CN110082416A - 一种基于复合膜修饰电极的l-酪氨酸和多巴胺同时检测方法及传感器 - Google Patents

一种基于复合膜修饰电极的l-酪氨酸和多巴胺同时检测方法及传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于复合膜修饰电极的L‑酪氨酸(L‑Tyr)和多巴胺(DA)同时检测方法，所述方法包括制备3D‑PtCu/CNDs/GQDs复合材料、制备3D‑PtCu/CNDs/GQDs/GCE复合膜修饰电极、L‑酪氨酸和多巴胺同时检测等步骤。结果表明该修饰电极对L‑Tyr和DA具有较好的可分辨的电化学响应，可用于实际样品中L‑Tyr和DA的测定，其检测下限分别达到6.4×10‑8mol/L(S/N＝3)，7.2×10‑8mol/L(S/N＝3)，说明该修饰电极在生物分析检测领域有潜在的应用价值。

Description

一种基于复合膜修饰电极的L-酪氨酸和多巴胺同时检测方法 及传感器
技术领域
本发明属于化学/生物传感技术领域，具体涉及一种基于复合膜修饰电极的L-酪氨酸和多巴胺同时检测方法及传感器。
背景技术
多巴胺(DA)和L-酪氨酸(L-Tyr)都属于神经递质，其中大脑中多巴胺对目标导向行为很重要，影响人类的情绪和行为。多巴胺还在大脑中传递兴奋和开心的感觉，上瘾也与之有关。因此多巴胺在人体代谢、心血管、中枢神经、肾脏和激素系统的功能中发挥着重要作用。缺乏多巴胺将会导致多种疾病，如精神分裂症、亨廷顿氏病和帕金森综合症等。而酪氨酸是多巴胺的前体，是蛋白质的组成部分，酪氨酸的代谢异常会引起酪氨酸血症、佝偻病、染色体隐性疾病等。此外，人及动物体内酪氨酸被酪氨酸酶氧化可产生黑色素，所以酪氨酸的含量与人体的白化病、褐黄病及动物的营养与毛色有关。因此，快速灵敏的测定DA和L-Tyr对研究相关疾病的病理和临床诊断具有重要意义。
目前前国内外用于检测DA和L-Tyr的方法主要有分光光度法、离子交换色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用、毛细管电泳、荧光光谱法，但是这些方法因仪器设备笨重，价格昂贵，操作繁琐，而电化学传感器检测L-Tyr具有操作简单、成本低廉、选择性好、灵敏度高等优点，其中通过电化学检测多巴胺和酪氨酸已引起研究者的广泛关注，其中用电化学的方法可用于同时检测酪氨酸和多巴胺的方法也存在，如Bhakta等制备了铁纳米粒子/碳纳米管复合材料修饰玻碳电极用于检测多巴胺、抗坏血酸和酪氨酸同时存在下的尿酸，采用循环伏安法检测的结果显示这四种物质的氧化峰明显分开，互不干扰。而Tian等采用化学气相沉积的方法在钽电极上修饰了石墨烯纳米墙(graphene/Ta)。该复合电极具有较大的比表面积、高导电性和大量的催化活性位点，可用于同时检测多巴胺(DA)、尿酸(UA)、L-酪氨酸(Tyr)和利尿剂氢氯噻嗪(HCTZ)，在pH为7.0的缓冲溶液中，DA的氧化峰值电位为0.124V，UA为0.256V，Tyr为0.536V，HCTZ为0.708V，因此，该传感电极可同时用于DA、UA、Tyr、HCTZ的定量检测。Kemmegne-Mbouguen等运用天然粘土和无金属卟啉修饰碳糊电极(TCPP–Sa/CPE)用于同时检测多巴胺(DA)、对乙酰氨基酚(AC)和酪氨酸(Tyr)，TCPP-Sa/CPE具有线性范围宽，灵敏度高，选择性好的优点，对DA、AC、Tyr的检测限分别为0.1μM、0.2μM、0.7μM。因此，为了更好地同时检测L-Tyr和DA，研发一种简便、快速、高灵敏度的方法刻不容缓。
碳纳米点(CNDs)和石墨烯量子点(GQDs)是新型零维碳纳米材料，其尺寸大小在10nm以下，由于量子限域和边缘效应，他们具有高稳定性、生物相容性，体积小，分子量小和毒性低，热/化学稳定性好等特点，是构建电化学传感器的理想材料，现已引起广泛学者的兴趣。Sheng等制备了一种基于碳纳米点(CNDs)和壳聚糖的新型复合膜，并将其作为固定化基质固定血红蛋白(Hb)，将Hb-CNDs壳聚糖复合材料修饰在玻碳电极表面，用于检测过氧化氢，其检测下限为0.27μM。Razmi等因石墨烯量子点(GQD)具有很好的生物相容性，引入GQDs作为酶固定剂，将葡萄糖氧化酶(GOx)固定在GQD修饰的碳陶瓷电极(CCE)上用于葡萄糖的检测，其检测范围为5～1270mM。
具有三维(3D)结构的多金属纳米材料代表了一种新兴的高效纳米催化剂，在催化和电催化领域具有良好的应用前景。Nosheen等制备了三角锥状的Pt-Cu纳米四方结构，与工业Pt/C和铂黑相比，该四方结构对甲醇和乙醇具有更好的电催化性能。Feng等采用原位还原法制备了三维多孔镍纳米微电极(3D-PNNF)。该电极具有较高的表面积，与导电衬底紧密结合，同时3D-PNNF电极对联氨的电催化氧化性能比普通Pt/C催化剂高很多。迄今，基于三维Pt-Cu纳米结构复合膜的电化学传感器用于同时检测L-Tyr和DA尚未见报道。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于复合膜修饰电极的L-酪氨酸和多巴胺同时检测方法及传感器。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述基于复合膜修饰电极的L-酪氨酸和多巴胺同时检测方法包括如下步骤：
(1)制备3D-PtCu/CNDs/GQDs复合材料：
a)制备3D-PtCu纳米材料；
b)采用共混酸化法制备表面羧基化的F-MWCNTs；
c)将步骤b)制备的F-MWCNTs置于研钵中研磨后，再用无水乙醇超声溶解制得CNDs溶液，将制备的3D-PtCu纳米材料用无水乙醇超声溶解制得3D-PtCu溶液；将CNDs溶液、3D-PtCu溶液、GQDs溶液按(0.8～1.2):(0.8～1.2)，优选为1:1:1的比例(mL:mL:mL)混合超声均匀，制得3D-PtCu/CNDs/GQDs复合材料；其中，所述CNDs溶液中CNDs的浓度为0.5～2.0mg/mL，所述GQDs溶液中GQDs的浓度为0.5～2.0mg/mL，所述3D-PtCu溶液中3D-PtCu纳米材料的浓度为0.5～2.0mg/mL；
(2)制备3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE复合膜修饰电极：对玻碳电极表面进行抛光，超声洗净后晾干，将3D-PtCu/CNDs/GQDs复合材料进行超声分散后得到的3D-PtCu/CNDs/GQDs分散液滴涂于玻碳电极表面并晾干，即得3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE复合膜修饰电极；所述3D-PtCu/CNDs/GQDs分散液中3D-PtCu/CNDs/GQDs的浓度为0.5～2.0mg/mL；
(3)以3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE复合膜修饰电极为工作电极，以银/氯化银电极作为参比电极，以铂丝电极作为对电极，构成三电极体系；然后采用示差脉冲伏安法在固定L-Tyr浓度条件下对不同浓度的DA进行测试，且在固定DA浓度条件下对不同浓度的L-Tyr进行测试，绘制工作标准曲线，再采用标准加入法对待测样品中的L-酪氨酸和多巴胺同时进行检测。
优选地，3D-PtCu纳米材料是由边长为8.47±0.47nm的立方体和八个长度为7.20±0.38nm的对称爪组成的八爪形。
优选地，步骤(1)中步骤b)所述制备3D-PtCu纳米材料的方法为：步骤(1)中步骤a)所述制备3D-PtCu纳米材料的方法为：取CuCl·2H2O、H2PtCl6·H2O和油胺混合置于聚四氟乙烯反应釜中；然后加入CTAB于聚四氟乙烯反应釜中混合搅拌均匀；接着封闭聚四氟乙烯反应釜，于165～175℃的油浴中磁力搅拌20～30h；冷却至室温后加入过量乙醇洗涤并离心，再将沉淀干燥成粉末，保存备用；其中，所述CuCl·2H2O、H2PtCl6·H2O、油胺和CTAB的比例为(40～50)mg：(20～30)mg：(5～15)mL：(320～400)mg，所述聚四氟乙烯反应釜的容量为20～50mL。
优选地，步骤(2)中对玻碳电极表面进行抛光是分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对玻碳电极表面进行抛光。
优选地，步骤(2)中所述玻碳电极直径为3mm，将4μL3D-PtCu/CNDs/GQDs分散液滴涂于玻碳电极表面并晾干。
优选地，步骤(3)中是采用示差脉冲伏安法测试时设置示差脉冲伏安法参数为：振幅0.05V、脉冲宽度为0.2s、抽样宽度为0.02、脉冲周期为0.5s。
所述基于复合膜修饰电极的L-酪氨酸和多巴胺同时检测传感器包括作为工作电极的复合膜修饰电极；所述复合膜修饰电极包括玻碳基质(5)，所述玻碳基质(5)表面修饰有3D-PtCu/CNDs/GQDs纳米复合膜(6)。
优选地，所述传感器包括玻碳基质(5)的厚度为1.0～5.0mm，所述3D-PtCu/CNDs/GQDs纳米复合膜(6)的厚度为10～250nm；所述3D-PtCu/CNDs/GQDs纳米复合膜(6)中的3D-PtCu纳米材料是由边长为8.47±0.47nm的立方体和八个长度为7.20±0.38nm的对称爪组成的八爪形。
优选地，所述传感器对L-酪氨酸和多巴胺的浓度均存在良好的线性关系，其中，L-酪氨酸的线性范围为2.0×10-7mol/L～1.0×10-5mol/L，检测下限为6.4×10-8mol/L；多巴胺的线性范围为3.0×10-7mol/L～1.0×10-5mol/L，检测下限为7.2×10-8mol/L。
本发明制备了3D八爪形Pt-Cu纳米框架(3D-PtCu)，采用自组装法将其负载到碳纳米点(CNDs)/石墨稀量子点(GQDs)复合材料上，制得3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE复合膜修饰电极。利用透射电子显微镜对3D-PtCu的形貌进行表征，结果显示3D-PtCu的形貌是由边长为8.47±0.47nm的立方体和八个长度为7.20±0.38nm的对称爪组成。采用循环伏安法(CV)及差分脉冲伏安法(DPV)对L-酪氨酸(L-Tyr)和多巴胺(DA)的电化学行为进行研究，结果表明3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE对L-酪氨酸和多巴胺具有较好的可分辨的电催化氧化特性。在0.10mol/L的PBS缓冲溶液(pH＝5.5)中，该修饰电极的DPV响应峰电流与L-Tyr和DA的浓度均存在良好的线性关系，其中L-Tyr的线性范围为2.0×10-7mol/L～1.0×10-5mol/L，检测下限达到6.4×10-8mol/L(S/N＝3)；DA的线性范围为3.0×10-7mol/L～1.0×10-5mol/L，检测下限达到7.2×10-8mol/L(S/N＝3)。将该电极用于猪血清样品中L-Tyr和DA的测定，回收率分别为95.9％～107.4％，97.2％～105.7％。说明该修饰电极在生物分析检测领域有潜在的应用价值。
附图说明
图1为基于复合膜修饰电极的肾上腺素检测传感器的工作结构示意图；
图2为3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极的构建示意图；
图3为TEM电镜表征图：CNDs(A)，GQDs(B)，3D-PtCu(C)和(D)；
图4：复合电极在1.0×10-3mol/L铁氰化钾溶液中的循环伏安曲线(A)：裸GCE(a)，3D-PtCu(b)，CNDs(c)，GQDs(d)，3D-PtCu/CNDs/GQDs(e)；3D-PtCu/CNDs/GQDs复合电极电极在L-Tyr(4.0×10-5mol/L)和DA(4.0×10-5mol/L)混合溶液的差分脉冲伏安曲线(B)；
图5：(A)pH值与L-Tyr氧化峰电流的关系，(B)pH值与DA氧化峰电流的关系；(C)pH值与L-Tyr氧化峰电位的关系，(D)pH值与DA氧化峰电位的关系；
图6：(A)不同扫描速率下的L-Tyr在3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极上循环伏安曲线；(B)氧化峰电流随扫描速率变化的关系图；
图7为L-酪氨酸和多巴胺在3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE上的氧化机理图；
图8：(A，C)3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE响应不同浓度L-Tyr和DA的DPV曲线；(B，D)氧化峰电流与L-Tyr和DA浓度的线性关系曲线；
图9：干扰物质对3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极检测L-Tyr和DA的影响。
图2中：1、银/氯化银电极；2、铂丝电极；3、玻碳电极；4、待测溶液；5、玻碳基质；6、3D-PtCu/CNDs/GQDs纳米复合膜；7、DA；8、L-Tyr。
具体实施方式
实施例中所用试剂均为分析纯(AR)，实验用水均为超纯水(电阻率≥18.3MΩ·cm)。以下描述中，氨基酸的描述均采用英文缩写。
一、实验过程
1、3D-PtCu/CNDs/GQDs复合材料的制备
制备3D-PtCu纳米材料：(1)先取45.3mg CuCl·2H2O、26.7mg H2PtCl6·H2O和10mL油胺混合置于25mL聚四氟乙烯反应釜中；(2)再加入350mg的CTAB于反应釜中混合搅拌均匀；(3)接着封闭装置，在170℃的油浴中磁力搅拌24h；(4)冷却至室温，加入过量乙醇洗涤三次并离心，后将沉淀置于电热鼓风干燥箱中(60℃)干燥成粉末，于冰箱中保存备用。
采用共混酸化法来制备酸化多壁碳纳米管(F-MWCNTs)，使其表面羧基化。将F-MWCNTs置于研钵中研磨2h，再用无水乙醇超声溶解制得1mg/mL的碳纳米点(CNDs)溶液；制备的3D-PtCu纳米材料用无水乙醇超声溶解制得3D-PtCu溶液。取上述制备好的CNDs溶液和3D-PtCu溶液与石墨烯量子点(GQDs，1mg/mL)溶液按1:1:1的比例(mL:mL:mL)混合超声均匀，制得3D-PtCu/CNDs/GQDs复合材料，于冰箱中保存备用。
2、3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE复合膜修饰电极的制备
依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对玻碳电极(GCE，直径3mm)表面进行抛光，分别在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声10min清洗干净，室温下自然晾干。取4μL超声分散后的3D-PtCu/CNDs/GQDs分散液(0.5～2.0mg/mL)滴涂于玻碳电极表面，室温下自然晾干后于4℃下保存备用(如图2所示)。
3、L-Tyr和DA的电化学检测
参见图1，以3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE复合膜修饰的玻碳电极作为工作电极3，银/氯化银(内含饱和氯化钾)电极1作为参比电极，铂丝电极2作为对电极的三电极体系，使用电化学工作站同时对L-Trp 8和DA7进行电化学检测，背景溶液为0.10mol/L的PBS缓冲溶液。
其中，所述表面修饰的玻碳电极3即为本发明所述基于复合膜修饰电极的L-酪氨酸和多巴胺同时检测传感器中的复合膜修饰电极；所述复合膜修饰电极包括玻碳基质5，所述玻碳基质5表面修饰有3D-PtCu/CNDs/GQDs纳米复合膜6。
设置示差脉冲伏安法(DPV)参数：振幅为0.05V，脉冲宽度为0.2s，抽样宽度为0.02，脉冲周期为0.5s。采用DPV法分别考察固定L-Tyr浓度对不同浓度的DA进行测试和固定DA浓度对不同浓度的L-Tyr进行测试，绘制工作曲线。采用标准加入法对猪血清样品中L-Trp和DA进行检测。猪血清样品(来源于5头活体三元杂小猪，体重为7～15Kg)由中国科学院亚热带农业生态研究所(长沙)提供。分别将5种不同的猪血清样品(50.00μL)加入pH＝5.50的PBS缓冲溶液(4.950mL)中稀释100倍，再向猪血清溶液中加入不同浓度的L-Trp和DA，采用DPV法进行测定。
二、实验结果与分析
1、材料的表征
采用透射电子显微镜(TEM)分别对CNDs,GQDs和3D-PtCu的结构和表面形貌进行表征。如图3A所示，经过研磨的酸化碳纳米管已成为了小颗粒状的纳米点，分散性较好，从图3B可看到石墨烯量子点呈大小均匀的颗粒状，分散均匀，CNDs和GQDs具有大的表面积，对电流信号放大起到重要作用。图3C和图3D分别是不同尺寸下的3D-PtCu纳米框架，该纳米框架由边长为8.47±0.47nm的正方体和八个长度为7.20±0.38nm的对称爪组成，相比Pt-Cu正方体边缘框架，八爪更加稳定，这个可能是由于Pt表面不能完全覆盖Cu原子，从而在溶液中不断溶解。由结果图中还可看到每个纳米框架表面覆盖有一层薄膜，该3D-PtCu超薄膜提高了电极表面电催化性能的表面积，增加的活性位点。
2、电化学性能测试
采用循环伏安法(CV)，考察裸GCE，3D-PtCu/GCE，CNDs/GCE，GQDs/GCE，3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极在含有0.001mol/L铁氰化钾溶液中的电化学行为(图4A)，从图4A中裸GCE曲线上可以看出，裸电极上有一个很弱的氧化还原峰。3D-PtCu纳米材料电极等氧化还原峰电位差明显增大，说明3D-PtCu纳米框架具有很好的电催化性能，这是由于3D-PtCu形成了双金属合金，提高了电催化效率。而CNDs/GCE和GQDs/GCE的CV响应的氧化还原峰电流相对于裸GCE的氧化还原峰电流明显增大，可以看出这两种材料具有高电导率，从而使电极的导电性增大，起到放大电信号的作用。3D-PtCu/CNDs/GQDs修饰电极的氧化还原峰电流最大，显示了三种材料共同修饰在电极表面具有互补作用，不仅使电极的表面积增大，导电性能加强，其电催化性能也明显增大。图4B是采用差分脉冲伏安法(DPV)考察修饰电极对相同浓度的L-Tyr和DA的同时检测，结果表明L-Tyr和DA在3D-PtCu/CNDs/GQDs修饰电极上分别出现了很强的氧化峰，表明该复合电极能实现同时对L-Tyr和DA的灵敏检测。
3、pH值对L-Tyr和DA电化学行为的影响
缓冲溶液的pH值是影响L-Tyr、DA在电极表面发生氧化反应的一个重要因素。采用DPV考察3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极在pH值在4.5～8.0的范围内PBS缓冲溶液(0.10mol/L)对L-Tyr和DA(浓度均为4.0×10-5mol/L)的峰电流、峰电位的关系影响。L-Tyr和DA的氧化峰电流随pH值变化分别如图5A和4B所示。由此图可知：当pH等于5.5时，L-Tyr和DA的氧化峰电流达到最大值，同时在pH为5.5时，L-Tyr的氧化峰电位为0.788V，DA的氧化峰电位为0.352V，此时氧化峰电位差为0.436V(即ΔE＝0.436V)，因此pH＝5.5为检测L-Tyr和DA的最佳pH。
由峰电位曲线图5C可以看出L-Tyr与pH值成线性关系，说明L-Tyr在其电极反应中存在质子和电子的转移过程。其线性拟合方程为Epa＝1.09624-0.05724pH，线性相关系数R＝0.9808；根据能斯特方程：Ep＝E0+0.05916(m/n)pH(m为反应转移的质子数，n为转移的电子数)，可推算出m≈n，说明L-Tyr在该修饰电极界面上是等电子等质子转移。
另外由峰电位曲线图5D可以看出DA的峰电位与pH值成线性关系，说明DA在其电极反应中存在质子和电子的转移过程。其线性拟合方程为Epa＝0.670-0.061pH，线性相关系数R＝0.9744。根据能斯特方程：Ep＝E0+0.05916(m/n)pH(m为反应转移的质子数，n为转移的电子数)，可推算出m≈n，说明DA在该修饰电极界面上是等电子等质子转移。
4、L-Tyr和DA在修饰电极上氧化机理的探讨
采用CV考察扫速与L-Tyr和DA的峰电流的关系。在选定了最佳pH值的条件下，考察了扫速为10～175mV/s范围内对L-Tyr和DA在3D-PtCu/CNDs/GQD修饰电极上的氧化峰电流的影响。结果如图6A所示，氧化峰电流随着扫速的增大而增大，L-酪氨酸和多巴胺在电极上的电化学行为是一个不可逆的氧化过程。L-Tyr和DA的氧化峰电流与扫速呈线性关系(图6B)，其拟合线性方程分别为ITyr＝0.3358v+2.42002，IDA＝1.0009v+2.35952。这说明L-Tyr和DA在修饰电极上的氧化过程均是吸附控制过程。
由图6A可得在电极表面L-Tyr的氧化峰峰随扫速的增加而正移，其峰值电位与扫速的自然对数的线性关系为Epa＝0.77612+0.02406lnv，R＝0.9660；在电极表面DA的还原峰随扫速的增加而负移，峰值电位与扫速的自然对数的线性关系为Epc＝0.44443-0.02111lnv，R＝0.9142；根据Laviron公式：
式中：Epc为还原峰电位；Epa为氧化峰电位；Eθ为式量电位；α为电子传递系数；n为传递电子数；T为温度；R为摩尔气体常数；F为法拉第常数；KS为标准异相电子传递速率常数；v为扫描速率。
其中Tyr氧化峰电位与扫速的自然对数的关系为：EPa＝0.77612+0.02406lnv(R＝0.9660)，对比上式(1)可得到(1-α)·n＝1.0671，由于常温下不可逆电极反应的α＝0.4～0.6，可计算出n≈2，因此得出，L-Tyr在3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极上转移的电子数n约为2，则转移的质子数m＝2。此外，DA还原峰电位与扫速自然对数的关系为Epc＝0.44443-0.02111lnv(R＝0.9142)，对比上式(2)，可计算出DA在电极表面的转移电子数也是2电子2质子。由此推断L-Tyr和DA在电极表面的反应机理如图7所示。
5、线性范围和检出限
配置一系列不同浓度的L-酪氨酸和多巴胺标准溶液，在选定最优缓冲溶液pH值下，使用3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极，采用差分脉冲伏安法(DPV)对不同浓度的L-Tyr和DA进行检测。在最优的实验条件下，保持多巴胺(3.0×10-6mol/L)的浓度不变，酪氨酸在浓度为0.2μmol/L～50μmol/L的范围内的DPV曲线如图8A所示。由图可知酪氨酸的浓度与氧化电流强度呈线性关系(图8B)，线性拟合方程是Ipa＝0.20603C+0.06615，线性相关系数R＝0.9967；检测下限达到6.4×10-8mol/L(S/N＝3)。在最优的实验条件下，保持酪氨酸(1.0×10-5mol/L)的浓度不变，多巴胺在浓度为0.3μmol/L～50μmol/L的范围内的DPV曲线如图8C所示。由图可知多巴胺的浓度与氧化电流强度呈线性关系(图8D)，线性拟合方程是Ipa＝2.73896C-084685，线性相关系数R＝0.9970；检测下限达到7.2×10-8mol/L(S/N＝3)。此外，实验结果还表明在检测酪氨酸或多巴胺时，多巴胺或酪氨酸的电流响应并没有变化，说明该电极检测酪氨酸和多巴胺时，相互之间互不干扰，说明3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极能应用于同时检测酪氨酸和多巴胺。
7、电极的重现性、重复性与稳定性
用同一批次相同条件下制备6根修饰电极分别检测8.0×10-6moL/L的L-Tyr和6.0×10-7mol/L的DA溶液，测得Tyr的氧化峰电流平均值为-1.8122mA，相对标准偏差为2.3694％，而测得DA的氧化峰电流平均值为-0.8467mA，相对标准偏差为2.6263％。说明该修饰电极重现性较好。采用同一根3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极对1.0×10-5moL/L的L-Tyr和2.5×10-6mol/L的DA溶液连续检测6次，测得Tyr的氧化峰电流平均值为-2.0718mA，相对标准偏差为0.9818％，而测得DA的氧化峰电流平均值为-5.9645mA，相对标准偏差为2.4531％，说明该修饰电极具有较好的重复性。此外，考察了电极的稳定性，同一根修饰电极间隔36h对L-Tyr和DA在最佳pH条件下检测一次，不用时在4℃条件下保存，结果表明经30d后，修饰电极对L-Tyr和DA的响应信号分别是最初时的90.73％和92.44％，从而判断此该电极对L-Tyr和DA的测定具有较好的稳定性。
8、抗干扰性测试
考察其他氨基酸对3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极的影响，采用以pH为5.5的磷酸盐缓冲溶液做底液的三电极体系中在其他氨基酸存在的情况下对L-Tyr(4.0×10-6mol/L)和DA(2.0×10-6mol/L)的检测，结果如图9所示，加入是酪氨酸25倍(多巴胺50倍)的L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-赖氨酸(L-Lys)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-组氨酸(L-His)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、L-苏氨酸(L-Thr)、L-缬氨酸(L-Val)、L-甲硫氨酸(L-Met)后峰电流没有发生明显变化。表明3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极对L-Tyr和DA有很好的选择性。
9、实际样品检测及回收率测定
考察3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极对实际样品(血清)中L-酪氨酸和多巴胺的检测应用。检测时将血清样品用采用0.10mol/LPBS对1、2、3号血清稀释100倍，对4、5号血清稀释10倍。在最优实验条件下，5次重复实验检测结果见表1。采用标准加入法进行测定时，即向加有血清的缓冲溶液中加入不同浓度的L-Tyr和DA标准液，用该修饰电极进行检测并计算回收率，测得L-Tyr的回收率为95.9％～107.4％，DA的回收率为97.2～105.7％，表明该修饰电极具有较高的准确性和精确度，可用于实际样品中L-Tyr和DA的检测。
表1血清样品中L-Tyr和DA的测定(n＝5)
Table1 Application of 3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE to determination of Tyrand DAin serum samples.(n＝5)
本发明在合成的一种新型由边长为8.47±0.47nm的立方体和八个长度为7.20±0.38nm的对称爪组成的三维PtCu纳米框架的基础上，结合碳纳米点和石墨烯量子点成功制备了一种新型复合膜电极，实现了对L-Tyr和DA的同时灵敏检测。通过实验考察到3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE修饰电极具有较好的电化学性能，采用DPV对L-酪氨酸和多巴胺进行检测，其中L-Tyr的线性范围为2.0×10-7mol/L～1.0×10-5mol/L，检测下限达到6.4×10-8mol/L(S/N＝3)；DA的线性范围为3.0×10-7mol/L～1.0×10-5mol/L，检测下限达到7.2×10-8mol/L(S/N＝3)。该修饰电极具有良好的稳定性、重现性及选择性。因此，本发明所述方法在未来生物分析领域的L-Tyr和DA检测具有潜在的应用价值。

Claims (10)

1.一种基于复合膜修饰电极的L-酪氨酸和多巴胺同时检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备3D-PtCu/CNDs/GQDs复合材料：
a)制备3D-PtCu纳米材料；
b)采用共混酸化法制备表面羧基化的F-MWCNTs；
c)将步骤b)制备的F-MWCNTs置于研钵中研磨后，再用无水乙醇超声溶解制得CNDs溶液，制备的3D-PtCu纳米材料用无水乙醇超声溶解制得3D-PtCu溶液；将CNDs溶液、3D-PtCu溶液、GQDs溶液按1:(0.8～1.2):(0.8～1.2)的比例混合超声均匀，制得3D-PtCu/CNDs/GQDs复合材料；其中，所述CNDs溶液中CNDs的浓度为0.5～2.0mg/mL，所述GQDs溶液中GQDs的浓度为0.5～2.0mg/mL，所述3D-PtCu溶液中3D-PtCu纳米材料的浓度为0.5～2.0mg/mL；
(2)制备3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE复合膜修饰电极：对玻碳电极表面进行抛光，超声洗净后晾干，将3D-PtCu/CNDs/GQDs复合材料进行超声分散后得到的3D-PtCu/CNDs/GQDs分散液滴涂于玻碳电极表面并晾干，即得3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE复合膜修饰电极；所述3D-PtCu/CNDs/GQDs分散液中3D-PtCu/CNDs/GQDs的浓度为0.5～2.0mg/mL；
(3)以3D-PtCu/CNDs/GQDs/GCE复合膜修饰电极为工作电极，以银/氯化银电极作为参比电极，以铂丝电极作为对电极，构成三电极体系；然后采用示差脉冲伏安法在固定L-Tyr浓度条件下对不同浓度的DA进行测试，且在固定DA浓度条件下对不同浓度的L-Tyr进行测试，绘制工作标准曲线，再采用标准加入法对待测样品中的L-酪氨酸和多巴胺同时进行检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3D-PtCu纳米材料是由边长为8.47±0.47nm的立方体和八个长度为7.20±0.38nm的对称爪组成的八爪形。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中步骤a)所述制备3D-PtCu纳米材料的方法为：取CuCl·2H2O、H2PtCl6·H2O和油胺混合置于聚四氟乙烯反应釜中；然后加入CTAB于聚四氟乙烯反应釜中混合搅拌均匀；接着封闭聚四氟乙烯反应釜，于165～175℃的油浴中磁力搅拌20～30h；冷却至室温后加入过量乙醇洗涤并离心，再将沉淀干燥成粉末，保存备用；其中，所述CuCl·2H2O、H2PtCl6·H2O、油胺和CTAB的比例为(40～50)mg：(20～30)mg：(5～15)mL：(320～400)mg，所述聚四氟乙烯反应釜的容量为20～50mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中对玻碳电极表面进行抛光是分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对玻碳电极表面进行抛光。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述玻碳电极直径为3mm，将4μL3D-PtCu/CNDs/GQDs分散液滴涂于玻碳电极表面并晾干。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中是采用示差脉冲伏安法测试时设置示差脉冲伏安法参数为：振幅0.05V、脉冲宽度为0.2s、抽样宽度为0.02、脉冲周期为0.5s。
7.一种基于复合膜修饰电极的L-酪氨酸和多巴胺同时检测传感器，其特征在于，所属传感器包括作为工作电极的复合膜修饰电极；所述复合膜修饰电极包括玻碳基质(5)，所述玻碳基质(5)表面修饰有3D-Pt-Cu/CNDs/GQDs纳米复合膜(6)。
8.如权利要求7所述的传感器，其特征在于，所述传感器包括玻碳基质(5)的厚度为1.0～5.0mm，所述3D-PtCu/CNDs/GQDs纳米复合膜(6)的厚度为10～250nm。
9.如权利要求7所述的传感器，其特征在于，所述3D-PtCu/CNDs/GQDs纳米复合膜(6)中的3D-PtCu纳米材料是由边长为8.47±0.47nm的立方体和八个长度为7.20±0.38nm的对称爪组成的八爪形。
10.如权利要求7至9任一项所述的传感器，其特征在于，所述传感器对L-酪氨酸和多巴胺的浓度均存在良好的线性关系，其中，L-酪氨酸的线性范围为2.0×10-7mol/L～1.0×10-5mol/L，检测下限为6.4×10-8mol/L；多巴胺的线性范围为3.0×10-7mol/L～1.0×10-5mol/L，检测下限为7.2×10-8mol/L。
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