CN114651548B - 一种土壤原位固氮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土壤原位固氮的方法，该固氮方法包括以下步骤：在土壤中添加电活性菌，并在三电极系统工作下进行原位固氮。本发明中的固氮方法通过在低氮土壤体系中接种电活性菌，构建三电极系统并施加工作电位，从而实现在土壤中原位固氮，降低经济成本，提高固氮效率，固氮过程中无污染物产生，对环境友好。此外，本发明通过在土壤中投入导电颗粒可进一步提高固氮效率，该方法操作便利，经济有效。
Description
技术领域
本发明涉及环境领域，具体涉及一种土壤原位固氮的方法。
背景技术
土壤生物固氮是自然生态系统中氮的重要来源之一，加强土壤固氮微生物的研究,对农林环境保护有十分重大的意义。土壤固氮效率提高，可为农作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少水土污染和疾病传播，在建立生态平衡和促进现代农业可持续发展等方面具有广泛的开发应用前景。目前，最有效的人工固氮方法是Haber-Bosch法，其占比达到了世界人工氮肥产量的90％。但其苛刻的生产条件(高温、高压)对环境保护提出了巨大挑战，二氧化碳排放量大且耗能高，不满足农业可持续发展的需求。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种土壤原位固氮的方法，该固氮方法可以解决现有缺氮土壤固氮方法效率低，固氮耗能高、污染大、成本高等问题。
本发明的目的之二在于提供一种土壤原位固氮的方法在土壤改良中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面在于提供一种土壤原位固氮的方法，包括以下步骤：在土壤中添加电活性菌，并在三电极系统工作下进行原位固氮。
优选地，所述电活性菌的添加量不小于1×1010cfu/(kg土壤)；进一步优选地，所述电活性菌的添加量不小于2×1010cfu/(kg土壤)；再进一步优选地，所述电活性菌的添加量为2×1010cfu/(kg土壤)～3×1010cfu/(kg土壤)。过量的细菌接种量不会大幅度提高固氮效果，因此，处于成本考虑，本发明中的电活性菌的添加量为2×1010cfu/(kg土壤)～3×1010cfu/(kg土壤)。
优选地，所述电活性菌为处于生长对数期的电活性固氮菌。
优选地，所述电活性菌包括施氏假单胞菌、硫还原地杆菌中的至少一种。
优选地，所述土壤中还添加有导电颗粒。
优选地，所述导电颗粒包括生物炭、石墨粉、活性炭、磁铁矿、金属粉中的至少一种。
优选地，所述导电颗粒能通过300目以上的筛子；进一步优选地，所述导电颗粒的粒径为300～400目。采用该粒径的导电颗粒，可以便于导电颗粒充分与土壤混合，同时有利于电活性菌的附着。
优选地，所述生物炭的原料为秸秆、果壳中的至少一种。
优选地，所述果壳包括花生壳、椰子壳中的至少一种。
本发明中的导电颗粒可提高三电极系统的电化学效率，并具有一定的储存电荷的能力，可作为电子穿梭体，有效促进电子传递，且导电颗粒在常温下具有优异的化学稳定性，可在固氮系统中稳定存在而不干扰电活性菌的代谢活动。
优选地，所述三电极系统包括工作电极、对电极和参比电极。
优选地，所述工作电极、对电极和参比电极之间通过电极线连接；进一步优选地，所述工作电极、对电极和参比电极之间通过铂丝或钛丝连接。钛丝作为电极线材料具有优异的导电性、化学耐久性，具备优良的抗腐蚀性能，适用于土壤中三电极体系的构建。
优选地，所述工作电极包括碳材料、金属板、导电玻璃中的一种。
优选地，所示碳材料包括碳刷、石墨板、石墨毡中的一种。
优选地，所述对电极为金属丝。
优选地，所述金属丝为铂丝、钛丝中的至少一种。
优选地，所述参比电极包括甘汞电极、Ag/AgCl电极中的至少一种。
优选地，所述固氮方法是在厌氧条件下进行固氮。
优选地，所述土壤中氧气浓度≤0.5mg/L。
优选地，所述土壤中总有机碳的含量为0～12000ppm；进一步优选地，所述土壤中总有机碳的含量为0～12000ppm；但不为零。
优选地，所述土壤中总有机碳含量大于1000ppm时，所述三电极系统的工作电位为+0.1V～+0.3V；进一步优选地，所述土壤中总有机碳含量大于1000ppm时，所述三电极系统的工作电位为+0.2V～+0.3V；再进一步优选地，所述土壤中总有机碳含量大于1000ppm时，所述三电极系统的工作电位为+0.25V～+0.3V。
当土壤中的总有机碳含量大于1000ppm时的固氮工作机理图如图1所示，当土壤中总有机碳含量充足且施加工作电位为正时，三电极系统可为电活性菌提供充足有效的电驱动力，可提高电活性菌的固氮效率。以碳源作为电子供体，即工作电极作为电子受体，电活性菌通过消耗碳源将一部分电子提供给电活性菌中的固氮酶用于固氮，另一部分电子通过跨膜运输到工作电极再由外接电路回到对电极，这个跨膜运输过程会产生ATP以支持固氮。此驱动力产生的ATP让固氮系统具备了在碳源充足却缺氮的环境中持续固氮的能力，因此提高了固氮效率。
优选地，所述土壤中总有机碳(TOC)含量小于1000ppm时，所述三电极系统的工作电位为-0.1V～-0.3V；进一步优选地，所述土壤中总有机碳含量小于1000ppm时，所述三电极系统的工作电位为-0.2V～-0.3V；再进一步优选地，所述土壤中总有机碳含量小于1000ppm时，所述三电极系统的工作电位为-0.25V～-0.3V。
当土壤中的总有机碳含量小于1000ppm时的固氮工作机理图如图2所示，土壤中总有机碳含量不足且施加工作电位为负时，以三电极系统作为电子供体，即工作电极作为电子供体，电活性菌中的固氮酶消耗电子用于固氮，工作电极提供的电子跨膜运输到固氮酶处，跨膜运输电子过程会产生ATP以支持固氮。
当土壤中的总有机碳含量较低时，三电极体系充当了电活性菌固氮反应的电子来源；当土壤中的总有机碳含量较高时，有机碳是电活性菌固氮反应的电子来源，电子一部分用于固氮，一部分流向电极。本发明通过根据土壤中总有机碳含量的不同而调整不同的电势，使本发明中的固氮体系在不同含量的总有机碳下均可以实现固氮，并提高电活性菌的固氮效果。
本发明中施加的工作电位可提高电活性菌的固氮酶活性，同时抑制土壤中的水的电解，避免土壤中水电解产生氢气，进而干扰固氮效果。
优选地，所述土壤温度为25～35℃；进一步优选地，所述土壤的温度为28～32℃；再进一步优选地，所述土壤的温度为30℃。本发明所采用的温度可保证电活性菌处于最大的生理活性，固氮效果更佳。
本发明的第二个方面在于提供本发明第一方面提供的土壤原位固氮的方法在土壤改良中的应用。
本发明的有益效果是：本发明中的固氮方法通过在低氮土壤体系中接种电活性菌，构建三电极系统并施加工作电位，从而实现在土壤中原位固氮，降低经济成本，提高固氮效率，固氮过程中无污染物产生，对环境友好。
此外，本发明通过在土壤中投入导电颗粒可进一步提高固氮效率，该方法操作便利，经济有效。
附图说明
图1为土壤总有机碳含量大于1000ppm时固氮工作原理图。
图2为土壤总有机碳含量小于1000ppm时固氮工作原理图。
图3为实施例4～5、对比例5～8中的土壤原位固氮的方法的固氮效果图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步详细说明，但本发明的实施和保护不限于此。需要指出的是，以下若为有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
原料信息：
施氏假单胞菌可购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号:CGMCC0351，菌株编号：A1501，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心。
硫还原地杆菌可购买自北京百欧博伟生物技术有限公司或美国模式培养物集存库(ATCC)，菌种保藏号：ATCC51573，保藏单位名称：美国模式培养物集存库(ATCC)。
对数生长期的菌株的制备方法为：首先，配置LB培养基，LB培养基采用现有技术中的培养基的配置方法和配方进行配置，将配置完成的LB培养基在121℃的高温，103.4kPa的高压下灭活20min，然后将菌株(施氏假单胞菌或硫还原地杆菌)接种到LB培养基中，置于30℃摇床培养箱中培养10h，即可获得处于对数生长期的菌株。
实施例1：
本例中的土壤原位固氮的方法，包括以下步骤：
(1)在缺氮的、TOC＝200mg/kg的水稻田土壤区域，在每千克土壤中投入15mL处于生长对数期的硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens PCA)(使其最终的有效活菌数达到约为2.5×1010cfu/(kg土壤))，混合均匀。
(2)将石墨板作为工作电极，钛丝作为对电极，甘汞电极(含饱和氯化钾)作为参比电极，构建三电极系统，将三电极系统置于表层土壤下10cm处，设定工作电极的电位为-0.3V，工作并使土壤原位固氮。
实施例2：
本例中的土壤原位固氮的方法，包括以下步骤：
(1)在缺氮的、TOC＝200mg/kg的水稻田土壤区域，投放生物炭(原料为秸秆，目数为325目)并与土壤充分混合，每千克土壤中，生物炭的投放量为20g。
(2)在每千克土壤中投入15mL处于生长对数期的硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens PCA)(使其最终的有效活菌数达到约为2.5×1010cfu/(kg土壤))，并混合。
(3)将石墨板作为工作电极，钛丝作为对电极，甘汞电极(含饱和氯化钾)作为参比电极，构建三电极系统，将三电极系统置于表层土壤下10cm，设定工作电极的电位为-0.3V，工作并使土壤原位固氮。
实施例3：
本例中的土壤原位固氮的方法，包括以下步骤：
(1)在缺氮的、TOC＝200mg/kg的水稻田土壤区域，投放活性炭颗粒(活性炭颗粒的粒径为325目)并与土壤充分混合，每千克土壤中，活性炭颗粒的投放量为20g。
(2)在每千克土壤中投入15mL处于生长对数期的硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens PCA)(使其最终的有效活菌数达到约为2.5×1010cfu/(kg土壤))，混合均匀。
(3)将石墨板作为工作电极，钛丝作为对电极，甘汞电极(含饱和氯化钾)作为参比电极，构建三电极系统，将三电极系统置于表层土壤下10cm，设定工作电极的电位为-0.3V，工作并使土壤原位固氮。
实施例4：
本例中的土壤原位固氮的方法，包括以下步骤：
(1)在缺氮的、TOC＝6270mg/kg的水稻田土壤区域一次性投入石墨粉(325目)，每千克土壤的投放量为49.7g±6.3g，充分翻土以保证石墨粉与下层土壤充分混合。
(2)在每千克土壤投入15mL处于生长对数期的施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri A1501)(使其最终的有效活菌数达到约为2.5×1010cfu/(kg土壤))，混合均匀。
(3)将石墨板作为工作电极，钛丝作为对电极，甘汞电极(含饱和氯化钾)作为参比电极，构建三电极系统，三电极体系置于表层土壤下10cm，设定工作电极电位为+0.3V，工作并使土壤原位固氮。
实施例5：
本例中的土壤原位固氮的方法与实施例4相比，区别在于：在土壤中未添加石墨粉，其他步骤均与实施例4相同。
对比例1：
本例中的土壤原位固氮的方法与实施例1相比，区别在于：在土壤中未构建三电极系统，其他步骤均与实施例1相同。
对比例2：
本例中的土壤原位固氮的方法与实施例1相比，区别在于：在土壤中未添加硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens PCA)，其他步骤均与实施例1相同。
对比例3：
本例中的土壤原位固氮的方法与实施例3相比，区别在于：在土壤中未添加硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens PCA)，其他步骤均与实施例3相同。
对比例4：
本例中的土壤原位固氮的方法与实施例3相比，区别在于：在土壤中未构建三电极系统，其他步骤均与实施例3相同。
对比例5：
本例中的土壤原位固氮的方法与实施例4相比，区别在于：在土壤中未构建三电极系统，其他步骤均与实施例4相同。
对比例6：
本例中的土壤原位固氮的方法与实施例4相比，区别在于：在土壤中未投放施氏假单胞菌，其他步骤均与实施例4相同。
对比例7：
本例中的土壤原位固氮的方法与实施例4相比，区别在于：在土壤中未投放施氏假单胞菌，同时也未添加石墨粉，其他步骤均与实施例4相同。
对比例8：
本例中的土壤原位固氮的方法与实施例4相比，区别在于：在土壤中未构建三电极系统，同时也未添加石墨粉，其他步骤均与实施例4相同。
性能测试：
使用总氮试剂盒(Test'N Tube)(DR/3900；购买自美国哈希公司)分别测试实施例1～3和对比例1～4中的土壤原位固氮的方法的固氮效果，具体测试方法为：测量实验第一天与最后一天总氮，总氮增量为(最后一天与第一天总氮数值之差)/天数，并计算总氮增量。固氮酶活的测定方法为乙炔还原法。固氮酶活性(nmol C2H4·mg-1蛋白·h-1)＝所测菌株乙烯峰面积×(三角瓶中气相体积÷进样量)÷1nmol标准乙烯峰的面积÷菌体蛋白浓度÷反应时间。
具体测试结果如下表1所示：
表1实施例1～3和对比例1～4中的土壤原位固氮的方法的固氮效果
由表1可以看出，与对比例1相比，实施例1通过构建三电极体系，其总氮增量提高了6倍，固氮酶活性提高了12～16倍；与对比例2相比，实施例1通过投放电活性菌，使总氮增量提高了27倍。与对比例3相比，实施例3通过投放电活性菌，使总氮增量提高了7.8倍；与对比例4相比，实施例3通过构建三电极体系，使总氮增量提高了7.2倍，固氮酶活性提高了10～16倍。综上可知，本发明中的三电极系统和电活性菌相互配合，协同作用，共同实现土壤原位固氮的作用，同时通过在土壤中混合导电颗粒，进一步提高了土壤的总氮增量，使土壤原位固氮效果更佳。
采用同样的测试方法分别测试实施例4～5、对比例5～8中的土壤原位固氮的方法的固氮效果，并计算土壤中氮含量及氮增加量，具体测试结果如下表2和图3所示：
表2实施例4～5、对比例5～8中的土壤原位固氮的方法的固氮效果
通过表2可以看出，相对于对比例5～8而言，实施例4中的总氮增量均获得了极大的提高，表明了在本发明中的土壤原位固氮的方法中，三电极系统、电活性菌和导电颗粒之间相互配合，存在协同作用，对土壤原位增氮具有增效作用。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (9)
1.一种土壤原位固氮的方法，其特征在于：包括以下步骤：在土壤中添加电活性菌，并在三电极系统工作下进行原位固氮；所述三电极系统包括工作电极、对电极和参比电极；所述工作电极包括碳材料、金属板、导电玻璃中的至少一种；所述对电极为金属丝；所述参比电极包括甘汞电极、Ag/AgCl电极中的至少一种。
2.根据权利要求1所述土壤原位固氮的方法，其特征在于：所述电活性菌的添加量不小于1×1010cfu/kg土壤。
3.根据权利要求2所述土壤原位固氮的方法，其特征在于：所述电活性菌包括施氏假单胞菌、硫还原地杆菌中的至少一种。
4.根据权利要求1至3任一项所述土壤原位固氮的方法，其特征在于：所述土壤中还添加有导电颗粒。
5.根据权利要求4所述土壤原位固氮的方法，其特征在于：所述导电颗粒包括生物炭、石墨粉、活性炭、磁铁矿、金属粉中的至少一种。
6.根据权利要求1所述土壤原位固氮的方法，其特征在于：所述土壤中氧气浓度≤0.5mg/L。
7.根据权利要求1所述土壤原位固氮的方法，其特征在于：所述土壤中总有机碳的含量为0～12000ppm。
8.根据权利要求7所述土壤原位固氮的方法，其特征在于：所述土壤中总有机碳含量大于1000ppm时，所述三电极系统的工作电位为+0.1V～+0.3V；所述土壤中总有机碳含量小于1000ppm时，所述三电极系统的工作电位为-0.1V～-0.3V。
9.权利要求1～8任一项所述的土壤原位固氮的方法在土壤改良中的应用。
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