CN108956739B - 一种高电活性修饰电极的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高电活性修饰电极的应用。高电活性修饰电极的制备方法步骤包括:首先在预先处理的玻碳电极上修饰有序介孔碳CMK‑3薄膜,再修饰全氟化酞菁钴分子层,得到高电活性修饰电极CoPcF16‑CMK‑3/GCE。本发明还涉及一种高电活性修饰电极在半胱氨酸检测中的应用。有益效果:通过该方法制备的修饰电极,呈现5对氧化还原峰,表现出优异的电化学活性,制备方法简单、牢固。本申请制备的高电化学活性电极不仅能催化巯基的氧化,还能催化其氧化产物的还原,并且对半胱氨酸和谷胱甘肽产生了电化学氧化还原差别,可用于在高浓度谷胱甘肽存在条件下选择性识别半胱氨酸。此外,该方法实现了在较负电位范围内半胱氨酸检测,解决了传统电氧化方法检测半胱氨酸时存在多巴胺、抗坏血酸、尿酸等易氧化干扰物的影响问题。

Description

一种高电活性修饰电极的应用
技术领域
本发明涉及一种高电活性修饰电极的应用。
背景技术
半胱氨酸是存在于绝大多数蛋白质中的重要生物巯基化合物,它在生物系统中起到合成蛋白质、脱毒、新陈代谢等作用。生物系统中半胱氨酸的异常水平与心血管疾病、帕金森、阿尔海默症等疾病相关,因此,它能作为判断疾病的危险程度以及健康状况的重要指标。
快速选择性检测半胱氨酸具有十分重要的意义,然而由于人体内另一种生物巯基谷胱甘肽的大量存在(浓度可达10mM,是半胱氨酸浓度的20-200倍)以及与半胱氨酸相似的化学性质,使得半胱氨酸的检测成为一种挑战。目前用于识别这两种巯基化合物的方法有色谱、电泳、质谱和荧光传感等。然而这些方法存在样品处理复杂、耗时以及仪器昂贵等不足。
在众多的巯基检测方法中,电化学检测法由于具有仪器设备简单、灵敏度高、价格低廉以及分析速度快等优点,越来越引起人们的关注。巯基化合物在传统电极上由于氧化过电位较高,很难被氧化,因此,不同的电催化剂被修饰在电极表面去降低其过电位,用于巯基化合物的电化学检测。电化学检测的缺陷在于,它很难识别半胱氨酸和谷胱甘肽,这是因为它们具有非常相似的氧化电位。电化学检测另外一个需要克服的问题是消除生物样品中像多巴胺、抗坏血酸、尿酸等易发生电氧化的常见干扰物的影响。因此,有必要提出有效的技术方案,解决上述问题。
发明内容
本发明为解决上述技术不足,提供一种高电活性修饰电极的制备方法。该方法制得的高电活性修饰电极可有效用于在高浓度谷胱甘肽存在条件下半胱氨酸的选择性检测。
一种高电活性修饰电极的制备方法,步骤包括:
(1)将有序介孔碳CMK-3粉末置于N,N-二甲基甲酰胺中,水浴超声40分钟,形成0.2mg/mL的介孔碳CMK-3分散液;
(2)用移液枪移取5微升0.2mg/mL介孔碳CMK-3分散液滴到经预处理后的玻碳电极表面,形成微球液滴,自然蒸发晾干,得到介孔碳CMK-3修饰的玻碳电极(CMK-3/GCE);
(3)将2mg全氟化酞菁钴(CoPcF16)置于1mL DMF中,60摄氏度水浴超声40分钟,然后离心除去未溶解的CoPcF16,制得CoPcF16溶液;
(4)取5微升CoPcF16溶液滴到CMK-3/GCE电极表面形成微球液滴,放置40分钟,然后依次用N,N-二甲基甲酰胺和水冲洗电极表面,得到高电活性修饰电极CoPcF16-CMK-3/GCE。
优选的,所述预处理玻碳电极的步骤为:玻碳电极依次经过1μm、0.3μm以及0.05μm氧化铝抛光粉抛光至镜面,然后分别在水和乙醇中超声清洗,晾干,备用。
一种高电活性修饰电极的应用,所述应用为用于半胱氨酸的检测。
优选的,所述半胱氨酸的检测为:采用差分脉冲伏安法以及三电极体系,三电极体系分别由工作电极、参比电极和对电极组成,工作电极为如权利要求1或2所述的制备方法制备的高电活性修饰电极,参比电极为Ag/AgCl电极,铂丝作为对电极,pH 7.0的0.1MNaH2PO4-Na2HPO4溶液作为缓冲溶液。
优选的,所述差分脉冲伏安法为正扫差分脉冲伏安法,参数设定为:初始电位为-1.1V,最终电位为0.6V,电位增幅0.004V,振幅0.05V,脉冲宽度0.2s,脉冲周期0.5s。线性范围为0.01mM到20mM(R2=0.9982,I/μA=0.325+0.00134C/mM),最低检出限为1μM(S/N=3)。
优选的,所述差分脉冲伏安法为负扫差分脉冲伏安法,参数设定为:负扫DPV初始电位为0.6V,最终电位为-1.1V,电位增幅0.004V,振幅0.05V,脉冲宽度0.2s,脉冲周期0.5s。呈两段线性关系,线性范围为20μM到0.5mM(R2=0.9960,I/μA=0.295+3.36C/mM)以及0.5mM到10mM(R2=0.9950,I/μA=1.59+1.71C/mM),最低检出限为4.2μM(S/N=3)。
有益效果:
通过该方法制备的修饰电极,呈现5对氧化还原峰,表现出很好的电化学活性,制备方法简单、牢固。
本申请制备的高电化学活性电极,该电极不仅能催化巯基的氧化还能催化其氧化产物的还原,并且对半胱氨酸和谷胱甘肽产生了电化学氧化还原差别,可用于在高浓度谷胱甘肽存在下选择性识别半胱氨酸。另外,与传统电化学氧化方法检测半胱氨酸相比,该方法检测是在负电位范围内,从而消除了多巴胺、抗坏血酸、尿酸等易发生电氧化的常见干扰物的影响。
附图说明
图1为本发明CMK-3/GCE扫描电镜图。
图2为CoPcF16-CMK-3/GCE在0.1M PBS(pH 7.0)中的循环伏安图。
图3为CoPcF16-CMK-3/GCE的X射线光电子能谱分析图。
图4为CoPcF16-CMK-3/GCE在不同扫速下的循环伏安图。
图5为CoPcF16-CMK-3/GCE在不同pH溶液中的循环伏安图。
图6为半胱氨酸,还原型谷胱甘肽以及氧化型谷胱甘肽分别在不同的修饰电极上的循环伏安图。
图7为CoPcF16-CMK-3/GCE对不同浓度半胱氨酸的正向扫描DPV响应图。
图8为常见干扰物在CoPcF16-CMK-3/GCE上对半胱氨酸的正向扫描DPV干扰实验图。
图9为高浓度谷胱氨肽存在条件下,CoPcF16-CMK-3/GCE对不同浓度半胱氨酸的负向扫描DPV响应图。
图10为常见干扰物在CoPcF16-CMK-3/GCE上对半胱氨酸的负向扫描DPV图。
具体实施方式
实施例1
一种高电活性修饰电极的制备方法,步骤包括:
将有序介孔碳CMK-3粉末置于N,N-二甲基甲酰胺中,水浴超声40分钟,形成0.2mg/mL的介孔碳CMK-3分散液;
用移液枪移取5微升0.2mg/mL介孔碳CMK-3分散液滴到经预处理后的玻碳电极表面,形成微球液滴,自然蒸发晾干,得到介孔碳CMK-3修饰的玻碳电极(CMK-3/GCE);
将2mg全氟化酞菁钴(CoPcF16)置于1mL DMF中,60摄氏度水浴超声40分钟,然后离心除去未溶解的CoPcF16,制得CoPcF16溶液;
取5微升CoPcF16溶液滴到CMK-3/GCE电极表面形成微球液滴,放置40分钟,然后依次用N,N-二甲基甲酰胺和水冲洗电极表面,得到高电活性修饰电极CoPcF16-CMK-3/GCE。
上述方法制备的电极CMK-3与CoPcF16通过π-π作用,并产生协同作用,产生多个催化位点,这些催化位点不仅能催化巯基的氧化还能催化其氧化产物的再还原。半胱氨酸和谷胱甘肽这两种不同的巯基化合物的氧化产物在这些位位点上呈现出不同的还原行为,这为它们的电化学识别奠定了基础。
将实施例1得到的高电活性修饰电极CoPcF16-CMK-3/GCE分别采用扫描电镜、EDX能谱、XPS光电子能谱、循环伏安等技术进行表征。
图1为CMK-3/GCE扫描电镜图,从图1可以看出,介孔碳呈棒状结构,长度在800纳米左右,直径在400纳米左右。
图2为CoPcF16-CMK-3/GCE在0.1M PBS(pH 7.0)中的循环伏安图,从CoPcF16-CMK-3/GCE在0.1M磷酸缓冲盐溶液(pH 7.0)中的循环伏安图可知,该修饰电极呈现5对氧化还原峰,这是由于介孔碳与全氟酞菁钴共同作用的结果,产生了多个催化活性位点,导致谷胱甘肽和半胱氨酸在这些位点上的氧化还原产生了差别,由此才能选择性识别,其中(1,1’)和(3,3’)两对峰是由[CoPc(-2)F16]-/[CoPc(-3)F16]2-电对之间转换形成的,而(2,2’),(4,4’)和(5,5’)三对峰是由[Co(Ⅱ)Pc(-2)F16]/[Co(Ⅰ)Pc(-2)F16]-之间相互转换产生的,同一类型的不同组峰是由多层CoPcF16造成的,通过循环伏安图可计算得到CoPcF16在电极表面上的覆盖率高达4.5×10-9mol·cm-2
图3为CoPcF16-CMK-3/GCE的X射线光电子能谱分析图。图3显示Co2p3/2、F1s和N1s的结合能分别为779.3、686.1和397.5,说明CoPcF16成功的修饰在电极表面。
图4为CoPcF16-CMK-3/GCE在不同扫速下的循环伏安图,如图4所示,随着扫速的增加,峰电流逐渐增大,峰电流与扫速一次方成正比,说明电极反应过程受表面控制。
图5为CoPcF16-CMK-3/GCE在不同pH溶液中的循环伏安图,如图5所示,随着pH值增加,氧化和还原峰均向负电位方向移动,且峰3电位对pH值作图为一直线,斜率为62mV/pH,说明质子参与电化学反应,质子数为1。
图6为半胱氨酸,谷胱甘肽以及氧化型谷胱甘肽分别在不同的修饰电极上的循环伏安图。其中,点线为背景电解质的循环伏安图。介孔碳CMK-3修饰的玻碳电极(A)于背景电解质中在-0.8-0.2V之间有若干微弱的氧化还原峰,这是由介孔碳表面的含氧官能团发生电化学反应产生的。溶液中加入半胱氨酸和谷胱甘肽后,在0V以上氧化电流有所增加,这说明巯基发生了电催化氧化。在CMK-3表面进一步修饰没有氟化的酞菁钴(CoPc)之后(B),溶液中加入巯基化合物之后,不仅0v以上观察到氧化电流,在-0.8V还出现了还原峰,这说明CoPc的引入不仅催化了巯基的氧化,还进一步催化了氧化产物的还原。在单独CoPcF16修饰的电极上(C),观察到了同样的现象,只不过半胱氨酸要比谷胱甘肽明显的多,对半胱氨酸的催化效果要好一些。最后,在CoPcF16和CMK-3共同修饰的电极上(D),这三种物质的氧化和氧化产物的再还原均能明显的观察到,而且强度最大。更应值得注意的是,半胱氨酸相比于谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽,在还原过程中出现了了一肩峰1′,该肩峰可通过后面的DPV技术分离开。
通过本申请的修饰方法,CoPcF16不会在电极表面聚集,并且通过π-π作用力紧密结合,并产生协同作用,产生多个催化位点,这些催化位点不仅能催化巯基的氧化还能催化其氧化产物的再还原。更重要的是半胱氨酸和谷胱甘肽这两种不同的巯基化合物的氧化产物在该修饰电极上呈现出不同的还原行为,这为它们的电化学识别奠定了基础。
该方法具有简单、快速、灵敏度高、选择性好等优点。可排除同类型巯基化合物谷胱甘肽,以及常见干扰物尿酸、多巴胺、抗坏血酸等干扰,可以用于人尿样中半胱氨酸的检测,有望用于临床分析。可在电催化、能源、电分析、生物传感等领域有潜在的应用。
采用该修饰电极可通过正扫DPV和负扫DPV三种模式实现半胱氨酸的检测。下面将通过实施例进一步具体阐述检测方法。
实施例2
一种半胱氨酸的检测方法,采用正扫差分脉冲伏安法以及三电极体系,三电极体系分别由工作电极、参比电极和对电极组成,工作电极为如权利要求1或2所述的制备方法制备的高电活性修饰电极,参比电极为Ag/AgCl电极,铂丝作为对电极,pH 7.0的0.1MNaH2PO4-Na2HPO4溶液作为缓冲溶液。
所述差分脉冲伏安法为正扫差分脉冲伏安法,参数设定为:初始电位为-1.1V,最终电位为0.6V,电位增幅0.004V,振幅0.05V,脉冲宽度0.2s,脉冲周期0.5s。线性范围为0.01mM到20mM(R2=0.9982,I/μA=0.325+0.00134C/mM),最低检出限为1μM(S/N=3)。
本申请正扫差分脉冲伏安法用于半胱氨酸的检测,图7为CoPcF16-CMK-3/GCE对不同浓度半胱氨酸的正向扫描DPV响应图。图8为常见干扰物在CoPcF16-CMK-3/GCE上对半胱氨酸的正向扫描DPV干扰实验图。如图8干扰实验显示,抗坏血酸和谷胱甘肽干扰半胱氨酸的检测。
实施例3
一种半胱氨酸的检测方法,采用正扫差分脉冲伏安法以及三电极体系,三电极体系分别由工作电极、参比电极和对电极组成,工作电极为如权利要求1或2所述的制备方法制备的高电活性修饰电极,参比电极为Ag/AgCl电极,铂丝作为对电极,pH 7.0的0.1MNaH2PO4-Na2HPO4溶液作为缓冲溶液。
所述差分脉冲伏安法为负扫差分脉冲伏安法,参数设定为:负扫DPV初始电位为0.6V,最终电位为-1.1V,电位增幅0.004V,振幅0.05V,脉冲宽度0.2s,脉冲周期0.5s。呈两段线性关系,线性范围为20μM到0.5mM(R2=0.9960,I/μA=0.295+3.36C/mM)以及0.5mM到10mM(R2=0.9950,I/μA=1.59+1.71C/mM),最低检出限为4.2μM(S/N=3)。
本申请负扫差分脉冲伏安法用于半胱氨酸的检测,图9为高浓度谷胱甘肽共存条件下,CoPcF16-CMK-3/GCE对不同浓度半胱氨酸的负向扫描DPV响应图。由于谷胱甘肽和半胱氨酸的氧化产物在修饰电极上表现出的电还原差别,即使在高浓度谷胱氨肽存在下,对半胱氨酸的检测没有任何影响。图10为常见干扰物在CoPcF16-CMK-3/GCE上对半胱氨酸的负向扫描DPV干扰实验图。如图10干扰实验显示,采用负扫DPV,常见的干扰物均不干扰半胱氨酸的检测。负扫差分脉冲伏安法用于加标尿样中半胱氨酸的检测,加标回收率在100%-103%之间,说明该方法有望用于临床分析。负扫DPV检测模式不仅能区分半胱氨酸和谷胱甘肽,还能消除生物样品中共存的易发生电氧化的多巴胺、抗坏血酸、尿酸等干扰物质的影响。
本申请所述试剂来源:全氟酞菁钴、酞菁钴、DMF、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、抗坏血酸、尿酸、多巴胺、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠等试剂均购于Sigma-Aldrich公司;介孔碳CMK-3购于南京先丰纳米材料科技有限公司;玻碳电极(3毫米)购于武汉高仕睿联科技有限公司。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此,无论从哪一点来看,本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明,权利要求书指出了本发明的范围,而上述的说明并未指出本发明的范围,因此,在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变,都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。

Claims (1)

1.一种高电活性修饰电极的应用,其特征在于,所述应用为用于半胱氨酸的检测;
所述半胱氨酸的检测为:采用差分脉冲伏安法以及三电极体系,三电极体系分别由工作电极、参比电极和对电极组成,工作电极为高电活性修饰电极,参比电极为Ag/AgCl电极,铂丝作为对电极,pH 7.0的0.1 M NaH2PO4-Na2HPO4溶液作为缓冲溶液;
所述差分脉冲伏安法为正扫差分脉冲伏安法,参数设定为:初始电位为-1.1 V,最终电位为0.6 V, 电位增幅0.004 V,振幅0.05 V, 脉冲宽度0.2 s,脉冲周期0.5 s;线性范围为0.01 mM 到 20 mM ,R2=0.9982, I/μA=0.325+0.00134C/mM,最低检出限为 1 μM,S/N=3;或
所述差分脉冲伏安法为负扫差分脉冲伏安法,参数设定为:电位增幅0.004 V,振幅0.05 V, 脉冲宽度0.2 s,脉冲周期0.5 s;负扫DPV初始电位为0.6 V,最终电位为-1.1 V,呈两段线性关系,线性范围为20 µM 到 0.5 mM ,R2=0.9960, I/μA=0.295+3.36C/mM以及0.5 mM 到 10 mM ,R2=0.9950, I/μA=1.59+1.71 C/mM,最低检出限为 4.2 μM,S/N=3;
所述高电活性修饰电极的制备方法,步骤包括:
(1)将有序介孔碳CMK-3 粉末置于N,N-二甲基甲酰胺中,水浴超声40分钟,形成0.2mg/mL的介孔碳CMK-3分散液;
(2)用移液枪移取5微升0.2 mg/mL介孔碳CMK-3分散液滴到经预处理后的玻碳电极表面,形成微球液滴,自然蒸发晾干,得到介孔碳CMK-3修饰的玻碳电极;
(3)将2 mg 全氟化酞菁钴置于1 mL DMF中,60摄氏度水浴超声40分钟,然后离心除去未溶解的全氟酞菁钴,制得全氟酞菁钴溶液;
(4)取5微升全氟酞菁钴溶液滴到有序介孔碳CMK-3修饰的玻碳电极表面形成微球液滴,放置40分钟,然后依次用N,N-二甲基甲酰胺和水冲洗电极表面,得到高电活性修饰电极。
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