电极在含有和不含1×10-6mol/L槲皮素的电解液中的CV曲线，扫描速率为50mV/s；图2B中GCE电极(a1)与CMK-8/GCE电极(b1)的DPV曲线对比；

图3为实施例1-2和对比例8-10的CMK-8涂覆量对槲皮素电化学传感器响应的影响；

图4为实施例1、实施例3和对比例11-12的缓冲溶液浓度对槲皮素电化学传感器响应的影响；

图5为实施例1、实施例4与对比例13-15的缓冲溶液对槲皮素电化学传感器响应的影响；

图6为实施例5-7与对比例16-19的富集电位对测试槲皮素时峰电位响应的影响；

图7为实施例5、实施例8-9与对比例20-22的富集时间对测试槲皮素时峰电位响应的影响；

图8为实施例5、实施例10-11与对比例23-24的磁搅拌的转速对测试槲皮素时峰电位响应的影响；

图9为循环伏安法(CV)在不同扫描速率下检测1×10^-6mol/L槲皮素的响应情况，图9A为1×10^-6mol/L槲皮素在不同扫速下与氧化还原峰电流与电位的关系图，图9B为不同扫速下与氧化还原峰电流与电位的线性关系图；

图10为DPV法测试CMK-8/GCE电极在不同pH值PBS缓冲液中的峰电流响应情况，图10A为CMK-8/GCE电极在不同pH值(a→e为pH从4→8)的PBS缓冲液下的DPV曲线，图10B为pH值与峰电位(Ep)的关系曲线；

图11为CMK-8/GCE和CMK-8/Au两种不同电极连续5天对1×10^-6mol/L槲皮素溶液进行电化学测试的DPV曲线，图11A为CMK-8/GCE电极的DPV曲线，图11B为CMK-8/Au电极的DPV曲线；

图12为CMK-8/GCE电极测试槲皮素标准溶液的一系列浓度峰电流响应情况，图12A为不同浓度的槲皮素的DPV图，图12B为不同浓度的槲皮素的标准曲线；

图13为最佳条件下对槲皮素测定时干扰物的影响，在1×10^-6mol/L槲皮素溶液中加入1×10^-4mol/L的Mg²⁺、Al³⁺、Ca²⁺、葡萄糖、肌苷和抗坏血酸时，CMK-8修饰电极对槲皮素选择性柱形图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

本发明实施例提出的一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极及其应用，其中，利用立方la3d结构介孔碳CMK-8对玻碳电极进行修饰，修饰后的玻碳电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、钛棒为对电极，得到槲皮素电化学传感器。利用该电化学传感器对槲皮素的含量进行检测。其有益效果是，该电化学传感器的工作电极制备方法简便，线性范围广、检测灵敏度高、检出限低。

为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

其中，循环伏安法(CV)的测试条件是：初始电位-0.1V，高电位0.4V，低电位-0.1V，扫描速度0.05V/s，采样间隔0.001V，静止时间2s，灵敏度100A/V。

差分脉冲伏安法(DPV)的测试条件是：电位区间在-0.1～0.4V，增幅为10mV，脉冲宽度为0.06s，取样间隔0.02s，脉冲周期0.5s，振幅为50mV，灵敏度100μA。

槲皮素标准溶液的制备方法：精密称定质量为0.00604g的槲皮素标准品，放入10mL容量瓶中，加适量无水乙醇超声溶解后定容，配置成浓度为2mmol/L的槲皮素标准溶液。放入超声清洗器中超声20分钟后获得均匀分散的待测物标准溶液，并置于4℃的冰箱中备用。

实施例1

一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极，通过以下步骤制得，

S1立方la3d结构介孔碳CMK-8溶液配制：精密称定质量为20mg的CMK-8，将其加入10mL容量瓶中，加适量N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后再加溶液定容，配置成浓度为2mg/mL的CMK-8分散液。放入超声清洗器中超声1h，常温放置备用；

S2玻碳电极预处理：用0.05μm规格的高级氧化铝粉末抛光玻碳电极(直径3mm)，直到工作面光滑，然后用蒸馏水冲净，在5mmol/L铁氰化钾溶液中用循环伏安法检测GCE抛光程度，得到可逆的循环伏安峰形且峰电位差在70～80mV，用蒸馏水冲洗并晾干备用；

S3介孔碳CMK-8涂覆修饰：将步骤S1制备的CMK-8分散液在使用前超声分散后，用进样器取4μL CMK-8分散液均匀涂覆在经过预处理的玻碳电极工作面，在红外灯下照干，冷却至室温后形成CMK-8/GCE电极；

S4电极的初始化：对制备的立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极置于0.2mol/L的PBS缓冲液中，缓冲溶液pH为6的条件下，在-1～-1.4V范围的电位窗内用差分脉冲伏安法循环至曲线稳定。

对比例1-6

本对比例在实施例1基础上，将S1步骤制备溶液的材料改为单壁碳纳米角(SWCNT)、有序介孔碳FDU-15、有序介孔碳CMK-3、氨基化多壁碳纳米管(N-WCNTs)、石墨化多壁碳纳米管8-15nm(G-WCNTs)以及氧化石墨烯(GO)，配制成2mg/mL的分散液，并用上述分散液对裸玻碳电极进行修饰，其他条件与步骤均与实施例1相同。

将实施例1和对比例1-6的电化学传感器工作电极与饱和甘汞电极为参比电极、钛棒为对电极，构建得到槲皮素电化学传感器。将该电化学传感器用于槲皮素检测，利用DPV技术测试上述电极的电化学峰电流响应。本实施例和对比例均在装载量为20mL的0.2mol/L的PBS缓冲液(pH值为6)，涂覆量为4μL，富集电位为-0.1V，富集时间为12min,搅拌器的转速为1000r/min的电化学体系中进行检测，利用含有1×10^-6mol/L槲皮素的标准溶液进行测定。

具体的，不同碳材料修饰的玻碳电极在DPV测试方法的峰电流柱形图结果见图1，

从图1可以看出，CMK-8/GCE电极对槲皮素的电化学氧化表现出最好的催化性能，其峰形最好，峰电流最大，灵敏度也最高，这可能归因于CMK-8有序的介孔结构，在修饰电极过程中可以有效保持其巨大的比表面积以及优异的电子迁移能力。因此，选择立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极作为工作电极。

对比例7

对比例7与实施例1相比，是裸玻碳电极GCE，没有经过步骤S1处理，GCE为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、钛棒为对电极，得到的槲皮素电化学传感器。

将实施例1与对比例7在含有和没含有槲皮素标准液的情况下，采用CV和DPV法进行电化学传感器性能测试，具体结果见图2，

图2A为GCE电极和CMK-8/GCE电极在不含(c)和含有(d)1×10^-6mol/L槲皮素的电解液中的CV曲线。由图可见，与不含槲皮素的CV曲线对比，CMK-8/GCE电极在含有槲皮素的电解液中出现一对可逆的氧化还原峰，氧化峰和还原峰电位分别为0.167V和0.152V，氧化峰峰电流响应值为18.76μA，还原峰峰电流响应值为-8.36μA。说明槲皮素在CMK-8/GCE电极可以发生良好的电化学氧化还原反应。与GCE电极相比(氧化峰和还原峰电位分别为0.213V和0.155V；峰电流分别为1.20μA和-5.16μA)，槲皮素在CMK-8/GCE电极上的反应过电位发生了明显的降低，峰电流明显增加。说明CMK-8对槲皮素的电化学氧化具有优异的电化学催化效果。

图2B为DPV法测试曲线，其中a₁为GCE电极，b₁为CMK-8/GCE电极。GCE电极与CMK-8/GCE电极的氧化峰电流分别为1.902μA和133.2μA。与裸电极相比，CMK-8/GCE电极上槲皮素的峰电流响应值增强了大约80倍。据此，体现了CMK-8/GCE工作电极对槲皮素有更强效的吸附能力以及催化性能。

实施例2

在实施例1的基础上，将步骤S3中CMK-8涂覆量改为6μL，其他条件与实施例1相同。

对比例8-10

在实施例1的基础上，将步骤S3中CMK-8涂覆量改为0μL、2μL、8μL，其他条件与实施例1相同。

将实施例1-2与对比例8-10制得的电化学传感器工作电极，利用饱和甘汞电极为参比电极、钛棒为对电极，得到的槲皮素电化学传感器。

该电化学传感器利用DPV法测定1×10^-6mol/L的槲皮素，具体结果见图3，

从图3可以看出，在涂覆量小于4μL时，逐渐增加玻碳电极工作面的涂覆量，修饰电极的电活性比表面积也增大，DPV峰电流响应值也逐步增大。当涂覆量大于4μL后，涂覆层过厚可能会导致碳材料堆积，使电极电阻增加，故DPV峰电流响应值逐渐减小。在4μL涂覆量测定1×10^-6mol/L的槲皮素时电流响应值达到最大。

实施例3

在在实施例1的基础上，将步骤S4中缓冲溶液的浓度改为0.3mol/L，其他条件与实施例1相同。

对比例11-12

在在实施例1的基础上，将步骤S4中缓冲溶液的浓度改为0.1mol/L、0.4mol/L，其他条件与实施例1相同。

将利用实施例1、实施例3与对比例11-12得到的工作电极制备的电化学传感器采用DPV法测定1×10^-6mol/L的槲皮素，具体结果见图4，

从图4可以看出，浓度为0.2mol/L的PBS缓冲溶液最有利于电极反应。在浓度小于0.2mol/L时，随着PBS溶液的增加，峰电流增大。在浓度为0.2mol/L时，峰电流达到最大。当浓度大于0.2mol/L时，随着浓度的增大峰电流反而降低。

实施例4

在在实施例1的基础上，将步骤S4中缓冲溶液的pH值改为5，其他条件与实施例1相同。

对比例13-15

在在实施例1的基础上，将步骤S4中缓冲溶液的pH值改为4、7、8，其他条件与实施例1相同。

将利用实施例1、实施例4与对比例13-15的工作电极制备得到的电化学传感器利用DPV法测定1×10^-6mol/L的槲皮素，具体结果见图5，

从图5可以看出，在pH值小于6时，峰电流随着PBS缓冲液的pH值增加而增加。在pH为6时，峰电流最大。在pH值大于6时，峰电流随着PBS缓冲液的pH增加而减小。

实施例5

一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极的应用，对槲皮素进行检测，其电化学体系的富集条件如下：富集电位为-0.1V，富集时间为12min,磁搅拌器的转速为1000r/min；

在该富集条件下，利用实施例1的高灵敏度槲皮素电化学传感器工作电极构建电化学传感器，其参比电极为饱和甘汞电极、对电极为钛棒；对1×10^-6mol/L槲皮素进行DPV测试。

实施例6

在在实施例5的基础上，将电化学体系的富集电位改为0.1V，其他条件与实施例5相同。

实施例7

在在实施例5的基础上，将电化学体系的富集电位改为0V，其他条件与实施例5相同。

对比例16-19

在在实施例5的基础上，将电化学体系的富集电位改为-0.2V、0.2V、0.3V和0.4V，其他条件与实施例5相同。

将实施例5-7与对比例16-19考察富集电位对测试槲皮素时峰电位响应的影响，具体的测试结果见图6，

从图6可以看出，当电位小于-0.1V时，富集电位的DPV峰电流值增大。当富集电位大于-0.1V时，DPV峰电流响应随富集电位的增大而减小。峰电流响应值在-0.1V时最大。

实施例8

在在实施例5的基础上，将电化学体系的富集时间改为15min，其他条件与实施例5相同。

实施例9

在在实施例5的基础上，将电化学体系的富集时间改为21min，其他条件与实施例5相同。

对比例20-22

在在实施例5的基础上，将电化学体系的富集时间改为2min、6min、9min，其他条件与实施例5相同。

将实施例5、实施例8-9与对比例20-22考察富集时间对测试槲皮素时峰电位响应的影响，具体的测试结果见图7，

从图7可以看出，在富集时间小于12min前，富集时间越大，电极上比表面积吸附的槲皮素未饱和，其检测出的氧化峰电流呈增大趋势。当富集时间大于12min后，峰电流响应值平缓增长，这是由于此时CMK-8修饰电极工作面吸附的槲皮素接近饱和。为获取更好的灵敏度检测及更经济的实验时间，将12min作为本发明的较佳富集时间。

实施例10

在在实施例5的基础上，将磁搅拌的转速改为1250r/min，其他条件与实施例5相同。

实施例11

在在实施例5的基础上，将磁搅拌的转速改为1500r/min，其他条件与实施例5相同。

对比例23-24

在在实施例5的基础上，将磁搅拌的转速改为0r/min、500r/min，其他条件与实施例5相同。

将实施例5、实施例10-11与对比例23-24考察磁搅拌的转速对测试槲皮素时峰电位响应的影响，具体的测试结果见图8，

从图8可以看出，测试发现随着转速逐渐增大，电解质系统搅拌越来越充分，峰电流也随之增大。当转速大于1000r/min后，由于搅拌速度过快，带动空气的进入出现较深的漩涡和产生较多气泡，气泡会阻挡修饰电极对槲皮素的富集效果，故随着搅拌速度的增大而峰电流减小。故磁搅拌器的转速为1000r/min的时候有最佳效果。

综合图1-图8，可以看出，用CMK-8/GCE电极作为工作电极的电化学传感器，测试槲皮素的最佳条件是：CMK-8涂覆体积为4μL，磷酸盐PBS缓冲溶液的浓度为0.2mol/L，pH＝6，富集电位为-0.1V，富集时间12min，磁搅拌器的转速选择1000r/min。

本发明在最佳条件下，对CMK-8/GCE电极作为工作电极的槲皮素电化学传感器的电化学反应机理、线性范围及检出限、抗干扰性及稳定性和实用性等方面进行探究，具体情况如下，

1、槲皮素在CMK-8/GCE电极上的电化学反应机理

使用循环伏安法(CV)，研究CMK-8/GCE检测1×10^-6mol/L的槲皮素在0.01v/s、0.05v/s、0.1v/s、0.15v/s、0.2v/s下的扫描速率峰电流响应值，具体结果见图9，

从图9可知，通过增大扫描速率，氧化峰电流(I_pa)和还原峰电流(I_pc)的响应值也随之增大，且氧化峰的峰电流与在0.01v/s～0.2v/s范围内的扫描速率呈正相关(图9B)，其线性关系为I_pa(μA)＝0.1155v(mV/s)+2.4071，相关系数为r＝0.9981；还原峰的峰电流与在0.01v/s～0.2v/s范围内的扫描速率呈负相关，其线性关系为I_pc(μA)＝-0.0853v(mV/s)+0.2136，相关系数为r＝0.9981，两者关系表明槲皮素在该电化学传感器中主要受表面过程吸附的控制，即电子转移到电极表面并发生反应的过程。

进一步的，利用DPV法来对CMK-8/GCE电极在不同pH值的PBS缓冲溶液中的峰电流响应情况进行测试，具体的见图10，

从图10可以看出，DPV曲线，发现氧化峰电位会随pH增加而负移，峰电流响应值则先增加后减小，说明质子参与了该电极反应过程。图10B中可见氧化峰电位和pH间存在着良好的负相关线性关系，线性方程为E_pa(V)＝-0.054pH+0.458，(r＝0.9952)，其中方程的斜率为-54mV/pH，与能斯特方程的等质子电子传递理论值-59mV/pH接近，其数值的偏差可能涉及室温及修饰电极的差异，因此仍认为两者近似相等，表明槲皮素在该体系中质子参与的氧化还原反应涉及同等的电子数与质子数，由此，其反应机理如下所示，

对于现有利用CMK-8进行电极修饰的技术，作为电化学传感器，利用Au电极或是其它金属电极，还是会根据测试的物质或是电极的不同进行选择。不管是用玻碳电极还是Au电极，反应机理都一样，它们均作为导电载体，在电极上修饰不同的碳纳米材料，可不同程度地提高电极有效面积和导电性以及吸附能力，从而增强电极反应。使用不同材质的导电载体，可能会导致电极过程不同，比如Au电极，碳纳米材料在Au电极表面容易聚集，导致扩散速率变慢，电极过程会由吸附控制变成吸附-扩散共同控制。

对CMK-8/GCE电极和CMK-8/Au电极在进行槲皮素测试时的的稳定性进行对比，具体结果见图11和表1的数据。

表1 CMK-8/GCE电极和CMK-8/Au电极的稳定性对比

参照图11和表1，可以看出，利用本发明的CMK-8/GCE电极组成的电化学传感器稳定性良好，具有可重复使用性。在图11A中，利用CMK-8修饰玻碳电极连续5天，每天一次对1×10^-6mol/L槲皮素溶液进行电化学测试，CMK-8修饰玻碳电极的峰电流保持率为76.6％；采用相同的方法对CMK-8修饰Au电极进行考察，如图11B所示，其峰电流保持率仅为56.8％。与玻碳电极相比，金电极作为导电载体具有更好的导电性，使CMK-8/Au电极的灵敏度(118.3μA)略高于CMK-8/GCE电极(115.3μA)，但由于CMK-8在金电极容易团聚，导致其在重复使用过程中容易发生脱落，稳定性较差。

2、CMK-8/GCE电极作为工作电极的电化学传感器在测试槲皮素时的线性范围与检出限

在最优条件下运用差分脉冲伏安法测试槲皮素标准溶液的一系列不同浓度，对该传感器进行评估，具体结果见图12，

从图12可以看出，槲皮素的氧化峰电流I_pa(μA)与浓度c(nmol/L)呈线性关系，在1×10^-9～1×10^-6mol/L之间的相关线性回归方程为I_pa(μA)＝0.1169c(nmol/L)+10.70,r＝0.9934，检出限为1.67×10^-10mol/L(S/N＝3)。可见该方法具有灵敏度高、检出限低的优点。

通过查阅文献，比较通过不同电化学方法及不同修饰电极对槲皮素的检测限，具体情况见表2，发现本发明检出限更低，在电化学检测中具备一定的优势。

表2不同电化学检测方法对槲皮素检测的参数分析

备注：关于表2中的修饰电极及方法缩写的说明如下，

“CMK-8/GCE”表示立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰玻碳电极；

“LFONR-MWCNT/GPE”表示Lewatit FO36纳米树脂(LFONR-MWCNT/GPE)和多壁碳纳米管修饰石墨糊电极(GPE)；

“3D-SWCNTs/GCE”表示三维单壁碳纳米管修饰玻碳电极；

“GOD/Au NP/GCE”表示采用金纳米棱镜(Au NP)固定葡萄糖氧化酶(GOD)修饰玻碳电极；

“g-C₃N₄/NiO/GCE”表示利用三聚氰胺制备石墨相的氮化碳,即g-C₃N₄，以氧化镍和g-C₃N₄为基础物质采用电沉积方法制备复合化学修饰电极；

“LSV”线性扫描伏安法：Linear Sweep Voltammetry；

“DPSV”差示脉冲溶出伏安法：differential pulse stripping voltammetry。

3、本发明的电化学传感器在测试槲皮素的应用中干扰物的影响

在最佳条件下选择一些常见的有机物和金属离子作为干扰物对槲皮素测定进行干扰物试验，DPV差分脉冲伏安法的检测结果，具体情况见图13，

从图13可以看出，检测浓度为1×10^-6mol/L的槲皮素时，分别加入100倍浓度(即1×10^-4mol/L)的葡萄糖、肌苷、抗坏血酸、Mg²⁺、Al³⁺、Ca²⁺作为干扰物，其峰电流与最优条件测定槲皮素相比，几乎不干扰槲皮素的测定，说明CMK-8修饰电极测定槲皮素具有高选择性和强的抗干扰能力。

4、本发明的电化学传感器重现性及稳定性

利用五支不同的玻碳电极制备五支CMK-8修饰电极的电化学传感器，在最优且相同条件下分别在槲皮素浓度为1×10^-6mol/L的PBS缓冲溶液中检测，根据检测结果计算其相对标准误差RSD为3.8％。使用同一支CMK-8修饰电极对槲皮素浓度为1×10^-6mol/L的溶液中平行测定7次，RSD为2.57％，实验结果表明该传感器检测槲皮素具有良好的重现性。同等条件下用该电极重新制备传感器，放入4℃的冰箱中保存3天再检测，3天后所测氧化峰电流响应值为现制现用传感器的95.4％，由此可得该电化学传感器具备较强的稳定性。

5、实际样品的加标检测

在最优的条件下，取洋葱样品预处理所得溶液1mL加入19mL PBS缓冲液中进行电化学检测。

洋葱样品的处理方法如下：将新鲜洋葱切成小块，在60℃的烘箱中烘5小时后取出，趁热研磨成粉末，过60目筛。称量1.0g洋葱粉末，加20mL70％乙醇进行超声提取40min，倒入50mL离心管中，在离心机内以1200r/min的离心速度离心10min，吸取上清液在22μL有机相过滤膜中过滤后在鸡心瓶中旋干，所得粘稠物用20mL PBS缓冲液(pH值为6)复溶。

检测到经过预处理后，洋葱中的槲皮素含量为1.09mg/g，按累加原则加入3个不同浓度的槲皮素标准溶液，检测实际样品的加标回收率。测试结果如表3所示，

表3实际样品中检测加标槲皮素标准品溶液结果

从表3可以看出，洋葱样品溶液的回收率在95.33％～107.18％之间，相对标准偏差在0.61％～8.02％之间(n＝3)，且加标量在测定范围下成线性关系，表明该电化学传感器的方法可有效通过电化学方法检测洋葱中槲皮素的量，回收率与准确度良好。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极，其特征在于，所述工作电极为经立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极(CMK-8/GCE)；在玻碳电极(GCE)的工作面表面，立方la3d结构介孔碳CMK-8的负载量为0.056～0.226mg/cm²。

2.一种高灵敏度槲皮素电化学传感器的工作电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、配制立方la3d结构介孔碳CMK-8溶液；

S2、玻碳电极(GCE)预处理；

S3、使用立方la3d结构介孔碳CMK-8溶液对玻碳电极(GCE)进行修饰。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，使用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，超声分散，配制成浓度为2±0.1mg/mL的CMK-8分散液。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，用0.05μm规格的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，直至玻碳电极的工作面光滑，然后用蒸馏水冲净并晾干。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，使用涂覆或浸涂方法，将S1制备的立方la3d结构介孔碳CMK-8溶液涂布在经步骤S2处理的玻碳电极的工作面，烘干，冷却，得到立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括电极的初始化步骤S4：对制备的立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极置于0.1～0.5mol/L的PBS缓冲液中，在-0.1～0.4V范围的电位窗内用差分脉冲伏安法(DPV)循环至曲线稳定。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，检测玻碳电极的工作面是否光滑的方法为：在5mmol/L铁氰化钾溶液中用循环伏安法(CV)检测玻碳电极的抛光程度，得到可逆的循环伏安峰形且峰电位差在70～80mV即可。

8.如权利要求5所述的电化学传感器，其特征在于，在步骤S3中，CMK-8的涂覆量为2-6μL；优选为4μL。

9.一种高灵敏度槲皮素电化学传感器，其包含工作电极、对电极、参比电极；其特征在于，所述工作电极为权利要求1或权利要求2-8任一项所述的方法制备的立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极。

10.一种使用权利要求9所述的电化学传感器进行槲皮素的含量检测的方法，其特征在于，包括：

步骤1：0.1-0.5mol/L的PBS缓冲液中，在500-1500rpm磁力搅拌下进行恒电位富集，电位区间为-0.2V～0.4V，富集时间9～21min；

步骤2：电化学测试采用三电极体系：工作电极为立方la3d结构介孔碳CMK-8修饰的玻碳电极，对电极为钛棒，参比电极为饱和甘汞电极；

循环伏安法(CV)的测试参数为：初始电位-0.1V，高电位0.4V，低电位-0.1V，扫描速度0.05V/s，采样间隔0.001V，静止时间2s，灵敏度100A/V；

电化学测试的差分脉冲伏安法测定的参数为：电位区间在-0.1～0.4V，增幅为10mV，脉冲宽度为0.06s，取样间隔0.02s，脉冲周期0.5s，振幅为50mV，灵敏度100μA。

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