CN111925974B

CN111925974B - 泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系

Info

Publication number: CN111925974B
Application number: CN202010435008.6A
Authority: CN
Inventors: 柯秀彬; 林敏�; 燕永亮; 战嵛华; 陆伟
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Beijing Green Nitrogen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2040-05-21
Also published as: US20230193306A1; CN111925974A; WO2021232551A1

Abstract

本发明提供了一种根据合成生物学理论与方法构建的泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系。分别人工设计了两种全新的功能模块：即在固氮微生物底盘中构建的“Neb+amtR”泌铵基因模块和用在水稻、玉米和小麦等非豆科作物底盘中构建的“Ham”氮高效利用模块，并在作物根际通过种子包衣等接种技术，实现上述两种人工模块的功能偶联。与现有技术的联合固氮系统相比，本发明的人工联合固氮体系具有更高的生物固氮效率和植物促生效果。

Description

泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系

技术领域

本发明属于合成生物学技术领域，具体涉及一种泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系及其用途。

背景技术

氮肥投入是农业生产者获得高产的必要途径。但是目前氮利用效率普遍不高，导致过度使用。植物根际是土壤-植物进行物质交换的活跃界面，也是宿主植物和微生物相互作用的主要活动区。联合固氮体系广泛存在于水稻、玉米等非豆科作物根际，但是天然的联合固氮体系有许多缺陷，如受根际生物逆境影响大、固氮效率低下以及野生固氮菌根表抗逆能力和耐铵能力弱、传统农作物根系氮利用能力弱。

合成生物学是以系统化设计和工程化构建为理念的汇聚交叉学科，是新一代颠覆性生物技术的发展前沿。合成生物学利用工程化的设计理念，在作为“底盘”的活体宿主或用于转录和翻译的体外系统中，实现从元件到模块再到系统的“自下而上”设计。利用生物系统的DNA、RNA、蛋白质等生物大分子作为候选“元器件”进行人工设计和智能改造，利用转录调控、代谢调控等生物功能将这些人工元器件关联起来，创建人工“功能模块”、“调控回路”或“智能系统”，实现更高效、更节能或更环保的全新生物功能。

传统的增强植物氮素利用效率的研究主要围绕两方面技术开展：一是通过对植物底盘的性能改良，人工设计氮高效利用功能模块，使植物对氮素的亲和力增强；二是人工设计固氮菌固氮及耐铵泌铵等模块，提高根际固氮微生物的固氮效率，使固氮微生物为植物提供更多生物固定的氮素。

但是，传统的方法存在研究周期长、微生物和植物的改良技术和应用都相对独立等诸多缺陷。因此，利用合成生物学技术建立一种全新的人工根际联合固氮体系，对于提高氮肥利用率并降低农业生产中对氮肥的依赖具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是建立一种全新的泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系。

本发明的泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系，是运用合成生物学技术，分别人工设计并构建两种全新的功能模块：固氮微生物底盘构建的固氮泌铵基因模块和非豆科植物底盘构建的氮高效利用模块，并在作物根际通过种子包衣等接种技术，将上述两种模块实现功能偶联。

即，在具有氮高效利用功能模块的重组植物(氮高效利用植物底盘)中接种具有固氮泌铵基因模块的重组固氮工程菌(固氮微生物底盘)，以实现二者功能的协同。

所述固氮泌铵基因模块，是包括人工设计的固氮激活蛋白Neb(由SEQ ID NO.1所示的DNA序列编码)功能模块和amtR(SEQ ID NO.2所示DNA序列的基因)铵转运功能模块。

所述植物底盘的氮高效利用模块，是人工设计的铵高亲蛋白Ham功能模块。本发明设计并构建了三种植物底盘，具体为：

含有基因Ham和基因bar的重组玉米；

含有基因Ham和基因hyg的重组水稻；

含有基因Ham和基因NPT II的重组小麦。

其中，Ham是铵高亲蛋白Ham的编码基因，由本发明首次人工合成，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

上述泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系的构建方法，包括：

1)获得固氮泌铵模块，将所述固氮泌铵模块导入固氮微生物中，获得含所述固氮泌铵模块的重组微生物；

2)获得氮高效利用模块，将所述氮高效利用模块导入植物中，获得含所述氮高效利用模块的重组植物。

3)在作物根际通过种子包衣等接种技术，将固氮微生物底盘泌铵模块与植物底盘的氮高效利用模块实现功能偶联。

本发明的高效泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系的应用方法，是在含氮高效利用模块的重组植物根际中接种含有固氮泌铵基因模块的重组固氮微生物。

因此，本发明构建了以下泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系：

neb+amtR泌铵工程菌与Ham+bar玉米品系

neb+amtR泌铵工程菌与Ham+hyg水稻品系

neb+amtR泌铵工程菌与Ham+NPT II小麦品系

经测定植物生长量和生物固氮量，评价促生效果和固氮效率发现，本发明提供的上述泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系的固氮效果均非常显著。

具体来讲，本发明进行了如下工作：

1、构建微生物高效固氮泌铵基因模块

用施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri A1501)作为模式联合固氮菌，构建高效泌铵固氮微生物底盘。人工设计高效铵转运蛋白基因amtR，采用高铵条件下的启动子。在限氮条件下，铵高亲和力amtR蛋白将细胞外的铵转运到细胞内。

通过以下人工设计的功能模块，构建提高固氮酶的耐铵和泌铵能力的工程菌：

通过对野生型A1501进行人工设计固氮激活Neb功能模块，将Neb功能模块和amtR功能模块转入野生型菌株中，获得泌铵固氮工程菌。

2、分别构建三种植物底盘的氮高效利用模块

1)在玉米中构建氮高效玉米品系

将玉米作为模式植物，用人工合成的目的基因构建氮高效利用玉米底盘。

方法是：将目的基因构建到pCAMBIA 3300-bar表达载体(购买自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心Biovector Science Lab，Inc)上，以玉米HiII为受体，通过农杆菌介导的玉米幼胚转化法获得。除草剂筛选、PCR、RT-PCR、Southern blot等技术验证目的基因插入玉米基因组中，稳定表达，且多世代稳定遗传。以此获得氮高效玉米品系。

氮高效玉米品系所用的目的基因是：通过人工合成的铵高亲蛋白的目的基因Ham和抗除草剂草铵膦筛选基因bar。

2)在水稻中构建氮高效水稻品系

将水稻作为模式植物，用人工合成的目的基因构建氮高效利用水稻底盘。

方法是：将目的基因构建到pCXK1301-hyg表达载体(购买自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心Biovector Science Lab，Inc)上，以水稻IR8为受体，通过农杆菌介导的水稻幼胚转化法获得。抗生素筛选、PCR、RT-PCR、Southern blot等技术验证目的基因插入水稻基因组中，稳定表达，且多世代稳定遗传。以此获得氮高效水稻品系。

氮高效水稻品系所用的目的基因是：通过人工合成的铵高亲蛋白的目的基因Ham和抗潮霉素筛选基因hyg。

3)在小麦中构建氮高效小麦品系

将小麦作为模式植物，用人工合成的目的基因构建氮高效利用小麦底盘。

方法是：将目的基因构建到pCAMBIA1301-35S-NPT II表达载体(购买自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心Biovector Science Lab，Inc)上，以小麦京411为受体，通过农杆菌介导的小麦幼胚转化法获得。抗生素筛选、PCR、RT-PCR、Southern blot等技术验证目的基因插入小麦基因组中，稳定表达，且多世代稳定遗传。以此获得氮高效小麦品系。

氮高效小麦品系所用的目的基因是：通过人工合成的铵高亲蛋白的目的基因Ham和抗卡那霉素筛选基因NPT II。

3、微生物和植物底盘的功能适配与田间应用考察

将上述泌铵工程菌分别和氮高效玉米、水稻和小麦进行组合，形成以下三个泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系(图1)，分别是

neb+amtR泌铵工程菌与Ham+bar玉米品系

neb+amtR泌铵工程菌与Ham+hyg水稻品系

neb+amtR泌铵工程菌与Ham+NPT II小麦品系

考察评估三个泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系的根际固氮效率和植物促生效果，方法是在温室条件下分别对这三个人工联合固氮体系的植物生长量和生物固氮量进行测定。

结果表明：三个泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系的根际固氮效率和促进植物生长量都显著高于对照体系。

本发明采用合成生物学技术，分别构建了微生物的固氮泌铵模块和植物的氮高效利用模块，并分别在固氮菌底盘和玉米、水稻和小麦底盘中完成了功能适配，将固氮微生物泌铵基因线路与植物底盘的氮高效利用模块进行功能偶联，形成一个全新的泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系，相比对照体系，具有更好的固氮效率和促生效果，具有减肥增产的潜力，为解决农业生产系统中氮素限制和利用率低下等难题提供了一种新方法。该方法也克服了传统方法研究周期长、无法对植物和微生物同时进行基因改造和实践等缺陷。

序列表信息

SEQ ID NO.1：neb基因的DNA序列。

SEQ ID NO.2：amtR基因的DNA序列。

SEQ ID NO.3：ham基因的DNA序列。

附图说明：

图1泌铵与氮高亲模块偶联的人工联合固氮体系示意图。高效泌铵固氮微生物底盘包括Neb+amtR泌铵工程菌。氮高效利用作物底盘包括Ham+bar玉米底盘、Ham+hyg水稻底盘和Ham+NPY II小麦底盘。

图2高效泌铵固氮微生物底盘的生长曲线；

图3高效泌铵固氮微生物底盘的固氮酶活特征；

图4高效泌铵固氮微生物底盘的泌铵能力。

图2—图4中：

野生型菌株，野生型Pseudomonas stutzeri A1501；

固氮基因突变株，nifH基因缺失突变株；

泌铵工程菌株，Neb+amtR泌铵工程菌；

n.d.，未检出。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。

实施例1Neb+amtR泌铵工程菌的获得

一、固氮施氏假单胞菌A1501(P.stutzeri A1501)中amt基因缺失突变株的构建：首先利用融合PCR技术将目的基因的上游同源片段、氯霉素抗性盒基因以及目的基因的下游同源片段融合成一大小约为4.1kb的融合片段，然后将克隆片段进行BamH I和Hind III双酶切，连接到自杀载体pk18mobsacB上。将构建好的自杀重组质粒通过三亲结合的方法导入到野生型A1501菌中，通过与染色体上基因的同源重组将自杀质粒整合到了染色体上，利用抗性筛选和PCR验证得到单交换菌株，然后根据amt基因在10％蔗糖选择压下致死的特性，将经过PCR验证的单交换克隆按照10^-3、10^-4和10^-5的稀释梯度分别涂布在含有10％蔗糖的氯霉素抗性的LB平板，进行双交换的筛选，经PCR验证得到目的基因amt的缺失突变菌株Δamt。

二、固氮施氏假单胞菌A1501(P.stutzeri A1501)中Neb和amtR基因转化重组菌株的构建：首先PCR扩增获得完整的Neb和amtR DNA片段，然后将克隆片段进行BamHI和HindIII酶切，插入到广宿主表达载体pLAFR3的多克隆位点处，最后将neb和amtR表达载体转入到大肠杆菌感受态细胞Trans109中获得具有四环素抗性的重组表达菌株E.coliTrans109(pneb+amtR)。将构建好的E.coli Trans109(pneb+amtR)供体质粒，同样通过三亲结合的方法导入到amt的缺失突变菌株中。

实施例2Neb+amtR泌铵工程菌的固氮效果测定

一、实验目的：考察工程菌的固氮酶活和泌铵能力(固氮菌株的生长曲线、固氮酶活和泌铵特性)

二、实验对象：

对照菌株：野生型Pseudomonas stutzeri A1501；

固氮基因突变株：nifH基因缺失突变株；

泌铵工程菌株：Neb+amtR泌铵工程菌；

三、实验方法：

固氮菌株酶活测定，方法如下：

挑取待测菌株野生型、泌铵工程菌和nifH基因缺失突变株接种于含对应抗生素的LB液体培养基中，30℃、220r/min振荡培养过夜。4℃、4000r/min离心10min收集培养过夜的菌株，经0.85％的NaCl溶液洗涤菌体2次，转接至A15培养基中，调整初始OD600至0.1，30℃、200r/min振荡培养，每隔2h取样测定菌株的OD600。以时间(h)为横坐标轴，OD600为纵坐标轴绘制生长曲线。

采用乙炔还原法测定菌株的固氮酶活性。具体方法如下：

取10mL过夜培养的菌液，6000rpm/min离心10min，再使用0.85％的NaCl溶液悬浮洗涤菌体沉淀2次，取1mL OD600为1.0的菌液至转接至9mL装有A15无氮源培养基的三角瓶中，初始OD600为0.1，体积为10mL。盖上胶塞，密封瓶口，充氩气4min用以排出三角瓶中的空气。向瓶中注入0.5％的氧气和10％的乙炔。实验设置4个重复，30℃、220r/min振荡培养。每隔2h用微量进样器从瓶中抽取250μL气体注入气相色谱中(SP-2305型气相色谱仪)检测乙烯含量，记录乙烯峰面积。利用公式计算固氮酶的活性：固氮酶活性[nmol C2H4/(mgprotein·h)]＝所测菌株乙烯峰面积×(三角瓶中气相体积/进样量)/1nmol标准乙烯峰的面积×菌体蛋白浓度×反应时间。

固氮菌株泌铵能力测定，方法如下：

挑取待测菌株接种于含对应抗生素的LB液体培养基中过夜培养，菌株离心收集后转至10mL A15液体培养基中，调整初始OD600为0.1。菌液在固氮条件下培养72h后收集上清液利用酶标仪测定铵离子浓度。实验设置4个重复。

四、实验结果：

固氮施氏假单胞菌野生型、泌铵工程菌和nifH基因缺失突变株在LB培养基中长势基本一致，均在2h后进入对数生长期，在8-10h时到达平台期(图2)。固氮条件下，泌铵工程菌的固氮酶活达到1477nmol acetylene/(mg protein h)-1，略高于野生型的固氮酶活(图3)。同样在固氮条件下，培养72h后泌铵工程菌的胞外铵离子浓度达到18μM(图4)。

五、实验结论：

泌铵工程菌株的生理活性正常，其中固氮酶活和泌铵能力最佳，可用于后续高效联合固氮体系的构建。

实施例3泌铵工程菌株与玉米构建的高效联合固氮体系的田间应用效果

实验方法

(1)植物生长量测定

实验在智能温室进行，可以全时控制温度和湿度。实验接种的固氮菌包括5个处理(泌铵工程菌和野生型菌株、nifH基因缺失突变菌株以及50mg N每千克土施氮处理和不施肥不接种处理对照)；玉米品种包括2个处理(氮高效利用品系及对照品系)；实验设置8个重复。本实验总设置5×2×8＝80个样品；

将玉米种子在无菌水中浸泡清洗30min后转移至5％NaClO溶液浸泡1min，接着在75％乙醇中处理2min，最后用无菌水清洗5次。表面消毒后的种子分别放入准备好的各种菌悬液以及灭菌的野生型悬浮液(不接种对照)浸泡30min。将浸泡后的玉米种子放入装有2.5千克土壤基质(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(内径20cm、高20cm)，每盆4颗种子，每组8个重复。试验设置8个重复。玉米出苗后间苗至2颗/盆，玉米生长周期内按照正常管理。种植60天后分别测定玉米地上和地下部生长量。

实验结果：

玉米生长期第60天采集地上和地下部进行植物生物量测定，包括株高、株重和根系重量(表1)。数据分析表明相比施肥和不接种对照体系，由Neb+amtR泌铵工程菌与Ham+bar玉米品系构建的联合固氮体系的植物生物量均显著增加。

在这个高效固氮体系中，植物株高、地上和地下部及总生物量显著高于对照(表1)，接种泌铵工程菌株的植株总生物量较施肥处理提高7.2％，较不接种对照提高14.9％。其中地上部生物量较施肥处理提高13.5％，较不接种对照提高19.0％；根系重量较施肥处理提高1.2％，较不接种对照提高3.6％。

人工设计高效固氮体系的平均株高显著高于对照体系(表1)，接种泌铵工程菌后玉米平均株高较施肥处理增加1.9％，较不接种对照增加4.7％。

实验结论：

高效泌铵固氮微生物底盘与氮高效利用植物底盘构建的人工联合固氮系统可以显著提高植株生长量，对玉米的促生效果最佳。

(2)15N稳定性同位素稀释法测定生物固氮量

实验结果：

利用15N稀释法对人工设计根际联合固氮体系中的固氮菌固氮能力进行评价(表2)。对Neb+amtR泌铵工程菌底盘与Ham+bar玉米底盘构建的人工联合固氮体系的数据分析表明，与对照体系相比，泌铵工程菌显著提高了玉米植株的全氮含量、从空气中固定的氮素占植物总氮量的百分比(生物固氮效率)和生物固氮量。

在这个高效固氮体系中，接种泌铵工程菌株后植株全氮含量相对于对照体系增加40.6％，生物固氮贡献率为21.5％，经换算后生物固氮量为0.8g/株，假设玉米每公顷产6万株，估算每公顷的生物固氮量为48kg，按照玉米的正常施肥量是187.5kg N/公顷估算节肥率约为25.6％(表2)。

而在对照体系中，生物固氮量贡献率为10.1％，经换算后生物固氮量约为0.23g/株，估算每公顷的生物固氮量为13.8kg，节肥率约为7.3％(表2)。

实验结论：

高效泌铵固氮微生物底盘与氮高效利用植物底盘构建的人工联合固氮体系可以使植物获得具有更高的生物固氮效率和固氮量，预测节肥效果最佳，据估算每公顷可节省化肥约25.6％，而对照体系为7.3％。

实施例4泌铵工程菌株与水稻构建的高效联合固氮体系的田间应用效果

实验方法

(1)植物生长量测定

实验在智能温室进行，可以全时控制温度和湿度。实验接种的固氮菌包括5个处理(泌铵工程菌和野生型菌株、nifH基因缺失突变菌株以及50mg N每千克土施氮处理和不施肥不接种处理对照)；水稻品种包括2个处理(氮高效利用品系及对照品系)；实验设置8个重复。本实验总设置5×2×8＝80个样品；

将水稻种子在无菌水中浸泡清洗30min后转移至5％NaClO溶液浸泡1min，接着在75％乙醇中处理2min，最后用无菌水清洗5次。表面消毒后的种子分别放入准备好的各种菌悬液以及灭菌的野生型悬浮液(不接种对照)浸泡30min。将浸泡后的水稻种子放入装有2千克土壤基质(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(内径20cm、高20cm)，每盆4颗种子，每组8个重复。试验设置8个重复。水稻出苗后间苗至2颗/盆，水稻生长周期内按照正常管理。种植60天后分别测定水稻地上和地下部生长量。

实验结果：

水稻生长期第60天采集地上和地下部进行植物生物量测定，包括株高、株重和根系重量(表1)。数据分析表明相比施肥和不接种对照体系，由Neb+amtR泌铵工程菌与Ham+hyg水稻品系构建的联合固氮体系的植物生物量均显著增加。

在这个高效固氮体系中，植物株高、地上和地下部及总生物量显著高于对照(表1)，接种泌铵工程菌株的植株总生物量较施肥处理提高6.6％，较不接种对照提高10.9％。其中地上部生物量较施肥处理提高10.4％，较不接种对照提高20.6％；根系重量较施肥处理提高2.4％，较不接种对照提高2.6％。

人工设计高效固氮体系的平均株高显著高于对照体系(表1)，接种泌铵工程菌后水稻平均株高较施肥处理增加4.3％，较不接种对照增加6.8％。

实验结论：

高效泌铵固氮微生物底盘与氮高效利用植物底盘构建的人工联合固氮系统可以显著提高植株生长量，对水稻的促生效果最佳。

(2)15N稳定性同位素稀释法测定生物固氮量

实验结果：

利用15N稀释法对人工设计根际联合固氮体系中的固氮菌固氮能力进行评价(表2)。对Neb+amtR泌铵工程菌底盘与Ham+hyg水稻底盘构建的人工联合固氮体系的数据分析表明，与对照体系相比，泌铵工程菌显著提高了水稻植株的全氮含量、从空气中固定的氮素占植物总氮量的百分比(生物固氮效率)和生物固氮量。

在这个高效固氮体系中，接种泌铵工程菌株后植株全氮含量相对于对照体系增加48.2％，生物固氮贡献率为18.5％，经换算后生物固氮量为0.14g/株，假设玉米每公顷产21万株，估算每公顷的生物固氮量为29.4kg，按照水稻的正常施肥量是120kg N/公顷估算节肥率约为24.5％(表2)。

而在对照体系中，生物固氮量贡献率为9.0％，经换算后生物固氮量约为0.06g/株，估算每公顷的生物固氮量为12.6kg，节肥率约为10.5％(表2)。

实验结论：

高效泌铵固氮微生物底盘与氮高效利用植物底盘构建的人工联合固氮体系可以使植物获得具有更高的生物固氮效率和固氮量，预测节肥效果最佳，据估算每公顷可节省化肥约24.5％，而对照体系为10.5％。

实施例5泌铵工程菌株与小麦构建的高效联合固氮体系的田间应用效果

实验方法

(1)植物生长量测定

实验在智能温室进行，可以全时控制温度和湿度。实验接种的固氮菌包括5个处理(泌铵工程菌和野生型菌株、nifH基因缺失突变菌株以及50mg N每千克土施氮处理和不施肥不接种处理对照)；小麦品种包括2个处理(氮高效利用品系及对照品系)；实验设置8个重复。本实验总设置5×2×8＝80个样品；

将小麦种子在无菌水中浸泡清洗30min后转移至5％NaClO溶液浸泡1min，接着在75％乙醇中处理2min，最后用无菌水清洗5次。表面消毒后的种子分别放入准备好的各种菌悬液以及灭菌的野生型悬浮液(不接种对照)浸泡30min。将浸泡后的小麦种子放入装有2.5千克土壤基质(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(内径20cm、高20cm)，每盆4颗种子，每组8个重复。试验设置8个重复。小麦生长周期内按照正常管理。种植60天后分别测定小麦地上和地下部生长量。

实验结果：

小麦生长期第60天采集地上和地下部进行植物生物量测定，包括株高、株重和根系重量(表1)。数据分析表明相比施肥和不接种对照体系，由Neb+amtR泌铵工程菌与Ham+NPT II小麦品系构建的联合固氮体系的植物生物量均显著增加。

人工设计高效固氮体系的平均株高显著高于对照体系(表1)，接种泌铵工程菌后小麦平均株高较施肥处理增加1.9％，较不接种对照增加4.7％。

实验结论：

高效泌铵固氮微生物底盘与氮高效利用植物底盘构建的人工联合固氮系统可以显著提高植株生长量，对小麦的促生效果最佳。

(2)15N稳定性同位素稀释法测定生物固氮量

实验结果：

利用15N稀释法对人工设计根际联合固氮体系中的固氮菌固氮能力进行评价(表2)。对Neb+amtR泌铵工程菌底盘与Ham+NPT II小麦底盘构建的人工联合固氮体系的数据分析表明，与对照体系相比，泌铵工程菌显著提高了小麦植株的全氮含量、从空气中固定的氮素占植物总氮量的百分比(生物固氮效率)和生物固氮量。

在这个高效固氮体系中，接种泌铵工程菌株后植株全氮含量相对于对照体系增加42.6％，生物固氮贡献率为14.3％，经换算后生物固氮量为0.02g/株，估算每公顷的生物固氮量为80kg，节肥率约为66.6％(表2)。

而在对照体系中，生物固氮量贡献率为8.5％，经换算后生物固氮量约为0.01g/株，假定小麦每公顷产400万株，估算每公顷的生物固氮量为40kg，按照小麦的正常施肥量是120kg N/公顷估算节肥率约为33.3％(表2)。

实验结论：

高效泌铵固氮微生物底盘与氮高效利用植物底盘构建的人工联合固氮体系可以使植物获得具有更高的生物固氮效率和固氮量，预测节肥效果最佳，据估算每公顷可节省化肥约66.6％，而对照体系为33.3％。

实施例3—5中，实验结果的测定指标包括植物生长量和生物固氮量。其中：

1、植物生长量包括株高、地上部和地下部重量的相对增长率结果见表1。

表1人工联合固氮体系作物植株性状及生物量相对于对照体系的增长率

注：施肥对照系统中氮肥的施加量为50毫克氮每千克土壤。

2、生物固氮量测定，用15N稳定性同位素稀释法进行

15N稳定性同位素稀释法，是一种测定生物固氮量的通用方法。本发明中，玉米、水稻、小麦的生长量评价和15N测定生物固氮量的方法基本一致。具体操作和计算方法为：

1、实验开始前两周将15N稳定性同位素标记的硫酸铵(浓度为50mg N每千克土壤)加入土壤中并充分混合待用。

2、经菌液浸泡后的玉米(或水稻，或小麦)种子放入盆装土壤中。栽培60天后取茎叶烘干至恒重，研磨过100目筛后，经稳定性同位素质谱检测。

实验设置4个重复。

3、计算

1)生物固氮对植物氮素营养的贡献率，以从空气中固定的氮素占植物总氮量的百分比(％Ndfa)计，计算方法如下：

％Ndfa＝(1-atom％15NF excess/％15NNF excess)×100％

式中：

atom％15NF excess—接种固氮菌玉米(或水稻、或小麦)植株15N原子百分超；

atom％15NNF excess—接种niH基因突变株玉米(或水稻、或小麦)植株15N原子百分超；

计算结果以重复性条件下获得的3次独立测定结果的算术平均值表示。

2)植物体内总的固氮量(N fixed)以克计，按以下公式计算：

Nfixed＝Nt×％Ndfa×Biomass

式中：

Nt—植物总氮含量(％)，单位％；

Biomass—植株地上和地下部的生物量总和，单位克每株植物；

结果见表2。

表2人工设计根际联合固氮体系和对照体系的作物植株氮含量及生物固氮量计算

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种高效人工根际联合固氮体系

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atagacatca gctttgatac cggtgcgatt aggtacatga ttgtattatt tgcgcccgcc 60

gagcgcgcaa gtggcctata ccgttgcgtg gcgccgggta tacaggtcat tgtggccccc 120

ttcatcgtta tggagtggcg tagctcaagg tgccgaggac gcgccgcgat taaagtctat 180

ggaaacgctc acgccgaacg ccaaaaatta tgcgcgtctg taaccaaaac gtggacttct 240

ctattccccc aactgcaatt cgggccgtcc ggtgcggata tagtgccgac agctgattgt 300

caacactccc gacgcgggat gcccgcatta gggtacaagc tgtttgaaac cccacaaggg 360

tcattccggc gcacaagccg cacaccacgt aatccttcca gtaataaatt tgatccaaca 420

tcttgcacga tagagcggaa agactaccgg gggccatgct ctcactacgc gcacactcaa 480

gtcacaacta atactgcgcg tcgcatgggg cgtttagcgt tcagctctac agctcagatg 540

tacgctatcc tcgcaaggcg accacgggga cgatcgactt tacaactgaa agagtcacgt 600

ccgctgaaaa acacccatcc cgctacagcg cgctcagtga tggtgataga gatgtcgact 660

tctttggtat gcacgggccg ttgcactcac aaaccttcag ccgataaacg cgcccacaaa 720

cccttgtcgg ttcgaggtgt gaaactagtg gtggagggga accgacaacc tgcctacccc 780

cgtgatgtgc cgtttccgca tcgattagat ttgaaaacta ggccttggac tgcaataagc 840

catggctcat tcatcaatac cgaacccgag caaggcggag ccctgaacgc ggacaaagcg 900

ttactccagc tgcaggatgt cactccacta gtcagacgaa actgctctca atcgaaacaa 960

gctggtattc tgttttacaa aatcaatcac gttcgactaa 1020

<210> 2

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtgtccaat ttgttcagcc ccgtgagttt ggtgcaacct actcggtcca aatgtgctgc 60

agaagcttaa gactctctcg gaagatgcgc gcatgctcag tgggaatccc tcacatgccc 120

tctgtcgcac cacacgatat taaaatcctc gccttcacgc gtgggttaca atatagttgg 180

ggaacctctc tgcatcgatg gattaaactc accaatgtgt taaacagaaa tctgacccga 240

gtactggctg ttaacccgat aaatttcgag gcttgcctta cacaaatttt acatcggata 300

agccgcaaag tgcaccccgt gcgcagactg attataaaat tgatcgggat gcaacgacag 360

tggttcttca ctgggggcac acgtttgact tctagtgttc gtgctttttc catgaaagca 420

ttattacgac gggctttgtt attagatgct tcacctctga tagcccagta cgggtttagg 480

aagggggcac gccccacaca aatccacgga gtctcacccg atcatgatcc tcgtatttgg 540

tacccctggg gtcaacctcc agtagattca aaatgtagcg agtgtagctt tataggtggt 600

tcctgtaaca tattaagttg cgtgggagcg aaaaattccc tagtaggtca tcctgctgag 660

ccgggaagtg atctcaccaa tatatcaggg ggccttccga gcacgtggag ggttcttccg 720

gggggaagtc cgagcccctt cgctaggcta ggttcctctt tcgataactc cgcccaacac 780

gtagtcgcat gtatttggtc 840

<210> 3

<211> 471

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcattcctga tatgcgaggt ccgaacaccc tggtttacgg catggaggct aggtccctac 60

gttctggtct actgtaaggc acgttatgca tcatgcggcc cccccgcgag ctgcgatacg 120

ccttttacaa tagaaatgaa taaaaaatgc catgttggcg aacggctgag actggcacac 180

gcctgctacc cgaagaacac agatctaatt ttgcctgttg tgatgctagg cttgattgat 240

tcatcgttga caggtctgac ctttacgatg tgttcctttt cccggatccc acagaggctc 300

cagttagtgc cttaccattt catcaacgcc ctatactatc tggttcttaa tccaggtttc 360

agaaggaggg ggcgaccgat cctaccttca ccgctagcgc ccagccgcaa atgtaaacgt 420

tcgtgcggac ttagccgtct acgagaaggc actagtgtag acaacaattt g 480

Claims

1.一种人工根际联合固氮体系的构建方法，所述联合固氮体系由固氮微生物底盘构建的固氮泌铵基因模块和非豆科植物底盘的氮高效利用模块组成；构建方法包括：

1）将含有固氮激活蛋白Neb功能模块和amtR铵转运模块的固氮泌铵基因模块导入amt基因缺失的固氮施氏假单胞菌A1501中，获得含所述固氮泌铵基因模块的重组工程菌；

2）将含有铵高亲蛋白Ham的氮高效利用模块分别导入不同非豆科目标植物中，分别获得含所述氮高效利用模块的不同重组植物；

所述固氮激活蛋白Neb由 SEQ ID NO. 1所示的DNA序列编码；所述amtR铵转运模块由SEQ ID NO. 2所示的DNA序列编码；

所述铵高亲蛋白Ham由 SEQ ID NO. 3所示的DNA序列编码。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述重组植物选自以下之一：

含有基因Ham 和基因 bar的重组玉米；或

含有基因Ham 和基因 hyg的重组水稻；或

含有基因Ham 和基因 NPT II的重组小麦。

3.权利要求1所述构建方法构建的人工根际联合固氮体系的应用方法，所述应用是将所述重组工程菌接种于所述重组植物中。

4.根据权利要求3所述的应用方法，所述接种是在作物根际使用种子包衣接种技术进行。