CN103389328B - 基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及制备方法和应用，包括一玻碳电极，该玻碳电极的检测端表面沉积有L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳，L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳上通过戊二醛固定有酪氨酸酶。制备方法包括以下步骤：首先在一玻碳电极的检测端表面滴加L-半胱氨酸溶液和氮杂化介孔碳悬浮液，得到L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳电极，然后将其浸入戊二醛溶液中得到复合材料修饰电极，再滴加酪氨酸酶溶液得到酪氨酸酶生物传感器。本发明的生物传感器酶活性高、检测精度和效率高，制备方法简单、成本低廉、制作快速，且可以实现对苯酚和邻苯二酚两种物质的高效检测。

Description

基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种生物传感器及其制备方法和应用，尤其涉及一种酪氨酸酶生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

苯酚和邻苯二酚等酚类化合物因其具有高毒性和难于降解而污染环境、危害人体健康。苯酚和邻苯二酚在环境中广泛存在，是重要的有机化工原料，在化妆品、染料、制药、农药等行业广泛运用；另外，在生物修复过程中，比如堆肥，含苯氧基的化合物、芳香族化合物降解也会直接或间接的产生此类污染物，随着固体废弃物处置中堆肥技术的应用越来越广泛，研究快速、方便且准确测定苯酚和邻苯二酚含量的检测方法具有重要意义。

目前，苯酚、邻苯二酚等有机污染物的主要测定方法有色谱法、紫外分光法、同步荧光光谱法、分光光度法、导数光度法、流动注射分析法等，但是，这些方法都存在前处理复杂、耗时长、样品基体效应大、分析周期长等缺陷，对工作人员的操作水平要求高、仪器昂贵，且不便携带，不能进行实时检测，很难在中小型企业中推广应用。

生物传感器是基于生物有机成分（如酶、抗体、核酸、细胞、微生物等），对待测物质进行专一的识别，产生的信号经过信号传导器转变为电信号或光信号，进而定量检测出待测物质的一项新技术。运用生物传感器来检测环境中的重金属、病原微生物、有毒有机物时，生物传感器具有特异性强、检测灵敏度高、检测效率高、成本低廉的特点，因此成为了环境保护工作中的一个研究热点。

目前，科研人员正努力提高生物传感器的稳定性、重复性、结构的可靠性以及实用性，其中，利用各种新型材料固定生物敏感元件并保持活性是发展生物传感器的一个重要方向。制作生物酶传感器的关键是如何高效地固定酶，并保持酶的活性，常用的酶固定方法有：吸附固定法、包埋固定法、共价固定法和交联固定法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种制作简单、使用寿命长、酶活性高、检测精度和效率高的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，还相应提供一种成本低廉、操作简单、制作快速的酪氨酸酶生物传感器的制备方法，使酪氨酸酶的固定具有更好的稳定性和高活性的保持，在此基础上，还提供一种前述酪氨酸酶生物传感器的应用，该应用能够以低成本、简化操作、快速响应、高检测精度及较强抗干扰性等特点实现对苯酚和邻苯二酚两种物质的高效检测。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，所述生物传感器包括一玻碳电极，所述玻碳电极的检测端表面沉积有L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳，所述L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳上通过戊二醛固定有酪氨酸酶（戊二醛起交联作用，通过氨基-醛基键作用于酪氨酸酶和L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳上）。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）修饰氮杂化介孔碳：向一玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积L-半胱氨酸溶液（溶剂通常为水），得到L-半胱氨酸修饰电极，晾干备用；将准备好的氮杂化介孔碳悬浮液（以N,N-二甲基甲酰胺作为分散剂）滴加到L-半胱氨酸修饰电极的检测端表面上，得到L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳电极；

（2）交联戊二醛：将步骤（1）制得的L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳电极的检测端于室温下（一般为25℃～35℃）浸入配制好的戊二醛溶液中，得到复合材料修饰电极，晾干备用；

（3）固定酪氨酸酶（tyrosinase）：在步骤（2）得到的复合材料修饰电极的检测端表面滴加配制好的酪氨酸酶溶液，通过戊二醛的交联作用使酪氨酸酶固定于复合材料修饰电极上，得到酪氨酸酶生物传感器。

所述步骤（1）中，所述L-半胱氨酸溶液的浓度优选1.0×10^-3mol/L～1.0×10^-2mol/L；所述氮杂化介孔碳悬浮液的浓度优选1.0mg/mL～3.0mg/mL，所述L-半胱氨酸修饰电极的检测端表面优选滴加5μL～10μL的氮杂化介孔碳悬浮液。

所述步骤（2）中，所述戊二醛溶液中戊二醛的质量分数优选1%～3%，所述L-半胱氨酸修饰氮杂化介孔碳电极在戊二醛溶液中浸入的时间优选30min～60min。

所述步骤（3）中，所述酪氨酸酶溶液的pH值为4.5～9.2，所述酪氨酸酶溶液中酪氨酸酶的浓度为0.05mg/μL～0.1mg/μL。

所述氮杂化介孔碳是采用包括以下步骤的制备方法制得：

（1）合成介孔硅模板SBA-15：将嵌段共聚物P123置于盐酸中溶解，然后逐滴加入正硅酸乙酯，P123与正硅酸乙酯的质量比为8∶17～23，搅拌后水浴加热，温度控制在30℃～35℃，然后将所得混合物转移至反应釜中，在140℃～150℃水热23h～25h，抽滤，洗涤至中性，风干，再放入电阻炉中在530℃～550℃空气中焙烧4h～5h，得到介孔硅模板SBA-15；

（2）合成氮杂化介孔碳：将所得介孔硅模板SBA-15、四氯化碳、乙二胺按照0.5～1.5∶3∶1.35的质量比加入烧瓶中，然后在90℃～100℃下水浴加热搅拌6h～10h，冷凝回流6h～8h，将所得产物于40℃～60℃下进行干燥，再置于氮气或含氢氮气中于600℃～900℃下热处理5h～7h（进行碳化），控制升温速率为3℃/min～5℃/min；用质量分数为5%～7%的氢氟酸脱除硅模板（即SiO₂），过滤，洗涤，40℃～60℃下干燥，得到氮杂化介孔碳。

本发明的上述制备方法不仅工艺简单、成本低廉、制作快速，而且使酪氨酸酶的固定更稳固，并能维持酪氨酸酶的高活性。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的酪氨酸酶生物传感器在检测邻苯二酚（catechol）中的应用，检测时的具体操作方法包括以下步骤：以所述的酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中进行电化学反应时的还原电流大小，然后根据邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程，即可定性或定量地测定待测溶液中的邻苯二酚；

所述邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：

P₁=50.7049+681.4709C₁（1）

式（1）中，P₁为邻苯二酚检测时的电流变化值，单位为nA；C₁为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为μM；式（1）的相关系数为R²=0.9991，邻苯二酚检测线性范围为5×10^-8M～9.5×10^-6M，检测下限为10.24nM。

本发明还提供一种上述的酪氨酸酶生物传感器在检测苯酚（phenol）中的应用，检测时的具体操作方法包括以下步骤：以所述的酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中进行电化学反应时的还原电流大小，然后根据苯酚浓度与还原电流变化的线性回归方程，即可定性或定量地测定待测溶液中的苯酚；

所述苯酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：

P₂=303.9409+593.1184C₂（2）

式（2）中，P₂为苯酚检测时的电流变化值，单位为nA；C₂为待测溶液中苯酚的浓度值，单位为μM；式（2）的相关系数为R²=0.9881，所述苯酚的线性检测范围为5×10^-8M～1.25×10^-5M，检测下限为15nM。

上述的应用中，所述三电极系统检测待测溶液时用到的电解液优选pH值为4.5～9.2的磷酸盐缓冲溶液。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器不仅成本低廉、制作简单，而且具有优化的微观结构。首先，将玻碳电极用L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳修饰，使其具有优越的电子传递能力和导电性能，这能够显著提高生物传感器和待测溶液间电子的转移速度，能够快速获得稳定的响应电流，然后通过交联剂戊二醛，将酪氨酸酶滴加到电极上，这不仅提高酶的固定量，还能够保持酶的活性，使酪氨酸酶生物传感器使用寿命更长，酪氨酸酶活性更高。可见，本发明的酪氨酸酶生物传感器充分集成了现有技术中的各种技术手段，使组合后的生物传感器实现了各技术手段的优势互补、协同增效，大大提高了生物传感器的稳定性、重复性和传感器结构的可靠性，提高了现有生物传感器的检测水平。

2.本发明酪氨酸酶生物传感器的制备方法不仅工艺步骤简单、工艺成本小、且制作效率高。本发明中以戊二醛为交联剂将酪氨酸酶固定在修饰电极上，此外还可以通过氨基-醛基共价结合使得戊二醛与L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳结合得更加牢固，从而增强酶传感器的稳定性和使用寿命，并能维持酪氨酸酶的高活性。

3.本发明的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器可用于检测苯酚、邻苯二酚等有机酚类污染物，由于生物传感器上酪氨酸酶的高活性，对于苯酚、邻苯二酚的氧化能够起到良好的催化效果，本发明的酪氨酸酶生物传感器具有卓越的电子传导能力，使得每次达到稳定响应电流的时间很短，因此，在可测定的浓度范围内，测定结果较理想，用于水样测定的苯酚和邻苯二酚的加标回收率分别在95.7%～105.0%，96.3%～111.0%之间，与传统的高效液相色谱法相比，成本低廉、操作简单、响应速度快、检测精度高、抗干扰性强。

附图说明

图1为本发明实施例中酪氨酸酶生物传感器的自组装过程示意图。

图2为本发明实施例中酪氨酸酶生物传感器检测邻苯二酚的反应原理图。

图3为本发明实施例中酪氨酸酶生物传感器检测苯酚的反应原理图。

图4为本发明实施例中制得的氮杂化介孔碳的扫描电镜图。

图5为本发明实施例中制得的L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳扫描电镜图。

图6为本发明实施例中制得的氮杂化介孔碳的高倍透射电镜图。

图7为本发明实施例的酪氨酸酶生物传感器在制作过程中各种中间体的电化学阻抗图谱。

图8为本发明实施例中酪氨酸酶生物传感器检测时的pH值优化图。

图9为本发明实施例中检测邻苯二酚时的计时电流曲线图。

图10为本发明实施例中检测苯酚时的计时电流曲线图。

图11为本发明实施例中检测邻苯二酚时，邻苯二酚浓度与响应电流的线性图。

图12为本发明实施例中检测苯酚时，苯酚浓度与响应电流的线性图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例：

一种本发明的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器，自组装过程如图1所示，该生物传感器包括一玻碳电极，玻碳电极的检测端表面沉积有L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳，L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳上通过戊二醛固定有酪氨酸酶。

一种上述本实施例的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1.制备氮杂化介孔碳。

1.1介孔硅模板SBA-15的合成：将8.0g嵌段共聚物PluronicP123（EO20PO70EO20）置于盐酸（270gH₂O和320mL、1.54M的盐酸混配而成）中，于35℃水浴中搅拌直至其溶解，然后逐滴加入17g正硅酸乙酯（TEOS），将此混合物在35℃下搅拌20h，然后将混合物转移至反应釜中，在140℃温度下水浴加热24h，将所得产物抽滤、再用蒸馏水洗涤至滤液为中性，室温下风干，干燥后得到白色粉末；为了去除其中的模板剂（SiO₂），将白色粉末放入箱式电阻炉中焙烧，控制升温速率为l℃/min，在550℃空气中焙烧4h，研磨即得介孔硅模板SBA-15白色粉末。

1.2氮杂化介孔碳的合成：取0.5g介孔硅模板SBA-15加入圆底烧瓶中，再将3g四氯化碳和1.35g乙二胺加入到圆底烧瓶中，加入转子，在90℃下水浴加热搅拌，冷凝回流6h，取出后于50℃下干燥，再置于氮气中于900℃下热处理5h，控制升温速率为5℃/min，对所得固体用质量分数为5%的氢氟酸进行脱硅步骤，脱除硅模板，过滤，洗涤，40℃下干燥后，即得氮杂化介孔碳。

该氮杂化介孔碳的扫描电镜图如图4所示，氮杂化介孔碳为棒状的线型材料，透射电镜图如图6所示，有明显的六维介孔形状。

2.修饰氮杂化介孔碳。

在一准备好的玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积L-半胱氨酸溶液，即在L-半胱氨酸溶液中玻碳电极采用循环伏安法以-0.8V～1.0V，扫描速率50mV·s^-1进行扫描，得到L-半胱氨酸修饰电极，晾干备用；将上述制得的氮杂化介孔碳悬浮溶液（N,N-二甲基甲酰胺作为分散剂）滴加到L-半胱氨酸修饰电极的检测端表面上，检测端表面滴加7μL的氮杂化介孔碳悬浮液，得到L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳电极。L-半胱氨酸溶液的浓度为1.0×10^-3mol/L，氮杂化介孔碳悬浮液的浓度为1.0mg/mL。

如图5所示，是上述制得的L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳的扫描电镜图，与图4所示的氮杂化介孔碳相比，可以看到图5中L-半胱氨酸负载在氮杂化介孔碳上。

3.交联戊二醛。

将上述制得的L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳电极的检测端浸入配制好的戊二醛溶液（质量分数为2%，溶剂是水）中，在37℃的室温下保持45min，取出来晾干备用，得到复合材料修饰电极。

4.固定酪氨酸酶。

将步骤3中制得的复合材料修饰电极的检测端浸入配制好5μL的酪氨酸酶溶液（溶剂是PBS缓冲溶液）中，酪氨酸酶溶液中酪氨酸酶的浓度为0.05mg/μL；通过充分的共价交联作用使酪氨酸酶固定于复合材料修饰电极上，得到酪氨酸酶生物传感器，将该酪氨酸酶生物传感器保存于4℃条件下备用。

用电化学交流阻抗图谱（EIS）法分别表征上述制备过程中的玻碳电极（GCE）、L-半胱氨酸修饰氮杂化介孔碳电极（GCE/L-Cysteine-MCN）、复合材料修饰电极（GCE/L-Cysteine-MCN/Glutaricdialdehyde）、酪氨酸酶滴加到L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳电极上，得到酪氨酸酶生物传感器（GCE/L-Cysteine-MCN/Glutaricdialdehyde/tyrosinase），其结果如图7所示。由图7可见，GCE的半圆很大，这说明GCE的电阻大，表明GCE传导电子的能力很弱；但经过L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳修饰后GCE的半圆很小，近似一条直线，电阻显著降低，其电子传递速度大大提高，这说明氮杂化介孔碳增强了电子传递能力；修饰戊二醛和酪氨酸酶之后半圆又变大，可能是因为戊二醛分子不导电，但是戊二醛能够作为纳米材料和酪氨酸酶的交联剂，使酪氨酸酶能够更好的发挥催化作用。本发明的酪氨酸酶生物传感器传递电子的速度得到了明显的提高，应用时能显著提高工作电极和电解液间电子的转移速度，快速获得稳定的响应电流。

由以上制备过程及表征图谱数据可见，本实施例的酪氨酸酶生物传感器将会更稳定、使用寿命长、酪氨酸酶活性高，而且制备方法成本低廉、工艺简单、制作快速，酪氨酸酶不经过任何化学修饰而是交联剂的交联作用固定到玻碳电极表面，使酪氨酸酶的固定更稳固，并能维持酪氨酸酶的高活性。

本发明的上述方法也能用于与酪氨酸酶具有近似性质的其他生物有机成分的生物传感器的构建。

一种上述本实施例的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器的检测应用，检测反应原理如图2和图3所示，检测过程如下：

将上述本实施例的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站连接，对待测溶液中的苯酚、邻苯二酚浓度进行检测。

工作条件：所用的电解液为1/15mol/L的磷酸盐缓冲溶液（PBS），在pH=4.5～9.2范围内测定酪氨酸酶生物传感器对同一浓度苯酚的电流响应值，优化结果如图8所示，选定pH=6.98为最佳pH值，因为在此pH值下，其响应电流大且稳定。

本发明的酪氨酸酶生物传感器的检测原理如图2、3所示：酪氨酸酶催化氧化邻苯二酚成邻苯二醌（o-quinone），邻苯二醌在电极上得到电子，又被还原成邻苯二酚，通过检测还原电流的大小来定量指示待测液中邻苯二酚的浓度；但苯酚不是酪氨酸酶的直接底物，在酪氨酸酶作用下形成邻苯二酚，同样，邻苯二酚被酪氨酸酶氧化成邻苯二琨，邻苯二琨在修饰电极上得到电子，又被还原成邻苯二酚，通过检测还原电流的大小来定量指示待测液中苯酚的浓度，由于苯酚不是酪氨酸酶的直接底物，因此，在后面检测下限中，邻苯二酚的检测下限更低。

本发明检测过程的主反应式如下所示：

Phenol+H₂O+Tyrosinase(oxy)→Catechol+Tyrosinase(deoxy)+2H⁺+2e^-

Catechol+Tyrosinase(oxy)→Tyrosinase(deoxy)+o-quinone+2H⁺+2e^-

o-quinone+2H⁺+2e^-→Catechol

Tyrosinase(deoxy)+O₂→Tyrosinase(oxy)+H₂O

采用计时电流法（i-t）测定邻苯二酚、苯酚浓度，测量池中加入10mL的PBS电解液，里面放置一个磁力搅拌子，每测定一次后，用PBS清洗电极三次，再用于下一次测定，检测结果分别如图9和图10所示。

由图11可见，邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：

P₁=50.7049+681.4709C₁（1）

式（1）中，P₁为邻苯二酚检测时的电流变化值，单位为nA；C₁为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为μM；式（1）的相关系数为R²=0.9991，邻苯二酚检测线性范围为5×10^-8M～9.5×10^-6M，检测下限为10.24nM；

由图12可见，苯酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：

P₂=303.9409+593.1184C₂（2）

式（2）中，P₂为苯酚检测时的电流变化值，单位为nA；C₂为待测溶液中苯酚的浓度值，单位为μM；式（2）的相关系数为R²=0.9881，苯酚的线性检测范围为5×10^-8M～1.25×10^-5M，检测下限为15nM。

将上述本实施例的基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器用于实际水样样品的检测，检测结果如下表1、表2所示，该表中原水取自湘江橘子洲大桥段，E₁为原水过滤后测定的苯酚、邻苯二酚的浓度（均为0），经过过滤后加入确定浓度的苯酚、邻苯二酚，制成A、B、C、D四个水样，四个水样的配制浓度如E₂栏所示，而E₃栏为本发明酪氨酸酶生物传感器按照本实施例的检测方法和检测条件测定的浓度值。从加标回收率可以看出，本发明的酪氨酸酶生物传感器在可测定的浓度范围内，苯酚和邻苯二酚的加标回收率分别在95.7%～105.0%、96.3%～111.0%之间，测定结果理想，相比传统的高效液相色谱法，本发明的检测方法操作简单，且不受其它污染物的干扰。

表1酪氨酸酶生物传感器检测水中的苯酚

表2酪氨酸酶生物传感器检测水中的邻苯二酚

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，如将L-半胱氨酸换成其他的生物有机成分等。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）修饰氮杂化介孔碳：向一玻碳电极的检测端表面用电化学方法沉积L-半胱氨酸溶液，得到L-半胱氨酸修饰电极，晾干备用；将准备好的氮杂化介孔碳悬浮液滴加到L-半胱氨酸修饰电极的检测端表面上，得到L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳电极；

（2）交联戊二醛：将步骤（1）制得的L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳电极的检测端于室温下浸入配制好的戊二醛溶液中，得到复合材料修饰电极，晾干备用；

（3）固定酪氨酸酶：在步骤（2）得到的复合材料修饰电极的检测端表面滴加配制好的酪氨酸酶溶液，通过戊二醛的交联作用使酪氨酸酶固定于复合材料修饰电极上，得到酪氨酸酶生物传感器；

所述步骤（1）中，所述L-半胱氨酸溶液的浓度为1.0×10^-3mol/L～1.0×10^-2mol/L；所述氮杂化介孔碳悬浮液的浓度为1.0mg/mL～3.0mg/mL，所述L-半胱氨酸修饰电极的检测端表面滴加5μL～10μL的氮杂化介孔碳悬浮液；

所述基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器包括一玻碳电极，所述玻碳电极的检测端表面沉积有L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳，所述L-半胱氨酸修饰的氮杂化介孔碳上通过戊二醛固定有酪氨酸酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述戊二醛溶液中戊二醛的质量分数为1%～3%，所述L-半胱氨酸修饰氮杂化介孔碳电极在戊二醛溶液中浸入的时间为30min～60min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述酪氨酸酶溶液的pH值为4.5～9.2，所述酪氨酸酶溶液中酪氨酸酶的浓度为0.05mg/μL～0.1mg/μL。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述氮杂化介孔碳是采用包括以下步骤的制备方法制得：

（1）合成介孔硅模板SBA-15：将嵌段共聚物P123置于盐酸中溶解，然后逐滴加入正硅酸乙酯，P123与正硅酸乙酯的质量比为8∶17～23，搅拌后水浴加热，温度控制在30℃～35℃，然后将所得混合物转移至反应釜中，在140℃～150℃水热23h～25h，抽滤，洗涤至中性，风干，再放入电阻炉中在530℃～550℃空气中焙烧4h～5h，得到介孔硅模板SBA-15；

（2）合成氮杂化介孔碳：将所得介孔硅模板SBA-15、四氯化碳、乙二胺按照0.5～1.5∶3∶1.35的质量比加入烧瓶中，然后在90℃～100℃下水浴加热搅拌6h～10h，冷凝回流6h～8h，将所得产物于40℃～60℃下进行干燥，再置于氮气或含氢氮气中于600℃～900℃下热处理5h～7h，控制升温速率为3℃/min～5℃/min；用质量分数为5%～7%的氢氟酸脱除硅模板，过滤，洗涤，40℃～60℃下干燥，得到氮杂化介孔碳。

5.一种如权利要求1～4中任一项所述制备方法制得的酪氨酸酶生物传感器在检测邻苯二酚中的应用，检测时的具体操作方法包括以下步骤：以所述的酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中进行电化学反应时的还原电流大小，然后根据邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程，即可定性或定量地测定待测溶液中的邻苯二酚；

所述邻苯二酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：

P₁=50.7049+681.4709C₁（1）

式（1）中，P₁为邻苯二酚检测时的电流变化值，单位为nA；C₁为待测溶液中邻苯二酚的浓度值，单位为μM；式（1）的相关系数为R²=0.9991，邻苯二酚检测线性范围为5×10^-8M～9.5×10^-6M，检测下限为10.24nM。

6.一种如权利要求1～4中任一项所述制备方法制得的酪氨酸酶生物传感器在检测苯酚中的应用，检测时的具体操作方法包括以下步骤：以所述的酪氨酸酶生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中进行电化学反应时的还原电流大小，然后根据苯酚浓度与还原电流变化的线性回归方程，即可定性或定量地测定待测溶液中的苯酚；

所述苯酚浓度与还原电流变化的线性回归方程为：

P₂=303.9409+593.1184C₂（2）

式（2）中，P₂为苯酚检测时的电流变化值，单位为nA；C₂为待测溶液中苯酚的浓度值，单位为μM；式（2）的相关系数为R²=0.9881，所述苯酚的线性检测范围为5×10^-8M～1.25×10^-5M，检测下限为15nM。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述三电极系统检测待测溶液时用到的电解液为pH值为4.5～9.2的磷酸盐缓冲溶液。